本文提供药物组合，包括(a)α-同种型特异性pi3k抑制剂和(b)mdm2抑制剂和可任选的(c)bcl-2抑制剂；含有其的药物组合物；使用这类组合和组合物治疗或预防病症的方法，病症中抑制α-同种型特异性pi3k抑制剂和mdm2抑制剂是有益的，如癌症。
发明背景
磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)包括脂质激酶家族，其催化磷酸转移到肌醇脂质的d-3'位以生成磷脂酰肌醇-3-磷酸(pip)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(pip2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(pip3)，其进而用作信号级联的第二信使，这是通过使含普列克底物蛋白同源区、fyve、phox和其它磷脂结合域的蛋白停靠到通常位于质膜上的多种信号复合体内(vanhaesebroeck等,annu.rev.biochem70:535(2001)；katso等,annu.rev.celldev.biol.17:615(2001))。在2种1类pi3k中，1a类pi3k是由催化性p110亚基(α,β,δ同种型)构成的异二聚体，该亚基组成型连接调节亚基，调节亚基可以是p85α,p55α,p50α,p85β或p55γ。1b类亚类有一个家族成员，即由催化性p110γ亚基与2个调节亚基p101或p84之一相连而构成的异二聚体(fruman等,annurev.biochem.67:481(1998)；suire等,curr.biol.15:566(2005))。p85/55/50亚基的模块结构域包括src同源(sh2)结构域，其结合活化受体和胞质酪氨酸激酶上特定序列环境中的磷酸酪氨酸残基，引起1a类pi3k活化和定位。1b类pi3k通过g蛋白偶联受体直接活化，该受体结合肽与非肽配体的多样性库(stephens等,cell89:105(1997)；katso等,annu.rev.celldev.biol.17:615-675(2001))。因此，i类pi3k的所得磷脂产物连接上游受体与下游细胞活性，包括增殖、存活、趋化性、细胞运输、运动性、代谢、炎症和过敏反应、转录和翻译(cantley等,cell64:281(1991)；escobedo和williams,nature335:85(1988)；fantl等,cell69:413(1992))。
许多情况下，pip2和pip3招募akt到质膜，在该处其用作对生长和存活重要的许多胞内信号通路的节点，akt是病毒癌基因v-akt的人同源物产物(fantl等,cell69:413-423(1992)；bader等,naturerev.cancer5:921(2005)；vivanco和sawyer,naturerev.cancer2:489(2002))。pi3k调节异常通常经akt活化增加存活，是人类癌症的最普遍事件之一且显示在多个水平出现。肿瘤抑制基因pten使磷酸肌醇在肌醇环3'位脱磷酸并因而拮抗pi3k活性，该基因在多个肿瘤中功能性缺失。其它肿瘤中，p110α同种型pik3ca和akt的基因扩增，并已在数个人类癌症中证明其基因产物的蛋白表达增加。
此外，用于上调p85-p110复合体的p85α的突变和易位已在人类癌症中得到描述。最后，激活下游信号通路的pik3ca的体细胞错义突变以显著频率在多种人类癌症中描述(kang等,proc.natl.acad.sci.usa102:802(2005)；samuels等,science304:554(2004)；samuels等,cancercell7:561-573(2005))。这些观察显示磷脂酰肌醇3-激酶以及此信号通路的上游和下游组分的失调是与人类癌症和增生性疾病相关的最常见失调之一(parsons等,nature436:792(2005)；hennessey等,naturerev.drugdisc.4:988-1004(2005))。
已发现下面给出的式(i)的2-甲酰胺环氨基尿素衍生物具有有利的药理性质，并抑制例如pi3k(磷脂酰肌醇3-激酶)。具体地，相对于β和/或δ和/或γ亚型，这些化合物优选显示对pi3kα的选择性提高。由此，式(i)化合物适合例如用于治疗依赖于pi3激酶的疾病(尤其是pi3kα，如显示过表达或扩增pi3kα或者pik3ca体细胞突变的那些)，特别是增生性疾病如肿瘤疾病和白血病。
此外，这些化合物优选显示代谢稳定性提高并因而清除率降低，产生改善的药代动力学分布。
许多癌症尤其是携带扩增的mdm2、pik3ca突变和/或pik3ca过表达的那些，适合用例如mdm2抑制剂治疗。然而，某些情况下，所述癌症获得对选定疗法的抗性并最终变得难于治疗。
尽管就癌症患者而言有许多治疗选择，仍需要有效和安全的治疗剂以及需要其优先用于联合疗法。具体地，需要有效的治疗癌症方法，特别是对当前疗法而言有抗性和/或难治的那些癌症。
技术实现要素：
本文提供药物组合，包括(a)α-同种型特异性pi3k抑制剂和(b)mdm2抑制剂和可任选的(c)bcl-2抑制剂。具有式(i)结构的化合物或其药学上可接受盐和(b)mdm2抑制剂和可任选的(c)bcl-2抑制剂的组合在本文称为“本发明组合”。
一方面，本文提供药物组合，包括：
(a)具有式(i)结构的化合物
(本文也称为“化合物(i)”、“化合物a”或“byl719”)
或其药学上可接受盐，和
(b)mdm2抑制剂。
在一个实施方式中，所述mdm2抑制剂选自下组：
具有式(ii)结构的化合物
具有式(iii)结构的化合物
和其药学上可接受盐。
在一个实施方式中，所述mdm2抑制剂是具有式(ii)结构的化合物或其药学上可接受盐。
在另一个实施方式中，所述mdm2抑制剂是具有式(iii)结构的化合物或其药学上可接受盐。
在一个实施方式中，所述具有式(i)结构的化合物和mdm2抑制剂在同一制剂中。
在另一个实施方式中，所述具有式(i)结构的化合物和mdm2抑制剂在分开的制剂中。
在另一个实施方式中，所述药物组合用于同时或依序给药。
在一个实施方式中，所述药物组合还包括bcl-2抑制剂。
在另一个实施方式中，所述bcl-2抑制剂选自4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-n-[[4-[[(1r)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺)或navitoclax；四卡星a；抗霉素；棉子酚；obatoclax；2-氨基-6-溴-4(s)-[1(s)-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基]-4h-1-苯并吡喃-3-羧酸乙酯；奥利默森；bakbh3肽；(-)-棉子酚乙酸；和4-[4-[(4'-氯[1,1'-联苯]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-n-[[4-[[(1r)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺,和其药学上可接受盐。
在另一个实施方式中，所述bcl-2抑制剂是navitoclax。
在一个实施方式中，所述具有式(i)结构的化合物、mdm2抑制剂和bcl-2抑制剂在同一制剂中。
在另一个实施方式中，所述具有式(i)结构的化合物、mdm2抑制剂和bcl-2抑制剂在2种或更多分开的制剂中。
在一个实施方式中，所述组合(还包括bcl-2抑制剂)用于同时或依序给药。
另一方面，本文提供在需要的对象中治疗或预防癌症的方法，包括向对象给予治疗有效量的本文所公开药物组合。
在一个实施方式中，所述癌症是实体瘤。
在另一个实施方式中，所述癌症选自以下的良性或恶性肿瘤：肺(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、支气管、前列腺、乳腺(包括散发性乳腺癌和考登病患者)、胰腺、胃肠道、结肠、直肠、结肠癌、结直肠癌、甲状腺、肝、胆道、肝内胆管、肝细胞、肾上腺、胃、胃部、胶质瘤、成胶质细胞瘤、子宫内膜、肾、肾盂、膀胱、子宫、宫颈、阴道、卵巢、多发性骨髓瘤、食管、颈或头、脑、口腔和咽、喉、小肠、黑素瘤、结肠绒毛腺瘤、肉瘤(包括软组织肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤或骨癌如骨肉瘤)、瘤形成、上皮特征性肿瘤、乳腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光化性角化病、红细胞增多、原发性血小板增多症、白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)、髓样化生性骨髓纤维化、瓦尔登斯特伦氏病。
