本申请要求于2015年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/187,040的优先权的权益，其优先权的权益在此要求并且其通过引用全文并入本文。
发明背景
先天性心脏病(chd)折磨着所有存活的婴儿的大约1％，并且具有相当高的发病率和死亡率(1-5)。心血管疾病是全球头号死因，自1900年以来，它一直是美国每年最常见的死亡原因。如今，每三个成年人中就有一人患有心血管疾病。最后，先天性心脏缺陷是一般人群中最常见的出生缺陷形式，并且在儿童和成人群体中导致晚期或终末期心力衰竭。先天性心脏病和其他心血管疾病可以进展为心力衰竭。终末期心力衰竭的唯一治疗方法是心脏移植，但由于用于移植的器官短缺，相对较少的患者接受这种挽救生命的治疗。接受心脏移植的患者需要药物来预防心脏的排斥反应，这些药物通常会有长期的副作用，这也会限制生存。
发明简述
本文描述了开发nkx2-5/handii/tbx5敲除猪或其他动物，例如牛或山羊，作为用于产生临床应用的个体化人/人源化心肌组织/心肌细胞的宿主。
已经使用基因编辑技术产生了nkx2-5/handii/tbx5无效的(null)猪胚胎，并且我们已经使用人干细胞来生产人-动物嵌合体。对nkx2-5/handii/tbx5进行多重基因编辑，为使用具有多能性的人细胞重建心脏提供了一个允许的微环境，以得到人源化心脏细胞和/或组织(包括器官，如心脏)。
一个实施方案提供非人动物细胞、桑椹胚或胚泡，其中基因组在nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的两个等位基因中均携带突变，使得所述非人动物细胞、桑椹胚或胚泡缺少功能性nkx2-5蛋白、handii蛋白、tbx5蛋白或其组合。在一个实施方案中，突变是nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的缺失。在另一实施方案中，所述非人动物细胞、桑椹胚或胚泡是猪、牛、马或山羊。
一个实施方案提供表达人nkx2-5、handii、tbx5或其组合并且缺乏非人动物nkx2-5、handii、tbx5或其组合的表达的嵌合非人动物桑椹胚或胚泡。在一个实施方案中，所述非人动物产生人源化心脏细胞和/或组织。
一个实施方案提供表达外源猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合并且缺乏内源猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合的表达的嵌合猪(猪-猪嵌合体)。在一个实施方案中，所述非人动物是猪、牛、马或山羊。
一个实施方案提供用于产生表达人nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的嵌合非人动物的方法，包括：a)产生nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人动物细胞，其中所述非人nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合基因的两个拷贝都携带阻止功能性nkx2-5蛋白、handii蛋白、tbx5蛋白或其组合产生的突变；b)通过体细胞核转移建立nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人桑椹胚或胚泡，包括融合来自a)的所述nkx2-5、handi、tbx5或其组合无效的非人细胞的细胞核进入去核的非人卵母细胞并激活所述卵母细胞分裂以形成nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人桑椹胚或胚泡；c)将人干细胞引入至b)的非人nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的桑椹胚或胚泡中；以及d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡植入假孕替代非人动物中以产生表达人nkx2-5、handii、tbx5或其组合的嵌合非人动物。
另一实施方案提供产生表达外源nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的嵌合猪的方法，包括：a)产生nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪细胞，其中内源猪myf5基因、myod基因、mrf4基因或其组合基因的两个拷贝都携带阻止功能性内源猪myf5蛋白、myod蛋白、mrf4蛋白或其组合产生的突变；b)通过体细胞核转移建立nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡，包括融合来自a)的所述nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪细胞的细胞核进入去核猪卵母细胞并激活所述卵母细胞分裂以形成nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡；c)将猪干细胞引入至b)的猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的桑椹胚或胚泡中；以及d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡植入假孕替代猪中以产生表达外源猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合的嵌合猪。
另一实施方案提供在非人动物中产生人或人源化心脏细胞的方法，包括：a)产生nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人细胞，其中非人nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的两个等位基因都携带阻止功能性非人nkx2-5蛋白、handii蛋白、tbx5蛋白或其组合产生的突变；b)通过体细胞核转移建立nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人桑椹胚或胚泡，包括融合来自a)的所述myf5、myod、mrf4或其组合无效的非人细胞的细胞核进入去核非人动物卵母细胞并激活所述卵母细胞分裂以形成nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人动物桑椹胚或胚泡；c)将人干细胞引入至b)的nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的非人动物胚泡或桑椹胚中；以及d)将来自c)的所述胚泡或桑椹胚植入假孕替代非人动物中以产生表达人或人源化心脏细胞的非人动物。
在一个实施方案中，所述非人动物是猪、牛、马或山羊。在另一实施方案中，所述人干细胞是组织特异性干细胞、多能干细胞、多能成体干细胞、诱导性多能干细胞或脐带血干细胞(ucbsc)。在另一实施方案中，从成纤维细胞形成所述诱导性多能干细胞。
一个实施方案提供猪细胞、桑椹胚或胚泡，其中基因组在nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的两个等位基因中均携带突变，使得所述猪细胞或胚泡缺乏功能性nkx2-5蛋白、handii蛋白、tbx5蛋白或其组合。在一个实施方案中，所述突变是nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的缺失。
一个实施方案提供表达人nkx2-5、handii、tbx5或其组合并且缺乏猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合的表达的嵌合猪。在一个实施方案中，所述嵌合猪产生人源化心脏细胞和/或组织。
