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发明领域
本发明的领域大体上涉及生物学和医学领域。所述领域也涉及用于产生适用于治疗疾病诸如癌症的树突细胞和相关组合物的方法。
发明背景
在专职抗原递呈细胞(apc)之中，树突细胞(dc)在介导抗原特异性适应性免疫应答方面具有对原初t淋巴细胞进行致敏的独特能力。palucka,k.和banchereau,j.cancerimmunotherapyviadendriticcells.naturereviewscancer12,265-277(2012)。dc也具有用以诱导γσt细胞和自然杀伤(nk)细胞的活化和增殖，从而使先天免疫性桥接于适应性免疫应答的能力。tyler,c.j.,doherty,d.g.,moser,b.和eberl,m.humanvγ9/vδ2tcells:innateadaptorsoftheimmunesystem.cellularimmunology296,10-21(2015)；vanbeek,j.j.,wimmers,f.,hato,s.v.,devries,i.j.m.和skold,a.e.dendriticcellcrosstalkwithinnateandinnate-likeeffectorcellsinantitumorimmunity:implicationsfordcvaccination.criticalreviewstminimmunology34:517-536(2014)。dc由骨髓进化，并且通过血液循环迁移至淋巴组织和非淋巴组织。在血液中，大多数dc是不成熟的，并且能够吞噬来自入侵病原体的外来抗原。在摄取外来抗原后，不成熟dc经历通过许多病原体识别受体(prr)诸如toll样受体(tlr)和细胞因子受体的活化而达成的复杂的成熟和活化过程。pradere,j.-p.,dapito,d.h.和schwabe,r.f.theyinandyangoftoll-likereceptorsincancer.oncogene33,3485-3495(2014)；dzopalic,t.,rajkovic,i.,dragicevic,a.和colic,m.theresponseofhumandendriticcellstoco-ligationofpattern-recognitionreceptors.immunologicresearch52,20-33(2012)；hammer,g.e.和ma,a.molecularcontrolofsteady-statedendriticcellmaturationandimmunehomeostasis.annualreviewofimmunology31,743-791(2013)。成熟和活化的dc特征性地表达细胞表面共刺激性分子诸如cd80、cd83和cd86，装配抗原肽-mhc复合物，并且迁移至次级淋巴组织以促进抗原特异性t细胞扩增。
dc占血液中免疫细胞的1％。已表征两种主要类型的血液dc，包括cd11c+髓样dc(mdc)和cd303+浆细胞样dc(pdc)。mildner,a.和jung,s.developmentandfunctionofdendriticcellsubsets.immunity40,642-656(2014)。尽管pdc通过在遭遇病原体后分泌大量干扰素α(ifnα)而在介导抗炎性应答方面至关重要，但mdc在进行抗原递呈以对原初t细胞进行致敏方面起主要作用。osugi,y.,vuckovic,s.和hart,d.n.myeloidbloodcd11c+dendriticcellsandmonocyte-deriveddendriticcellsdifferintheirabilitytostimulatetlymphocytes.blood100,2858-2866(2002)；kassianos,a.j.,jongbloed,s.l.,hart,d.n.和radford,k.j.isolationofhumanblooddcsubtypes.dendriticcellprotocols,45-54(2010)。mdc的cd11c+子组相对充足，并且次要子组或cd141+mdc展现用以向cd8t细胞交叉递呈mhc-i上的细胞外抗原，从而使得极化成细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的强效能力。jongbloed,s.l.等humancd141+(bdca-3)+dendriticcells(dcs)representauniquemyeloiddcsubsetthatcross-presentsnecroticcellantigens.thejournalofexperimentalmedicine207,1247-1260(2010)；bachem,a.等superiorantigencross-presentationandxcr1expressiondefinehumancd11c+cd141+cellsashomologuesofmousecd8+dendriticcells.thejournalofexperimentalmedicine207,1273-1281(2010)。通过比较评估人dc子组和鼠dc子组来分析转录概况，提出人cd141+dc与鼠cd8+dc对应物(即在介导抗原交叉递呈方面的主要dc子组)密切相关。因为dc很少受入侵病原体感染，所以dc介导的交叉递呈和终末分化细胞毒性效应t细胞的诱导是产生针对病原性病毒和癌细胞的适应性免疫时的主要步骤。
由于血液dc贫乏，所以当前dc方法经常通过用细胞因子和prr刺激因子的混合物进行的复杂的成熟和活化过程来利用经抗原负载的单核细胞源性dc(modc)。kvistborg,p.,
1型人t细胞白血病病毒(htlv-1)主要感染cd4+t细胞以在3-5％的受感染个体之中导致恶性t细胞转化和发展成人t细胞白血病-淋巴瘤(atl)。ishitsuka,k.和tamura,k.humant-cellleukaemiavirustypeiandadultt-cellleukaemia-lymphoma.thelancetoncology15,e517-e526(2014)。其它htlv病毒也是已知的。举例来说，htlv-2与它的病原性对应物htlv-1相关，然而，htlv-2尚未与白血病在人中的发展相关联。ciminale,v.,rende,f.,bertazzoni,u.和romanelli,m.g.htlv-1andhtlv-2:highlysimilarviruseswithdistinctoncogenicproperties.front.microbiol.5(398):1-9(2014)。htlv-1的病毒tax蛋白被认为在导致成人t细胞白血病的过程中起主要作用。azran等,roleoftaxproteininhumant-cellleukemiavirustype-ileukemogenicity,retrovirology20041:20(2004)。htlv-1也感染树突细胞，从而允许无细胞病毒可向cd4+t细胞传播。jones,k.s.,petrow-sadowski,c.,huang,y.k.,bertolette,d.c.和ruscetti,f.w.cell-freehtlv-1infectsdendriticcellsleadingtotransmissionandtransformationofcd4+tcells.naturemedicine14,429-436(2008)；jain,p.等dc-signmediatescell-freeinfectionandtransmissionofhumant-celllymphotropicvirustype1bydendriticcells.journalofvirology83,10908-10921(2009)。在极小百分比的htlv-1感染患者中，发生称为htlv-1相关脊髓病和热带痉挛性下肢轻瘫(ham/tsp)的神经炎症性病症。yamano,y.和sato,t.clinicalpathophysiologyofhumant-lymphotropicvirus-type1-associatedmyelopathy/tropicalspasticparaparesis.frontiersinmicrobiology3,389(2012)。已认识到tax反应性cd8+ctl的产生在ham/tsp的发病机理中起作用，而tax特异性ctl施加针对atl的保护性免疫。
对开发用于特别是从血液产生树突细胞的新方法存在需要，所述树突细胞可治疗性地用于受试者，用作树突细胞疫苗以及用于使细胞毒性t淋巴细胞活化。本发明满足这个需要，并且也提供额外优势。
这个背景信息仅出于提供信息的目的而提供。并非必然意图承认，也不应解释为任何先前信息构成相对于本发明的现有技术。
发明概述
应理解先前对实施方案的一般性描述与以下详细描述两者均是示例性的，因此不限定实施方案的范围。
本文提供一种用以产生具有病毒蛋白tax的原代树突细胞的方法，所述病毒蛋白tax来自不导致白血病的逆转录病毒2型人t细胞白血病病毒(htlv-2)，即与它的病原性对应物htlv-1相关的病毒。
本文显示tax可支配树突细胞，从而引起它们的成熟/活化以及后续诱导极化细胞毒性t淋巴细胞应答。在本公开中，htlv-2tax已作为分子工具被利用来建立原代血液树突细胞系和单核细胞源性树突细胞。提供使得能够产生高度强力抗癌细胞毒性淋巴细胞的人原代血液树突细胞和单核细胞源性树突细胞以及其制备和使用方法。
在一个方面，本发明提供一种工程改造的原代血液树突细胞，其中所述树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。在一些实施方案中，tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞具有组成性成熟和活化表型。工程改造的原代血液树突细胞为cd205+和cd11c+。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞表达一种或多种选自由cd83、cd80、cd86、cd70、ccr7和hla-dr组成的组的树突细胞成熟和活化标志物。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞为tlr3+和tlr4+。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞表达tlr7的裂解形式。在一些实施方案中，树突细胞表达tlr9。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞产生il-1a和tnfα。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞产生il-15。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞产生可忽略水平的il-10和tgfβ。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞表达c-myc、mcl-1、bcl-xl、bcl-2、磷酸化prb、磷酸化cdc、磷酸化stat1、磷酸化stat3和磷酸化stat5中的一者或多者。在一些实施方案中，在工程改造的原代血液树突细胞中，转录因子nf-κb、stat3和ap-1具有活性。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴细胞的增殖。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞已被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。在一些实施方案中，hla蛋白是hla-a2.1。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞具有一种或多种外源添加的抗原或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和人端粒酶逆转录酶的片段的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括seqidno:13。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞以hla限定的方式递呈癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原通过病毒转导来引入。在一些实施方案中，病毒是慢病毒。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生能够以非hla限定的方式杀灭细胞的细胞毒性淋巴细胞。
在另一方面，本发明提供一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品；和
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
在一些实施方案中，方法进一步包括iii)培养所述细胞以诱导它们的成熟和活化。用以诱导工程改造的原代血液树突细胞的成熟和活化的培养步骤不具有限制性。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培养细胞。在一些实施方案中，在包含有效量的il-2的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，方法进一步包括使t细胞从培养的细胞消减。
在另一方面，本发明提供一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品；
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白以及培养所述细胞；
iii)培养所述细胞以诱导它们分化成成熟树突细胞；和
iv)使t细胞从培养的细胞消减。
在另一方面，本发明提供一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品，诸如pbmc样品；
ii)用有效量的植物血球凝集素(phytohemagglutinin，pha)处理所培养的所述细胞；
iii)用有效量的il-2处理所培养的所述细胞；
iv)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白以及培养所述细胞；和
v)使t细胞从培养的细胞消减。
在一些实施方案中，pbmc从leukopak分离。在一些实施方案中，pha的浓度在约1-5μg/ml的范围内。在一些实施方案中，用pha处理细胞约12小时至约36小时。在一些实施方案中，用约100-200单位/ml的il-2处理细胞，并且在包含il-2的培养基中培养一段时期。在一些实施方案中，在包含il-2的培养基中培养细胞约4-5天的时期。在一些实施方案中，在步骤iii)之后对细胞进行操作以表达功能性tax蛋白。
在一些实施方案中，用编码功能性tax蛋白的病毒转导细胞。在一些实施方案中，病毒是慢病毒。在一些实施方案中，在约10μg/ml聚凝胺(polybrene)存在下对细胞进行转导。
在一些实施方案中，在包含约100-200单位/ml的il-2的培养基中进一步培养经转导的细胞。在一些实施方案中，在包含il-2的培养基中进一步培养经转导的细胞约2-3个月。在一些实施方案中，在包含人血清和约100-200单位/ml的il-2的培养基中培养经转导的细胞。在一些实施方案中，在包含人血清和约100-200单位/ml的il-2的培养基中培养经转导的细胞约2-3个月。在一些实施方案中，在包含5％热失活人ab血清和约100-200单位/ml的il-2的完全rpmi1640培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包括完全rpmi1640培养基的培养基中培养细胞，所述完全rpmi1640培养基包含10％胎牛血清和约100-200单位/ml的il-2。
在一些实施方案中，用包含结合t细胞的分子的组合物使t细胞消减。在一些实施方案中，用抗体使t细胞消减。在一些实施方案中，抗体是抗cd3抗体。在一些实施方案中，使抗体缀合于磁珠。
在另一方面，本发明提供一种工程改造的单核细胞源性树突细胞，其中所述树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。在一些实施方案中，tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。工程改造的单核细胞源性树突细胞为cd205+。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞具有组成性成熟和活化表型。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达一种或多种选自由cd83、cd80、cd86和cd70组成的组的树突细胞成熟和活化标志物。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞进一步表达4-1bbl和/或cd4。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够在培养中增殖多达3个月。在一些实施方案中，细胞为tlr3+和tlr4-。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达tlr7的裂解形式。在一些实施方案中，细胞产生il-1a和tnfα。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞产生tgfβ。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞产生il-15。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达以下中的一者或多者：c-myc、mcl-1、bcl-xl、bcl-2、磷酸化prb、磷酸化cdc2、磷酸化stat1、磷酸化stat3和磷酸化stat5。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴细胞的增殖。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞已被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达一种或多种抗原或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和人端粒酶逆转录酶的片段的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括seqidno:13。在一些实施方案中，细胞以hla限定的方式递呈癌抗原。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够对原初淋巴细胞诸如pbmc群体进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够对原初淋巴细胞诸如pbmc群体进行致敏以产生能够以非hla限定的方式杀灭细胞的细胞毒性淋巴细胞。
在另一方面，本发明提供一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含源于单核细胞的不成熟树突细胞的细胞样品；和
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
在一些实施方案中，方法进一步包括在第i)部分之前培养单核细胞以诱导它们分化成不成熟树突细胞。在一些实施方案中，通过使单核细胞与包含诱导单核细胞分化成不成熟树突细胞的有效量的组合物的培养基接触来诱导分化，所述组合物包括但不限于gm-csf；gm-csf和il-4；gm-csf和il-13；gm-csf和il-15；以及ifnα。在一些实施方案中，在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养单核细胞以诱导分化成不成熟树突细胞。
在一些实施方案中，方法在第ii)部分之后进一步包括以下步骤：所述步骤包括培养所述细胞以诱导它们的成熟和活化。用以诱导单核细胞源性树突细胞的成熟和活化的培养步骤不具有限制性。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培养细胞。在一些实施方案中，在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中进一步培养细胞。