在另一个实施方式中，所述癌症是结直肠癌、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤或鳞状细胞癌。
在一个实施方式中，所述癌症表征是braf突变、kras突变、扩增mdm2、pik3ca突变和pik3ca过表达中的一个或多个。在一个实施方式中，所述癌症表征是扩增mdm2、pik3ca突变和pik3ca过表达中一个或多个。
在另一个实施方式中，所述癌症对mdm2抑制剂治疗而言有抗性或难治。
在另一个实施方式中，所述癌症对mdm2抑制剂治疗而言有抗性或难治，其中所述mdm2抑制剂选自具有式(ii)结构的化合物、具有式(iii)结构的化合物，和其药学上可接受盐。
在一个实施方式中，本文提供的任何药物组合用于治疗或预防癌症。
在另一个实施方式中，本文提供的任何药物组合用于制备治疗或预防癌症的药物。
一方面，本文提供本文所公开任何一种药物组合在制造治疗或预防癌症药物中的应用。
另一方面，本文提供本文所公开任何一种药物组合在治疗或预防癌症中的应用。
一方面，本文提供含药物组合物，包括：
(a)具有式(i)结构的化合物
或其药学上可接受盐，和
(b)mdm2抑制剂。
在药物组合物的一个实施方式中，所述mdm2抑制剂选自具有式(ii)结构的化合物、具有式(iii)结构的化合物和其药学上可接受盐。
在一个实施方式中，所述药物组合还包括bcl-2抑制剂。
在另一个实施方式中，所述bcl-2抑制剂选自4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-n-[[4-[[(1r)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺)或navitoclax；四卡星a；抗霉素；棉子酚；obatoclax；2-氨基-6-溴-4(s)-[1(s)-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基]-4h-1-苯并吡喃-3-羧酸乙酯；奥利默森；bakbh3肽；(-)-棉子酚乙酸；和4-[4-[(4'-氯[1,1'-联苯]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-n-[[4-[[(1r)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺,和其药学上可接受盐。
在另一个实施方式中，所述bcl-2抑制剂是navitoclax。
在一个实施方式中，本文提供的药物组合物还包括一种或多种赋形剂。
附图简要说明
图1显示化合物a(也称为byl719)和化合物b以及化合物a与化合物b组合在5个tp53野生型结直肠癌细胞系中的剂量-反应曲线。x轴表示log10(处理稀释)；y轴表示处理后相对于dmso的细胞计数。强虚线表示处理开始前的细胞数(‘基线’)。
图2显示化合物a和化合物b及化合物a与化合物b组合在5个tp53野生型结直肠癌细胞系中且在24小时、48小时和72小时后(不同色度的灰色)的最大半胱天冬酶3/7诱导。x轴表示处理；y轴表示各处理所见的最大半胱天冬酶3/7诱导(％细胞)。
图3显示化合物a、化合物b、navitoclax(c或abt-263)、a+b、a+c、b+c和a+b+c在5个tp53野生型结直肠癌细胞系中的剂量-反应曲线。x轴表示log10(处理稀释)；y轴表示处理后相对于dmso的细胞计数。强虚线表示处理开始前的细胞数(‘基线’)。
图4显示化合物a、化合物b、navitoclax(化合物c或abt-263)、a+b、a+c、b+c和a+b+c在5个tp53野生型结直肠癌细胞系中且在24小时、48小时和72小时后(不同色度的灰色)的最大半胱天冬酶3/7诱导。x轴表示处理；y轴表示各处理所见的最大半胱天冬酶3/7诱导(％细胞)。
发明详述
本文提供药物组合，包括α-同种型特异性pi3k抑制剂、mdm2抑制剂和可任选的bcl-2抑制剂。特别地，本文提供药物组合，包括：
(a)具有式(i)结构的化合物
或其药学上可接受盐，和
(b)mdm2抑制剂。
在一个实施方式中，所述药物组合还包括bcl-2抑制剂，如navitoclax。
本文公开的药物组合特别用于治疗或预防癌症。
本文使用的某些术语如下所述。本发明的化合物或生物剂用标准命名法描述。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的意义。
本文所用的术语“组合”、“治疗组合”或“药物组合”指采用一个剂量单位形式的固定组合,或非固定组合，或联合给药的成套药盒，其中2种或更多治疗剂可同时或在一定时间间隔内分开地独立给药，尤其是当这些时间间隔允许组合伴侣显示协作如协同效应。
术语“联合疗法”指给予2种或更多治疗剂以治疗本公开所述治疗病症或疾病。这类给药涵盖以基本同时的方式共给予这些治疗剂，如在活性成分比例固定的单一制剂或各活性成分的分开制剂中(如胶囊和/或静脉内制剂)。另外，这类给药也涵盖以依序或分开方式大致同时或不同时间使用各类治疗剂。无论活性成分是作为单一制剂或分开制剂给予，这些药物作为同一治疗进程的一部分给予相同患者。任何情况下，治疗方案会提供治疗本文所述病症或疾病的有益效果。
本文所用的术语“α-同种型特异性磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂”、“α-同种型特异性pi3k抑制剂”、“α-同种型选择性磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂”和“α-同种型选择性pi3k抑制剂”指相对于β和/或δ和/或γ亚型，选择性靶向、减少或抑制至少一种α-同种型pi3k活性的化合物。示范性α-同种型特异性pi3k抑制剂公开于国际pct申请wo2010/029082，该申请通过引用全文纳入本文。
本文所用的术语“mdm2抑制剂”指选择性靶向、减少或抑制至少一种mdm2活性的化合物。
本文所用的术语“bcl-2抑制剂”指选择性靶向、减少或抑制至少一种bcl-2活性的化合物或生物剂。
本文定义的术语“药物组合物”指含至少一种治疗剂的混合物或溶液，所述治疗剂待给予对象如哺乳动物或人，以预防或治疗影响哺乳动物的特定疾病或病症。
本文所用的术语“药学上可接受”指在合理医学判断范围内，适于接触温血动物如哺乳动物或人组织的那些化合物、治疗剂(如抗体)、材料、组合物和/或剂型，而没有过度毒性、刺激、过敏反应和其它问题或并发症，并具有合理的效益/风险比。
本文所用的术语“固定组合”、“固定剂量”和“单一制剂”指配制成以一定量递送2种治疗剂给患者的单一载体或载剂或剂型，所述量共同在治疗上有效治疗或预防癌症。单一载剂设计成递送一定量的各药剂以及任何药学上可接受载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述载剂是片剂、胶囊、药丸或贴片。在其它实施方式中，所述载剂是溶液或悬液。
术语“非固定组合”、“成套药盒”和“分开的制剂”都指至少一种活性成分(即化合物(i)、mdm2抑制剂或可任选的bcl-2抑制剂)作为单独实体同时、同步或无特定时间限制地依序给予患者，其中这类给药在需要其的对象体内提供治疗有效水平的2种活性成分。后者还应用于鸡尾酒疗法，如给予3种或更多活性成分。
本文所用的术语“单位剂量”指向所治疗患者同时给予采用一个剂型的2种药剂。在一些实施方式中，所述单位剂量是单一制剂。在某些实施方式中，所述单位剂量包括一个或多个载剂，从而各载剂包括有效量的至少一种药剂以及药学上可接受载体和赋形剂。在一些实施方式中，所述单位剂量是同时给予患者的一个或多个片剂、胶囊、药丸、注射剂、输液、贴片等。
“口服剂型”包括处方或预期用于口服给药的单位剂型。
本文所用的术语“治疗”或“处理”包括减缓、减轻或缓解对象中至少一种症状或者实现疾病发展延迟的治疗。例如，治疗可以是减少一种或多种疾病症状或者完全消除疾病，如癌症。在本公开意义内，术语“治疗”也指阻滞、延迟疾病发生(即疾病临床表征前的阶段)和/或降低疾病发展或恶化的风险。本文所用的术语“保护”指在对象如哺乳动物或人中预防、延迟或治疗疾病发展、持续或加剧，或者适当时指全部。本文所用的术语“预防”、“防止”或“阻止”包括预防至少一种症状，该症状与所预防状态、疾病或紊乱相关或由其导致。