一个实施方案提供用于产生表达人nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的嵌合猪的方法，包括：a)产生nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪细胞，其中猪nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合基因的两个拷贝都携带阻止功能性猪nkx2-5蛋白、handii蛋白、tbx5蛋白或其组合产生的突变；b)通过体细胞核转移建立nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡，包括融合来自a)的所述nkx2-5、handi、tbx5或其组合无效的猪细胞的细胞核进入去核猪卵母细胞并激活所述卵母细胞分裂以形成nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡；c)将人干细胞引入至b)的猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的桑椹胚或胚泡中；以及d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡植入假孕替代猪中以产生表达人nkx2-5、handii、tbx5或其组合的嵌合猪。
另一个实施方案提供在猪中产生人源化心脏细胞的方法，包括：a)产生nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪细胞，其中猪nkx2-5基因、handii基因、tbx5基因或其组合的两个等位基因都携带阻止功能性猪nkx2-5蛋白、handii蛋白、tbx5蛋白或其组合产生的突变；b)通过体细胞核转移建立nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡，包括融合来自a)的所述myf5、myod、mrf4或其组合无效的猪细胞的细胞核进入去核猪卵母细胞并激活所述卵母细胞分裂以形成nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡；c)将人干细胞引入至b)的猪nkx2-5、handii、tbx5或其组合无效的胚泡中；以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕替代猪中以产生表达人源化心脏细胞的猪。在一个实施方案中，所述人干细胞是人诱导性多能干细胞、人多能干细胞或人脐带血干细胞。在另一实施方案中，从成纤维细胞形成所述人诱导性多能干细胞。
使人或人源化组织和器官对于每个接受者的免疫复合物个体化是有用的。如本文所公开的，通过使用大型动物作为宿主并编辑它的基因组以敲除或减弱负责靶器官生长和/或分化的基因并在胚泡或合子期用供体干细胞接种该动物来补充缺失的用于器官生长和发育的遗传信息可以做到这样。结果是一种嵌合动物，其内补充的组织(人/人源化器官)与供体的基因型和表现型相匹配。这样的器官可以在单一一代中制造，并且干细胞可以从患者自身身体采集或产生。如本文所公开的，通过同时编辑细胞中的多个基因可以做到这样(参见例如wo2015/168125，其通过引用并入本文)。使用靶向核酸酶和脊椎动物细胞或胚胎中的同源性定向修复(hdr)模板可以将多个基因靶向用于编辑。
附图简述
图1描述了小鼠心脏形态发生的示意图。(左至右)新月形生心区(cardiaccrescent)(e7.5)、线性心管(e8.5)、环化心脏(e9.5)以及四室心脏(e10.5)的形成。
图2示出了nkx2-5和handii(也称为dhand)双敲除缺乏两个心室(rv和lv)，并有一个单一的小原始心房(dc)(yamagishi2001)。
图3a-c描述了猪成纤维细胞中nkx2-5、handii和tbx5的三重敲除。a)显示每个基因编码序列的示意图；交替的颜色表示外显子边界，蓝色区域(下面)表示每个转录因子的dna结合结构域，三角形表示talen结合位点的位置。b)对tbx5和nkx2-5的双等位基因ko的成纤维细胞集落的rflp分析。星号标示双重双等位基因ko集落。c)集落筛选结果(n＝480)。仅在tbx5和nkx2-5双阳性克隆中通过测序分析handii突变率。
图4描述了nkx2-5/handii/tbx5三重敲除的猪胚胎是无心畸型的。三重敲除猪胚胎缺少心脏，在e18.0(h：心脏及fg：前肠)基本上没有gata4免疫组织化学阳性细胞(标记心脏)。
图5a-f示出nkx2-5支配cpc中的网络并且是心脏发生的因子。(a)将nkx2-5基因的心脏增强子区域与荧光报道分子(eyfp)融合并用于产生转基因小鼠。(b)nkx2-5增强子将eyfp表达导向至转基因小鼠胚胎中的心脏祖细胞群。(c)从分选的cpc分离rna，扩增并使用affymetrix阵列分析评估基因表达。nkx2-5-eyfpcpc与来自单胚胎(e7.75-e9.5)的相应阴性细胞群的affymetrix阵列分析结果揭示出与心脏发育相关的增加的基因表达，并鉴别handii和tbx5为新月形生心区的因子。鉴别在nkx2-5无效心脏祖细胞(cpc)中上调的基因。(d)在e8.0和e9.5，eyfp被导向至6kbnkx2-5-eyfp:wt和6kbnkx2-5-eyfp:nkx2-5无效的同胞中的cpc。(e)在e8.0和e9.5阶段分离的wt(+/+)cpc与eyfp阳性nkx2-5无效(-/-)中显著上调的基因的阵列分析维恩图。(f)示意图，其总结了研究结果，示出nkx2-5在抑制血液形成、促进内皮谱系(通过etv2)和促进心脏谱系(通过调节bnp、anf、mlc-2v和cripto)的作用。
图6描绘了在猪模型中产生人源化心脏的总体策略。将利用多重基因编辑来产生nkx2-5/handii/tbx5突变猪成纤维细胞，以及scnt和人干细胞递送以工程化具有人源化心脏的猪。
图7a-b描绘了talen介导的etv2敲除。(a)利用三层pcr测定检测基因编辑。来自引物a-d的扩增指示存在等位基因缺失。为区分杂合克隆和纯合克隆，使用引物a-b和c-d来扩增野生型等位基因。只有当a-d产物存在并且a-b、c-d产物两者都不存在时，认为克隆对于缺失等位基因是纯合的。(b)符合这些标准的克隆用绿色方框包围。
图8a-h示出猪etv2的丢失重现了小鼠etv2突变表现型。在24体节期的野生型e18.0猪胚胎(a)和etv2敲除胚胎(b)。插图展示了尿囊的放大视图。注意突变体中缺乏血管丛形成的整体形态学异常(插图)。(c-h)a和b所示的胚胎的通过尿囊(c，d)、心脏水平(e，f)和干水平(g，h)的切片分别针对内皮标记物tie2、心脏细胞谱系标记gata4、以及核复染色剂dapi染色。野生型尿囊用tie2阳性内皮内衬(c，箭头)高度血管化，而突变体缺少这种细胞群(d)。在野生型胚胎(e，g)中清晰可见心内膜、主静脉(cv)和背主动脉(da)。相比之下，etv2无效胚胎完全缺乏这些结构，尽管存在由gata4(绿色)标记的心脏祖细胞和肠(分别为f和h)。比例尺：1000μm(a，b)，200μm(a、b中的插图)，100μm(c-h)。
图9a-b描绘了(a)icm中具有dii标记的hipsc的胚泡。箭头表示dii和hna呈阳性的细胞。(b)在icm中具有edu标记的hipsc的胚泡。hipsc用40μmedu标记24小时并注射。胚泡用10μmbrdu脉冲1小时以标记分裂中的细胞。双箭头表示双阳性细胞。brdu+/edu-细胞是分裂中的宿主细胞。注意胚泡开始孵化(括号)，这表明发育进展。hna：人核抗原；ol：覆盖。
发明详述
心血管疾病是这个国家乃至全世界头号死因。目前三分之一的成年人都患有心血管疾病。先天性心脏缺陷是常见的，并且可以进展到终末期心力衰竭。虽然心脏移植是终末期心力衰竭的唯一治愈方法，但由于供体器官供应有限，相对较少的患者接受这种治疗。总之，对需要这种治疗的患者来说心脏供应不足。此外，没有相关的人体模型来测试先天性或心力衰竭疾病的新装置、药理疗法或手术疗法。第三，没有相关的人体模型来鉴别或检查促进心脏再生的因子，所述因子会消除心脏移植的需要。最后，本文提供了可以用患者自己的干细胞产生的个体化人组织的来源(从而避免了诸如器官捐献或使用人胚胎干细胞的道德问题)。因此，本文提供了利用新兴技术通过在大型动物模型中工程化人源化心脏来革新该领域。
本文提供了用于在猪中产生人器官(心脏)/人源化组织的组合物和方法，其将作为用于移植的心脏/组织的无限制来源，并提供大型动物模型来研究人心脏再生和/或人心脏对实验药物的反应。