在另一方面，本发明提供一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：
i)提供贴附单核细胞；
ii)在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养所述细胞；
iii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白；和
iv)在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养所述功能性tax蛋白表达性细胞。
在一些实施方案中，在步骤iv)之后，方法进一步包括在包含有效量的il-2的培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，使il-4和/或gm-csf融合于fc4。在一些实施方案中，贴附单核细胞来自pbmc，例如约400万个pbmc。在一些实施方案中，第ii)部分的培养包括在包括根据gm-csf-fc4/il-4-fc4产生性293细胞的条件培养基的培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，在包括条件培养基的培养基中在约1:10稀释度下培养细胞约7天。在一些实施方案中，用编码来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白的病毒转导细胞。在一些实施方案中，在约10μg/ml聚凝胺存在下对细胞进行转导。
在一些实施方案中，在包括具有约10％胎牛血清的rpmi1640的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，培养步骤iv)包括在gm-csf-fc4和il-4-fc4存在下，在具有10％fbs的rpmi1640培养基中培养tax蛋白表达性细胞约5-7天，随后在约100-200u/ml的il-2存在下在培养物中维持细胞。
在一些实施方案中，方法进一步包括使单核细胞源性树突细胞活化。在一些实施方案中，活化包括用有效量的tnfα和lps刺激细胞。在一些实施方案中，将细胞刺激约2天。
在另一方面，本发明提供一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括培养原代血液或单核细胞源性树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续一段时期，借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
在另一方面，本发明提供一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括
i)培养本发明的树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续第一时期以产生混合细胞培养物；和
ii)用il-2处理所述混合细胞培养物以及继续培养所述细胞持续第二时期，
借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
在一些实施方案中，包含原初淋巴细胞的细胞包括原初pbmc。在一些实施方案中，原初淋巴细胞从leukopak分离。在一些实施方案中，原初淋巴细胞和树突细胞是同种异体的。在一些实施方案中，树突细胞与原初pbmc的比率是约1:100。在一些实施方案中，在不添加外源性细胞因子下进行步骤i)的培养。在一些实施方案中，第一时期是约2-3天。在一些实施方案中，il-2的浓度是约100-200u/ml。在一些实施方案中，第二时期是2-6周。在一些实施方案中，细胞毒性t淋巴细胞具有抗原特异性，并且以hla限定的方式诱导对靶细胞的细胞溶解。
在一些实施方案中，细胞毒性t淋巴细胞包括能够以非hla限定的方式杀灭靶细胞的cd3+/cd56+t细胞。在一些实施方案中，树突细胞表达4-1bbl。在一些实施方案中，树突细胞已被工程改造来表达4-1bbl。在一些实施方案中，对细胞的非hla限定杀灭通过nkg2d的配体结合来介导。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的根据本发明方法产生的细胞毒性t淋巴细胞。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞使用本发明的原代血液树突细胞和/或单核细胞源性树突细胞产生。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞通过本发明方法产生。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的原代血液树突细胞和/或单核细胞源性树突细胞。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的通过本发明方法产生的原代血液树突细胞和/或单核细胞源性树突细胞。
在一些实施方案中，待治疗的疾病是癌症。在一些实施方案中，癌细胞表达mica/b。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，待治疗的受试者是人。
本发明的其它目标、特征和优势将根据以下详细描述而变得显而易知。然而，应理解，尽管指示本发明的特定实施方案，但详细描述和特定实施例通过仅说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将根据这个详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
附图简述
熟练技术人员将理解下述附图仅出于说明目的。附图不意图以任何方式限制本教义的范围。
图1.建立的ihv-dc细胞系的免疫表型。(a)ihv-dc1。(b)ihv-dc2。(c)来自健康供血者的贴附单核细胞的经gm-csf/il-4刺激和分化的dc的图像。(d)从用tax-gfp慢病毒转导的modc产生的modc-tax细胞的免疫表型。
图2.tlr、细胞因子和细胞信号传导分子在ihv-dc中的表达谱。(a)通过facs考查的tlr3和tlr4在ihv-dc和modc-tax细胞中的表达。(b)使用相关抗体对建立的dc中的tlr1、tlr2、tlr7和tlr9的免疫印迹分析。通过qrt-pcr来确定ihv-dc1细胞(c)、ihv-dc2细胞(d)、modc-tax细胞(e)和tnfα/lps活化的modc(f)中的细胞因子表达谱。(g)通过qrt-pcr来测定c-myc在各种dc中的表达水平。(h)对tax-gfp、bcl-2、bcl-xl和mcl-1在建立的dc中的表达的免疫印迹分析。pbl(来自正常供体的外周血液淋巴细胞)和mt4用于对照。(i)使用特定抗磷酸特异性抗体考查stat1、stat3、stat5、prb或cdc2的磷酸化状态。(j)用于使用从ihv-dc制备的核提取物来检测nf-κb、stat3和ap-1的转录活性的emsa测定。
图3.由ihv-dc对抗原特异性ctl的诱导。(a)ihv-dc2活化的ctl的通过双色facs分析获得的免疫表型。(b)使用相关抗体，用免疫印迹评估从6名供血者产生的ihv-dc活化的ctl中的穿孔素和粒酶b的水平。(c)通过qrt-pcr获得的ihv-dc2活化的ctl的细胞因子表达谱。(d)mt4l细胞(表达荧光素酶的mt4细胞)用hla-a2.1慢病毒转导以产生mt4l-a2.1细胞。使用抗hla-a2-apc，用facs验证mt4l和mt4l-a2.1细胞中的hla-a2表达。(e)用以测定由ihv-dc2活化的ctl对经修饰mt4细胞的细胞溶解的细胞活力测定。(f)nih3t3细胞用荧光素酶和hla-a2慢病毒连同或不与tax-flag慢病毒一起转导以产生3t3l-a2.1和3t3l-a2.1/tax细胞。通过facs达成的3t3细胞中的hla-a2染色显示于左侧图中，而使用抗flag抗体，通过免疫荧光成像来测定tax表达(右侧图)。使用荧光素酶测定(g)和细胞成像分析(h)，进行细胞活力测定以测定由ihv-dc2活化的ctl对3t3l-a2.1和3t3l-a2.1/tax细胞的细胞溶解。**：p<0.01，如通过双尾学生t检验(2-tailstudentt-test)所确定。
图4.由ihv-dc2活化的ctl达成的hla限定的癌杀灭。用以使用荧光素酶测定和细胞成像分析(d)测定由ihv-dc2活化的ctl对a375细胞(a)、panc-1细胞(b)和h1299细胞(c)的细胞溶解的细胞活力测定。(e)对a375、panc-1、h1299和h1299-hla-a2.1细胞中的hla-a2表达的facs分析。通过将hla-a2.1以慢病毒转导至h1299细胞中来产生h1299-hla-a2.1细胞。使用荧光素酶测定(f)和细胞成像分析(g)，进行细胞活力测定以测定由ihv-dc1活化的ctl对h1299/hla-a2.1细胞的细胞溶解。**：p<0.01，如通过双尾学生t检验(2-tailstudentt-test)所确定。
图5.在ihv-dc1细胞中表达htert片段以产生htert特异性ctl。(a)用hla-a2.1慢病毒转导的ihv-dc1细胞中的hla-a2表达。(b)描绘htert上的6个hla-a2限定的ctl表位(aa301-700)。(c)通过使iκbα与tert(aa301-700)融合来产生ptert，其通过慢病毒转导来递送至ihv-dc1细胞中。使用来自用dmso或用mg132(5μm)预处理1小时的ihv-dc的全细胞提取物，用抗iκbα免疫印迹验证ptert的表达。(d)使用抗flag抗体染色获得的hla-a2+nih3t3细胞中flag-tert(aa301-700)表达的图像。使用荧光素酶测定(e)和细胞成像分析(f)，进行细胞活力测定以测定由ihv-dc1或ihv-dc1/ptert活化的ctl对3t3l-a2.1/flag-tert(aa301-700)细胞的细胞溶解。**：p<0.01，如通过双尾学生t检验(2-tailstudentt-test)所确定。
图6.由ihv-dc1活化的cd3+/cd56+ctl达成的非hla限定的癌细胞杀灭。(a)ihv-dc1活化的ctl的免疫表型。(b)如通过facs所考查的各种癌细胞系中的mica/b表达。使用荧光素酶测定，进行细胞活力测定以测定由ihv-dc1活化的ctl对h1299细胞(c)、hela细胞(d)和a375细胞(e)的细胞溶解。对在指示的e:t比率下与ihv-dc1活化的ctl一起孵育的各种癌细胞系(f)和正常纤维母细胞(g)的细胞成像分析。**：p<0.01，如通过双尾学生t检验(2-tailstudentt-test)所确定。
图7.ihv-dc1活化的ctl通过nkg2d和它的配体的相互作用来杀灭癌细胞。(a)在同种型igg抗体或抗nkg2d抗体(50μg/ml)存在下，使k562细胞与ihv-dc1活化的ctl在指示的e:t比率下混合4小时。通过荧光素酶测定来测定细胞溶解。(b)在处于指示剂量下的同种型igg抗体和抗nkg2d抗体存在下，使k562细胞与ihv-dc1活化的ctl在固定e:t比率(2.5:1)下混合4小时。(c)在同种型igg抗体和抗nkg2d抗体(50μg/ml)存在下，使a375细胞与ihv-dc1活化的ctl在指示的e:t比率下混合。通过荧光素酶测定来测定细胞溶解。(d)用hmica慢病毒转导3t3l细胞，并且通过facs来考查hmica的表达。使用荧光素酶测定(e)和细胞成像分析(f)，进行细胞活力测定以测定由ihv-dc1活化的ctl对3t3l/载体和3t3l/hmica细胞的细胞溶解。**：p<0.01，如通过双尾学生t检验(2-tailstudentt-test)所确定。
图8.ihv-dc1活化的ctl以nkg2d依赖性方式杀灭乳腺癌细胞。通过荧光素酶测定(a)和细胞成像分析(b)，进行细胞活力测定以测定由ihv-dc1活化的ctl对mcf-7、mcf-7/adr和hcc1954细胞的细胞溶解。(c)如通过facs所考查的mcf-7、mcf-7/adr和hcc1954细胞中的mica/b表达。(d)在同种型igg抗体(100μg/ml)或nkg2d阻断抗体(100μg/ml)存在下，使mcf-7、mcf-7/adr和hcc1954细胞与ihv-dc1活化的ctl一起在指示的e:t比率下孵育。通过荧光素酶测定来测定由ihv-dc1活化的ctl对各种癌细胞系的细胞溶解。
图9.ihv-dc1活化的ctl抑制nsg小鼠中hcc1954肿瘤的生长。乳腺癌异种移植物和ctl疗法描述于方法中。(a)对照组和ctl治疗组的小鼠的肿瘤体积。(b)在终点时收集的肿瘤的图像。(c)在终点时的肿瘤重量。(d)对照组和ctl治疗组中的肺组织的he染色。(e)使用ihc方法对肿瘤和各种组织的抗人cd3染色。
图10.ihv-dc1活化的ctl抑制nsg小鼠中mcf-7/adr肿瘤的生长。(a)肿瘤体积。(b)在终点时的肿瘤重量。(c)小鼠重量。(d)对照组和ctl治疗组中的小鼠的肺组织的he染色。(e)使用ihc方法对肿瘤和各种组织的抗人cd3染色。
发明详述
本发明者已惊人地发现制备工程改造的树突细胞的方法。工程改造的树突细胞可为原代血液树突细胞或源于单核细胞的树突细胞。工程改造的树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。本发明提供工程改造的树突细胞、制备和使用所述细胞的方法、以及包含所述细胞的药物和疫苗组合物。
在一些实施方案中，本发明的经抗原负载的树突细胞适于用作治疗或预防疾病或的疫苗适用于使t细胞活化，所述t细胞可接着用于疗法中。举例来说，经抗原负载的树突细胞可用于引发针对抗原的免疫应答。它们可作为疫苗用于预防未来感染或疾病，或使免疫系统活化以治疗进行性疾病，所述疾病包括但不限于病原体感染或癌症。可将经抗原负载的树突细胞与适合载体诸如生理缓冲剂或其它可注射液体一起配制以用作疫苗或药物组合物。可以足以引发免疫应答的治疗有效量施用疫苗或药物组合物。
现将详细提及本发明的目前优选实施方案，其连同附图和以下实施例一起用于说明本发明的原理。这些实施方案足够详细地进行描述以使得本领域技术人员能够实施本发明，并且应理解可利用其它实施方案，并且可在不脱离本发明的精神和范围下进行结构、生物学和化学变化。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
除非另外指示，否则本发明的实施采用属于本领域的技能的常规分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。所述技术在文献中有充分说明。参见例如sambrook等molecularcloning:alaboratorymanual,第2版(1989)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等编(1987))；丛书methodsinenzymology(academicpress,inc.)；pcr:apracticalapproach(m.macpherson等irlpressatoxforduniversitypress(1991))；pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.taylor编(1995))；antibodies,alaboratorymanual(harlow和lane编(1988))；usingantibodies,alaboratorymanual(harlow和lane编(1999))；以及animalcellculture(r.i.freshney编(1987))。
分子生物学中常见术语的定义可例如见于以下中：benjaminlewin,genesvii,由oxforduniversitypress出版,2000(isbn019879276x)；kendrew等(编)；theencyclopediaofmolecularbiology,由blackwellpublishers出版,1994(isbn0632021829)；以及roberta.meyers(编),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,由wiley,john&sons,inc.出版,1995(isbn0471186341)。
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且每当适当时，以单数使用的术语也将包括复数，并且反之亦然。在以下阐述的任何定义与那个用词在任何其它文件(包括以引用的方式并入本文的任何文件)中的用法冲突的情况下，出于解释本说明书和它的相关权利要求的目的，将始终以以下阐述的定义为准，除非明确意指相反含义(例如在最初使用术语所处的文件中)。除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。除非上下文另外明确规定，否则如说明书和权利要求中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。举例来说，术语“一个(种)细胞”包括复数个(种)细胞，包括其混合物。对“包含(comprise/comprises/comprising)”和“包括(include/includes/including)”的使用可互换，并且不意图具有限制性。此外，当对一个或多个实施方案的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员将理解在一些特定情况下，所述一个或多个实施方案可使用措辞“基本上由……组成”和/或“由……组成”加以替代描述。
如本文所用，术语“约”意指它与其一起使用的数字的数值加上或减去10％。
“有效量”是足以实现有益或所需结果的量。可以一次或多次施用、施加或剂量施用有效量。举例来说，关于活化的淋巴细胞的术语“有效量”意指产生它被施用所欲达成的期望作用例如抑制癌细胞生长或杀灭癌细胞的量。在树突细胞的情形下，“有效量”意指能够诱导免疫应答例如诱导t淋巴细胞的活化的量。活化的t淋巴细胞可以hla限定的方式或非hla限定的方式起作用。精确量将取决于特定药剂、待治疗的受试者，并且将可由本领域技术人员使用用于确定有效剂量的已知方法和技术确定。
如本文所用，“治疗(treat)”以及它的所有形式和时态(包括例如treating、treated和treatment)可指治疗性或防治性治疗。在本发明的某些方面，需要治疗者包括已患有本发明的病理性病状(包括例如癌症)的那些，在所述情况下，治疗是指向受试者(包括例如需要治疗的人或其它哺乳动物)施用治疗有效量的组合物，以使所述受试者在本发明的病理性病状的征象或症状方面具有改善。改善可为任何可观察或可测量的改善。因此，本领域技术人员认识到治疗可使患者的病状改善，但可为不完全治愈病理性病状。在本发明的其它某些方面，需要治疗者包括已患有癌症的那些以及倾向于患有癌症的那些或其中癌转移待预防的那些。
就“癌症”来说，其意指异常存在展现相对自主生长的细胞，以使癌细胞展现特征在于显著丧失细胞增殖控制的异常生长表型。癌性细胞可为良性或恶性。各种类型的癌症是已知的，并且待治疗的癌症不具有限制性。如本文所用的癌细胞不仅包括原发性癌细胞，而且也包括源于癌细胞的任何细胞。这包括转移的癌细胞以及源于癌细胞的体外培养物和细胞系。癌症包括但不限于实体肿瘤和血液学恶性肿瘤。
术语“抗原”在本领域中是充分理解的，并且包括免疫原性物质即免疫原以及抗原性表位。在一些实施方案中，本发明的工程改造的原代血液树突细胞和单核细胞源性树突细胞可负载有一种或多种用于向其它细胞例如t淋巴细胞递呈的抗原。经抗原负载的树突细胞适用作疫苗以及适用于体外刺激t细胞。
应理解设想任何抗原用于本发明中，因此包括但不限于自体抗原(正常或疾病相关)、感染性抗原(例如微生物抗原、病毒抗原等)或某一其它外来抗原(例如食物组分、花粉等)。术语“抗原”或替代地“免疫原”也适用于具有超过一种免疫原的集合，以使可同时调节对多种免疫原的免疫应答。此外，所述术语包括多种不同免疫原或抗原制剂中的任一者。
在一些实施方案中，抗原来自癌细胞或病原体。在一些实施方案中，癌细胞是乳腺癌细胞。
可将抗原负载至不成熟或成熟树突细胞中。如果将抗原负载至不成熟树突细胞中，那么不成熟树突细胞可接着通过负载过程自身，或通过本文所述的其它成熟方法或为本领域技术人员所知的替代性成熟方法来成熟。将抗原负载于树突细胞上不具有限制性。在一些实施方案中，可使用如本文所述的方法来负载抗原，所述方法包括转染、转导、电穿孔和肽脉冲。在一些实施方案中，癌抗原通过病毒转导来引入。在一些实施方案中，病毒是慢病毒。在一些实施方案中，将抗原以从癌细胞或病原体分离或获得的核酸形式递送至如本文所述的树突细胞中。在一些实施方案中，抗原由能够感染树突细胞的病毒编码。“源于”包括但不限于天然存在的序列的重组变体，包括与无关或相关序列的融合物。