术语治疗剂组合的“药物有效量”、“治疗有效量”或“临床有效量”是相比所述组合治疗疾病的基线临床可观察征兆和症状，足以提供可观察或临床显著改善的量。
本文所用的术语“联合治疗活性”或“联合治疗效果”指治疗剂能(以按时间顺序交叉方式尤其是顺序特异方式)在待治疗温血动物特别是人中以其优选的时间间隔分开给予，仍显示(优选协同)相互作用(联合治疗效果)。是否如此能通过跟踪化合物的血液水平等来测定，显示2种化合物至少在某些时间间隔中都存在于待治疗人的血液。
本文所用的术语“对象”或“患者”意在包括动物，其能患有癌症或直接或间接涉及癌症的任何疾病，或者受其影响。对象示例包括哺乳动物，如人、猿、猴、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠以及转基因非人动物。在一个实施方式中，所述对象是人，如患有、有风险患有、或潜在能患有癌症的人。
术语“包含”和“包括”在本文中以其开放和非限制性意义使用，除非另有说明。
术语“一个”和“一种”和“所述”以及描述本发明上下文中的类似提法(特别是下列权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。复数用于化合物、生物剂、盐等时，也指单一化合物、盐等。
术语“约”或“大致”一般由了解相关主题领域的人理解，但某些情况下，能指给定值或范围的20％以内、10％以内或5％以内。或者，特别是生物系统中，术语“约”指给定值的大致一个log(即一个数量级)内或2倍内。
本文所用的pi3k抑制剂即(s)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)是潜在和选择性靶向alpha(α)-同种型ia类pi3k的特定2-甲酰胺环氨基尿素衍生物并具有以下化学结构：
具有式(i)结构的化合物在本领域也称为alpelisib，本文中称为“化合物(i)”、“化合物a”或“byl719”。为方便起见，具有式(i)结构的化合物以及其可能盐和溶剂合物的组统称为化合物(i)，意味着提及化合物(i)也指该化合物或替代的其药学上可接受盐或溶剂合物中的任何。
化合物(i)和其药学上可接受盐描述于pct申请号wo2010/029082，所述申请通过引用全文纳入本文，其制备方法描述于例如其中的实施例15。化合物(i)的制备也描述于本文的实施例1。优选地，化合物(i)采用游离碱形式。化合物(i)的盐优选是药学上可接受盐；合适的反离子形成药学上可接受盐为本领域已知。
化合物(i)可以约1-6.5mg/kg有效日剂量在成年人或儿童中口服给药。化合物(i)可以约70mg-455mg日剂量口服给予70kg体重的成年人，如约200-400mg，或约240mg-400mg，或约300mg-400mg，或约350mg-400mg，采用单一剂量或分开的剂量，最多至每日4次。优选地，化合物(i)以约350mg-约400mg日剂量给予70kg体重的成年人。
数种mdm2抑制剂为本领域技术人员已知，并在本发明组合范围内。
在一个实施方式中，所述mdm2抑制剂是(s)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2h-异喹啉-3-酮，该化合物具有式(ii)结构：
具有式(ii)结构的化合物在本文中称为“化合物(ii)”或“化合物b”。为方便起见，具有式(ii)结构的化合物以及其可能盐和溶剂合物的组统称为“化合物(ii)”，意味着提及化合物(ii)则指该化合物或替代的其药学上可接受盐中的任何。化合物(ii)能根据wo2011/076786制备，所述专利通过引用全文纳入本文。化合物(ii)公开为wo2011/076786的实施例106。
在另一个实施方式中所述mdm2抑制剂是(s)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1h-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，抑制mdm2与p53之间的相互作用，同时其也抑制mdm4与p53之间的相互作用。其制备描述于wo2013/111105，所述专利通过引用纳入本文。所述化合物具有式(iii)结构
具有式(iii)结构的化合物在本文中称为“化合物(iii)”。为方便起见，具有式(iii)结构的化合物以及其可能盐和溶剂合物的组统称为“化合物(iii)”，意味着提及化合物(iii)则指该化合物或替代的其药学上可接受盐或溶剂合物中的任何。
化合物(ii)和(iii)能一般以约1-5000mg活性成分的单位剂量用于约50-70kg的对象，或约1mg–3g或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg、或约1-50mg活性成分。单位剂量可在同一天或一周中给予一次或重复给予。更特别地，100mg-1500mg尤其是300mg-1000mg的日剂量可适合化合物(ii)。对于化合物(iii)，10mg-1000mg的剂量可能合适。化合物的日剂量可需要或不需要药物假期。例如，给药方案可包括用药3周和停用1周。组合伴侣可不根据同一给药方案施用。化合物(ii)或(iii)能每3周或每4周使用。具体地，化合物(iii)能每3周使用。其也能每4周给予患者。治疗有效剂量的化合物、药物组合物或其组合取决于对象的物种、体重、年龄和所治疗个体病症、紊乱或疾病或者其严重度。掌握普通技术的医生、临床医生或兽医能容易确定预防、治疗或抑制紊乱或疾病发展所需的各活性成分有效量。
在一个实施方式中，本发明组合还包括bcl-2抑制剂。bcl-2抑制剂示例包括4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-n-[[4-[[(1r)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺)(本领域也称为navitoclax或abt-263，描述于pct公开号wo09/155386,cas923564-51-6)；四卡星a；抗霉素；棉子酚((-)bl-193)；obatoclax；2-氨基-6-溴-4(s)-[1(s)-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基]-4h-1-苯并吡喃-3-羧酸乙酯(本领域也称为ha14–1)；奥利默森(本领域也称为g3139,
在一个优选实施方式中，所述bcl-2抑制剂是navitoclax。navitoclax在本文也称为“化合物c”或“abt-263”。
化合物(i)、mdm2抑制剂(如化合物(ii)或化合物(iii))或bcl-2抑制剂(如navitoclax)或其组合可以游离形式或药学上可接受盐形式给药。本文所用的“药学上可接受盐”包括所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转换成其盐形式来修饰。药学上可接受盐的示例包括但不限于：碱性残基如胺的矿物或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱性或有机盐；等等。本公开的药学上可接受盐包括形成自例如无毒无机或有机酸的母体化合物的常规无毒盐。合适的有机酸是例如羧酸或磺酸，如乙酸、琥珀酸、富马酸或甲磺酸。本公开的药学上可接受盐能通过常规化学方法合成自含碱性或酸性部分的母体化合物。一般，这类盐能如下制备：使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的合适碱或酸在水或有机溶剂中反应，或在两者的混合物中反应；一般，优选非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的列表参见《雷明顿药物科学》(remington’spharmaceuticalsciences),第17版,麦克出版公司(mackpublishingcompany),宾夕法尼亚州伊斯顿,1985,第1418页和journalofpharmaceuticalscience,66,2(1977)，各通过引用全文纳入本文。例如，化合物(ii)的盐是硫酸盐或硫酸氢盐。在另一个实施方式中，化合物(iii))的盐是琥珀酸盐。
除非另有规定或由文本明确说明，提及用于本文所提供药物组合的治疗剂包括化合物的游离碱，以及化合物的所有药学上可接受盐。
本文提供联合疗法，包括α-同种型选择性pi3k抑制剂(化合物(i)或其药学上可接受盐)和mdm2抑制剂(例如化合物(ii)或化合物(iii))，包括其药学上可接受盐)。此联合疗法能进一步包括bcl-2抑制剂，如navitoclax。给予组合包括给予采用单一制剂或单位剂型的组合，同步但分开给予组合单独药剂，或通过任何适当途径依序给予组合单独药剂。组合中这些个体药剂的剂量可能需要其中一种药剂相较组合中其它药剂更频繁给予。因此，为允许适当给药，包装的药物产品能包括含药剂组合的一种或多种剂型，和含药剂组合之一但没有组合中其它药剂的一种或多种剂型。