具体地，本文提供了为成千上万的人提供个体化心脏组织或心脏的组合物和方法，这些人将从这种治疗中受益。这一策略将彻底改变心血管医学，并为这种毁灭性疾病提供治疗方法。个体化的心脏瓣膜、心脏组织、冠状动脉和整个心脏可供患者获得，这将会避免使用免疫抑制剂。此外，本文提供了用于产生其他组织如个体化血液、血管、肌肉、骨骼和肺的平台。
之前，转基因的和基因破坏的小鼠模型被工程化以定义对于心脏发育来说是必需的和充分的网络。已经证实了nkx2-5作为心脏发育的转录激活因子、作为血液形成的阻遏剂和作为主内皮/心内膜因子etv2(5-21)的激活剂的作用。根据数据和其他出版物，确信nkx2-5/hand2/tbx5突变的动物会完全缺少心脏(22-26)。使用最先进的基因编辑技术，产生了突变的猪胚胎，这些胚胎在早期发育时是致死的，并且具有被干扰的心血管细胞谱系或不存在心血管细胞谱系。除了作为用于治疗心血管疾病的人组织的新型来源之外，人源化猪还可以作为大型动物模型来研究人细胞谱系的再生或对药剂的反应，并导致改善的心血管疾病包括先天性和心力衰竭疾病的治疗。这种方法结合了创新技术和新兴技术，以破译支配心血管细胞谱系的网络和干细胞群并在猪宿主中产生人特异性组织。
定义
囊括以下定义以提供对说明书和权利要求清楚且一致的理解。如本文所使用的，所述术语具有以下含义。本说明书中使用的所有其他术语和短语具有本领域技术人员将理解的其普通含义。这种普通含义可以通过参考技术字典获得，诸如howley'scondensedchemicaldictionary第14版，r.j.lewis，johnwiley&sons，newyork，n.y.，2001。
说明书中对“一个实施方案”、“实施方案”等的引用表示所描述的实施方案可以包括特定的方面、特征、结构、部分或特性，但不是每个实施方案都必须包括该方面、特征、结构、部分或特征。而且，这样的短语可能，但不是必须，指代该说明书其他部分中提到的相同实施方案。此外，当结合实施方案描述特定的方面、特征、结构、部分或特性时，无论是否明确描述，本领域技术人员都知道把这样的方面、特征、结构、部分或特性影响或联系其他实施方案。
如在此使用的，冠词“一(a)”和“一(an)”是指冠词的语法对象的一个或多于一个，即至少一个。举例来说，“一(an)元素”是指一个元素或多于一个元素。
术语“和/或”意思是与该术语相关联的项目中的任何一个、项目的任何组合或者所有项目。本领域技术人员容易理解短语“一个或多个”，尤其是当在其使用的上下文中阅读时。例如，苯环上的一个或多个取代基是指1至5个，或1至4个，例如如果苯环是双取代的。
如在本文使用的，“或”应当理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔一个列表的项目时，“和/或”或“或”将解释为包含性的，例如包括许多项目中的至少一个项目，但也包括多于一个项目，并且，可选地，额外的未列出的物项目。仅在术语清楚地被表示为相反意思时，诸如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”将指包含许多或一个列表的元素中的恰好一个元素。一般而言，在本文使用的术语“或”在排他性术语，诸如“任一个”、“之一”、“只有一个”、或者“正好一个”之前，应当仅解释为指示排他性替代方案(即，“一个或另一个，而不是两个”)。
如本文所使用的，术语“包括”、“包含”、“具备”、“具有”、“有”或其变体意为包括的，类似于术语“含有”。
术语“约”可以表示指定值±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，“约50”百分比在一些实施方案中可以具有45％至55％的变化。对于整数范围，术语“约”可以包括大于和/或小于在该范围的每个末端处所列举的整数的一个或两个整数。除非本文另外指出，术语“约”旨在包括接近所述范围的值，例如，重量百分数，其就个别成分、组合物或实施方案的功能而言是等同的。术语“约”还可以修饰所列范围的端点。
如本领域技术人员将理解的，所有数字，包括表示成分的数量、特性诸如分子量、反应条件等等的数字都是近似值，并且理解为在任何情况下任选地被术语“约”修饰。根据本领域技术人员利用本说明书描述的启示来寻求获得的期望特性，这些值可以变化。还应该理解的是，这样的值固有地包含由他们各自的测试测量中发现的标准差所必然引起的可变性。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，尤其是在提供书面说明方面，本文列举的所有范围还包含任何和所有可能的子范围及其子范围的组合，以及组成该范围的各个值，尤其是整数值。所列举的范围(例如，重量百分比或碳基团)包括该范围内的每个特定值、整数、小数或身份。任何列出的范围都可以容易地认为是充分描述并且使相同的范围分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一或十分之一。作为非限制性示例，这里讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“少于”、“多于”、“或更多”等类似的所有语言包括所列举的数字，并且这样的术语是指随后可以分解成如上所述的子范围的范围。以相同的方式，本文列举的所有比率还包括落在该较宽比率内的所有子比率。因此，对于自由基、取代基和范围所列举的具体数值仅用于说明；它们不排除自由基和取代基在限定范围内的其他限定值或其他值。
本领域的技术人员还将容易认识到，当成员以普通的方式组合在一起时，例如在马库什组中，本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，还独立地包括组中的每个成员和主组的所有可能的亚组。
此外，出于各种目的，本发明不仅包括主组，还包括缺乏一个或多个组成员的主组。因此本发明设想明确排除上述组中任意一个或多个成员。相应地，附带条件可适用于任何所公开的类别或实施方案，由此任何一种或多种上述的元件、物质或实施方案可从类似的类别或实施方案中排除，例如，用于明确的否定限制。
术语“分离的”指代一或多个因子、一个或多个细胞，其与在体内与所述一或多个因子、一个或多个细胞有关联的一个或多个因子、细胞或一或多个细胞组分没有关联。
术语“接触”是指触摸、使接触或使紧密靠近或非常靠近的行为，包括在细胞水平或分子水平，例如，导致生理反应、化学反应或物理变化，例如在溶液中、在反应混合物中，在体外或在体内。
本文中使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。这些术语都包含其后代，即任何或所有后续世代。可以理解的是，由于有意或无意的突变，并非所有的后代都是一样的。
“细胞”包括来自脊椎动物例如哺乳动物的细胞或“对象”是脊椎动物例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、农场动物、运动动物和伴侣动物。包含在术语“动物”中的有狗、猫、鱼、沙鼠、豚鼠、仓鼠、马、兔、猪、小鼠、猴(例如猿、大猩猩、黑猩猩或猩猩)、大鼠、绵羊、山羊、牛和鸟。
在一个实施方案中，干细胞、祖细胞或前体细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多能干细胞，和/或多能干细胞(例如多能中胚层前体细胞)。在一个实施方案中，干细胞、祖细胞或前体细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，干细胞包括但不限于：诱导性多能干细胞、脐带血脐带干细胞、间充质干细胞、多能干细胞。在一个实施方案中，干细胞来源于人。在一个实施方案中，干细胞来源于猪。
全能性(亦称全能的)干细胞可分化成胚胎和胚外细胞型。此类细胞可构建完整的活生物体。这些细胞由卵和精细胞融合而产生。通过受精卵细胞的第一次少数分裂产生的细胞也有全能性。多能干细胞是全能性细胞的后代，且可分化成几乎所有细胞，即从三个胚层中的任何一层衍生的细胞。多潜能干细胞可分化成多个细胞类型，但仅是密切相关的细胞家族。寡能干细胞可分化成仅仅少数细胞类型，例如淋巴或骨髓干细胞。单能干细胞可产生仅一种细胞类型，其自身细胞，[4]但具有自我更新特性，从而将其与非干细胞(例如，祖细胞、肌肉干细胞)区分开来。
“扩增”是指不分化情况下的细胞增殖。
“祖细胞”是具有其终末分化后代的部分特征但非所有特征的干细胞分化期间产生的细胞。定义的祖细胞定型为谱系，而不是具体或终末分化的细胞类型。词语“内皮细胞”不仅包括终末分化细胞类型，还包括定型为内皮细胞谱系但并非终末分化的细胞。