在一些实施方案中，抗原可以抗原自身(例如蛋白质、肽、表位、细胞溶解产物、病毒粒子等)形式负载，或可以编码抗原的核酸形式负载。用于用肽和蛋白质抗原、细胞、细胞或组织溶解产物、病毒或病毒粒子、核酸等负载树突细胞的方法为本领域技术人员所知。
抗原可来自任何来源。然而，在一些实施方案中，一种或多种抗原是受试者自体同源的。就受试者自体同源来说，其意指抗原从受试者取得或获得。作为非限制性实例，抗原可来自从受试者获得的癌细胞或肿瘤组织。可将癌抗原以存在于提取物中、经纯化、经扩增、经体外翻译等的癌细胞、癌细胞或组织溶解产物、来自癌细胞或组织的提取物、癌细胞或组织的纯化或克隆组分、总rna或总mrna、或来自所述细胞或组织的所选rna或mrna形式负载至树突细胞中。在一个实施方案中，将癌抗原工程改造至病毒载体诸如慢病毒载体中以向不成熟或成熟树突细胞施用。在一些实施方案中，抗原可从存在于受试者中的病原体或受病原体感染的细胞取得或获得。
在一些实施方案中，抗原是癌抗原，并且包括人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，癌抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和来自癌细胞的序列的融合蛋白。在一些实施方案中，iκbα分别具有seqidno:11中显示的核苷酸和氨基酸序列和seqidno:12中显示的核苷酸序列。在一些实施方案中，来自癌细胞的序列包括人端粒酶逆转录酶(htert)的片段。在一些实施方案中，htert具有以seqidno:9显示的氨基酸序列和以seqidno:10显示的核苷酸序列。在一些实施方案中，癌抗原包括全长iκbα和htert片段(aa301-700)融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括seqidno:13。
如本文所用，术语“细胞因子”是指对细胞施加多种作用(例如诱导生长或增殖)的众多因子中的任一者。可单独或组合用于实施本发明的细胞因子的非限制性实例包括白介素-2(il-2)、干细胞因子(scf)、白介素-3(il-3)、白介素-4(il-4)、白介素-6(il-6)、白介素-11(il-11)、白介素-12(il-12)、白介素-13(il-13)、白介素-15(il-15)、粒细胞-集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(gm-csf)、白介素-1β(il-1β)、干扰素-γ(ifnγ)、肿瘤坏死因子-α(tnfα)、前列腺素e2(pge2)、mip-11、白血病抑制因子(lif)、c-kit配体、血小板生成素(tpo)和flt3配体。细胞因子可从若干供应商诸如像genzyme(framingham,mass)、genentech(southsanfrancisco,calif.)、amgen(thousandoaks,calif.)、r&dsystems(minneapolis,minn.)和immunex(seattle,wash.)商购获得。尽管未始终明确陈述，但意图与野生型或纯化细胞因子具有类似生物活性的分子(例如重组产生或其突变蛋白)意图在本发明的精神和范围内使用。
术语“树突细胞(dc)”是指见于多种淋巴组织和非淋巴组织中的在形态上类似的细胞类型的群体。steinman,ann.rev.immunol.9:271-296(1991)。树突细胞构成生物体中最强力和优选apc。树突细胞可从单核细胞分化，并且具有与单核细胞不同的表型。举例来说，特定分化标志物cd14抗原不见于树突细胞中，但为单核细胞所具有。已显示成熟dc可提供为t细胞活化和增殖所必需的所有信号。此外，成熟树突细胞不具有吞噬性，而单核细胞和不成熟树突细胞是强烈吞噬性细胞。不成熟dc能够通过胞吞作用、吞噬作用、巨胞饮作用或吸附胞饮作用和受体介导的抗原摄取来捕集抗原，并且在表型上呈cd80-或cd80低、cd83-或cd83低、cd86低，并且具有高细胞内浓度的ii类mhc分子。相较于不成熟dc，成熟dc具有隐蔽形态、较低胞吞能力，并且在表型上呈cd80高、cd83高、cd86高。
如本文所用，“表达”是指多核苷酸被转录成mrna和/或mrna被翻译成肽、多肽或蛋白质所采用的过程。
术语“遗传修饰”意指含有和/或表达外来基因或核酸序列，此转而对细胞或它的后代的基因型或表型进行修饰。
术语“分离”意指与细胞组分和另外组分分离，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段或细胞通常在自然界中相关联。举例来说，关于哺乳动物细胞，在一些实施方案中，经分离哺乳动物细胞从它通常在身体中所见的位置分离，或从身体移除。举例来说，通过白细胞单采术(leukopheresis)收集的白细胞是“分离的”，并且在体外从单核细胞或其它细胞分化的树突细胞是“分离的”。树突细胞也可从异质细胞群体例如它们与其相关联的淋巴细胞进一步分离和纯化。
术语“主要组织相容性复合物”或“mhc”是指编码细胞表面分子的基因的复合物,所述细胞表面分子为向t细胞进行抗原递呈以及为快速移植物排斥所需。在人中，mhc也称为“人白细胞抗原”或“hla”复合物。由mhc编码的蛋白质称为“mhc分子”，并且分类成i类和ii类mhc分子。i类mhc分子包括由在mhc中编码的α链非共价地与β2-微球蛋白连接组成的膜异二聚蛋白质。i类mhc分子由几乎所有有核细胞表达，并且已显示在向cd8t细胞进行抗原递呈中起作用。在人中，i类分子包括hla-a、hla-b和hla-c。ii类mhc分子也包括由非共价缔合的α链和β链组成的膜异二聚蛋白质。已知ii类mhc分子在cd4+t细胞中起作用，并且在人中，包括hla-dp、hla-dq和hla-dr。
如本文所用的“病原体”是指任何致病生物体诸如像细菌、真菌、寄生物或病毒，并且也指其减毒衍生物。
“药物组合物”意图包括活性剂(诸如经抗原负载的树突细胞和/或活化的淋巴细胞)与惰性或活性载体的组合，从而使得所述组合物适于在体外、在体内或离体诊断或治疗使用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖任何标准药物载体，诸如热失活血清加10％dmso加5％右旋糖、磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液诸如油/水或水/油乳液以及各种类型的湿润剂。组合物也可包含佐剂、稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见remington'spharm.sci.第18版(mackpubl.co.,easton(1990))。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换用于指代具有任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知功能。术语“多核苷酸”包括例如单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mrna、trna、rrna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的经分离dna、具有任何序列的经分离rna、核酸探针和引物。除天然核酸分子之外，本发明的核酸分子也可包括经修饰的核酸分子。
术语“肽”以它的最广泛意义用于指代具有两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可由肽键连接。在另一实施方案中，亚基可由其它键例如酯键、醚键等连接。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸以及d光学异构体与l光学异构体两者、氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链较短，那么具有三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链较长，那么肽通常称为多肽或蛋白质。
如本文所用，“受试者”是指任何鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是灵长类动物、啮齿动物、狗或猫。在一些实施方案中，受试者是人。
如本文所用，“单核细胞”是指具有分化成树突细胞的能力的cd14+白细胞。单核细胞能够响应于gm-csf和il-4而分化成不成熟树突细胞。单核细胞可来自任何动物，并且在一些实施方案中是人单核细胞。单核细胞可以诸如但不限于血液、血液部分(例如白血细胞(wbc)、血沉棕黄层、外周血液单核细胞(pbmc)等)的组合物，并且以及以进一步富含单核细胞的组合物提供和孵育。在一个实施方案中，单核细胞连同其它外周血液单核细胞(pbmc)一起例如以白细胞单采术产物的形式提供。在另一实施方案中，单核细胞从pbmc富集，或直接从外周血液分离。分离单核细胞或含有单核细胞的pbmc的方法为本领域技术人员所知。在一些实施方案中，通过白细胞单采术将单核细胞连同其它pbmc一起加以收集。白细胞单采术的方法在本领域中是已知的。在本发明的一些实施方案中，在医院、诊所、医生的办公室等，通过白细胞单采术来从受试者收集包含单核细胞的pbmc。白细胞单采术是从受试者的血液移除白血细胞，所述血液的其余部分接着被回输至所述受试者中所采用的程序。白细胞单采术产物通常是富含pbmc的血液部分，具有低水平的污染性红血细胞、粒细胞和血小板。用于进行白细胞单采术的方法和设备在本领域中是熟知的。对于白细胞单采术的详细信息，参见例如gambrobct.com/products_&_services/。白细胞单采术装置的实例包括由gambrobct制造的cobespectratm和由baxterfenwal制造的cs3000plus血细胞分离机。
“功能性tax蛋白”是能够执行来自t细胞白血病病毒(htlv)的野生型tax蛋白的一种或多种功能的蛋白质。功能性tax蛋白根据它在细胞中诱导nf-κb活化的活性来定义。本发明的工程改造的原代血液树突细胞和单核细胞源性树突细胞包含功能性tax蛋白。在一些实施方案中，tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。在一些实施方案中，功能性tax蛋白是来自人t细胞白血病病毒的全长蛋白质，所述人t细胞白血病病毒选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-1。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-1，并且包含氨基酸序列seqidno:1和核苷酸序列seqidno:2。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-2。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-2，并且包含氨基酸序列seqidno:3和核苷酸序列seqidno:4。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-3。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-3，并且包含氨基酸序列seqidno:5和核苷酸序列seqidno:6。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-4。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-4，并且包含氨基酸序列seqidno:7和核苷酸序列seqidno:8。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-2，所述htlv-2是不在人中导致白血病的病毒。
在一些实施方案中，功能性tax蛋白的核酸序列含有与编码tax多肽的核苷酸序列具有高同一性即至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，功能性tax蛋白的核酸序列包含与以seqidno:2、4、6或8中的任一者阐述的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码功能性tax蛋白的多核苷酸可包括单独全长多肽或其片段的编码序列；或与其它编码序列一起处于阅读框中的全长多肽或片段的编码序列。多核苷酸也可含有非编码5'和3'序列，诸如转录非翻译序列、剪接和多聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和使mrna稳定的序列。
在一些实施方案中，编码功能性tax蛋白的核苷酸序列包括包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与(a)编码具有以seqidno:1、3、5或7中的任一者表示的氨基酸序列的tax蛋白的核苷酸序列；或(b)互补于(a)中的核苷酸序列的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于本发明中的功能性tax蛋白包括seqidno:3。在一些实施方案中，tax蛋白包括seqidno:3的生物活性片段或变体。在一些实施方案中，包括生物活性片段或变体的tax蛋白与seqidno:3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，生物活性片段或变体与seqidno:3的多肽具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方案中，功能性tax蛋白包括包含全长tax蛋白或其生物活性片段的融合蛋白。片段是具有在整体上与以上提及的tax多肽的部分而非全部氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，片段可构成在seqidno:1、3、5或7中的任一者中鉴定的至少约150个连续氨基酸。在一些实施方案中，片段是在seqidno:1、3、5或7中的任一者中鉴定的至少约100、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320或330个连续氨基酸。
在一些实施方案中，片段包括例如截短多肽，其具有tax的氨基酸序列，例外之处是缺失包括氨基末端的一系列连续残基或包括羧基末端的一系列连续残基，或缺失两个系列的连续残基，一个系列包括氨基末端，并且一个系列包括羧基末端。
在一个实施方案中，片段包含seqidno:1、3、5或7中的任一者的最终约290、300、310、320或330个氨基酸。
在一个实施方案中，片段包含seqidno:1、3、5或7中的任一者的前200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320或330个氨基酸。
tax蛋白的生物活性或功能性片段或变体包括具有与seqidno:1、3、5或7中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽或其与seqidno:1、3、5或7中的任一者的相应片段具有至少80％同一性的片段。这个群组中包括确定序列和片段的变体。在一些实施方案中，变体是由于保守性氨基酸取代而与参照物不同的那些，即某一残基被具有类似特征的另一残基取代的那些。典型取代在ala、val、leu和ile之间；在ser和thr之间；在酸性残基asp和glu之间；在asn和gln之间；以及在碱性残基lys和arg或芳族残基phe和tyr之间。在一些实施方案中，多肽是其中数个、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸以任何组合被取代、缺失或添加的变体。
利用已知计算机程序诸如bestfit程序(wisconsin序列分析包,用于unix的第10版,geneticscomputergroup,universityresearchpark,575sciencedrive,madison,wis.53711)的常规手段可用于确定特定序列的同一性百分比。
如本文方法中所述，对不成熟树突细胞进行操作以表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。根据本发明的存在于如本文所述的树突细胞中的功能性tax蛋白并非由于t细胞白血病病毒(即非工程改造的病毒或野生型病毒)感染不成熟树突细胞而表达。而是，通过其它机理来将编码功能性tax蛋白的核酸递送至细胞中，诸如工程改造包含功能性tax蛋白的核酸构建体以及将所述构建体递送至不成熟树突细胞中。在一些实施方案中，编码功能性tax蛋白的核酸可被工程改造于病毒载体中并用于对细胞进行转导。在一些实施方案中，在约10μg/ml聚凝胺存在下对细胞进行转导。
可用于对细胞进行转导的病毒载体不具有限制性。在一些实施方案中，病毒载体将通常包括高度减毒的非复制型病毒。病毒载体包括但不限于dna病毒载体诸如基于腺病毒、单纯疱疹病毒、禽类病毒诸如新城病病毒(newcastlediseasevirus)、痘病毒诸如痘苗病毒和细小病毒(包括腺相关病毒)的那些；以及rna病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体。适用于免疫方案中的痘苗载体和方法描述于美国专利号4,722,848中。逆转录病毒载体包括慢病毒诸如人免疫缺陷病毒。naldini等(1996)science272:263-267。可使用具有目标核苷酸序列作为逆转录病毒基因组的一部分的复制缺陷性逆转录病毒载体。所述载体已被详细描述。(miller等(1990)mol.cell.biol.10:4239；kolberg,r.(1992)j.nihres.4:43；cornetta等(1991)hum.genetherapy2:215)。
适用于本发明中的腺病毒和腺相关病毒载体可根据本领域中已教导的方法来产生。(参见例如karlsson等(1986)embo5:2377；carter(1992)currentopinioninbiotechnology3:533-539；muzcyzka(1992)currenttop.microbiol.immunol.158:97-129；genetargeting:apracticalapproach(1992)a.l.joyner编,oxforduniversitypress,ny)。若干不同方法是可行的。
α病毒载体诸如委内瑞拉马脑炎(venezuelanequineencephalitis，vee)病毒、塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus，sfv)和辛德毕斯病毒(sindbisvirus)载体可用于高效基因递送。复制缺陷性载体是可用的。
描述可用于本发明方法中的病毒载体的额外文献包括以下：horwitz,m.s.,adenoviridaeandtheirreplication,infields,b.等(编)virology,第2卷,ravenpressnewyork,第1679-1721页,1990)；graham,f.等,第109-128页,methodsinmolecularbiology,第7卷:genetransferandexpressionprotocols,murray,e.(编),humanapress,clifton,n.j.(1991)；miller等(1995)fasebjournal9:190-199,schreier(1994)pharmaceuticaactahelvetiae68:145-159；schneider和french(1993)circulation88:1937-1942；curiel等(1992)humangenetherapy3:147-154；wo95/00655；wo95/16772；wo95/23867；wo94/26914；wo95/02697(1995年1月26日)；以及wo95/25071。
在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒/慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、α病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。
i.工程改造的原代血液树突细胞和制备方法
a.工程改造的原代血液树突细胞