本发明特定涉及本发明组合以治疗或预防癌症。在一个实施方式中，本发明组合用于治疗或预防癌症，包括向对象给予联合疗法，包括有效量的具有式(i)结构的化合物或其药学上可接受盐以及有效量的mdm2抑制剂。在一个实施方式中，所述联合疗法还包括有效量的bcl-2抑制剂。优选地，这些化合物或生物剂以治疗有效剂量给予，其在组合时可提供有益效果。给药可以是分开、同时或依序。在一个实施方式中，所述给药是同时或依序的。
因此，在一个实施方式中，本发明组合用于治疗或预防癌症。在一个实施方式中，本发明组合用于治疗癌症。
本文还提供本发明组合在治疗或预防癌症中的应用。在一个实施方式中，所述组合的应用是用于治疗癌症。
在一个实施方式中，所述癌症是实体瘤。术语“实体瘤”特别指黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、和一般胃肠道癌、宫颈癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、头颈癌、膀胱癌或前列腺癌。本组合抑制实体瘤以及液体瘤的生长。此外，取决于肿瘤类型和所用特定组合，能获得肿瘤体积减少。本文公开的本发明组合也适合预防肿瘤转移性扩散和微转移的生长或发展。本文公开的组合适合治疗不良预后患者，特别适合有结直肠癌、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、脂肪肉瘤或鳞状细胞癌的这类不良预后患者。
在本文所提供任何药物组合的另一实施方式中，所述癌症选自以下的良性或恶性肿瘤：肺(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、支气管、前列腺、乳腺(包括散发性乳腺癌和考登病患者)、胰腺、胃肠道、结肠、直肠、结肠癌、结直肠癌、甲状腺、肝、胆道、肝内胆管、肝细胞、肾上腺、胃、胃部、胶质瘤、成胶质细胞瘤、子宫内膜、肾、肾盂、膀胱、子宫、宫颈、阴道、卵巢、多发性骨髓瘤、食管、颈或头、脑、口腔和咽、喉、小肠、黑素瘤、结肠绒毛腺瘤、肉瘤(包括软组织肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤或骨癌如骨肉瘤)、瘤形成、上皮特征性肿瘤、乳腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光化性角化病、红细胞增多、原发性血小板增多症、白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)、髓样化生性骨髓纤维化、瓦尔登斯特伦氏病。
在另一个实施方式中，所述癌症是结直肠癌、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、脂肪肉瘤或鳞状细胞癌。
在另一个实施方式中，所述癌症表征是braf突变、kras突变、扩增mdm2、pik3ca突变和pik3ca过表达中的一个或多个。在一个实施方式中，所述癌症表征是扩增mdm2、pik3ca突变和pik3ca过表达中的一个或多个。
在另一个实施方式中，所述癌症对mdm2抑制剂治疗而言有抗性或难治。在另一个实施方式中，所述癌症对选自下组的mdm2抑制剂治疗而言有抗性或难治：具有式(ii)结构的化合物、具有式(iii)结构的化合物和其药学上可接受盐。
癌性质是多因子的。某些情况下，作用机制不同的药物可组合。然而，仅考虑具有不同作用模式的任何治疗剂组合不必定产生具有利效果的组合。
给予本发明的药物组合相比仅施用本发明组合所用药物治疗剂之一的单一疗法，可能不仅产生有益效果如协同治疗效果，例如涉及缓解、延迟症状发展或抑制症状，而且产生进一步意外的有益效果，如副作用更少、反应更持久、生活质量改善或发病率降低。
另一益处是能使用更低剂量的本发明组合治疗剂，例如从而剂量不仅通常更小，而且可更低频率施用，或能用于减少单独用组合伴侣之一时观察到的副作用发生率。这与待治疗患者的期望和需求一致。
已建立的测试模型能显示，本发明组合产生本文之前所述的有益效果。本领域技术人员完全能选择相关测试模型以证明这类有益效果。例如，本发明组合的药理活性可在临床研究或动物模型中证明。
在确定一种或多种组分之间的协同相互作用时，效果的最优范围和就效果而言的各组分绝对剂量范围可如下明确测量：以不同w/w比例范围和剂量向需要治疗的患者给予组分。对于人，完成患者临床研究的复杂性和成本可使得应用此种测试形式作为协同作用初级模型不切实际。然而，在某些实验中(参见例如实施例2和3)观察协同作用能预测物种中的效果，存在的动物模型可用于进一步定量协同效应。这些研究的结果也能用于预测有效剂量比范围以及绝对剂量和血浆浓度。
在一个实施方式中，本文提供的所述组合或组合物或两者展示出协同效应。本文所用的术语“协同效应”指2种(或更多)药剂如化合物(i)或其药学上可接受盐和mdm2抑制剂(如化合物(ii)、化合物(iii)和其药学上可接受盐)作用以产生的效果，例如减缓癌症或其症状的症状进展，大于所给予各药物自身所得效果的简单叠加。例如，协同效应能用合适方法计算，如sigmoid-emax方程(holford,n.h.g.和scheiner,l.b.,clin.pharmacokinet.6:429-453(1981))、loewe相加性方程(loewe,s.和muischnek,h.,arch.exp.patholpharmacol.114:313-326(1926))和中效方程(chou,t.c.和talalay,p.,adv.enzymeregul.22:27-55(1984))。上面所指的各方程能施用于实验数据以产生对应图，从而协助评价药物组合效果。与上面所指方程相关的对应图分别是浓度-效应曲线、等效应图曲线和联合指数曲线。显示协同效应的额外方法是最高单一药剂模型(hsa)作为零假设(berenbaum1989)。超过hsa模型则预测受抑制靶标之间的功能联系(lehar,zimmermann等.2007,lehar,krueger等.2009)。此方法产生组合强度指示物zc(参见例如实施例2和3，包括表2和3中本发明组合某些实施方式的zc得分)。
在另一个实施方式中，本发明提供给予人的协同组合，包括本发明组合，其中各组分的剂量范围对应于合适肿瘤模型或临床研究中表明的协同范围。
另一方面，本文提供药物组合物如联合制剂或含(a)化合物(i)或其药学上可接受盐和(b)mdm2抑制剂的药物组合物。
在一个实施方式中，所述mdm2抑制剂选自化合物(ii)、化合物(iii)和其药学上可接受盐。
在一个实施方式中，所述药物组合物还包括bcl-2抑制剂。在一个优选实施方式中，所述bcl-2抑制剂是navitoclax。
在本文所提供任何药物组合物的一个实施方式中，所述组合物还包括一种或多种赋形剂。在另一个实施方式中，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受赋形剂。
本文所用的术语“药学上可接受赋形剂”或“药学上可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等和其组合，如本领域技术人员已知(参见例如《雷明顿药物科学》,第18版,麦克出版公司,1990,第1289-1329页)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在治疗或药物组合物中的应用。
用于以固定组合给予的药物组合物即含本发明组合的单一盖仑组合物，可以本身已知的方式制备且是适合肠部如口服或直肠和胃肠外给予包括人在内的哺乳动物(温血动物)的那些，包括治疗有效量的至少一种药理学活性组合伴侣，单独例如上面所示或与一种或多种药学上可接受载体联合，尤其适合肠部或胃肠外施用。
所述药物组合物可包含约0.1％-约99.9％，优选约1％-约60％的治疗剂。就肠部或胃肠外给药而言，用于联合疗法的合适药物组合物是例如采用单位剂型的那些，如包糖衣片剂、片剂、胶囊或栓剂或安瓶。除非另有说明，这些以本身已知的方式制备，例如通过本领域技术人员显而易见的多种常规混合、粉碎、直接压片、制粒、包糖衣、溶解、冻干工艺、熔融造粒或制造技术。应理解各剂型单独剂量所含组合伴侣的单位内容本身不需构成有效量，因为必要的有效量可通过给予多种剂量单位来实现。
一方面，本文提供本发明组合在制造治疗或预防癌症药物中的应用。在一个实施方式中，药物组合的应用是用于制造治疗癌症的药物。