“分化因子”是指细胞因子，优选地是诱导谱系定型(lineagecommitment)的生长因子或血管生成因子。
术语“猪(pig)”、“猪(swine)”和“猪(porcine)”可互换使用且是上位术语，指代不考虑性别、大小和品种的同一种类型的动物。还应注意到，术语“猪(pig)”、“猪(swine)”和“猪(porcine)”，例如用人类基因或猪的基因补足的无效的“猪(pig)”、“猪(swine)”和“猪(porcine)”中，“猪(pig)”、“猪(swine)”和“猪(porcine)”可以是胚胎、新生体或成体(包括新生猪和幼猪)。
术语“hand2”和“handii”可互换使用。
本文使用的词语“人源化骨骼肌”、“人源化心肌”或“人源化肌肉”是指猪或其他非人类动物中表达一种以上人类基因和/或蛋白的的细胞或组织。在一个实施方案中，所述表达一种以上人类基因和/或蛋白的猪细胞或组织不表达相应的功能性猪基因和/或蛋白。
基因的“编码区域”由基因编码链的核苷酸残基以及基因的非编码链的核苷酸组成，它们与通过基因转录生成的mrna分子的编码区域分别同源或互补。
“对照”细胞是与测试细胞具有相同细胞类型的细胞。例如，对照细胞可以在测试细胞检查的同时或接近同时进行检查。例如，对照细胞的检查时间还可与测试细胞的检查时间相距较远，且对照细胞的检查结果可被记录，以便记录结果可以与测试细胞检查得出的结果相比较。
本文所用的“有效量”或“治疗有效量”意思是足以产生选定效果的量，例如缓解疾病或病症的症状。当以组合的形式施用化合物的情况下，例如多个化合物，每种化合物的量在当与另一化合物组合施用时可与此化合物单独施用时不同。因此，化合物组合的有效量总体地是指整个组合，尽管每种化合物的实际量可能不同。术语“更有效”是指通过一种治疗对比与之相较的第二种治疗，所选定效果得到了更大程度地缓解。
“编码”意指在多核苷酸中特定核苷酸序列例如基因、cdna或mdna的遗传特性，生物学过程中担当合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列以及由此导致的生物学特性。因此，当对应于基因的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白时，该基因编码蛋白。其核苷酸序列与mrna序列相同并且通常在序列表中提供的编码链，以及用作基因或cdna转录的模板的非编码链，两者都能够称作编码蛋白质或该基因或cdna的其它产物。
“片段(fragment)”或“节段(segment)”是氨基酸序列的一部分，包括至少一个氨基酸，或是核酸序列的一部分，包括至少一个核苷酸。“片段”或“节段”在本文中可互换使用。
如本文所用，“功能性”生物分子是这样形式的生物分子，其显示特征性特性。例如，功能性酶是一种显示特征性催化活性的酶，所述酶通过所述特征性催化活性表征。
本文所用的“同源”意指两聚合分子间(例如，两个核酸分子如两个dna分子或rna分子之间，或两个多肽分子之间)的亚单元序列相似性。当这两个分子中的亚单元位置被同一单体亚单元占据，例如，如果两个dna分子中的每一个的一位置被腺嘌呤占据，则它们在这个位置同源。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数的直接函数，例如，如果两个化合物序列中半数位置同源(如10个亚单元长度聚合物中的5个位置)，那么这两个序列为50％同源；如果90％位置(如10个中9个)匹配或同源，那么两个序列具有90％同源性。举例来说，dna序列3′attgcc5′和3′tatggc具有50％同源性。
如本文所使用，“同源性”与“相同性”同义使用。
两核苷酸或氨基酸序列间的百分比相同性的测量，可利用数学算法来完成。例如，可用于比较两个序列的数学算法是karlin和altschul的算法(1990，proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268)，修改于karlin和altschul(1993，proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877)。该算法被结合到altschul等(1990，j.mol.biol.215:403-410)的nblast和xblast程序中，而且可以由例如具有全球资源定位器的美国生物技术信息中心(ncbi)环球网站点，通过blast工具在ncbi网站上获取。可使用如下参数用nblast程序进行blast核苷酸检索(在ncbi站点称作“blastn”)：缺口罚分＝5；缺口延伸罚分＝2；错配罚分＝3；匹配奖励＝1；期望值10.0；以及字长＝11，以获得与本文所述核酸同源的核苷酸序列。可以使用如下参数用xblast程序(在ncbi站点称为“blastx”)或ncbi“blastp”程序进行blast蛋白质搜索：期望值10.0；blosum62评分矩阵，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对用于比较的目的，可采用altschul等人所著(1997，nucleicacidsres.，25:3389)的gappedblast进行。此外，可以使用psi-blast或phi-blast来进行迭代搜索，其可检测分子之间的远缘关系(id.)和共享共有模式的分子之间的关系。在利用blast、gappedblast、psi-blast、和phi-blast程序时，可以使用各个程序(例如xblast和nblast)的默认参数。
可用类似于如上所描述的技术，在允许或不允许缺口的情况下，确定两条序列间的百分比相同性。在计算百分比相同性中，通常计算准确匹配。
如本文所用的“指导材料”包括出版物、录音、图表或任何其它的表达介质，其能够用于传达试剂盒中本发明组合物的有效性，用于缓解本文所述各种疾病或病症。任选地或可选地，指导材料能够描述一种或多种在哺乳动物的细胞或者组织中减轻疾病或者病症的方法。本发明试剂盒的指导材料可以例如粘贴在装有本发明(或其部分)的容器上或与装有本发明或其部分的容器一起运输。或者，指导材料可以与容器分开单独装运，目的是令接受者协调地使用指导材料和化合物。
本文所用术语“核酸”包括rna以及单链和双链dna和cdna。此外，术语“核酸”、“dna”、“rna”和类似术语还包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯键之外的类似物。例如，本领域已知的在主链中具有肽键而非磷酸二酯键的所谓的“肽核酸”均视为本发明的范围。“核酸”是指任何核酸，不管是包含脱氧核糖核苷还是包含核糖核苷，也不管其连接方式是磷酸二酯键还是其他的修饰过的键，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、桥联氨基磷酸酯、桥联亚甲基膦酸酯、桥联氨基磷酸酯、桥联亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯或砜键以及这些键的组合。术语核酸还具体包括包含五种生物学发生的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、和尿嘧啶)之外的碱基的核酸。本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手末端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向意指5’端方向。以5’端至3’端的方向增加核苷酸至初生的rna转录物意指转录方向。具有与mrna相同序列的dna链称为“编码链”；dna链上位于dna上参照点5’的序列称为“上游序列”；dna链上位于dna上参照点3’的序列称为“下游序列”。
本文所用的术语“核酸构建体”包括编码所需特定基因或基因片断的dna和rna序列，无论通过基因组或合成方法获得。
除非另行指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并版本，且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和rna的核苷酸序列可以包含内含子。
术语“寡核苷酸”典型地意指短的多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列通过dna序列(即a、t、g、c)代表时，这还包括rna序列(即a、u、g、c)，其中“u”代替“t”。