在一个实施方案中，本发明提供一种工程改造的原代血液树突细胞，其中所述树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。根据本发明，原代血液树突细胞为cd205+和cd11c+。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞通过如本文所述的方法制备。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞具有组成性成熟和活化表型。在一些实施方案中，树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。在一些实施方案中，树突细胞包含一种或多种选自由cd83、cd80、cd86、cd70、ccr7和hla-dr组成的组的成熟和活化标志物。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞可通过存在或不存在各种标志物，它们产生各种细胞因子的能力以及在悬浮培养中的生长来进一步表征。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞为tlr3+和tlr4-。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞包含tlr7的裂解形式。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞表达tlr9。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞产生il-1a和tnfα。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞产生il-15。
可使用已知技术诸如荧光激活的细胞分选(facs)来测定存在或不存在某些标志物。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞产生可忽略水平的il-10和tgfβ。在一些实施方案中，树突细胞能够在悬浮培养中生长。
细胞的来源不具有特定限制性。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞可源于来自鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或哺乳动物的血细胞。在一些实施方案中，细胞源于来自灵长类动物、啮齿动物(诸如大鼠、小鼠或豚鼠)、狗或猫的血细胞。在一些实施方案中，细胞源于来自人的血细胞。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞进一步表达c-myc。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞进一步表达mcl-1、bcl-xl、bcl-2、磷酸化prb、磷酸化cdc2、磷酸化stat1、磷酸化stat3和磷酸化stat5中的一者或多者。在一些实施方案中，转录因子nf-κb、stat3和ap-1具有活性。
工程改造的原代血液树突细胞可被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。hla是为人所特有的主要组织相容性复合物(mhc)抗原。hla-a、hla-b和hla-c是人i类mhc细胞表面受体的类型。所述受体是异二聚体，并且由重型α链和较小β链组成。α链由变体hla-a、hla-b或hla-c基因编码，并且β链是不变的β2微球蛋白分子。β2微球蛋白由人基因组的单独区域编码。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞可被遗传修饰来表达hla-a、hla-b或hla-c中的一者或多者。在一个实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞被遗传修饰来表达hla-a。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞可被遗传修饰来表达hla-a2.1。在一些实施方案中，hla-a2.1的氨基酸序列是seqidno:15。
工程改造的原代血液树突细胞可负载有一种或多种抗原。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞具有一种或多种抗原或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，抗原是来自病原性生物体的抗原。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞可诱导原初淋巴细胞的增殖。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴细胞的增殖。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞包括如实施例1中所述的细胞系ihv-dc1和ihv-dc2。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞能够对原初淋巴细胞(诸如pbmc群体)进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞以hla限定的方式递呈抗原。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞能够对原初淋巴细胞(诸如pbmc群体)进行致敏以产生能够以非hla限定的方式杀灭细胞的细胞毒性淋巴细胞。
b.制备工程改造的原代血液树突细胞的方法
本发明的工程改造的原代血液树突细胞可通过多种方法制备，并且不具有限制性。在一些实施方案中，根据本文所述的方法制备工程改造的原代血液树突细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品；和
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
在一些实施方案中，方法进一步包括iii)培养所述细胞以诱导它们的成熟和活化。用以诱导工程改造的原代血液树突细胞的成熟和活化的培养步骤不具有限制性。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培养细胞。在一些实施方案中，在包含有效量的il-2的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，il-2的浓度包括至少约10单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约50单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约100单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度在约100-200单位/ml的范围内。il-2可以重组形式提供。重组il-2可从nihaids试剂计划(nihaidsreagentprogram，germantown,maryland)获得。
在一些实施方案中，方法进一步包括使t细胞从培养的细胞消减。
在一个实施方案中，本发明提供一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品；
ii)用有效量的植物血球凝集素(pha)处理所培养的所述细胞；
iii)用有效量的il-2处理所培养的所述细胞；
iv)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白；和
v)使t细胞从培养的细胞消减。
在一些实施方案中，包含不成熟树突细胞的细胞样品包括pbmc样品。在一些实施方案中，pbmc来自待随后用树突细胞或由树突细胞活化的t淋巴细胞治疗的受试者。在一些实施方案中，pbmc从leukopak分离。在一些实施方案中，pbmc从健康供血者制备。举例来说，来自健康供血者的leukopak可从血库获得。pbmc可使用ficoll-paque方法来分离。举例来说，可使来自leukopak的10ml血液与10ml无ca2+/mg2+的pbs缓冲液在50ml锥形管中混合。可将15mlficoll-paqueplus(gehealthcare)吸移于单独50ml管中。可将20ml稀释血液分层至ficoll上。可使样品在室温(rt)下在400xg下旋转30分钟。在稀释血浆/ficoll界面处收集pbmc层，并且可添加pbs缓冲液以达成40ml的总体积，接着在室温下在200xg下旋转10分钟。沉淀可用pbs洗涤，并且在室温下在200xg下再次旋转10分钟。可对细胞数目进行计数，并且可用pha(5μg/ml)和il-2(100u/ml)刺激200万个新鲜pbmc。
在一些实施方案中，第ii)部分的pha的浓度是至少约1μg/ml。在一些实施方案中，pha的浓度在约1-30μg/ml的范围内。在一些实施方案中，第ii)部分的pha的浓度在约1-5μg/ml的范围内。在一些实施方案中，第ii)部分的pha的浓度是至少约5μg/ml。在一些实施方案中，用pha处理细胞约12小时至约36小时。在一些实施方案中，用pha处理细胞约24小时。
在一些实施方案中，在用pha处理之后，用il-2处理细胞。在一些实施方案中，用至少约10单位/ml的il-2处理细胞。在一些实施方案中，用至少约50单位/ml的il-2处理细胞。在一些实施方案中，在表达功能性tax蛋白之前，用约10-500单位/ml的il-2处理细胞，并且在包含il-2的培养基中培养一段时期。在一些实施方案中，用约100-200单位/mlil-2处理细胞，并且在包含il-2的培养基中培养一段时期。在一些实施方案中，在包含il-2的培养基中培养细胞持续在约2-10天的范围内的时期。在一些实施方案中，在包含约100-200单位/mlil-2的培养基中培养细胞持续约4-5天的时期。
对细胞进行操作以表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。根据本发明的存在于如本文所述的树突细胞中的功能性tax蛋白并非由于t细胞白血病病毒(即非工程改造的病毒或野生型病毒)感染不成熟树突细胞而表达。而是，通过其它机理来将编码功能性tax蛋白的核酸递送至细胞中，诸如工程改造包含功能性tax蛋白的核酸构建体以及将所述构建体递送至不成熟树突细胞中。在一些实施方案中，tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-2，所述htlv-2是不在人中导致白血病的病毒。
在一些实施方案中，编码功能性tax蛋白的核酸可被工程改造于病毒载体中并用于对细胞进行转导。在一些实施方案中，在约10μg/ml聚凝胺存在下对细胞进行转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒/慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、α病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。
在一些实施方案中，将功能性tax蛋白制备于慢病毒载体中，并且如下培养和转导细胞。可使来自htlv-2的tax基因与编码增强绿色荧光蛋白(egfp)的片段融合，并且可将tax2-gfp融合片段克隆至慢病毒载体中。在一些实施方案中，tax2-gfp融合物具有氨基酸序列seqidno:16和核苷酸序列seqidno:17。为产生tax2-gfp慢病毒，可使用superfect转染试剂(qiagen)将慢病毒tax2-gfp载体与含有vsv-g、gag-pol和rev的表达质粒的包装质粒混合物(lnvitrogen)一起共转染至293细胞中。可收集病毒上清液，并且可使其在25,000rpm/4℃下超速离心2小时。病毒沉淀可用补充有10％热失活胎牛血清(fbs)(sigma)的rpmi1640培养基再悬浮，并且储存在-80℃下。可用pha(5μg/ml)刺激200万个新鲜分离的pbmc24小时。次日，可用完全rpml1640培养基洗涤细胞一次，随后添加重组il-2(100单位/ml)。可将活化的pbmc培养4-5天。可使200万个活化的pbmc与tax2-gfp慢病毒在约20的moi(感染复数)下，外加添加聚凝胺(6μg/ml)下进行混合。在细胞培养孵育器中在32℃/5％co2下孵育细胞-慢病毒混合物16小时。次日，经转导的细胞可用完全rpml1640培养基洗涤一次，接着放置在具有补充有重组il-2(100单位/ml)的完全rpml1640培养基的培养烧瓶中。在一些实施方案中，完全培养基中的10％fbs可用来自sigma的5％热失活人ab血清替换。
在一些实施方案中，在包含有效量的il-2的培养基中进一步培养经转导的细胞以有助于它们的成熟和活化。在一些实施方案中，il-2的浓度包括至少约10单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约50单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约100单位/ml。在一些实施方案中，在包含约100-200单位/ml的il-2的培养基中培养经转导的细胞。在一些实施方案中，在包含有效量的il-2的培养基中进一步培养经转导的细胞约2-3个月。在一些实施方案中，培养基包含100-200单位/ml的il-2和血清。在一些实施方案中，培养基包含约10％胎牛血清和100-200单位/ml的il-2。在一些实施方案中，培养基包含约5％人血清和100-200单位/ml的il-2。在一些实施方案中，在包含il-2和人血清的培养基中培养经转导的细胞约2-3个月。在一些实施方案中，培养基包含5％热失活人ab血清和100-200单位/ml的il-2。培养基通常包括基础培养基。基础培养基不具有限制性。在一些实施方案中，基础培养基是完全rpmi1640培养基。
可使用已知方法使t细胞从培养的细胞消减。在一些实施方案中，用包含结合t细胞的分子的组合物使t细胞消减。在一些实施方案中，用抗体使t细胞消减。在一些实施方案中，抗体是抗cd3抗体。在一些实施方案中，使抗体缀合于磁珠。在一些实施方案中，通过细胞分选或流式细胞术来使t细胞消减。
在一些实施方案中，如下使t细胞消减。在慢病毒转导之后2至3周，可使1000万个经转导的细胞与100μl抗cd3磁珠(invitrogen)一起在4℃下孵育30分钟。可将在磁棒下未结合于珠粒的细胞吸出，并且在6孔培养板中在补充有il-2的完全rpml1640培养基中培养。在一些实施方案中，可用facs考查cd3阴性选择细胞以测定细胞纯度。在一些实施方案中，如果撷取的细胞群体不纯，那么如果需要，可进行额外各轮抗cd3阴性选择。
在一些实施方案中，可在包含有效量的il-2的培养基中进一步培养消减了t细胞的细胞群体。在一些实施方案中，il-2的浓度是约100-200单位/ml。在一些实施方案中，在补充有100-200单位/mlil-2的完全rpml1640培养基中培养cd3阴性细胞群体。在一些实施方案中，在cd3阴性选择之后约2个月，可使用facs用一组抗体分析cd3阴性细胞群体以确定它们的免疫表型。
在一些实施方案中，根据方法产生的工程改造的原代血液树突细胞具有组成性成熟和活化表型。在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞包含成熟和活化标志物，所述标志物选自由cd83、cd80、cd86、cd70、ccr7、4-1bbl和hla-dr及其组合组成的组。
在一些实施方案中，方法进一步包括用一种或多种抗原或其抗原片段或变体负载原代血液树突细胞。在一些实施方案中，方法包括用编码一种或多种抗原或其抗原片段或变体的病毒载体对细胞进行转导。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。
在一些实施方案中，原代血液树突细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或衍生物。在一些实施方案中，人端粒酶逆转录酶氨基酸序列包括seqidno:9，并且核苷酸序列包括seqidno:10。
在一些实施方案中，人端粒酶逆转录酶的核酸序列含有与编码人端粒酶逆转录酶多肽的核苷酸序列具有高度同一性即至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，人端粒酶逆转录酶的核酸序列包含与以seqidno:10阐述的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码人端粒酶逆转录酶的多核苷酸可包括单独全长多肽或其片段的编码序列；或与其它编码序列一起处于阅读框中的全长多肽或片段的编码序列。多核苷酸也可含有非编码5'和3'序列，诸如转录非翻译序列、剪接和多聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和使mrna稳定的序列。
在一些实施方案中，编码人端粒酶逆转录酶的核苷酸序列包括包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与(a)编码具有seqidno:9中的氨基酸序列的人端粒酶逆转录酶的核苷酸序列；或(b)互补于(a)中的核苷酸序列的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于本发明中的人端粒酶逆转录酶包括seqidno:9。在一些实施方案中，人端粒酶逆转录酶包括seqidno:9的抗原片段或变体。在一些实施方案中，包括抗原片段或变体的人端粒酶逆转录酶与seqidno:9具有至少80％同一性。在一些实施方案中，抗原片段或变体与seqidno:9的多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方案中，人端粒酶逆转录酶包括包含全长人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或衍生物的融合蛋白。片段是具有在整体上与以上提及的人端粒酶逆转录酶的部分而非全部氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，片段可构成在seqidno:9中鉴定的至少约250个连续氨基酸。在一些实施方案中，片段是在seqidno:9中鉴定的至少约250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或1050个连续氨基酸。
在一些实施方案中，片段包括例如截短多肽，其具有人端粒酶逆转录酶的氨基酸序列，例外之处是缺失包括氨基末端的一系列连续残基或包括羧基末端的一系列连续残基，或缺失两个系列的连续残基，一个系列包括氨基末端，并且一个系列包括羧基末端。
人端粒酶逆转录酶的抗原片段或变体包括具有与seqidno:9具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，或其与seqidno:9的相应片段具有至少90％同一性的片段。这个组中包括确定序列和片段的变体。在一些实施方案中，变体是由于保守性氨基酸取代而与参照物不同的那些，即某一残基被具有类似特征的另一残基取代的那些。典型取代在ala、val、leu和ile之间；在ser和thr之间；在酸性残基asp和glu之间；在asn和gln之间；以及在碱性残基lys和arg或芳族残基phe和tyr之间。在一些实施方案中，多肽是其中数个、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸以任何组合被取代、缺失或添加的变体。
在一些实施方案中，抗原包括融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含iκbα与抗原融合。在一些实施方案中，iκbα的氨基酸序列包括seqidno:11，并且核苷酸序列包括seqidno:12。在一些实施方案中，融合蛋白包含iκbα的蛋白酶体靶序列和抗原诸如癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原是人端粒酶逆转录酶的片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含iκbα与人端粒酶逆转录酶的片段融合，并且包含氨基酸序列seqidno:13和包括seqidno:14的核苷酸序列。
在一些实施方案中，方法进一步包括遗传修饰原代血液树突细胞以表达一种或多种hla蛋白。在一些实施方案中，方法包括遗传修饰原代血液树突细胞以表达hla-a、hla-b或hla-c中的一者或多者。在一些实施方案中，原代血液树突细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。在一些实施方案中，hla-a2.1的氨基酸序列是seqidno:15。