本文还提供本发明组合供用于制备治疗或预防癌症的药物。在一个实施方式中，所述组合用于制备治疗癌症的药物。
治疗有效量的本发明组合中各组合伴侣可同时或依序并以任何顺序给予，所述组分可作为相同制剂或分开的制剂给予。
有效剂量的本发明组合所用各组合伴侣可根据所用特定治疗剂或药物组合物、给药模式、所治疗病症和所治疗病症严重度而变化。因此，本发明组合的剂量方案根据多种因素选择，包括给药途径以及患者的肾和肝功能。
产生功效而无毒性的本发明组合的组合伴侣的最优比例、个体和组合剂量、浓度是基于治疗剂对靶位点可及性的动力学，并用本领域技术人员已知的方法测定,组和伴侣如(a)化合物(i)或其药学上可接受盐以及(b)化合物(ii)、化合物(iii)之一和其任何药学上可接受盐，或者(a)化合物(i)或其药学上可接受盐以及(b)化合物(ii)、化合物(iii)之一和其任何药学上可接受盐及(c)navitoclax)。
各组合伴侣的有效剂量可能需要相较组合其它化合物或生物剂，更频繁给予一种化合物或生物剂。因此，为允许适当给药，包装的药物产品能包括含化合物或生物剂组合的一种或多种剂型，和含化合物或生物剂组合之一但没有组合中其它化合物或生物剂的一种或多种剂型。
用于本发明组合的组合伴侣以市售单一药物形式施用时，其剂量和给药模式能按照各市售药物包装说明书提供的信息，除非本文另有提及。
用于治疗癌症的最优剂量各组合伴侣能用已知方法就各个体凭经验确定，并取决于多种因素，包括但不限于：疾病进展程度；个体的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药时间和途径；和个体服用的其它药物。最优剂量可用常规测试和本领域熟知的程序确立。
可联合载体材料以产生单一剂型的各组合伴侣量会根据所治疗个体和特定给药模式而变化。在一些实施方式中，含本文所述药剂组合的单位剂型包含的组合各药剂的量是在这些药剂单独给药时给予的量。
剂量频率可根据所用化合物或生物剂和待治疗或预防的特定病症而变化。一般可监测患者的疗效，使用本领域普通技术人员熟悉的适合所治疗或预防病症的试验。
本发明还提供商业包装，包括作为治疗剂的本发明组合以及其同时、分开或依序给药的说明书以用于延迟癌症进展或治疗癌症。
治疗方法
本文提供在需要的对象中治疗或预防癌症的方法，包括向对象给予治疗有效量的本发明药物组合，即含以下的药物组合：(a)化合物(i)或其药学上可接受盐，(b)mdm2抑制剂，和可任选的(c)blc-2抑制剂。
因此，在一个实施方式中，本文提供在需要的对象中治疗或预防癌症的方法，包括向对象给予治疗有效量的含(a)化合物(i)或其药学上可接受盐和(b)mdm2抑制剂的药物组合。
在另一个实施方式中，本文提供在需要的对象中治疗或预防癌症的方法，包括向对象给予治疗有效量的含(a)化合物(i)或其药学上可接受盐和(b)mdm2抑制剂和(c)bcl-2抑制剂的药物组合。
在一个实施方式中，本文提供在需要的对象中治疗癌症的方法，包括向对象给予治疗有效量的本发明组合。
在本发明所提供任何方法的一个实施方式中，所述癌症是实体瘤。术语“实体瘤”特别指黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、和一般胃肠道癌、宫颈癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、头颈癌、膀胱癌或前列腺癌。本组合抑制实体瘤以及液体瘤的生长。此外，取决于肿瘤类型和所用特定组合，能获得肿瘤体积减少。本文公开的本发明组合也适合预防肿瘤转移性扩散和微转移的生长或发展。本文公开的组合适合治疗不良预后患者，特别适合有结直肠癌、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、脂肪肉瘤或鳞状细胞癌的这类不良预后患者。
在本文所提供任何方法的另一个实施方式中，所述癌症选自以下的良性或恶性肿瘤：肺(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、支气管、前列腺、乳腺(包括散发性乳腺癌和考登病患者)、胰腺、胃肠道、结肠、直肠、结肠癌、结直肠癌、甲状腺、肝、胆道、肝内胆管、肝细胞、肾上腺、胃、胃部、胶质瘤、成胶质细胞瘤、子宫内膜、肾、肾盂、膀胱、子宫、宫颈、阴道、卵巢、多发性骨髓瘤、食管、颈或头、脑、口腔和咽、喉、小肠、黑素瘤、结肠绒毛腺瘤、肉瘤(包括软组织肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤或骨癌如骨肉瘤)、瘤形成、上皮特征性肿瘤、乳腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光化性角化病、红细胞增多、原发性血小板增多症、白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)、髓样化生性骨髓纤维化、瓦尔登斯特伦氏病。
在一个实施方式中，所述癌症是结直肠癌、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、脂肪肉瘤或鳞状细胞癌。
在另一个实施方式中，所述癌症表征是braf突变、kras突变、扩增mdm2、pik3ca突变和pik3ca过表达中的一个或多个。
在另一个实施方式中，所述癌症对mdm2抑制剂治疗而言有抗性或难治。在另一个实施方式中，所述癌症对mdm2抑制剂治疗而言有抗性或难治，其中所述mdm2抑制剂选自具有式(ii)结构的化合物、具有式(iii)结构的化合物和其药学上可接受盐。
本发明所述治疗癌症的方法可包括(i)给予采用游离或药学上可接受盐形式的药剂(a)和(ii)给予采用游离或药学上可接受盐形式的药剂(b)(和可选的采用游离或药学上可接受形式的药剂(c))，同时或以任何顺序依序，采用联合治疗有效量，优选协同有效量，如对应本文所述量的每日或间歇性剂量。本发明组合的个体组合伴侣可在治疗进程中不同时间单独给药或者以分开或单一组合形式同步给药。因此，本发明应理解为涵盖所有这类同时或交替治疗方案且术语“给药”也相应解释。
以下实施例阐明上述公开；然而其不意在以任何方式限制本公开范围。本发明药物组合的有益效果也能通过相关领域技术人员已知的其它测试模型确定。
实施例
实施例1：
i.合成(s)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-{[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在氩气氛下将et3n(1.54ml,11.1mmol,3eq)加入溶于dmf(25ml)的咪唑-1-羧酸[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(步骤1.1)(1.26g,3.7mmol)和l-脯氨酰胺(0.548g,4.8mmol,1.3eq)溶液。反应混合物室温搅拌14小时，通过加入饱和nahco3溶液来淬灭，etoac萃取。有机相用饱和nahco3溶液洗涤，(na2so4)干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh,1:0→94:6)纯化，然后是et2o中研磨以提供1.22g灰白色固体的标题化合物：esi-ms:388.1[m+h]+；tr＝2.35min(系统1)；tlc:rf＝0.36(dcm/meoh,9:1).1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):1.32(s,9h)1.75-1.95(m,3h)1.97-2.13(m,1h)2.39(s,3h)3.38-3.50(m,1h)3.52-3.65(m.,1h)4.10-4.40(m,1h)6.94(br.s.,1h)7.22(d,1h)7.30-7.48(m,2h)8.49(d,1h)10.87(br.s.,1h)。
步骤1.1:咪唑-1-羧酸[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺
溶于dcm(50ml)的5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤1.2)(1g,4.05mmol)和1,1’-羰二咪唑(0.984g,6.07mmol,1.5eq)混合物回流搅拌4小时并使其冷却。所得沉淀物经过滤收集以提供1.26g白色固体的标题化合物：esi-ms:340.2[m-h]-；tr＝2.85min(系统1).