转录激活因子样效应物核酸酶(talen)，是通过将tal效应物dna结合结构域融合到dna切割结构域生成的人工限制酶。这些试剂能实施有效、可编程及特异性的dna切割用以原位基因组编辑。转录激活因子样效应物(tale)是以序列特异性方式结合dna的蛋白。通过将此tale与核酸酶(例如，foki内切酶)融合，制备高度特异性dna剪刀(这些分子可改造成结合任何dna序列)。本文使用的术语talen很宽泛，且包括单体talen，其可切割双链dna，而不需要另一talen的协助。术语talen还用于指代talen对的一个或两个成员，其经过工程化而一起工作，在同一位点割裂dna。一起工作的talen可被称为左-talen和右-talen，指代dna的手性。
一旦talen基因被装配，它们被插入到质粒；质粒进而被用于转染靶细胞，其中基因产物被表达并进入细胞核以接近基因组。talen可用于编辑基因组，通过诱导双链断裂(dsb)和任选地插入货物/预选基因，细胞通过修复机制对其进行响应。以此方式，它们可用于纠正基因组中的突变，所述突变例如导致疾病。
遗传工程，包括基因编辑，可由技术人员可用的任何方法进行实施，例如，通过使用靶向核酸内切酶和同源性导向修复(hdr)、talen、crispr(例如cas9/crispr)、重组酶融合分子、合成猪人工染色体、大范围核酸酶、锌指或基于raav的系统，用于基因编辑(例如敲除期望的靶基因)。此外，可将多种核酸引入细胞，用于敲除目的，用于基因失活(例如干扰rna(shrna，sirna，dsrna，risc，mirna))或表达基因。
体细胞核转移(scnt)是一种从体细胞和卵细胞建立活胚胎的实验室技术。体细胞核移植的过程涉及两种不同的细胞。第一种是雌性配子，称为卵子(卵/卵母细胞)。第二种为体细胞，指代人体的细胞。表皮细胞、脂肪细胞和肝细胞仅是少数实例。供体卵细胞的细胞核被移除并丢弃，使其去编程。体细胞的细胞核也被移除但被保留，去核的体细胞被丢弃。留下的是单个体细胞核和去核卵细胞。通过将体细胞核注入“空”的卵细胞，将这二者融合。被插入卵后，体细胞核通过其宿主卵细胞被重编程。现在包括体细胞的细胞核的卵细胞，通过电击进行刺激，并将开始分裂。卵现在是活的，且能够产生仅包括一个亲本所有必要遗传信息的成体生物体。随之会正常发育，且多次有丝分裂之后，此单个细胞形成胚泡(具有约100个细胞的早期胚胎)，其基因组与原始生物体相同(即克隆)。进而可通过破坏此克隆胚胎而获得干细胞用于治疗性克隆，或在繁殖性克隆的情况下，该克隆胚胎被植入宿主母体(假孕/代孕)用于进一步发育及至足月。
“嵌合体”是指包含遗传不同的细胞的单个生物体。
缺合(nullizygous)生物体携带同一基因的两个突变的或缺失的等位基因。突变/缺失的等位基因都是完全功能丧失或“无效(null)”的等位基因，因此纯合无效和缺合是同义的。
基因敲除(缩写ko)是一种遗传技术，其中使得生物体的两个等位基因不起作用(从生物体中“敲除”)。也称为敲除生物体或简称敲除(knockouts)。此术语还指代建立这样的生物体的过程，如“敲除”基因。此技术基本上与基因敲入意思相反。
术语基因含义广泛，并指代被表达以产生功能性产物的染色体dna。基因具有等位基因。基因编辑可为单等位基因编辑或双等位基因编辑。
描述两种多核苷酸为“可操作连接”是指单链或双链核酸部分包含这两种多核苷酸，它们在所述核酸部分中的排列方式使得两种多核苷酸中的至少一种能够对另一种发挥其特征性的生理学作用。例如，与基因编码区可操作连接的启动子能够促进编码区的转录。
“重组多核苷酸”指具有在自然状况下不连在一起的序列的多核苷酸。可以在合适载体中包含扩增或装配的重组多核苷酸，并且可以将载体用于转化合适的宿主细胞。
重组多核苷酸还可以承担非编码功能(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
包含重组多核苷酸的宿主细胞称作“重组宿主细胞”。在重组宿主细胞中表达的基因(其中此基因包括重组多核苷酸)产生“重组多肽”。
“重组细胞”是包含转基因的细胞。此种细胞可以是真核细胞或原核细胞。转基因细胞还包括但不限于：包括转基因的胚胎干细胞、由衍生自转基因胚胎干细胞(所述细胞包含转基因)的嵌合哺乳动物获得的细胞、从转基因哺乳动物或从其胎儿或胎盘组织获得的细胞，以及包括转基因的原核细胞。
术语“调节”是指刺激或抑制所关注的功能或活性。
本文所用的“有需要的对象”是将从本发明受益的患者、动物、哺乳动物或人。
本文所用的“基本同源的氨基酸序列”包括与参照抗体链的氨基酸序列具有至少大约95％同源性，优选地具有至少大约96％同源性，更优选地具有至少大约97％同源性，甚至更优选地具有至少大约98％同源性，以及最优地具有至少大约99％或更高同源性的氨基酸序列。氨基酸序列的相似性或相同性可以通过采用blastp和tblastn程序计算，这些程序采用blast(基本局部相似性比对搜索工具)2.0.14算法。用于这些程序的默认设置适用于为本发明目的而识别基本相似的氨基酸序列。
“基本同源的氨基酸序列”意思是指与参照核酸序列对应的核酸序列，其中对应序列编码与参照核酸序列编码的肽具有基本相同的结构和功能的肽；例如，仅仅在不显著影响肽功能的氨基酸有变化。优选地，基本相同的核酸序列编码由参照核酸序列编码的肽。基本相似的核酸序列和参照核酸序列之间的相同性的百分比为至少大约50％、65％、75％、85％、95％、99％或更高。核酸序列的基本相同性可以通过比较两序列的序列相同性确定，例如通过物理/化学方法(即杂交)或通过计算机算法的序列比对。确定核苷酸序列和参照核苷酸序列是否基本相似的合适的核酸杂交条件为：50℃下7％十二烷基硫酸钠sds，0.5mnapo4，1mmedta，50℃下在2x的标准柠檬酸盐水(ssc)，0.1％的sds中洗涤；优选地是50℃下7％的sds，0.5mnapo4，1mmedta，50℃下在1x的ssc，0.1％的sds中洗涤；优选地是50℃下7％的sds，0.5mnapo4，1mmedta，50℃下在0.5x的ssc，0.1％的sds中洗涤；更优选地是50℃下7％的sds，0.5mnapo4，1mmedta，65℃下在0.1x的ssc，0.1％的sds中洗涤。用于确定两核酸序列之间基本相似性的合适的计算机算法包括gcs程序包(devereuxetal.，1984nucl.acidsres.12:387)以及blastn或fasta程序(altschuletal.，1990proc.natl.acad.sci.usa.199087:14:5509-13；altschuletal.，j.mol.biol.1990215:3:403-10；altschul等，1997nucleicacidsres.25:3389-3402).这些程序提供的默认设置，适用于为本发明目的而确定核苷酸序列的基本相似性。
“载体”是包括分离的核酸且可用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组成。本技术领域已知多种载体，包括但不限于：线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应视为包括促进核酸转移或递送到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如诸如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的实例包括但不限于：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、重组病毒载体等等。非病毒载体的实例包括但不限于：脂质体、dna的多胺衍生物等等。
本文描述了包括常规分子生物学技术的方法。此类技术为本领域技术人员一般通晓，并在方法学文献中有详细的描述，例如分子克隆：实验指南第二版，卷1-3版，sambrook等，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1989；以及currentprotocolsinmolecularbiology，ed.ausubel等，greenepublishingandwiley-interscience，newyork，1992(定期更新)。化学合成核酸的方法例如在beaucage和carruthers，tetra..letts.22:1859-1862(1981)和matteucci等，j.am.chem.soc.103:3185，1981中有所讨论。