在一些实施方案中，工程改造的原代血液树突细胞的功能性可根据它们对原初淋巴细胞进行致敏的能力来确定。在一些实施方案中，这用称为混合白细胞反应(mlr)的测定进行。在一些实施方案中，使约200万个未刺激(原初)同种异体pbmc与工程改造的原代血液树突细胞(例如2x104个细胞)以约100:1的比率在不添加任何细胞因子和生长因子的情况下进行混合。10-14天后，可将il-2添加至细胞培养物中。可分别用facs和细胞毒性测定来确定增殖细胞的免疫表型和肿瘤杀灭活性。
在一些实施方案中，本发明提供一种根据任何上述方法制备的原代血液树突细胞。
ii.工程改造的单核细胞源性树突细胞和制备方法
a.工程改造的单核细胞源性树突细胞
在一些实施方案中，本发明提供一种工程改造的单核细胞源性树突细胞，其中所述树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。单核细胞源性树突细胞为cd205+。
细胞的来源不具有特定限制性。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞可源于来自鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或哺乳动物的单核细胞。在一些实施方案中，细胞源于来自灵长类动物、啮齿动物诸如大鼠、小鼠或豚鼠、狗或猫的单核细胞。在一些实施方案中，细胞源于来自人的单核细胞。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞具有组成性成熟和活化表型。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。在一些实施方案中，树突细胞成熟和活化标志物选自由cd83、cd80、cd86和cd70组成的组。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞可通过存在或不存在各种标志物，它们产生各种细胞因子的能力以及它们的生长特征来进一步表征。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达tlr7的裂解形式。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞产生il-1a和tnfα。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞产生tgfβ。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞产生il-15。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞表达以下中的一者或多者：c-myc、mcl-1、bcl-xl、bcl-2、磷酸化prb、磷酸化cdc2、磷酸化stat1、磷酸化stat3和磷酸化stat5。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞进一步表达4-1bbl和/或cd4。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞为tlr3+和tlr4-。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够在悬浮培养中生长。在一些实施方案中，单核细胞源性树突细胞能够在培养中增殖多达3个月。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴细胞的增殖。
工程改造的单核细胞源性树突细胞可被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞可被遗传修饰来表达hla-a、hla-b或hla-c中的一者或多者。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞被遗传修饰来表达hla-a。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞可被遗传修饰来表达hla-a2.1。在一些实施方案中，hla-a2.1的氨基酸序列是seqidno:15。
工程改造的单核细胞源性树突细胞可负载有一种或多种抗原。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞递呈一种或多种抗原或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，抗原是来自病原性生物体的抗原。
将抗原负载于工程改造的单核细胞源性树突细胞上不具有限制性。在一些实施方案中，可使用如本文所述的方法来负载抗原，所述方法包括转染、转导、电穿孔和肽脉冲。在一些实施方案中，癌抗原通过病毒转导来引入。在一些实施方案中，病毒是慢病毒。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞可诱导原初淋巴细胞的增殖。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够对原初淋巴细胞(诸如pbmc群体)进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞以hla限定的方式递呈抗原。在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞能够对原初淋巴细胞(诸如pbmc群体)进行致敏以产生能够以非hla限定的方式杀灭细胞的细胞毒性淋巴细胞。
b.制备工程改造的单核细胞源性树突细胞的方法
本发明的工程改造的单核细胞源性树突细胞可通过多种方法制备，并且不具有限制性。在一些实施方案中，根据本文所述的方法制备工程改造的单核细胞源性树突细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含源于单核细胞的不成熟树突细胞的细胞样品；和
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
在一些实施方案中，方法进一步包括在第i)部分之前培养单核细胞以诱导它们分化成不成熟树突细胞。在一些实施方案中，通过使单核细胞与包含诱导单核细胞分化成不成熟树突细胞的有效量的组合物的培养基接触来诱导分化，所述组合物诸如但不限于gm-csf；gm-csf和il-4；gm-csf和il-13；gm-csf和il-15；以及ifnα。在一些实施方案中，在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养单核细胞以诱导分化成不成熟树突细胞。
在一些实施方案中，方法在第ii)部分之后进一步包括以下步骤：所述步骤包括培养所述细胞以诱导它们的成熟和活化。用以诱导单核细胞源性树突细胞的成熟和活化的培养步骤不具有限制性。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培养细胞。在一些实施方案中，在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中进一步培养细胞。
用于从受试者收集单核细胞和包含单核细胞的pbmc的多种方法为本领域普通技术人员所知。对于用于收集pbmc以及淘析以纯化单核细胞的白细胞单采术的详细信息，参见例如gambrobct.com/products_&_services/。在一个实施方案中，通过以下方式来获得pbmc：将血液收集在肝素化注射器中，在pbs中稀释，在histopaque1077(sigma)上分层，离心并在界面处回收pbmc。参见woodhead等(2000)internationalimmunol12:1051-1061。收集、纯化或分级分离pbmc的额外方法为本领域普通技术人员所知。
在一些实施方案中，方法使用富集单核细胞培养。使单核细胞富集的方法为本领域普通技术人员所知，并且包括但不限于密度梯度离心(例如稀释ficoll密度梯度离心、稀释percoll密度梯度离心等)、淘析、贴附于塑料、切向流过滤、荧光激活的细胞分选(facs)、免疫细胞分离技术(用以选择单核细胞或移除非单核细胞(例如白细胞、巨噬细胞、粒细胞等)的抗体淘选、差异性溶解、磁性细胞分选等)、在用塑料微载体珠粒涂布的塑料培养袋中培养等。参见例如o'doherty等(1993)jexpmed178:1067-1076；young等(1990)jexpmed171:1315-1332；freudenthal等(1990)pnas87:7698-7702；bernhard等(1995)cancerres55:1099-1104；caux等(1992)nature360:258-261；read等(2003)“evaluationofaclosedautomatedsystemtoisolateperipheralbloodmonocytesfordendriticdell(dc)immunotherapy”,isct的第9届年会；mu等(2003)scandjimmunol58:578-586；maffei等(2000)transfusion40:1419-1420；mitenyibiotec.com；meyer-wentrup等(2003)jhematotherstemcellres12:289-299；以及wo2004/000444，所述参考文献的内容以引用的方式并入本文。举例来说，磁性细胞分选可用于通过阳性选择(cd14+细胞)或通过阴性选择(即移除不是单核细胞的细胞；例如cd3+、cd19+和cd2+细胞)来使单核细胞富集。
在一些实施方案中，通过淘析来从白细胞单采术产物使单核细胞富集，所述淘析是一种用以由主题白细胞单采术分离单核细胞的自动化方法。白细胞单采术的方法在本领域中是已知的。举例来说，可在gambrobctelutratm细胞分离系统(gambrobct,lakewood,colo.)上进行淘析。可通过将1000ml5％人白蛋白血清(hsa)添加至一袋4l汉克氏平衡盐溶液(hank'sbalancedsaltsolution，hbss)中来制备淘析缓冲液。可根据制造商方案，通过淘析来对细胞进行分级分离。在一个实施方案中，制造商(gambro)方案的改进形式用于淘析，其中最终转子停止部分是第四部分而非第五部分。可对单核细胞部分进行cbc以及差异分析以验证纯度和回收率。在一些实施方案中，单核细胞纯度可通过关于cd14进行免疫表型分析来评估。
在一些实施方案中，在使细胞分化成树突细胞之前，使单核细胞富集。特定来说，可进一步纯化pbmc，或可在这个孵育时期期间使单核细胞从pbmc富集。在一个实施方案中，可在孵育时期之后，通过在容器(优选是塑料容器)中培养以及选择贴附单核细胞来使单核细胞从pbmc富集。
在一个实施方案中，在包含诱导单核细胞分化成不成熟或成熟树突细胞的组合物的培养基中培养单核细胞。诱导单核细胞分化成不成熟树突细胞的组合物为本领域技术人员所知。此类组合物包括但不限于gm-csf+il-4；gm-csf+il-13；gm-csf+il-15；ifnα；和gm-csf+tnfα。在一些实施方案中，诱导分化的组合物是gm-csf+il-4。在一些实施方案中，gm-csf和il-4的浓度可在约400至2000单位/ml各细胞因子的范围内。在一些实施方案中，gm-csf和il-4的浓度是500至1000单位/ml各细胞因子。在一个实施方案中，使单核细胞与gm-csf和il-4接触约4-7天，在一些实施方案中，接触约5-6天，在所述时间期间，单核细胞分化成不成熟树突细胞。也可利用包含有效量的gm-csf和il-4的条件培养基。在一些实施方案中，培养包括在包括根据gm-csf-fc4/il-4-fc4产生性293细胞的条件培养基的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包括条件培养基的培养基中在约1:10稀释度下培养细胞。
在单核细胞分化成不成熟树突细胞以及表达功能性tax蛋白之后，在一些实施方案中，可使不成熟树突细胞成熟成为成熟树突细胞。在一个实施方案中，通过与包含有效量的il-2的培养基接触来使不成熟树突细胞成熟。在一些实施方案中，il-2的浓度包括至少约10单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约50单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约100单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度在约100-200单位/ml的范围内。
在另一实施方案中，本发明提供一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：
i)提供贴附单核细胞；
ii)在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养所述细胞；
iii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白；
iv)在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养所述功能性tax蛋白表达性细胞。
在一些实施方案中，贴附单核细胞从pbmc分离。在一些实施方案中，贴附单核细胞从约400万个pbmc分离。在一些实施方案中，在表达功能性tax蛋白以及在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养的步骤之后，方法进一步包括在包含il-2(例如包含约100-200单位/ml)的培养基中培养细胞。
在一些实施方案中，使il-4和/或gm-csf融合于fc4。在一些实施方案中，il-4和/或gm-csf可由条件培养基提供。在一些实施方案中，第ii)部分的培养包括在包括根据gm-csf-fc4/il-4-fc4产生性293细胞的条件培养基的培养基中培养所述细胞。在一些实施方案中，在包括条件培养基的培养基中以约1:10稀释度培养细胞约7天。
对细胞进行操作以表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。根据本发明的存在于如本文所述的树突细胞中的功能性tax蛋白并非由于t细胞白血病病毒(即非工程改造的病毒或野生型病毒)感染不成熟树突细胞而表达。而是，通过其它机理来将编码功能性tax蛋白的核酸递送至细胞中，诸如工程改造包含功能性tax蛋白的核酸构建体以及将所述构建体递送至不成熟树突细胞中。在一些实施方案中，tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。在一些实施方案中，tax蛋白来自htlv-2，所述htlv-2是不在人中导致白血病的病毒。
在一些实施方案中，编码功能性tax蛋白的核酸可被工程改造于病毒载体中并用于对细胞进行转导。在一些实施方案中，在有效量的聚凝胺例如约10μg/ml聚凝胺存在下对细胞进行转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒/慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、α病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。
用于培养细胞的基础培养基不具有限制性。在一些实施方案中，培养基包括具有约10％胎牛血清的rpmi1640培养基。在一些实施方案中，第iv)培养部分包括在有效量的gm-csf-fc4和il-4-fc4存在下，在具有10％fbs的rpmi1640培养基中培养tax蛋白表达性细胞约5-7天，随后在约100-200单位/ml的il-2存在下在培养中维持细胞。
在一些实施方案中，方法进一步包括使单核细胞源性树突细胞活化。在一些实施方案中，用有效量的tnfα和lps刺激单核细胞源性树突细胞。在一些实施方案中，以约10-250ng/ml的量施用tnfα，并且以约1-5μg/ml的量施用lps。在一些实施方案中，将细胞刺激1-5天。在一些实施方案中，将细胞刺激约2天。
在一些实施方案中，通过方法产生的单核细胞源性树突细胞具有组成性成熟和活化表型。在一些实施方案中，单核细胞源性树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。在一些实施方案中，单核细胞源性树突细胞成熟和活化标志物选自由cd83、cd80、cd86和cd70组成的组。在一些实施方案中，单核细胞源性树突细胞进一步表达4-1bbl和/或cd4。
在一些实施方案中，单核细胞源性树突细胞能够在培养中增殖多达3个月。
在一些实施方案中，方法进一步包括用一种或多种抗原或其抗原片段或变体负载单核细胞源性树突细胞。在一些实施方案中，方法包括用编码一种或多种抗原或其抗原片段或变体的病毒载体对细胞进行转导。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，单核细胞源性树突细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。在一些实施方案中，癌抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和人端粒酶逆转录酶的片段的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括seqidno:13。
在一些实施方案中，方法进一步包括遗传修饰单核细胞源性树突细胞以表达一种或多种hla蛋白。在一些实施方案中，方法包括用编码一种或多种hla蛋白的病毒载体对细胞进行转导。在一些实施方案中，方法包括遗传修饰单核细胞源性树突细胞以表达hla-a、hla-b或hla-c中的一者或多者。在一些实施方案中，树突细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。在一些实施方案中，hla-a2.1的氨基酸序列是seqidno:15。
在一些实施方案中，工程改造的单核细胞源性树突细胞的功能性可根据它们对原初淋巴细胞进行致敏的能力来确定。在一些实施方案中，这用称为混合白细胞反应(mlr)的测定进行。在一些实施方案中，使约200万个未刺激(原初)同种异体pbmc与工程改造的单核细胞源性树突细胞(例如2x104个细胞)以约100:1的比率在不添加任何细胞因子和生长因子的情况下进行混合。10-14天后，可将il-2添加至细胞培养物中。可分别用facs和细胞毒性测定来确定增殖细胞的免疫表型和肿瘤杀灭活性。
在一些实施方案中，本发明提供一种根据任何上述方法制备的单核细胞源性树突细胞。
iii.产生细胞毒性t淋巴细胞的方法
在另一实施方案中，本发明提供一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括培养本发明的原代血液树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续一段时期，借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括培养本发明的单核细胞源性树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续一段时期，借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括
i)培养本发明的原代血液树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续第一时期以产生混合细胞培养物；和
ii)用有效量的il-2处理所述混合细胞培养物以及继续培养所述细胞持续第二时期，
借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括
i)培养本发明的单核细胞源性树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续第一时期以产生混合细胞培养物；和
ii)用有效量的il-2处理所述混合细胞培养物以及继续培养所述细胞持续第二时期，
借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
在一些实施方案中，包含原初淋巴细胞的细胞包括原初pbmc。在一些实施方案中，原初淋巴细胞从leukopak分离。在一些实施方案中，原初淋巴细胞和树突细胞是同种异体的。
树突细胞与原初pbmc的比率不具有特定限制性。在一些实施方案中，树突细胞与原初pbmc的比率是约1:10、约1:25、约1:50、约1:100、约1:250或约1:500。在一些实施方案中，树突细胞与原初pbmc的比率是约1:100。
在一些实施方案中，在不添加外源性细胞因子的情况下进行步骤i)的培养。在一些实施方案中，第一时期是约2-3天。