步骤1.2:5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
n-[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(步骤1.3)(2g,7mmol)、6nhcl水溶液(10ml)和etoh(50ml)的混合物在85℃搅拌2小时，使其冷却，通过加入饱和nahco3溶液来淬灭，dcm/meoh(9:1,v/v)萃取。有机相用饱和nahco3溶液洗涤，(na2so4)干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh,1:0→96:4)纯化以提供1.21g黄色固体的标题化合物：esi-ms:248.1[m+h]+；tlc:rf＝0.36(dcm/meoh,9:1).
步骤1.3:n-[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺
溶于dmf(50ml)的2-乙酰胺基-4-甲基噻唑(1.2g,7.7mmol,1.1eq)、碳酸铯(4.55g,14mmol,2eq),三-叔丁基膦四氟硼酸盐(0.406g,1.4mmol,0.2eq),乙酸钯(ii)(0.15g,0.7mmol,0.1eq)和4-溴-2-叔丁基-吡啶(步骤1.4)(1.5g,7mmol)混合物在氩气氛下于90℃搅拌1.5小时，使其冷却，通过加入饱和nahco3溶液来淬灭，并经硅藻土垫过滤。滤液用etoac萃取。有机相用饱和nahco3溶液洗涤，(na2so4)干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh,1:0→97:3)纯化以提供2.02g黄色固体的标题化合物：esi-ms:290.1[m+h]+；tlc:rf＝0.35(dcm/meoh,9:1).
步骤1.4:4-溴-2-叔丁基-吡啶
2-叔丁基-1h-吡啶-4-酮(步骤1.5)(4.25g,28mmol)和pobr3(8.88g,31mmol,1.1eq)的混合物加热至120℃，搅拌15分钟，使其冷却，通过加入饱和nahco3溶液来淬灭，dcm/meoh(9:1,v/v)萃取。有机相用饱和nahco3溶液洗涤，(na2so4)干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(hex/etoac,95:5)纯化以提供5.18g作为黄色油的标题化合物：esi-ms:214.0/216.0[m+h]+；tr＝2.49min(系统1)；tlc:rf＝0.35(hex/etoac,1:1).
步骤1.5:2-叔丁基-1h-吡啶-4-酮
2-叔丁基-吡喃-4-酮(步骤1.6)(5.74g,37.7mmol)和30％氢氧化铵水溶液(100ml)的混合物回流搅拌1小时，使其冷却并浓缩。残留物用meoh(200ml)研磨并过滤。浓缩滤液，残留物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh/nh3aq,94:5:1→92:7:1)纯化以提供4.46g黄色固体的标题化合物：esi-ms:152.0[m+h]+；tr＝1.45min(系统1)；tlc:rf＝0.11(dcm/meoh,9:1).
步骤1.6:2-叔丁基-吡喃-4-酮
溶于苯(250ml)的5-羟基-1-甲氧基-6,6-二甲基-庚-1,4-二烯-3-酮(步骤1.7)(6.8g,36.9mmol)和tfa(5.65ml,74mmol,2eq)混合物室温搅拌14小时并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(hex/etoac,1:0→75:25)纯化以提供5.74作为黄色油的标题化合物：esi-ms:153.1[m+h]+；tr＝3.21min(系统1)；tlc:rf＝0.22(hex/etoac,1:1).
步骤1.7:5-羟基-1-甲氧基-6,6-二甲基-庚-1,4-二烯-3-酮
将lihmds(thf中1m,100ml,2eq)逐滴加入溶于thf(400ml)的4-甲氧基-3-丁烯-2-酮(10ml,100mmol,2eq)冷(-78℃)溶液。-78℃搅拌30分钟后，加入溶于thf(100ml)的特戊酰氯(6.12ml,50mmol)溶液。使所得混合物回暖2小时至室温并通过加入饱和nh4cl溶液来淬灭。真空移出thf。浓缩的混合物用et2o萃取。有机相用卤水洗涤，(na2so4)干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(hex/etoac,1:0→85:15)纯化以提供6.83g作为黄色油的标题化合物：esi-ms:185.1[m+h]+；tlc:rf＝0.87(hex/etoac,1:1).
ii.合成(s)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(化合物(i)或化合物a或byl719)：
标题化合物以与上述程序类似的方式制备，但有下列修改。步骤1.1中，反应混合物回流搅拌14小时。步骤1.2中，反应混合物在85℃搅拌1小时，淬灭后用etoac萃取。步骤1.3中，反应混合物在120℃搅拌2.5小时。步骤1.4中，反应混合物在83℃搅拌1小时，淬灭后用etoac萃取。步骤1.5中，反应混合物在65℃搅拌1小时，不进行meoh中的研磨。步骤1.6中，粗产物未纯化。步骤1.7中，使用3,3,3-三氟-2,2-二甲基-丙酰氯。
标题化合物：esi-ms:442.0[m+h]+；tr＝3.02min(系统1)；tlc:rf＝0.35(dcm/meoh,9:1).1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):1.60(s,6h)1.70-1.95(m,3h)1.99-2.16(m,1h)2.40(s,3h)3.38-3.51(m,1h)3.51-3.69(m,1h)4.10-4.40(m,1h)6.95(br.s.,1h)7.39(d,2h)7.53(s,1h)8.58(d,1h)10.93(br.s.,1h)
在替代程序中，标题化合物以与上述程序类似的方式制备，但有下列修改：使用n,n-二甲基乙酰胺替代dmf，混合物在65℃搅拌2小时。步骤1.1中，使用氯甲酸苯酯(缓慢添加)替代1,1’-羰二咪唑，反应在n,n-二乙基-异丙胺存在下于thf中室温完成(1.5小时)。步骤1.2中，反应混合物在(回流)下搅拌加热5小时，淬灭后用etoac萃取。步骤1.3中，反应混合物在100℃搅拌2小时。步骤1.4中，反应在甲苯中进行，使用1.1当量pobr3和1.1当量三丙胺，混合物在80℃搅拌2小时且淬灭后用etoac萃取。步骤1.5中，反应混合物在65℃搅拌1小时，不进行meoh中的研磨。步骤1.6中，使用甲苯替代苯，粗产物未纯化。步骤1.7中，使用3,3,3-三氟-2,2-二甲基-丙酰氯。
实施例2：联合pik3ca抑制剂(化合物a、byl719)与mdm2抑制剂(化合物b)在tp53野生型结直肠癌细胞系中对增殖的体外效果
化合物a和化合物b以20mm浓度溶于100％dmso(西格玛(sigma)，产品目录号d2650)，-20℃保存待用。化合物排列在药物靠模板(葛莱娜(greiner)，产品目录号788876)中并以2000x浓度3倍连续稀释(7级)。
从商业公司atcc和ecacc获得用于此研究的结直肠癌细胞系，培养并处理(表1)。所有细胞系培养基补充有10％fbs(海克隆(hyclone),产品目录号sh30071.03)。
表1.细胞系信息