术语“包含”可具有美国专利法所给定的含义并且可意指“包括”等。本文所用“包括”等意指包含，不作限制。
外源器官/组织产生
人源化大型动物模型是再生医学的资源，并将成为个体化人源化猪模型的平台。此策略将转变慢性肌骨骼疾病和移植的当前临床实践范式。猪心脏组织的消融是独特的，因为它不仅旨在在大型动物模型中开发人源化心肌组织，而且因为其是一种规避免疫排斥的新方法，所以可以广泛地应用于外源器官开发策略。
目前，晚期终末期器官衰竭的唯一确定性治疗是移植。数百万患者可以从这种治疗中受益，但由于供体器官可用性有限，所以无法移植。因此，尸体或与活体有关的供体器官严重短缺。此外，器官移植需要终身免疫抑制，这也具有有害的，限制寿命的副作用。本文描述的是在猪中产生的人源化组织，其将作为用于移植的器官的无限来源并为治疗心血管疾病提供范式转换平台(图6)。
强烈的兴趣集中在外源性移植上，最近的技术进步支持了这些策略可以成功的观点。例如，通过胚泡互补方法在小鼠中产生大鼠胰腺(38)。在这些研究中，向用于胰腺发育的主导调节基因pdx1的胚泡突变体注射来自野生型大鼠的多能干细胞(rpsc)(38)。将rpsc-注射的胚泡转移到替代性母鼠中产生了具有由大鼠细胞组成的功能性胰腺的小鼠嵌合体。这些突变体宿主为健康的供体干细胞提供了一个发育的“微环境(niche)”，以增殖和产生供体来源的器官。胚泡互补策略也在啮齿动物产生了例如肾脏和肝脏的器官，以及最近在猪中胰腺(39-41)。后一个使用猪模型的报道支持在猪中开发随后可用于移植或改进疗法的人类患者特异性器官(图6)。
人源化大型动物模型是再生医学的资源，并将成为个体化人源化猪模型的平台。此策略将转变慢性肌骨骼疾病和移植的当前临床实践范式。猪心脏组织的消融是独特的，因为它不仅旨在在大型动物模型中开发人源化心肌组织，而且因为其是一种规避免疫排斥的新方法，所以可以广泛地应用于外源器官开发策略。
使用基因编辑平台，各种发育基因可以突变以产生器官和/或组织缺陷型猪，在其上可以应用胚泡互补以产生外源器官和/或组织。这个系统的效率允许实验测试许多基因。多个调控基因的同时修饰允许调节复杂组织的个体发育。
肌肉疾病/障碍
心脏组织和细胞包括心脏肌肉细胞或心肌细胞(也称为心肌细胞或心脏肌细胞)，其是组成心肌的肌肉细胞(肌细胞)。心血管疾病或心脏疾病包括心脏和血管疾病，其中许多与动脉粥样硬化有关。疾病/障碍包括但不限于心脏病发作、中风、心力衰竭、心律失常和心脏瓣膜问题。
产生精确基因敲除(ko)猪以产生用于器官生产的人-猪嵌合体
通过使用位点特异性核酸酶，在大型动物基因组中导入精确遗传改变的效率提高了超过100000倍。使用基于talen的平台以通过位点特异性核酸酶裂解的双链断裂的非同源末端连接(nhej)灭活基因说明在家畜中分别以50％和20％的比例的高效杂合和双等位基因敲除(27)。利用基因编辑平台，可以对各种发育基因进行突变，产生器官缺陷型猪，在此基础上，胚泡互补可以用于外源器官的产生。这个系统的效率允许实验测试许多基因。
etv2敲除的猪胚胎缺乏内皮谱系
先前的研究已经证明nkx2-5是etv2基因的上游调节因子，etv2是小鼠内皮谱系的主要调节因子，因为缺乏etv2的胚胎在没有血管系统下在约e9.5处是致死的(8，10，12，13)。为了检查etv2在猪中的作用，在猪成纤维细胞中使用基因侧翼的两个talen对去除整个etv2编码序列(图7a)。该过程在纯合基因去除方面效率为15％；对于etv2基因的缺失，79/528个基因分型克隆是纯合的(图7b)。etv2纯合敲除的成纤维细胞克隆用于核克隆(体细胞核转移；scnt)以产生etv2无效胚胎，其被转移至替代母猪。克隆效率为29％，高于平均20％的成功率。收获胚胎并在e18.0处分析(图8)。在这个阶段，wt胚胎血管化，在尿囊中有发育良好的血管丛(图8a，c)。相比之下，etv2ko的生长明显受阻(图7b)，这些胚胎缺乏心内膜/内皮谱系(图8d，f，h)。etv2ko胚胎缺乏在wt胚胎中明显发育的主静脉、背主动脉和心内膜(图8e-h)。结果反映了小鼠和猪表型的相似性，并且表明etv2的功能在这些物种之间是保守的。此外，这些数据表明，可以将多个突变导入猪基因组以支持嵌合器官的生长，所述嵌合器官将在多于一种细胞类型中被人源化。
nkx2-5、handii和tbx5
将nkx2-5、handii和tbx5突变以产生心肌谱系缺陷猪胚胎(nkx2-5/handii/tbx5无效猪胚胎)。对nkx2-5/handii/tbx5进行多重基因编辑创建了容许性微环境，其利用具有多能能力的人细胞重建心脏细胞，产生人源化的心脏/心脏组织和/或心肌。细节见实例2。
人源化的大型动物模型将成为再生医学的重要资源，并将作为制造个体化器官的平台。这策略可以改变肌肉疾病和移植的目前临床实践范式。迄今为止，在小鼠与大鼠之间(27，29)以及猪与猪之间(31)进行了器官的外源性移植，没有在大型动物模型中成功开发人源化器官的报道。在此通过引用并入的是美国临时申请序列号62/247,092；62/247096；和62/247,122。
以下实施例旨在进一步说明本发明的某些特别优选的实施方案，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：nkx2-5、handii和tbx5作为心脏发生的调节剂
心脏发育是一个复杂的高度协调的事件，其包括心脏祖细胞的特化、增殖、迁移和分化，这些祖细胞变成电耦合并最终形成功能性合胞体(图1)。这些心脏发生阶段是由转录网络控制的，使用基因破坏技术，这些网络被证明是心脏形成和生存所必需的(6，8，9，22-26)(表1)。
nkx2-5是果蝇同源域蛋白tinman(csx)的脊椎动物同系物。tinman突变导致苍蝇没有心脏形成(35)。nkx2-5是心脏谱系中表达的最早的转录因子之一。nkx2-5的靶向破坏在大约e9.5导致心脏形态发生紊乱，严重的生长迟缓和胚胎致死(22，24)。nkx2-5相互作用因子之一是t-box转录因子tbx5，它们一起形成复合物并反式激活心脏基因表达(36)。小鼠中tbx5的全局缺失导致截止e10.5的受干扰的心脏形态发生(严重的心房和心室发育不全)以及胚胎致死(25)。甚至单倍体不足的小鼠(tbx5+/-)表现出严重的先天性心脏和前肢畸形，并且已被证明导致holt-oram综合症患者的缺陷(25)。handii(dhand)是bhlh转录因子，其也被证明是心脏形态发生所需要的。handii突变胚胎在胚胎发生早期是致死性的，并具有严重的右心室发育不全和主动脉弓缺陷(23)。而且，缺乏nkx2-5和handii的小鼠表现出心室发育不全，并且只有一个房室(图2)(26)。
猪nkx2-5、handii和tbx5基因的多重基因敲除
为了明确心脏祖细胞中的nkx2-5转录调控级联，利用工程化的敲除和转基因小鼠模型来明确指导来自干细胞群的心脏谱系特化的分子网络(8，9，37)。为了在心脏发生过程中明确nkx2-5介导的网络，检查正发育的nkx2-5无效心脏(9)中cpc群体的分子标记。将6kbnkx2-5增强子-eyfp转基因小鼠模型组合地交配到nkx2-5无效背景中以指导nkx2-5无效cpc中的eyfp表达。使用facs，从阶段(年龄)匹配的个体胚胎分离wt和nkx2-5无效cpc，分离rna并扩增，并且使用全基因组分析研究相应分子程序。这策略明确了下游nkx2-5靶基因并揭示了nkx2-5在心脏发生、内皮/心内膜谱系特化(诱导etv2)和血液形成抑制中的作用(图5f)。研究还鉴别了包括nkx2-5、handii和tbx5的早期cpc群体的分子标记(37)。
猪中的多重同源依赖性重组(hdr)
如前所述(见上文)，使用talen指定的hdr技术(28)开发了将双等位基因敲除(ko)引入猪成纤维细胞的方法。这些新兴技术被进一步用于执行多重基因ko(即与nkx2-5/handii/tbx5突变和其它器官特异性因子一起构建etv2基因敲除)。为了验证该技术用于多重双等位基因基因编辑，使用各自产生超过20％hdr/位点的多对talen，并且以三种组合同时共转染这些对，每种组合靶向猪基因组中五个分离的基因(28)。