在一些实施方案中，il-2的浓度包括至少约10单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约50单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是至少约100单位/ml。在一些实施方案中，il-2的浓度是约100-200单位/ml。在一些实施方案中，第二时期是约2-6周。
在一些实施方案中，细胞毒性t淋巴细胞具有抗原特异性，并且以hla限定的方式诱导对靶细胞的细胞溶解。
在一些实施方案中，细胞毒性t淋巴细胞包括能够以非hla限定的方式杀灭靶细胞的cd3+/cd56+t细胞。在一些实施方案中，树突细胞表达4-1bbl。在一些实施方案中，树突细胞已被工程改造来表达4-1bbl。在一些实施方案中，对细胞的非hla限定的杀灭通过nkg2d的配体结合来介导。
iv.用细胞毒性t淋巴细胞进行治疗的方法
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞使用本发明的工程改造的原代血液树突细胞产生。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞使用已根据本发明方法产生的工程改造的原代血液树突细胞产生。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞使用本发明的工程改造的单核细胞源性树突细胞产生。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞使用已根据本发明方法产生的工程改造的单核细胞源性树突细胞产生。
在一些实施方案中，每次注射施用约1x108至1x1010个细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，每次注射施用约5x109个细胞。
在一些实施方案中，待治疗的疾病是癌症。在一些实施方案中，癌细胞表达mica/b。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
在另一实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的根据本发明方法产生的细胞毒性t淋巴细胞。
将细胞毒性t淋巴细胞于药学上可接受的载体中施用。在一些实施方案中，在低温保护剂存在下冷冻细胞毒性t淋巴细胞例如以进行储存和/或运输，并且随后在施用之前解冻。对于示例性低温保护剂组合物，参见以下第v.部分。
可使用医学领域中已知的方法向受试者或患者施用细胞。在一些实施方案中，将细胞注射至受试者中。在一些实施方案中，将细胞植入受试者中。细胞可以单次剂量形式或历经一段时期以多次剂量形式加以施用。在一些实施方案中，约每1-2周、约每3周、约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每3个月、约每4个月、约每5个月、约每6个月或约每年施用细胞。
在一些实施方案中，使本发明方法与一种或多种其它已知治疗组合。对于癌症治疗，一种或多种其它已知治疗可包括放射、手术、化学疗法或施用其它抗癌剂及其组合。在一些实施方案中，使本发明的治疗与化学治疗剂组合。
v.树突细胞疫苗和使用方法
本文所述的树突细胞和它们的制备方法特别适用于制备疫苗。因此，本文提供相关树突细胞组合物和疫苗。在一个实施方案中，疫苗是受试者自体同源的。在一些实施方案中，疫苗是受试者同种异体的。在一些实施方案中，树突细胞疫苗负载有来自存在于受试者中的癌细胞或病原体的抗原。
可将成熟或不成熟、经或未经抗原负载的树突细胞冷冻在包含低温保护剂的组合物中。众多低温保护剂为本领域技术人员所知。低温保护剂的实例包括但不限于二甲亚砜(dmso)、甘油、乙醇、甲醇、乙酰胺、甘油单乙酸酯、丙烷-二醇、聚乙二醇、乙二醇、异赤藓糖醇、d-核糖醇、d-甘露糖醇、d-山梨糖醇、d-乳糖、异肌醇、氯化胆碱、氨基酸、白蛋白(优选是人血清白蛋白)、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷、蔗糖、ficoll、无机盐和羟乙基淀粉。在一优选实施方案中，低温保护剂是dmso。在一些实施方案中，dmso的浓度是2-20％，更优选是5-15％，并且最优选是约10％。此外，冷冻介质可含有一种或多种源于碳水化合物的多元醇化合物诸如葡萄糖、右旋糖、蔗糖等，优选采用2-30％，更优选5-10％，最优选5％右旋糖的浓度。用于使树突细胞冷冻的方法为本领域技术人员所知。参见例如美国专利申请公布号2004/0253574，其内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，低温保护剂是二甲亚砜(dmso)。在一些实施方案中，dmso的浓度是5％至20％。最优选地，组合物中dmso的浓度是约10％。
其它适于施用的制剂可包括水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、免疫刺激剂、细胞因子和佐剂。
在一个实施方案中，将治疗性细胞以约1x108个细胞/毫升的最终浓度悬浮于热失活自体同源血浆和10％右旋糖中。接着用热失活自体同源血浆和于含有5％右旋糖和10％dmso的热失活自体同源血浆中的20％dmso的混合物1:1稀释这些细胞。将最终填充制剂储存在适于低温保存的容器中。接着使疫苗冷冻并在干燥液氮冷冻器中储存在≤150℃下。疫苗可在解冻之后就准备用于施用，而无需洗涤和再悬浮。
在一些实施方案中，本发明提供根据本发明的经抗原负载的树突细胞用于制备用以治疗或预防疾病诸如癌症或病原体感染的冷冻药剂的用途，其中所述药剂包含药学上可接受的媒介物，并且在解冻后就准备用于施用。
在另一实施方案中，本发明提供一种对受试者接种疫苗的方法，其包括：
i)使本发明的冷冻树突细胞疫苗解冻；和
ii)向所述受试者施用解冻疫苗。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的工程改造的原代血液树突细胞。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的工程改造的单核细胞源性树突细胞。
可通过多种方法施用树突细胞疫苗，所述方法诸如但不限于注射(例如皮下、皮内、静脉内、淋巴内、关节内、肌肉内、腹膜内)、通过连续输注、从植入物持续释放等。在一些实施方案中，以2至4周间隔施用树突细胞疫苗。树突细胞疫苗可与生理上可接受的载体、缓冲剂、稀释剂、佐剂、免疫调节剂等一起施用。在一些实施方案中，树突细胞疫苗就它所施用的患者而言是自体同源的，或是hla匹配的。
向受试者施用的细胞(例如活化的t细胞或树突细胞)的剂量为在所述受试者中随时间有效实现所需有益治疗响应，诸如抑制癌细胞生长或抑制感染的有效量。在一个实施方案中，剂量是约107–1010个细胞。任选添加生物应答调节剂以达成通过本发明的树突细胞或活化的t细胞来进行治疗。举例来说，在一些实施方案中，细胞任选与佐剂或细胞因子诸如gm-csf、il-12或il-2一起施用。在一些实施方案中，在向受试者施用之前，对树突细胞进行照射。在一些实施方案中，每次注射施用约1x108至约1x1010个细胞。
在一些实施方案中，待治疗的疾病是癌症。在一些实施方案中，癌细胞表达mica/b。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
可使用医学领域中已知的方法向受试者或患者施用细胞。在一些实施方案中，将细胞注射至受试者中。在一些实施方案中，将细胞植入受试者中。细胞可以单次剂量形式或历经一段时期以多次剂量形式加以施用。在一些实施方案中，约每1-2周、约每3周、约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每3个月、约每4个月、约每5个月、约每6个月或约每年施用细胞。
在一些实施方案中，使本发明方法与一种或多种其它已知治疗组合。对于癌症治疗，一种或多种其它已知治疗可包括放射、手术、化学疗法或施用其它抗癌剂及其组合。在一些实施方案中，使本发明的治疗与化学治疗剂组合。
vi.示例性实施方案
这个部分描述本发明的示例性组合物和方法，其以一系列段落形式不加限制地加以呈现，其中一些或全部段落为明晰和有效起见可采用字母数字加以指定。这些段落各自可与一个或多个其它段落，和/或与来自本申请中其它地方的公开内容(包括以引用的方式并入本文的材料)以任何适合方式组合。以下段落中的一些明确涉及并进一步限制其它段落，从而不加限制地提供一些适合组合的实例。
1.一种工程改造的树突细胞，其中所述树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
2.段落1的树突细胞，其中所述tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。
3.段落1-2中任一者的树突细胞，其中所述tax蛋白来自htlv-2。
4.段落1-3中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞具有组成性成熟和活化表型。
5.段落1-4中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞是人细胞。
6.段落1-5中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞为cd205+。
7.段落1-6中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞为cd11c+。
8.段落1-7中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。
9.段落8的树突细胞，其中所述树突细胞成熟和活化标志物选自由cd83、cd80、cd86、cd70、ccr7和hla-dr组成的组。
10.段落1-10中任一者的树突细胞，其中所述细胞能够在悬浮培养中生长。
11.段落1-10中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞为tlr3+和tlr4-。
12.段落1-11中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达tlr7的裂解形式。
13.段落1-12中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达tlr9。
14.段落1-13中任一者的树突细胞，其中所述细胞产生il-1a和tnfα。
15.段落1-14中任一者的树突细胞，其中所述细胞产生il-15。
16.段落1-15中任一者的树突细胞，其中所述细胞产生可忽略水平的il-10和tgfβ。
17.段落1-16中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达c-myc。
18.段落1-17中任一者的树突细胞，其中转录因子nf-κb、stat3和ap-1具有活性。
19.段落1-18中任一者的树突细胞，其中所述细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴细胞的增殖。
20.段落1-19中任一者的树突细胞，其中所述细胞已被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。
21.段落1-20中任一者的树突细胞，其中所述细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。
22.段落1-21中任一者的树突细胞，其中所述细胞递呈一种或多种抗原或其抗原片段或变体。
23.段落1-22中任一者的树突细胞，其中所述抗原是癌抗原。
24.段落1-23中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。
25.段落24的树突细胞，其中所述抗原包括包含全长iκbα和人端粒酶逆转录酶的包含氨基酸301-700的片段的融合蛋白。
26.段落25的树突细胞，其中所述融合蛋白包括seqidno:13。
27.段落1-26中任一者的树突细胞，其中所述细胞以hla限定的方式递呈所述癌抗原。
28.段落1-27中任一者的树突细胞，其中所述癌抗原通过病毒转导来引入。
29.段落1-28中任一者的树突细胞，其中所述病毒是慢病毒。
30.段落1-29中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。
31.段落1-30中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生能够以非hla限定的方式杀灭细胞的细胞毒性淋巴细胞。
32.一种工程改造的单核细胞源性树突细胞，其中所述树突细胞表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
33.段落32的树突细胞，其中所述tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。
34.段落32-33中任一者的树突细胞，其中所述tax蛋白来自htlv-2。
35.段落32-34中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞具有组成性成熟和活化表型。
36.段落32-35中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞是人细胞。
37.段落32-36中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞为cd205+。
38.段落32-37中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。
39.段落38的树突细胞，其中所述树突细胞成熟和活化标志物选自由cd83、cd80、cd86和cd70组成的组。
40.段落38的树突细胞，其中所述树突细胞进一步表达4-1bbl和/或cd4。
41.段落32-40中任一者的树突细胞，其中所述细胞能够在悬浮培养中生长。
42.段落32-41中任一者的树突细胞，其中所述细胞能够在培养中增殖多达3个月。
43.段落32-42中任一者的树突细胞，其中所述细胞为tlr3+和tlr4-。
44.段落32-43中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达tlr7的裂解形式。
45.段落32-44中任一者的树突细胞，其中所述细胞产生il-1a和tnfα。
46.段落32-45中任一者的树突细胞，其中所述细胞产生tgfβ。
47.段落32-46中任一者的树突细胞，其中所述细胞产生il-15。
48.段落32-47中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达c-myc。
49.段落32-48中任一者的树突细胞，其中所述细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴细胞的增殖。
50.段落32-49中任一者的树突细胞，其中所述细胞已被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。
51.段落32-50中任一者的树突细胞，其中所述细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。
52.段落32-51中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达一种或多种抗原或其抗原片段或变体。
53.段落32-52中任一者的树突细胞，其中所述抗原是癌抗原。
54.段落32-53中任一者的树突细胞，其中所述细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。
55.段落54的树突细胞，其中所述抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和人端粒酶逆转录酶的片段的融合蛋白。
56.段落55的树突细胞，其中所述融合蛋白包括seqidno:13。
57.段落32-56中任一者的树突细胞，其中所述细胞以hla限定的方式递呈所述癌抗原。
58.段落32-57中任一者的树突细胞，其中所述抗原通过病毒转导来引入。
59.段落32-58中任一者的树突细胞，其中所述病毒是慢病毒。
60.段落32-59中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。
61.段落32-60中任一者的树突细胞，其中所述树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生能够以非hla限定的方式杀灭细胞的细胞毒性淋巴细胞。
62.一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品诸如pbmc；
ii)用有效量的植物血球凝集素(pha)处理所培养的所述细胞；
iii)用有效量的il-2处理所培养的所述细胞；
iv)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白以及培养所述细胞；和
v)使t细胞从培养的细胞消减。
63.段落62的方法，其中所述pbmc从leukopak分离。
64.段落62-63中任一者的方法，其中pha的浓度在约1-5μg/ml的范围内。
65.段落62-64中任一者的方法，其中pha的所述浓度是约5μg/ml。
66.段落62-65中任一者的方法，其中用pha处理所述细胞约12小时至约36小时。
67.段落62-66中任一者的方法，其中用pha处理所述细胞约24小时。
68.段落62-67中任一者的方法，其中在用pha处理之后，用il-2处理所述细胞。
69.段落62-68中任一者的方法，其中在用pha处理之后，用il-2处理所述细胞。
70.段落62-69中任一者的方法，其中用约100-200单位/ml的il-2处理所述细胞，并且在包含il-2的培养基中培养一段时期。
71.段落62-70中任一者的方法，其中在包含il-2的培养基中培养所述细胞持续在约2-10天的范围内的时期。
72.段落62-71中任一者的方法，其中在包含约100-200单位/mlil-2的培养基中培养所述细胞持续约4-5天的时期。
73.段落71-72中任一者的方法，其中在步骤iii)之后对所述细胞进行操作以表达功能性tax蛋白。
74.段落73的方法，其中用编码来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白的病毒转导所述细胞。
75.段落74的方法，其中所述tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2和htlv-3组成的组的人t细胞白血病病毒。
76.段落75的方法，其中所述tax蛋白来自htlv-2。
77.段落74-76中任一者的方法，其中所述病毒是慢病毒。
78.段落74-77中任一者的方法，其中在约10μg/ml聚凝胺存在下对所述细胞进行转导。
79.段落73-78中任一者的方法，其中在包含约100单位/ml的il-2的培养基中进一步培养经转导的细胞。
80.段落73-79的方法，其中在包含il-2的培养基中进一步培养所述经转导的细胞约2-3个月。
81.段落73-78中任一者的方法，其中在包含人血清和il-2的培养基中培养经转导的细胞。
82.段落81的方法，其中在包含人血清的培养基中培养所述经转导的细胞约2-3个月。
83.段落82的方法，其中在包含5％热失活人ab血清的培养基中培养所述细胞。
84.段落70-80中任一者的方法，其中所述培养基包括含有10％胎牛血清的完全rpmi1640培养基。
85.段落81-83中任一者的方法，其中所述培养基包括完全rpmi1640培养基。
86.段落62-85中任一者的方法，其中用包含结合t细胞的分子的组合物使所述t细胞消减。
87.段落86的方法，其中用抗体使所述t细胞消减。
88.段落87的方法，其中所述抗体是抗cd3抗体。
89.段落87-88中任一者的方法，其中使所述抗体缀合于磁珠。
90.段落62-89中任一者的方法，其中所述树突细胞具有组成性成熟和活化表型。
91.段落62-90中任一者的方法，其中所述树突细胞是人细胞。
92.段落62-91中任一者的方法，其中所述树突细胞为cd205+。
93.段落62-92中任一者的方法，其中所述树突细胞为cd11c+。
94.段落62-93中任一者的方法，其中所述树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。
95.段落94的方法，其中所述树突细胞成熟和活化标志物选自由cd83、cd80、cd86、cd70、ccr7和hla-dr组成的组。
96.段落62-95中任一者的方法，其中所述树突细胞能够在悬浮培养中生长。
97.段落62-96中任一者的方法，其中所述树突细胞为tlr3+和tlr4-。