细胞系在37℃和5％co2培养箱中培养，在t-75培养瓶中扩增。所有情况下，细胞从冷冻储液中解冻，用1:3稀释通过≥1次传代来扩增，用vicell计数器(贝克曼库尔特(beckman-coulter))计数并评价活力，然后接种。为拆分并扩增细胞系，细胞用0.25％胰蛋白酶-edta(gibco，产品目录号25200)从培养瓶中移出。确定所有细胞系没有支原体污染，这通过idexxradil(美国密苏里州哥伦比亚)进行的pcr检测方法确定并通过检测snp组来正确鉴定。
为测试化合物a与化合物b组合对细胞增殖的效果，细胞接种入透明底的黑色384孔微量板(matrix/赛默科技(thermoscientific)，产品目录号4332)中的50μl培养基/每孔，细胞密度为500-1250细胞/孔(表1)，并允许在37度,5％co2孵育24小时。24小时后，各细胞系制备一块384孔板以通过显微镜检查(见下)进行细胞计数，而不接受处理(＝‘基线)。其它细胞板如下处理：用ats声学液体分配器(ecd生物系统公司(ecdbiosystems))从药物靠模板转移25nl2000x化合物，产生最终1x浓度。化合物a在13nm-10μm的终浓度范围中使用，化合物b在13nm-10μm的终浓度范围中使用(7个1:3稀释步骤)。对于化合物a与化合物b的组合，单一药剂在各稀释度以1:1固定比例组合产生7种组合处理。另外，转移阴性对照(dmso＝‘载剂’)和阳性对照(星孢菌素＝杀死细胞,7点1:2稀释系列用于16nm-1μm剂量范围)作为处理对照，在所测试细胞系中无功效的化合物与化合物a和化合物b联用作为组合对照(不超过更有效单一药剂功效的组合＝‘非相互作用’组合)。化合物添加后，用hpd300数字分配器(帝肯(tecan))将50nl2mmcellevent半胱天冬酶-3/7绿色检测试剂(赛默飞世尔(thermofisher)，产品目录号c10423)加入三个重复之一。半胱天冬酶3/7诱导作为处理诱导的细胞凋亡替代物测量。细胞根据其倍增时间处理72小时-96小时(表1)，每24小时通过显微镜检查测量半胱天冬酶3/7活化，使用装有4x物镜和fitc激发/发射滤光片的incell分析仪2000(通用电气医疗集团(gehealthcare))。处理结束时，制备细胞以通过显微镜检查进行细胞计数。细胞在溶于pbs(波士顿生物产品公司(bostonbioproducts)，产品目录号bm-220)的4％pfa(ems(electronmicroscopysciences)，产品目录号15714)、0.12％tx-100(ems，产品目录号22140)中固定并透化45分钟。细胞用pbs洗3次后，其dna用终浓度为4μg/ml的hoechst33342(赛默飞世尔，产品目录号h3570)染色30分。细胞用pbs洗3次，然后板用铝密封件(安捷伦科技(agilenttechnologies)，产品目录号06644-001)使用plateloc(安捷伦科技)热密封，4℃保存直至成像。通过荧光显微镜在单一图像中捕获各处理的每孔所有细胞，使用装有4x物镜和dapi激发/发射滤光片的incell分析仪2000(通用电气医疗集团)。
适应前述方法(horn,sandmann等.2011,nat.methods8(4):341-346)和使用r中的bioconductor包ebimage(pau,fuchs等.2010,bioinformatics26(7):979-981)后，分析图像。2个通道中即dapi(用于hoechst/dna)和fitc(用于半胱天冬酶3/7)中的对象通过自适应阈值化单独分段并计数。比较阴性对照(dmso)和阳性对照(星孢菌素)后，手动确定各细胞系的半胱天冬酶3/7阳性对象阈值。通过分析dna通道中的17个额外对象/核特征(形状和强度特征)，鉴定碎片/片段化核。为此，手动比较各细胞系阳性对照(星孢菌素)与阴性对照(dmso)之间的额外特征分布。能在条件之间区分的特征(如比较dmso与星孢菌素的特征测量分布的变化)用于确定‘碎片’群与‘活’核群。从原始核计数中减去碎片计数。所得核数目用作细胞增殖量度(‘细胞计数’)。
化合物对细胞增殖的作用计算自与阴性对照(dmso)的细胞计数相比较的处理的细胞计数，图1中表示为y轴上的‘标准化细胞计数’(＝‘xnorm’)。协同组合用最高单一药剂模型(hsa)作为零假设(berenbaum1989)鉴定。超过hsa模型则预测受抑制靶标之间的功能联系(lehar,zimmermann等.2007,lehar,krueger等.2009)。模型输入是各药物剂量的抑制值：
i＝1-xnorm
i:抑制
xnorm:标准化细胞计数(3个重复的中值)
在组合处理的各剂量点，计算组合抑制与2种单一药剂中更强者抑制之间的差异(＝模型残差)。类似地，为评价三重组合在各剂量点的协同作用，计算三联药物抑制与最强药物对抑制之间的差异。为有利于高抑制下的组合效果，残差用同一剂量点观察到的抑制加权。药物组合的总体组合得分c是所有浓度中加权残的总和：
c＝σconc(i数据*(i数据–i模型))
i数据:测量的抑制
i模型:根据hsa零假设的抑制
稳健组合z得分(zc)计算为处理组合得分c与非相互作用组合绝对中位差(mad)之比：
zc＝c/mad(c零)
c零:非相互作用组合的组合得分
zc是组合强度指示物:
zc≥3:协同作用
3>zc≥2:弱协同作用
zc<2:无协同作用
ic50是相对于dmso产生50％细胞计数的化合物浓度。完成ic50计算(见表2)，使用r中的drc包(ritz和streibig2005年1月,journalofstatisticalsoftware,“使用r的生物测定分析(bioassayanalysisusingr)”,12:5:1-22)并拟合四参数log-逻辑函数至数据。
化合物对细胞凋亡的作用如下确定：相对于原始细胞计数(减去碎片前)，计算各治疗和时间点有活化半胱天冬酶3/7的细胞百分数(图2的y轴)。未经实验测量的各时间点细胞计数通过回归分析由第0天和处理结束时细胞计数的对数变换作线性模型拟合获得(假设指数细胞生长)。
此实验中，在总共5个tp53野生型结直肠癌细胞系内，对pik3ca抑制剂(化合物a)和mdm2抑制剂(化合物b)的功效进行单独以及联合评价。4个细胞系是kras突变(gp2d,ls-180,hct-116,lovo)，1个细胞系是braf突变(rko)，4个细胞系还是pik3ca突变(gp2d,rko,ls-180,hct-116)(表1)。作为单一药剂的化合物a以微摩尔ic50值抑制2个细胞系生长，而在其它3个细胞系中仅在最高剂量(10μm)有活性(图1和表2)。作为单一药剂的化合物b以亚微摩尔到微摩尔ic50值抑制细胞系生长(图1和表2)。处理治疗在2/5细胞模型中引起协同抑制(根据hsa模型)，在另外2个模型中引起弱协同抑制(表2)。组合也在所测细胞模型中诱导不同程度的细胞调亡(通过测量半胱天冬酶3/7诱导来评价)(图2)，在gp2d中发现最强诱导。
在tp53野生型、kras及braf突变结直肠癌中联合抑制pik3ca和mdm2可提供相较各单一药剂能够改善反应的有效治疗模式，并产生临床更持久的反应。
表2.各化合物的单一药剂ic50值以及化合物a与化合物b组合的协同作用z得分的测量。
实施例3：联合pik3ca抑制剂(化合物a、byl719)和mdm2抑制剂(化合物b)与bcl-2抑制剂navitoclax(化合物c或abt-263)在tp53野生型结直肠癌细胞系中对增殖的体外效果
化合物a、b和c以20mm浓度溶于100％dmso(西格玛(sigma)，产品目录号d2650)，-20℃保存待用。化合物排列在药物靠模板(葛莱娜(greiner)，产品目录号788876)中并以2000x浓度3倍连续稀释(7级)。