使用talen刺激的hdr和nhej突变(本文讨论)的组合产生nkx2-5/handii/tbx5突变的猪胚胎成纤维细胞。每个基因被靶向于其保守的转录因子/dna结合结构域之内或之前(图3a)。这策略优于靶向基因的转录起始位点附近以减少通过在下游aug处起始产生功能性肽的机会。对于tbx5和nkx2-5，提供了同源模板以产生新的框内终止密码子，用于rflp筛选的限制性位点，以及在终止密码子之后的另外五个碱基插入，以防止功能性通读蛋白。handiitalen效率为约10％，因此在没有同源模板下进行试验，以避免干扰tbx5和nkx2-5hdr，在猪成纤维细胞中使用多重hdr观察到的现象(未公开的数据)。使用三层方法鉴定三重突变体。首先，通过rflp分析筛选集落的tbx5和nkx2-5的双敲除(图3b)。在480个集落的第一轮中，33个(7％)被发现是双敲除的。在双基因敲除中，鉴定到4个(总体上1％)也是handii突变的(图3c)。一次性可靠地生产三重无效猪成纤维细胞系的能力是独一无二的，也是一种变革性的技术。
在三重敲除猪胚胎中没有心脏
实验已经靶向许多转录因子(即mesp1、gata4、nkx2-5、handii、tbx5等)，其产生被干扰的心脏发生并为先天性心脏病的研究和治疗提供了新的模型。本文证明，作为概念验证，成功靶向和产生nkx2-5/handii/tbx5基因缺失纯合的克隆。三重敲除成纤维细胞克隆用于核克隆(scnt)以产生nkx2-5/handii/tbx5无效猪胚胎，其被转移至替代母猪。收获胚胎并在e18处分析，这相当于小鼠的e11。在e18处，与野生型对照猪胚胎相比，三重敲除猪胚胎具有血管系统、骨骼肌和血液，但缺少心脏(最小的gata4免疫组织化学阳性心肌细胞)(参见图4)。
实施例2-人干细胞整合进猪孤雌生殖体的内细胞团(icm)(不受精而电激活胚胎发育)
人类干细胞/祖细胞群体可以贡献和参与猪孤雌生殖体嵌合体。将比较人诱导性多能干细胞(hipsc)、人间充质干细胞(hmsc)、人多能干细胞和人心脏祖细胞(hcpc)对猪孤雌生殖体发育的贡献的能力。使用猪单性生殖胚泡的数据(30)支持hipsc被整合到孤雌生殖体内细胞团中的信念。试验将检测hipsc系、hmsc系、人多能干细胞和hcpc及其使用猪单性生殖胚胎在体外和体内成功产生人-猪嵌合体的能力。这些研究将检测人干细胞群体的增殖能力，细胞凋亡和发育进程用于体外分析。体内分析将利用使用人类特异性抗血清的免疫组织化学与植入后孤雌生殖体的原位杂交。
评估了hipsc整合到猪胚泡中并参与胚胎发育的能力。使用电刺激卵母细胞产生猪单性生殖胚泡(42)。激活6天后，将9-12个dii-或edu(24小时)标记的hipsc注射到囊胚腔内。允许胚泡在培养中恢复两天，然后成像。在90％的猪胚泡的icm中观察到标记的hipsc(图9a，b，显示了代表性图像)。使用人核抗原特异性抗体(hna)的免疫组织化学与dii分布的比较显示hna抗体检测注射的人干细胞(图9a，箭头)。用edu标记的hipsc注射的胚泡在收获前用brdu进一步脉冲1小时以检测增殖中的细胞。用edu双标记显示注射48小时后注射的人干细胞继续增殖(图9b，箭头)。这些结果表明人干细胞并入猪胚泡的icm中，并嵌合胚泡发育进展到准备植入子宫的孵化阶段。
这些结果支持所提出的策略的基本原理和可行性，并提供快速测定来检测人类干细胞群是否相容和/或有助于icm发育。此外，单性生殖胚泡的植入提供了高通量的方法来检测人类干细胞进入发育中的胚胎的整合和分化。这策略的一个显著优势是猪卵母细胞作为食品生产的双产物可以大量获得，并且可以定期大量产生单性生殖胚胎。应该注意的是，单性生殖胚胎不能存活超过8周，因此否定了无意中生出不希望的人-猪嵌合体的担忧。
人类干细胞群体增殖并且有助于形成人-猪孤雌生殖体嵌合体。人类间充质干细胞(hmsc)(46)和心脏祖细胞(hcpc)(47)在发育中的猪中对胚胎谱系贡献的能力将受到更多的限制。此外，hipsc和猪干细胞群可能对胚胎谱系有同等贡献。
人干/祖细胞群将拯救nkx2-5/handii/tbx5突变的猪胚胎。hipsc将是nkx2-5/handii/tbx5突变的早期胚胎中每个心脏细胞的祖细胞。
利用talen介导的技术(27，28)，产生了etv2突变的猪胚胎，该胚胎不能存活并且缺乏内皮谱系。使用talen介导的技术产生nkx2-5/handii/tbx5突变体成纤维细胞，数据表明这些突变猪胚胎缺乏心脏。这些数据进一步支持人类干细胞(人类脐带血干细胞和人类ipsc)可以整合到猪孤雌生殖体的icm中的观点。在人-猪互补研究中，将检测e17人干细胞-猪嵌合体中人干细胞的植入。
实施例3
材料和方法
talen设计和产生
使用在线工具“taleffectornucleotidetargeter2.0”鉴定候选talen靶dna序列和rvd序列。然后，使用rciscript-goldytalen(addgeneid38143)作为最终目标载体(carlson2012)，按照goldengateassembly方案构建talendna转染或体外talenmrna转录的质粒。如前所述(carlson，2009)，使用qiaprepspinminiprep试剂盒(qiagen)制备的组装的rciscript载体通过saci线性化，以用作模板使用mmessage
组织培养和转染
将猪成纤维细胞在补充有10％胎牛血清、100i.u./ml青霉素和链霉素、2mml-谷氨酰胺和10mmhepes的dmem中在5％co2下保持在37或30摄氏度(如所示)。neon转染系统(lifetechnologies)用来提供talen和hdr寡核苷酸。以70％-100％汇合的低传代ossabaw或landrace猪成纤维细胞以1:2分离，第二天以70-80％汇合收获。将约600000个细胞重悬于具有mrnatalen和hdr寡核苷酸的“r”缓冲液(lifetechnologies)中，并使用以下参数在100ul电极上进行电穿孔：输入电压：1800v；脉冲宽度：20ms；脉冲数：1。每次转染包括0.1-4μg的talenmrna和0.1-0.4nmol的感兴趣的特定基因的hdr寡核苷酸。将转染的细胞在30摄氏度下培养2或3天，然后分析基因编辑效率并涂布用于形成集落。
稀释克隆法
转染两或三天后，将50至250个细胞接种到10cm培养皿中并培养直到单个集落直径达到约5mm。加入8ml的tryple和dmem培养基(lifetechnologies)的1：4(体积/体积)混合物并吸出集落，转移到48孔培养皿和重复96孔培养皿的孔中并在相同条件下培养。收集达到汇合的集落，并用于冷冻保存和用于基因分型的样品制备。
样品制备
第3天和第10天从6孔培养皿的孔中收集转染的细胞群体，并将10-30％重悬于50μl的1xpcr相容的裂解缓冲液中：10mmtris-clph8.0、2mmedta、0.45％trytonx-100(体积/体积)、新鲜补充200μg/ml蛋白酶k的0.45％tween-20(体积/体积)。使用以下程序在热循环仪中处理裂解物：55℃下60分钟，95℃下15分钟。
分析基因编辑
使用accustarttmtaqdna聚合酶hifi(quantabiosciences)根据制造商的推荐用1μl细胞裂解物进行位于预期位点侧翼的pcr。使用surveyor突变检测试剂盒(transgenomic)，根据制造商推荐使用10ul如上所述的pcr产物分析群体中的突变频率。surveyor反应在10％tbe聚丙烯酰胺凝胶上解析并通过溴化乙锭染色显现。使用imagej进行带的密度测量；并且如(guschin等，2010)中所述计算surveyor反应的突变率。针对hdr等位基因的存在，使用引物筛选单个集落。通过用hindiii消化得到的pcr扩增子来进行pcr产物的限制性片段长度多态性分析(rflp)，以确定等位基因中的一个、两者或没一个是否被切割并因此含有hdr等位基因。产物在琼脂糖凝胶上解析。
猪序列
nkx2-5:enssscg00000016984
tbx5:enssscg00000009867
hand2:enssscg00000009703
猪基因:nkx2-5基因id:enssscg00000016984
描述:nk2homeobox5[源:hgncsymbol；acc:hgnc:2488]
同名:csx,csx1,nkx2.5,nkx2e,nkx4-1
位置:染色体16:55,400,561-55,403,626正链.