98.段落62-97中任一者的方法，其中所述树突细胞表达tlr7的裂解形式。
99.段落62-98中任一者的方法，其中所述树突细胞表达tlr9。
100.段落62-99中任一者的方法，其中所述树突细胞产生il-1a和tnfα。
101.段落62-100中任一者的方法，其中所述树突细胞产生il-15。
102.段落62-101中任一者的方法，其中所述树突细胞产生可忽略水平的il-10和tgfβ。
103.段落62-102中任一者的方法，其中所述树突细胞表达c-myc。
104.段落62-103中任一者的方法，其中转录因子nf-κb、stat3和ap-1具有活性。
105.段落62-104中任一者的方法，其中所述树突细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴树突细胞的增殖。
106.段落62-105中任一者的方法，其中所述树突细胞已被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。
107.段落62-106中任一者的方法，其中所述树突细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。
108.段落62-107中任一者的方法，其中所述树突细胞递呈一种或多种抗原或其抗原片段或变体。
109.段落62-108中任一者的方法，其中所述抗原是癌抗原。
110.段落62-109中任一者的方法，其中所述细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。
111.段落110的方法，其中所述癌抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和人端粒酶逆转录酶的片段的融合蛋白。
112.段落111的方法，其中所述融合蛋白包括seqidno:13。
113.段落62-112中任一者的方法，其中所述细胞以hla限定的方式递呈所述癌抗原。
114.段落62-113中任一者的方法，其中所述癌抗原通过病毒转导来引入。
115.段落114的方法，其中所述病毒是慢病毒。
116.段落62-115中任一者的方法，其中所述树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。
117.一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：提供包含源于单核细胞的不成熟树突细胞的细胞样品；以及在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
118.一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：
i)提供贴附单核细胞；
ii)在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养所述细胞；
iii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白；
iv)在包含有效量的gm-csf和il-4的培养基中培养所述功能性tax蛋白表达性细胞。
119.段落118的方法，其中在步骤iv)之后，所述方法进一步包括在包含il-2的培养基中培养所述细胞。
120.段落117-119中任一者的方法，其中使il-4和/或gm-csf融合于fc4。
121.段落117-120中任一者的方法，其中所述贴附单核细胞来自约400万个pbmc。
122.段落117-121中任一者的方法，其中第ii)部分的所述培养包括在包括根据gm-csf-fc4/il-4-fc4产生性293细胞的条件培养基的培养基中培养所述细胞。
123.段落122的方法，其中在包括所述条件培养基的培养基中以约1:10稀释度培养所述细胞约7天。
124.段落117-123的方法，其中用编码来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白的病毒转导所述细胞。
125.段落124的方法，其中所述tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2和htlv-3组成的组的人t细胞白血病病毒。
126.段落124的方法，其中所述tax蛋白来自htlv-2。
127.段落123-126中任一者的方法，其中所述病毒是慢病毒。
128.段落123-127中任一者的方法，其中在约10μg/ml聚凝胺存在下对所述细胞进行转导。
129.段落117-128中任一者的方法，其中所述培养基包括具有约10％胎牛血清的rpmi1640培养基。
130.段落117-129中任一者的方法，其中培养步骤iv)包括在gm-csf-fc4和il-4-fc4存在下，在具有10％fbs的rpmi1640培养基中培养所述tax蛋白表达性细胞约5-7天，随后在约100单位/ml的il-2存在下在培养中维持所述细胞。
131.段落117-130中任一者的方法，其进一步包括使所述单核细胞源性树突细胞活化。
132.段落131的方法，其中所述活化包括用tnfα和lps刺激所述细胞。
133.段落132的方法，其中以约10-250ng/ml的量施用tnfα，并且以约1-5μg/ml的量施用lps。
134.段落131-133中任一者的方法，其中将所述细胞刺激1-5天。
135.段落134的方法，其中将所述细胞刺激约2天。
136.段落117-135中任一者的方法，其中所述tax蛋白来自选自由htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4组成的组的人t细胞白血病病毒。
137.段落117-136中任一者的方法，其中所述tax蛋白来自htlv-2。
138.段落117-137中任一者的方法，其中所述树突细胞具有组成性成熟和活化表型。
139.段落117-138中任一者的方法，其中所述树突细胞是人细胞。
140.段落117-139中任一者的方法，其中所述树突细胞为cd205+。
141.段落117-140中任一者的方法，其中所述树突细胞表达一种或多种树突细胞成熟和活化标志物。
142.段落117-141的方法，其中所述树突细胞成熟和活化标志物选自由cd83、cd80、cd86、cd70组成的组。
143.段落142的方法，其中所述树突细胞进一步表达4-1bbl和/或cd4。
144.段落117-143中任一者的方法，其中所述树突细胞能够在悬浮培养中生长。
145.段落117-144中任一者的方法，其中所述树突细胞能够在培养中增殖多达3个月。
146.段落117-145中任一者的方法，其中所述树突细胞为tlr3+和tlr4-。
147.段落117-146中任一者的方法，其中所述树突细胞表达tlr7的裂解形式。
148.段落117-147中任一者的方法，其中所述树突细胞产生il-1a和tnfα。
149.段落117-148中任一者的方法，其中所述树突细胞产生tgfβ。
150.段落117-149中任一者的方法，其中所述树突细胞产生il-15。
151.段落117-150中任一者的方法，其中所述树突细胞表达c-myc。
152.段落117-151中任一者的方法，其中所述树突细胞能够在不存在外源添加的il-2的情况下诱导原初淋巴树突细胞的增殖。
153.段落117-152中任一者的方法，其中所述树突细胞已被遗传修饰来表达一种或多种hla蛋白。
154.段落117-153中任一者的方法，其中所述树突细胞已被遗传修饰来表达hla-a2.1。
155.段落117-154中任一者的方法，其中所述树突细胞表达一种或多种抗原或其抗原片段或变体。
156.段落117-155中任一者的方法，其中所述抗原是癌抗原。
157.段落117-156中任一者的方法，其中所述树突细胞表达人端粒酶逆转录酶或其抗原片段或变体。
158.段落157的方法，其中所述癌抗原包括包含iκbα的蛋白酶体靶序列和人端粒酶逆转录酶的片段的融合蛋白。
159.段落158的方法，其中所述融合蛋白包括seqidno:13。
160.段落154-159中任一者的方法，其中所述细胞以hla限定的方式递呈所述抗原。
161.段落154-160中任一者的方法，其中所述抗原通过病毒转导来引入。
162.段落161的方法，其中所述病毒是慢病毒。
163.段落117-162中任一者的方法，其中所述树突细胞能够对原初pbmc进行致敏以产生识别抗原的细胞毒性淋巴细胞。
164.一种树突细胞，其根据段落62-163中任一者的所述方法制备。
165.一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括
培养段落1-61中任一者的树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续一段时期，借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
166.一种用于产生细胞毒性t淋巴细胞的方法，其包括
i)培养段落1-61中任一者的树突细胞以及包含原初淋巴细胞的细胞持续第一时期以产生混合细胞培养物；和
ii)用有效量的il-2处理所述混合细胞培养物以及继续培养所述细胞持续第二时期，
借此产生细胞毒性t淋巴细胞。
167.段落165-166中任一者的方法，其中包含原初淋巴细胞的所述细胞包括原初pbmc。
168.段落165-167中任一者的方法，其中所述原初淋巴细胞从leukopak分离。
169.段落165-168中任一者的方法，其中所述原初淋巴细胞和所述树突细胞是同种异体的。
170.段落165-169中任一者的方法，其中树突细胞与原初pbmc的比率是约1:100。
171.段落166-170中任一者的方法，其中在不添加外源性细胞因子的情况下进行步骤i)的所述培养。
172.段落166-172中任一者的方法，其中所述第一时期是约2-3天。
173.段落166-172中任一者的方法，其中il-2的浓度是约100-200单位/ml。
174.段落166-173中任一者的方法，其中所述第二时期是2-6周。
175.段落166-174中任一者的方法，其中所述细胞毒性t淋巴细胞具有抗原特异性，并且以hla限定的方式诱导对靶细胞的细胞溶解。
176.段落166-175中任一者的方法，其中所述细胞毒性t淋巴细胞包括能够以非hla限定的方式杀灭靶细胞的cd3+/cd56+t细胞。
177.段落166-176中任一者的方法，其中所述树突细胞表达4-1bbl。
178.段落166-177中任一者的方法，其中所述树突细胞已被工程改造来表达4-1bbl。
179.段落176-178中任一者的方法，其中对细胞的所述非hla限定的杀灭通过nkg2d的配体结合来介导。
180.一种药物组合物，其包含有效量的根据段落165-179中任一者的所述方法产生的细胞毒性t淋巴细胞。
181.一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞使用段落1-61中任一者的树突细胞产生。
182.一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的细胞毒性t淋巴细胞，其中所述细胞毒性t淋巴细胞通过段落165-179中任一者的方法产生。
183.一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的段落1-61中任一者的树突细胞。
184.段落181-183中任一者的方法，其中所述疾病是癌症。
185.段落184的方法，其中所述癌细胞表达mica/b。
186.段落181-185中任一者的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
187.段落181-186中任一者的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
188.段落181-187中任一者的方法，其中所述受试者是人。
189.一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含不成熟树突细胞的细胞样品；和
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白。
190.一种产生工程改造的原代血液树突细胞的方法，其包括：
i)提供包含树突前体细胞的细胞样品；
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白以及培养所述细胞；
iii)培养所述细胞以诱导它们分化成树突细胞；和
iv)使t细胞从培养的细胞消减。
191.一种产生单核细胞源性树突细胞的方法，其包括：
i)提供贴附单核细胞；
ii)在所述细胞中表达来自t细胞白血病病毒的功能性tax蛋白；和
iii)培养所述细胞以诱导它们分化成树突细胞。
鉴于本文含有的教义来将本发明的教义应用于具体问题在本领域普通技术人员的能力范围内。本发明的组合物和方法的实例呈现在以下非限制性实施例中。
实施例
实施例1.人原代血液和单核细胞源性树突细胞系的产生
htlv-2tax由于它在调节dc功能方面的作用而被用作分子工具。为防止dc在培养经tax转导的pbmc期间的潜在损失，使用抗cd3磁珠阴性选择经转导的细胞以使t细胞消减。来自10名供血者的经转导pbmc的两个cd3阴性tax-gfp+细胞系逐步形成，并且历经6个月连续生长而不丧失生长潜力。从2名不同供血者建立的这两个dc细胞系显示树突细胞相关标志物。这些细胞呈谱系阴性，并且表达cd11c和cd205以及dc成熟和活化分子，包括cd83、cd80、cd86、cd70、ccr7和hla-dr(图1a和1b)。将这两个细胞系命名为ihv-dc1和ihv-dc2，其代表维持组成性成熟和活化表型的人cd11c+/cd205+血液树突细胞的子组。
ihv-dc在正常培养条件下悬浮生长，并且少许细胞具有贴附性并显示典型树突。为验证tax在促进dc生长方面的能力，首先用gm-csf/il-4刺激来自pbmc的贴附单核细胞以产生单核细胞源性树突细胞(modc)(图1c)。这些modc中的一些呈现树突，并且随后用tax慢病毒转导modc。在培养期间使经转导modc-tax细胞脱离，并且其能够增殖多达3个月。modc-tax细胞呈现成熟和活化表型(图1d)。这些结果表明tax能够促进在正常培养条件下丧失细胞贴附性的血液dc与单核细胞源性dc两者的生长。
结果
tlr、细胞因子和细胞信号传导分子在ihv-dc中的表达
在ihv-dc与modc-tax细胞两者中，细胞内dsrna感受性tlr3受体均表达，而tlr4呈阴性(图2a)。在ihv-dc与modc-tax两者中但不在modc中检测到tlr7的裂解形式(图2b)，从而表明tax使dc中的tlr7上调。tlr9在ihv-dc2中高度表达，并且在modc中略微表达(图2b)。无论tlr表达状况如何，这些受体都不再为诱导dc成熟和活化所需，因为这些建立的dc细胞系持续表达高水平的共刺激性分子诸如cd80、cd86、cd70和cd83。
炎症性细胞因子诸如il-1a和tnfα在所有ihv-dc和modc中都产生，而包括il-10和tgfβ的免疫调控因子以可忽略水平在ihv-dc中表达，并且modc-tax细胞产生tgfβ(图2c-2f)。有利于cd8+细胞毒性淋巴细胞的产生的il-15以高水平在所有建立的dc细胞系和活化的modc中产生(图2c-2f)。综合这些结果，tlr和细胞因子在ihv-dc中的表达谱与通过常规方法产生的成熟和活化的血液dc的表型充分关联。
tax具有驱动细胞周期进展的能力，如由c-myc在ihv-dc与modc-tax细胞两者中均过度表达所证实(图2g)。促存活bcl-2蛋白bcl-xl仅在表达tax的dc中被显著上调(图2h)。细胞周期调控子prb和cdc2在ihv-dc中被磷酸化(图2i)。在所有dc中都检测到磷酸化形式的stat1、stat3和stat5(图2l)，并且也在ihv-dc中观察到包括nf-κb、stat3和ap-1的转录因子的活性(图2j)。因此，似乎tax利用与通过致癌性活化和诱导细胞周期进展所达成的tax介导的cd4+t细胞永生化的机理类似的机理来使血液dc永生化。
ihv-dc对抗原特异性ctl的诱导
对来自ihv-dc的hla-a和hla–b等位基因克隆和测序。序列分析指示ihv-dc1细胞为hla-a30/b71，而ihv-dc2细胞为hla-a2.1/b40。因为hla-a2是一个最常见的hla等位基因，所以首先决定测试ihv-dc2在诱导细胞毒性淋巴细胞方面的功能性。通过使ihv-dc2细胞与直接从hla-a2+健康供血者分离的原初pbmc以1:100的比率混合来建立混合白细胞反应(mlr)测定。观察到在前2-3天，在不存在重组il-2的情况下，ihv-dc2细胞诱导供体淋巴细胞急剧扩增。在重组il-2存在下，反应性淋巴细胞继续增殖4-6周。在mlr之后2周，从各个供体的pbmc产生的ihv-dc活化的增殖淋巴细胞显示主要效应cd8+t细胞免疫表型，表达充足量的细胞毒性组分穿孔素和粒酶b，并且产生大量ifnγ和tnfα(图3a、3b和3c)。ihv-dc细胞完全消失，如由在mlr培养物中缺乏tax-gfp绿色荧光信号所证实。评估ihv-dc2活化的ctl对tax抗原的识别。首先将hla-a2.1表达至hla-a2阴性mt4细胞(tax+htlv-1转化的t细胞)中(图3d)。发现相比于对mt4细胞的细胞溶解，ihv-dc2活化的ctl更强力诱导对mt4-a2.1细胞的细胞溶解(图3e)。接着使用工程改造的nih3t3细胞，通过连同或不连同tax-flag一起依序用荧光素酶、β-2-微球蛋白(b2m)和hla-a2.1进行慢病毒转导来开发靶细胞模型(图3f)。tax主要定位在细胞质斑点中(图3f)。显示在10:1的e:t比率下，ihv-dc活化的ctl诱导对约90％tax表达性hla-a2+3t3细胞的细胞溶解(图3g和3h)。
因为tax永生化dc过度表达和活化细胞原致癌蛋白诸如c-myc以促进细胞周期进展和增殖，所以似乎合理的是由ihv-dc活化的ctl可识别其中这些致癌蛋白常常失调的癌细胞。为测试这个假设，选择两个hla-a2+癌细胞系a375(转移性黑素瘤)和panc-1(胰腺癌)以及一个hla-a2阴性细胞系h1299(肺癌)。显示ihv-dc2活化的ctl有效诱导对a375和panc-1细胞的细胞溶解，但对h1299细胞不具有明显杀灭活性(图4a-4d)。接着将hla-a2.1cdna引入h1299细胞中(图4e)，并且发现hla-a2.1+h1299细胞变得对由ihv-dc2活化的ctl介导的杀灭敏感(图4f、4g)。总之，这些结果支持ihv-dc2活化的ctl具有介导对tax表达性细胞和癌细胞的hla限定的靶细胞杀灭的能力的见解。
在ihv-dc中表达htert片段以产生htert特异性ctl
建立的树突细胞系的一个显著优势是不同于原代dc，dc细胞系可被遗传修饰来使它们在抗原递呈方面的功能增强。为验证这个理念，将hla-a2.1引入hla-a2阴性ihv-dc1细胞中以产生ihv-dc1-a2.1细胞。几乎100％的ihv-dc1-a2.1细胞为hla-a2+(图5a)。选择已知通用肿瘤抗原，并且将其引入ihv-dc1-a2.1细胞中。htert在超过90％的人癌症中过度表达，并且构成许多公认的ctl表位24。为有助于抗原加工，设计融合构建体ptert，其由iκbα的蛋白酶体靶序列和htert的涵盖6个hla-a2限定的ctl表位的片段(aa301-700)组成(图5b、5c)。因为ihv-dc展现组成性nf-κb活性，所以预期ptert将以快速速率被降解，从而在与hla分子形成复合物时潜在产生充足量的tert肽。通过慢病毒转导将ptert引入ihv-dc1-a2.1细胞中。发现ptert仅仅在dmso处理的ihv-dc1/ptert细胞中被检测到，并且用蛋白酶体的化学抑制剂mg132预处理这些dc诱导ptert积累(图5c)。接着，使用工程改造的3t3l-a2.1细胞，通过用flag-tert(aa301-700)进行慢病毒转导来设计靶细胞模型(图5d)。ihv-dc1-a2.1和ihv-dc1-a2.1/ptert细胞用于对原初pbmc进行致敏以产生细胞毒性淋巴细胞。发现相比于ihv-dc1-a2.1活化的ctl，ihv-dc1-a2.1/ptert活化的ctl更加强力诱导对工程改造的nih3t3细胞的细胞溶解(图5e、5f)。这些研究结果支持建立的ihv-dc可被进一步工程改造来在细胞内递送给定肿瘤抗原的理念。
由ihv-dc1活化的ctl达成的非hla限定的癌细胞杀灭