从商业公司atcc和ecacc获得用于此研究的结直肠癌细胞系，培养并处理(表1，实施例2)。所有细胞系培养基补充有10％fbs(海克隆(hyclone),产品目录号sh30071.03)。
细胞系在37℃和5％co2培养箱中培养，在t-75培养瓶中扩增。所有情况下，细胞从冷冻储液中解冻，用1:3稀释通过≥1次传代来扩增，用vicell计数器(贝克曼库尔特(beckman-coulter))计数并评价活力，然后接种。为拆分并扩增细胞系，细胞用0.25％胰蛋白酶-edta(gibco，产品目录号25200)从培养瓶中移出。确定所有细胞系没有支原体污染，这通过idexxradil(美国密苏里州哥伦比亚)进行的pcr检测方法确定并通过检测snp组来正确鉴定。
为测试化合物a、化合物b与化合物c组合对细胞增殖的效果，细胞接种入透明底的黑色384孔微量板(matrix/赛默科技(thermoscientific)，产品目录号4332)中的50μl培养基/每孔，细胞密度为500-1250细胞/孔(上表1)，并允许在37度,5％co2孵育24小时。24小时后，各细胞系制备一块384孔板以通过显微镜检查(见下)进行细胞计数，而不接受处理(＝‘基线)。其它细胞板如下处理：用ats声学液体分配器(ecd生物系统公司(ecdbiosystems))从药物靠模板转移25nl2000x化合物，产生最终1x浓度。化合物a在13nm-10μm的终浓度范围中使用，化合物b在13nm-10μm的终浓度范围中使用，化合物c在13nm-10μm的终浓度范围中使用(7级1:3稀释步骤)。为评价三重组合的效果，在同一实验中测试所有个体化合物(a,b,c)、所有3个成对组合(a+b,a+c,b+c)和三重组合(a+b+c)。成对组合和三重组合在各稀释度以1:1(用于药物对)和1:1:1(用于三联药物)固定比例测试，各处理产生7种组合条件。另外，转移阴性对照(dmso＝‘载剂’)和阳性对照(星孢菌素＝杀死细胞,7点1:2稀释系列用于16nm-1μm剂量范围)作为处理对照，在所测试细胞系中无功效的化合物与化合物a和化合物b联用作为组合对照(不超过更有效单一药剂功效的组合＝‘非相互作用’组合)。化合物添加后，用hpd300数字分配器(帝肯(tecan))将50nl2mmcellevent半胱天冬酶-3/7绿色检测试剂(赛默飞世尔(thermofisher)，产品目录号c10423)加入三个重复之一。半胱天冬酶3/7诱导作为处理诱导的细胞凋亡替代物测量。细胞根据其倍增时间处理72小时-96小时(表1)，每24小时通过显微镜检查测量半胱天冬酶3/7活化，使用装有4x物镜和fitc激发/发射滤光片的incell分析仪2000(通用电气医疗集团(gehealthcare))。处理结束时，制备细胞以通过显微镜检查进行细胞计数。细胞在溶于pbs(波士顿生物产品公司(bostonbioproducts)，产品目录号bm-220)的4％pfa(ems(electronmicroscopysciences)，产品目录号15714)、0.12％tx-100(ems，产品目录号22140)中固定并透化45分钟。细胞用pbs洗3次后，其dna用终浓度为4μg/ml的hoechst33342(赛默飞世尔，产品目录号h3570)染色30分钟。细胞用pbs洗3次，然后板用铝密封件(安捷伦科技(agilenttechnologies)，产品目录号06644-001)使用plateloc(安捷伦科技)热密封，4℃保存直至成像。通过荧光显微镜在单一图像中捕获各处理的每孔所有细胞，使用装有4x物镜和dapi激发/发射滤光片的incell分析仪2000(通用电气医疗集团)。
适应前述方法(horn,sandmann等.2011,nat.methods8(4):341-346)和使用r中的bioconductor包ebimage(pau,fuchs等.2010,bioinformatics26(7):979-981)后，分析图像。2个通道中即dapi(用于hoechst/dna)和fitc(用于半胱天冬酶3/7)的对象通过自适应阈值化单独分段并计数。比较阴性对照(dmso)和阳性对照(星孢菌素)后，手动确定各细胞系的半胱天冬酶3/7阳性对象阈值。通过分析dna通道中的17个额外对象/核特征(形状和强度特征)，鉴定碎片/片段化核。为此，手动比较各细胞系阳性对照(星孢菌素)与阴性对照(dmso)之间的额外特征分布。能在条件之间区分的特征(如比较dmso与星孢菌素的特征测量分布的变化)用于确定‘碎片’群与‘活’核群。从原始核计数中减去碎片计数。所得核数目用作细胞增殖量度(‘细胞计数’)。
化合物对细胞增殖的作用计算自与阴性对照(dmso)的细胞计数相比较的处理的细胞计数，，图3中表示为y轴上的‘标准化细胞计数’(＝‘xnorm’)。协同组合用最高单一药剂模型(hsa)作为零假设(berenbaum1989)鉴定。超过hsa模型则预测受抑制靶标之间的功能联系(lehar,zimmermann等.2007,lehar,krueger等.2009)。模型输入各药物剂量的是抑制值：
i＝1-xnorm
i:抑制
xnorm:标准化细胞计数(3个重复的中值)
在处理治疗的各剂量点，计算组合抑制与2种单一药剂中更强者抑制之间的差异(＝模型残差)。类似地，为评价三重组合在各剂量点的协同作用，计算三联药物抑制与最强药物对抑制之间的差异。为有利于高抑制下的组合效果，残差用同一剂量点观察到的抑制加权。药物组合的总体组合得分c是所有浓度中加权残的总和：
c＝σconc(i数据*(i数据–i模型))
i数据:测量的抑制
i模型:根据hsa零假设的抑制
稳健组合z得分(zc)计算为处理组合得分c与非相互作用组合绝对中位差(mad)之比：
zc＝c/mad(c零)
c零:非相互作用组合的组合得分
zc是组合强度指示物:
zc≥3:协同作用
3>zc≥2:弱协同作用
zc<2:无协同作用
ic50是相对于dmso产生50％细胞计数的化合物浓度。完成ic50计算(见表3)，使用r中的drc包(ritz和streibig2005年1月,journalofstatisticalsoftware,“使用r的生物测定分析(bioassayanalysisusingr)”,12:5:1-22)并拟合四参数log-逻辑函数至数据。
化合物对细胞凋亡的作用如下确定：相对于原始细胞计数(减去碎片前)，计算各处理和时间点有活化半胱天冬酶3/7的细胞百分数(图4的y轴)。未经实验测量的各时间点细胞计数通过回归分析由第0天和处理结束时细胞计数的对数变换作线性模型拟合得到(假设指数细胞生长)。
此实验中，在总共5个tp53野生型结直肠癌细胞系内，对pik3ca抑制剂(化合物a)、mdm2抑制剂(化合物b)和bcl-2抑制剂(navitoclax,abt-263,化合物c)的功效进行单独以及联合评价。4个细胞系是kras突变(gp2d,ls-180,hct-116,lovo)，1个细胞系是braf突变(rko)。作为单一药剂的化合物a以微摩尔ic50值抑制2个细胞系生长，而在其它3个细胞系中仅在最高剂量(10μm)有活性(图3和表3)。作为单一药剂的化合物b以亚微摩尔到微摩尔ic50值抑制细胞系生长，而化合物c没有单一药剂功效(图3和表3)。三重组合(a+b+c)在2/5所测试细胞模型中相比药物对引起协同抑制(根据hsa模型)(表3)。4个细胞系(hct-116,lovo,rko,ls-180)中，三重组合相较成对组合显示更强细胞凋亡(通过测量半胱天冬酶3/7诱导来评价)(图4)。总体上，在tp53野生型crc中联合抑制pik3ca、mdm2和bcl-2可提供相较各单一药剂能够改善反应的有效治疗方法，并产生临床更持久的反应。
表3.各化合物的单一药剂ic50值以及化合物a、化合物b和化合物c组合的协同作用z得分的测量。