insdc坐标:染色体:sscrofa10.2:cm000827.4:55400561:55403626:1
关于该基因:该基因具有一个转录物(剪接变体),37个直系同源物,15旁系同源物且是1ensembl蛋白家族的成员
猪nkx2-5基因组序列id:cu928102
..........gtccccctcctccggcctggtcccgcctctcctgccccttgcgccccgcattacctgccgcctggccacatcccgagctggaaggcgggtgcgcgggcgcgcagcgggcaccatgcagggaggctgccagggaccgtgggcagcgccgctctctgccgcccacctggcgctgtgagacgcgcgctgccaccatgttccccagccccgcgctcacgcccacgccgttctcggtcaaagacatcttgaacctggagcaacagcagcgcagcctggccgccggggagctctccgcgcgcttggaggccaccctggcgcccgcctcctgcatgctggccgccttcaagcccgaggcctacgcggggccggaggccgcagcgcccggcctctccgagctgcgcgccgagctgggccccgcgccctcaccagccaagtgcgcgccctccttctcagccgcccccgccttctacccgcgtgcctatggcgaccccgaccccgccaaggaccctcgagccgataagaaag
gtgaggaggaaacacaagcttcttc..........tctgcctctctgttcccccccgcagagctgtgcgcgctgcagaaggcggtggagctggagaagccagaggcggacagcgccgagagacctcgggcgcgacgacgaaggaagccgcgcgtgctcttttcgcaggcacaggtctacgagctggagcgacgcttcaagcagcagcggtacctgtcggctcccgagcgtgaccagttggccagcgtgctgaagctcacgtccacgcaggtcaagatctggttccagaaccggcgctacaagtgcaagcggcaacggcaggaccagactctggagctagtggggctgcccccgcccccgccgccgccggcccgcaggatcgcggtgccagtgctggtgcgcgatggcaagccttgcctcggggactccgcgccctacgcgccagcctacggcgtgggcctcaacgcctacggctataacgcctaccccgcctacccgggttacggtggcgcggcctgcagccctggctacagctgcaccgctgcgtacccagccgggccgcccccggcgcagtcggctacggccgccgccaataacaacttcgtgaacttcggcgtcggggacttaaacgcggtgcagagcccggggattccgcagggcaactcgggagtgtccacgctgcacggtatccgagcctggtagggaaggggcctgtctggggcacctctaaagaggggcactaactatcggggagagggagggctcccgatacgatcctgagtccctcagatgtcacattgactcccacggaggcctcggagctttttccgtccggtgcgcctttatccccacgcgcgggagagttcgtggcagaggttacgcagcttggggtgagtgatcccgcagcccggtgccttagccgtcgccccgggagtgccctccaagcgcccacgggcatccccaatcggctgacaccggccagttgggaccgggagcccgagcccaggcgtgccaggcttaagatggggccgcctttccccgatcctgggcccggtgcccggggcccttgctgccttgccgctgccctccccacacccgtatttatgtttttacttgtttctgtaagaaatgagaatctccttcccattaaagagagtgcgctga
tccgcctgtgtgcttctttcagcttgctgtgcttcagaaactgaaatttt..........(seqidno:1)
编码:
外显子/内含子
翻译的序列
侧翼序列
内含子序列
utr
猪nkx2-5mrna序列:idensssct00000018494
atgttccccagccccgcgctcacgcccacgccgttctcg
gtcaaagacatcttgaacctggagcaacagcagcgcagcctggccgccggggagctctccgcgcgcttggaggccaccctggcgcccgcctcctgcatgctggccgccttcaagcccgaggcctacgcggggccggaggccgcagcgcccggcctctccgagctgcgcgccgagctgggccccgcgccctcaccagccaagtgcgcgccctccttctcagccgcccccgccttctacccgcgtgcctatggcgaccccgaccccgccaaggaccctcgagccgataagaaag
agctgtgcgcgctgcagaaggcggtggagctggagaagccagaggcggacagcgccgagagacctcgggcgcgacgacgaaggaagccgcgcgtgctcttttcgcaggcacaggtctacgagctggagcgacgcttcaagcagcagcggtacctgtcggctcccgagcgtgaccagttggccagcgtgctgaagctcacgtccacgcaggtcaagatctggttccagaaccggcgctacaagtgcaagcggcaacggcaggaccagactctggagctagtggggctgcccccgcccccgccgccgccggcccgcaggatcgcggtgccagtgctggtgcgcgatggcaagccttgcctcggggactccgcgccctacgcgccagcctacggcgtgggcctcaacgcctacggctataacgcctaccccgcctacccgggttacggtggcgcggcctgcagccctggctacagctgcaccgctgcgtacccagccgggccgcccccggcgcagtcggctacggccgccgccaataacaacttcgtgaacttcggcgtcggggacttaaacgcggtgcagagcccggggattccgcagggcaactcgggagtgtccacgctgcacggtatccgagcctggtag(seqidno:2)
猪nkx2-5蛋白序列:f1sjy9-1
猪基因:hand2enssscg00000009703(ensenble)
描述；heartandneuralcrestderivativesexpressed2[源:hgncsymbol；acc:hgnc:4808]
同名；bhlha26,dhand,hed,thing2
位置；染色体14:17,528,447-17,531,529反链.
insdc坐标；染色体:sscrofa10.2:cm000825.4:17528447:17531529:1
关于该基因:该基因具有1个转录物(剪接变体),54个直系同源物,9个旁系同源物且是1ensembl蛋白家族成员.
猪hand2基因组序列id:cu468996
猪hand2-201mrnaid:ensssct00000010638(ensemble)xm_005670479(ncbi,预测的)
猪hand2蛋白(预测的)xp_005670536.1
uniprotid:f1rj02-1
猪基因:tbx5geneid:enssscg00000009867
猪tbx5基因组序列id:cu468413
描述:t-box5[source:hgncsymbol；acc:hgnc:11604]
同名:hos
位置:染色体14:40,211,210-40,259,321正链.
insdc坐标:染色体:sscrofa10.2:cm000825.4:40211210:40259321:1
关于该基因:该基因具有1个转录物(剪接变体),61个直系同源物,8个旁系同源物且是1ensembl蛋白家族的成员.
猪tbx5基因id:enssscg00000009867
猪tbx5mrna预测的序列
猪tbx5蛋白id:firkd2(ensembl,预测的)
>tr|f1rkd2|f1rkd2_piguncharacterizedproteinos＝susscrofagn＝tbx5pe＝4sv＝2madgdegfglahtplepdskdlpcdskpesglgapskspsspqaaftqqgmegikvflhe
relwlkfhevgtemiitkagrrmfpsykvkvtglnpktkyillmdivpaddhrykfadnk
wsvtgkaepampgrlyvhpdspatgahwmrqlvsfqklkltnnhldpfghiilnsmhkyq
prlhivkadenngfgskntafcthvfpetafiavtsyqnhkitqlkiennpfakgfrgsd
dmelhrmsrmqskeypvvprstvrqkvasnhspfssepralstssnlgsqyqcengvsgp
sqdllpppnpyplpqehsqiyhctkrkadeecsttehpykkpymetspseedpfyragyp
qqqglgasyrtesaqrqacmyassappsepvpslediscntwpsmpsyssctvttvqpmd
rlpyqhfsahftsgplvprlagmanhgspqlgegmfqhqtsvahqpvvrqcgpqtglqsp
gslqaseflyshgvprtlsphqyhsavhgvgmvpewsdns(seqidno:8)
/db_xref＝"geneid:100522280"(ncbientry,predicted)
/translation＝"madgdegfglahtplepdskdlpcdskpesglgapskspsspqa
aftqqgmegikvflherelwlkfhevgtemiitkagrrmfpsykvkvtglnpktkyil
lmdivpaddhrykfadnkwsvtgkaepampgrlyvhpdspatgahwmrqlvsfqklkl
tnnhldpfghiilnsmhkyqprlhivkadenngfgskntafcthvfpetafiavtsyq
nhkitqlkiennpfakgfrgsddmelhrmsrmqskeypvvprstvrqkvasnhspfss
epralstssnlgsqyqcengvsgpsqdllpppnpyplpqehsqiyhctkrkdeecstt
ehpykkpymetspseedpfyragypqqqglgasyrtesaqrqacmyassappsepvps
lediscntwpsmpsyssctvttvqpmdrlpyqhfsahftsgplvprlagmanhgspql
gegmfqhqtsvahqpvvrqcgpqtglqspgslqaseflyshgvprtlsphqyhsavhg
vgmvpewsdns"(seqidno:9)
人nk2转录因子相关,基因座5(果蝇),mrna(cdna克隆mgc:34495image:5225103),完整cds人nkx2-5基因信息:genbank:bc025711.1
蛋白序列信息
人nkx2-5蛋白序列
"mfpspaltptpfsvkdilnleqqqrslaaagelsarleatlaps
scmlaafkpeayagpeaaapglpelraelgrapspakcasafpaapafypraysdpdp
akdpraekkelcalqkavelekteadnaerprarrrrkprvlfsqaqvyelerrfkqq
rylsaperdqlasvlkltstqvkiwfqnrrykckrqrqdqtlelvglppppppparri
avpvlvrdgkpclgdsapyapaygvglnpygynaypaypgyggaacspgysctaaypa
gpspaqpataaannnfvnfgvgdlnavqspgipqsnsgvstlhgiraw"(seqidno:10)人nkx2-5mrna序列
人heartandneuralcrestderivativesexpressed2(hand2)mrna,完整cdsgenbank:fj226608.1
人hand2基因信息
人hand2mrna信息
人hand2蛋白信息
/product＝"heartandneuralcrestderivativesexpressed2"
/protein_id＝"aci42790.1"/db_xref＝"gi:209170694"
/translation＝"mslvggfphhpvvhhegypfaaaaaaaaaaaasrcsheenpyfh
gwlighpemsppdysmalsyspeyasgaagldhshyggvppgagppglggprpvkrrg
tanrkerrrtqsinsafaelrecipnvpadtklskiktlrlatsyiaylmdllakddq
ngeaeafkaeikktdvkeekrkkelneilkstvssndkktkgrtgwpqhvwalelkq"(seqidno:13)
人t-box5,mrna(cdna克隆mgc:35581image:5204163),完整cds
genbank:bc027942.1
人tbx5基因信息:
人tbx5mrna信息:
人tbx5蛋白信息
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