不同于ihv-dc2细胞，ihv-dc1活化的ctl构成主要cd3+/cd56+t细胞群体(图6a)，此类似于通过nkg2d和它的配体的相互作用以非hla限定的方式来杀灭癌细胞的细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)的组成。包括mica/micb的nkg2d配体在癌细胞和受病毒感染细胞的表面上选择性表达，但在正常细胞中不被检测到或以极低水平表达25,26。这个独特特征充当用于对癌细胞进行ctl介导的杀灭的选择性靶标。如图6b中所示，mica/b在h1299、hela和a375细胞中表达，但在正常人纤维母细胞(nhf)中未检测到。发现无论所有这些癌细胞的hla类型如何，ihv-dc1活化的ctl都极其强力诱导对它们的细胞溶解(图6c-6f)。相比之下，这些ctl对nhf细胞不具有杀灭活性(图6g)。
为进一步探究这个细胞溶解机理，将阻断抗体用于nkg2d。已知k562细胞对ctl介导的杀灭具有抗性，因为它们缺乏hla分子的表面表达，但对通过nkg2d和它的配体的相互作用来杀灭靶细胞的nk细胞敏感。在固定量的抗nkg2d抗体(50μg/ml)下，在较低e:t比率(1.25:1和2.5:1)下，它有效防止k562细胞由ihv-dc1活化的ctl杀灭(图7a)。而在较高e:t比率(5:1和10:1)下，抗nkg2d抗体在保护k562细胞免遭杀灭方面的有效性似乎较小(图7a)。接着，采用固定e:t比率(2.5:1)和递增量的抗nkg2d抗体。显示这个阻断抗体以剂量依赖性方式防止ihv-dc1-ctl介导的k562细胞杀灭(图7b)。类似地，发现在较低e:t比率下，抗nkg2d抗体(50μg/ml)挽救黑素瘤细胞免遭由ihv-dc1活化的ctl达成的细胞溶解(图7c)。通过与或不与人mica一起表达荧光素酶来进一步工程改造nih3t3细胞(图7d)。因为人hla等位基因不存在于nih3t3细胞中，因此，由人ctl杀灭这些靶细胞将不可能通过tcr识别来介导。确实发现相比于杀灭3t3l/载体细胞，ihv-dc1活化的ctl更强力诱导对3t3l/hmica细胞的细胞溶解(图7e、7f)。总之，这些研究结果指示具有主要cd3+/cd56+t细胞组成的ihv-dc1活化的ctl通过nkg2d和它的在癌细胞上表达的配体的相互作用来诱导对癌细胞的细胞溶解，并且它们也具有以hla依赖性方式杀灭靶细胞的能力，如图5中所见。此外，在ihv-dc1活化的ctl中表达的高密度的nkg2d可潜在克服来自可溶性nkg2d配体的中和作用。
用于nsg小鼠模型中的人乳腺癌的基于ihv-dc1的免疫疗法
为探索基于ihv-dc的免疫疗法的应用，ihv-dc1细胞由于它们在产生充足量的以非hla限定的方式杀灭癌细胞的cd3+/cd56+t细胞方面的独特能力而被选择。选择3个乳腺癌细胞系，包括mcf-7、mcf-7/adr(mcf-7的多化学抗性衍生物)和her2/neu+hcc1954细胞。观察到ihv-dc1活化的ctl极其强力诱导对这些乳腺癌细胞的细胞溶解(图8a、8b)。mica/b在所有测试乳腺癌细胞系上都高度表达(图8c)。nkg2d阻断抗体(100μg/ml)高效防止癌细胞被ctl杀灭(图8d)。
这些令人鼓舞的体外结果促使我们在原位乳腺癌nsg小鼠模型中探究t细胞疗法。在第一动物研究中，在方法中所述的t细胞治疗方法之后，ihv-dc1活化的ctl显著地抑制在乳腺脂肪垫中建立的hcc1954肿瘤的生长(图9a-9c)。更惊人的是，ihv-dc1活化的ctl有效抑制hcc1954肿瘤的肺转移。在ctl治疗组的所有小鼠中，都未见转移性病灶，而检测到来自非治疗组的所有小鼠的在肺中的微小转移(图9d)。接着应用抗人cd3染色以评估输注ctl的体内移行模式。显示在ctl组小鼠中，在肿瘤团块、脾和肺组织中检测到人cd3+t细胞，并且在肝中发现少许cd3+细胞(图9e)。在ctl组小鼠中，未在心脏和肾中发现浸润性t细胞(图9e)。第二动物实验利用mcf-7/adr乳腺癌nsg小鼠模型。观察到与hcc1954nsg模型类似，ihv-dc1活化的ctl抑制乳腺脂肪垫中mcf-7/adr肿瘤的生长(图10a-10b)。在60天实验时期期间，在ctl组小鼠中未见重量减轻和其它副作用(图10c)。更重要的是，在ctl组小鼠中，ihv-dc1活化的ctl有效抑制mcf-7/adr肿瘤的肺转移(图10d)。输注的ctl浸润至肿瘤团块、肝、脾和肺组织中，但不进入心脏和肾中(图10e)。因此，这些数据验证了ihv-dc1活化的ctl在小鼠模型中的治疗功效，并且也指示它们的体内移行模式合乎需要。
本文描述通过表达通过致癌性活化来诱导细胞周期进展的病毒tax蛋白来产生永生化和组成性活化的人原代血液树突细胞(dc)系ihv-dc。ihv-dc是cd11c+/cd205+dc的子组，持续显示共刺激性分子，并且能够对供体源性淋巴细胞进行致敏以产生可以hla限定的方式识别和杀灭tax表达性细胞和癌细胞的cd8+效应细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。ihv-dc可被遗传修饰来表达人端粒酶逆转录酶(htert)片段以对t细胞进行致敏来产生hla-a2限定的htert特异性ctl。除对t细胞进行致敏以介导hla限定的靶细胞杀灭之外，一个ihv-dc细胞系ihv-dc1也促进通过nkg2d与它的在癌细胞中表达的配体的相互作用而具有广泛抗癌活性的cd3+/cd56+ctl的强力扩增。在原位nsg小鼠模型中，ihv-dc1活化的ctl强力抑制建立的肿瘤的生长，并且抑制乳腺癌细胞的肺转移。更重要的是，ihv-dc1活化的ctl能够浸润至原发性肿瘤位置和转移性部位中，从而模拟天然体内ctl移行特征。这些建立的人血液dc将有助于开发基于细胞的免疫疗法。
本文描述一种用以通过选择来自供血者的pha/il-2刺激的经tax转导的pbmc来产生人血液树突细胞系的新方法。可使建立的ihv-dc在培养中可靠地生长和维持延长时间，而不丧失它们的成熟和活化表型。本文也描述一种用以通过在从贴附单核细胞分化的gm-csf/il-4诱导的dc中表达tax来扩增单核细胞源性树突细胞(modc)的方法。在一些实施方案中，第二方法使得成熟和活化的modc能够生长多达3个月。这个方法可从数百万个pbmc产生足够数目的活化的modc，此由于消除不合需要的单独采集(apheresis)程序而成为超过常规modc方法的显著优势。此外，不同于原代dc，建立的dc可易于通过在细胞内表达给定肿瘤抗原来修饰，由此在对cd8t细胞进行致敏时递呈多个抗原性表位以及增强抗癌免疫性的产生。
先前尚未报道tax能够使血液dc永生化和活化。在不受理论束缚下，尝试的成功归因于在若干水平上进行的细胞选择和培养技术。首先，pha/il-2刺激t细胞增殖，并且活化的t细胞可分泌可能使得血液不成熟dc能够由tax慢病毒转导的可溶性因子，因为原代不成熟dc对慢病毒转导具有高度抗性。其次，因为大多数经tax转导的淋巴细胞比经tax转导的dc更快增殖，所以在早期选择阶段使t细胞消减是使较低数目的dc旺盛的必要步骤。第三，大多数经tax转导的dc可在转导之后第三个月经受“生长危机”，并且它们中的一些在度过这个阶段之后重新获得它们的生长强度。因此，连续培养尝试为辅助经tax转导的dc变得永生所必需。
一个关键表型是ihv-dc被组成性活化，而不需要额外刺激。tax明显具有促进dc成熟和活化的能力。推断tax诱导的nf-κb信号传导活化在dc成熟和活化的过程中起关键作用。在遭遇侵袭性病原体后，病原体的组分刺激不成熟dc中的tlr诸如tlr3和tlr4。tlr3或tlr4啮合使受体缔合的traf6活化，此转而诱导它的下游信号传导分子的活化，所述分子包括作为nf-κb信号传导的主要调控子的iκb激酶复合物。kobayashi,t.等traf6isacriticalfactorfordendriticcellmaturationanddevelopment.immunity19,353-363(2003)；hull,c.,mclean,g.,wong,f.,duriez,p.j.和karsan,a.lipopolysaccharidesignalsanendothelialapoptosispathwaythroughtnfreceptor-associatedfactor6-mediatedactivationofc-junnh2-terminalkinase.thejournalofimmunology169,2611-2618(2002)。充分认识到nf-κb是在诱导dc成熟和活化方面的关键介质。rescigno,m.,martino,m.,sutherland,c.l.,gold,m.r.和ricciardi-castagnoli,p.dendriticcellsurvivalandmaturationareregulatedbydifferentsignalingpathways,thejournalofexperimentalmedicine188,2175-2180(1998)；ardeshna,k.m.,pizzey,a.r.,devereux,s.和khwaja,a.thepi3kinase,p38sapkinase,andnf-κbsignaltransductionpathwaysareinvolvedinthesurvivalandmaturationoflipopolysaccharide-stimulatedhumanmonocyte–deriveddendriticcells,blood96,1039-1046(2000)。traf6也为使map激酶活化，从而诱导ap-1活化所必需。bradley,j.r.和pober,j.s.tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactors(trafs).oncogene20,6482-6491(2001)。此外，stat3活性对于il-15源性dc获得它们的抗原递呈能力以及介导极化cd8+t细胞应答至关重要。okada,s.,han,s.,patel,e.s.,yang,l.-j.和chang,l.-j.stat3signalingcontributestothehigheffectoractivitiesofinterleukin-15-deriveddendriticcells.immunologyandcellbiology93,461-471(2015)。与这些报道一致，得以证明的是ihv-dc展现如由tax诱导的nf-κb、ap-1和stat3以及有可能诸如il-1和tnfα的炎症性细胞因子的组成性活性，由此促进它们的成熟和活化。
ihv-dc1细胞与ihv-dc2细胞两者均具有对原初pbmc进行致敏以产生以hla限定的方式诱导对靶细胞的细胞溶解的抗原特异性ctl的能力。然而，ihv-dc1细胞明显不同于ihv-dc2细胞，因为前者也可诱导和扩增可以非hla限定的方式杀灭靶细胞的cd3+/cd56+t细胞。通过分析dc标志物、共刺激性分子和细胞因子的表达谱，据信4-1bbl的水平和cd11c/4-1bbl的比率可能在决定细胞毒性淋巴细胞的组成命运方面起关键作用。相较于ihv-dc1细胞，ihv-dc2细胞表达较低水平的4-1bbl和较高水平的cd11c，从而促进产生cd3+/cd56-t细胞。相反，ihv-dc1细胞表达较高水平的4-1bbl和较低水平的cd11c，由此诱导cd3+cd56+t细胞的发育和扩增。为验证这种可能性，使4-1bbl在表达低水平的4-1bbl的dc中的表达增强。我们已确实发现具有高得多水平的4-1bbl的dc对原初pbmc进行致敏以产生cd3+/cd56+t细胞以及nk细胞(数据未显示)。这个现象将在未来研究中进一步探究。因此，ihv-dc1细胞是独特的，因为它们可对原初pbmc进行致敏以产生充足量的能够杀灭多种癌细胞(无论它们的hla类型如何)的cd3+/cd56+效应t细胞。
在理论上，经dc致敏的t细胞具有抗原特异性，从而在自体同源环境中以hla限定的方式杀灭靶细胞。然而，在健康供体中，肿瘤抗原特异性淋巴细胞的数目极低，因此，在使用自体同源环境下，产生足够数目的肿瘤抗原特异性ctl以进行癌症治疗是一项具有挑战的任务。值得注意的是，多达10％的原初淋巴细胞显示同种异体反应能力，从而在非同基因环境中识别肿瘤抗原/hla复合物。rossjohn,j.和mccluskey,j.howahome-growntcellreceptorinteractswithaforeignlandscape,cell129,19-20(2007)；gras,s.,kjer-nielsen,l.,chen,z.,rossjohn,j.和mccluskey,j.thestructuralbasesofdirectt-cellallorecognition:implicationsfort-cell-mediatedtransplantrejection.immunologyandcellbiology89,388-395(2011)；morelli,a.e.和thomson,a.w.dendriticcells:regulatorsofalloimmunityandopportunitiesfortoleranceinduction.immunologicalreviews196,125-146(2003)。发现ihv-dc1活化的同种异体ctl具有抗原特异性，从而识别递呈tax抗原/hla-a2复合物和肿瘤抗原/hla-a2复合物的靶细胞。此外，如同nk细胞一样，ihv-dc1活化的ctl通过靶向它的配体的nkg2d来杀灭广泛范围的人癌症，所述配体是通常在癌细胞和受病毒感染细胞中表达的一组应激诱导的表面分子。nausch,n.和cerwenka,a.nkg2dligandsintumorimmunity.oncogene27,5944-5958(2008).raulet,d.h.,gasser,s.,gowen,b.g.,deng,w.和jung,h.regulationofligandsforthenkg2dactivatingreceptor.annualreviewofimmunology31,413-441(2013)；verneris,m.r.,karami,m.,baker,j.,jayaswal,a.和negrin,r.s.roleofnkg2dsignalinginthecytotoxicityofactivatedandexpandedcd8+tcells.blood103,3065-3072(2004)；karimi,m.等silencinghumannkg2d,dap10,anddap12reducescytotoxicityofactivatedcd8+tcellsandnkcells.thejournalofimmunology175,7819-7828(2005)。通过ctl上的nkg2d与它的在癌细胞上的配体的相互作用，ihv-dc1诱导的ctl释放包括穿孔素和粒酶的细胞毒性组分，从而导致癌细胞死亡。在这个方面，ihv-dc1活化的ctl类似于以非hla限定的方式杀灭癌细胞的nk细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)来起作用。marten,a.等enhancedlyticactivityofcytokine-inducedkillercellsagainstmultiplemyelomacellsafterco-culturewithidiotype-pulseddendriticcells.haematologica86,1029-1037(2001)；wang,y.-f.等cytokine-inducedkillercellsco-culturedwithcompletetumorantigen-loadeddendriticcells,haveenhancedselectivecytotoxicityoncarboplatin-resistantretinoblastomacells.oncologyreports29,1841-1850(2013)；wongkajornsilp,a.等sunitinibindirectlyenhancedanti-tumorcytotoxicityofcytokine-inducedkillercellsandcd3+cd56+subsetthroughtheco-culturingdendriticcells.plosone8,e78980(2013)；castillo,e.f.,stonier,s.w.,frasca,l.和schluns,k.s.dendriticcellssupporttheinvivodevelopmentandmaintenanceofnkcellsviail-15trans-presentation.thejournalofimmunology183,4948-4956(2009)；denman,c.j.等membrane-boundil-21promotessustainedexvivoproliferationofhumannaturalkillercells.plosone7,e30264(2012)；domogala,a.,madrigal,j.a.和saudemont,a.naturalkillercellimmunotherapy:frombenchtobedside.frontiersinimmunology6,264(2015)；childs,r.w.和carlsten,m.therapeuticapproachestoenhancenaturalkillercellcytotoxicityagainstcancer:theforceawakens.naturereviewsdrugdiscovery14,487-498(2015)。此外，这些ctl仍然保留它们经由肿瘤抗原/hla复合物来识别靶细胞的能力。此外，在hla匹配条件下，这些ctl通过以下两种机理来攻击癌细胞：tcr识别taa/hla复合物和nkg2d与它的配体相互作用，从而潜在提供最优治疗功效。
总之，ihv-dc模型提供若干显著特征。(a)ihv-dc是活化和成熟dc，由此不需要复杂成熟和活化过程来获得功能性dc。(b)ihv-dc细胞组成性表达充足量的刺激抗原特异性cd8+细胞毒性t细胞进行增殖的共刺激性受体，包括cd80、cd86和cd70。(c)ihv-dc也表达作为淋巴组织归巢受体的趋化因子受体ccr7。(d)ihv-dc模型可提供特别适用于研究树突细胞生物学的工具。这些dc可被遗传修饰以探究介导或增强保护性抗癌或抗病毒免疫性的现有或推定共刺激性受体的作用。
材料和方法
细胞系、抗体和细胞因子。h1299、panc-1、hcc1954、mcf-7、hela和nih3t3细胞系从atcc获得。先前描述mcf-7/adr细胞系。wu,l.等thereversaleffectsof3-bromopyruvateonmultidrugresistanceinvitroandinvivoderivedfromhumanbreastmcf-7/adrcells.plosone9,e112132(2014)。a375细胞系和nhf细胞系分别由isaiahj.fidler博士和jieyuzhu博士友情提供。mt4细胞从nihaids试剂计划获得。
重组il-2从aids研究和参考试剂计划(aidsresearchandreferencereagentprogram)获得。tnfα购自r&d，并且lps来自sigma。针对穿孔素(prf1)和粒酶b(gzmb)的抗体来自santacruzbiotechnology，并且抗β-肌动蛋白来自sigma(st.louis,mo)。抗磷酸stat蛋白和抗bcl-2家族蛋白从cellsignaling获得。nkg2d阻断抗体和同种型igg对照抗体以及各种经apc或fitc标记的抗体购自biolegend。gm-csf-fc4和il-4-fc4蛋白从用使用基于pcr的克隆方法获得的慢病毒融合基因构建体转导的293细胞产生，其中gm-csf、il-4和igg4的cdna从openbiosystems获得。
慢病毒载体、病毒产生和转导。使来自htlv-2的tax基因与编码增强绿色荧光蛋白(egfp)的片段融合，并且将tax2-gfp融合片段克隆至其中人延伸因子启动子驱动转基因的表达的慢病毒载体中。使用基于pcr的克隆方法构建表达hla-a2(来自a375细胞的cdna)、b2m(来自正常淋巴细胞的cdna)和mica(来自a375细胞的cdna)的慢病毒载体。为产生融合基因构建体ptert(aa301-700)，通过高保真pcr来扩增iκbα(来自正常淋巴细胞的cdna)和htert(aa301-700)(来自u2os细胞的cdna)，进行酶消化，并且插入慢病毒载体中。
为产生重组慢病毒，使用superfect转染试剂(qiagen)将慢病毒构建体与含有vsv-g、gag-pol和rev的表达质粒的包装质粒混合物(invitrogen)一起共转染至293细胞中。收集病毒上清液，并且可使其在25,000rpm/4℃下超速离心2小时。将病毒沉淀再悬浮并储存在-80℃下。
为产生表达荧光素酶的靶细胞系，用荧光素酶慢病毒以感染复数(moi)10转导panc-1、a375、hela、h1299、mcf-7、mcf-7/adr、hcc1954、mt4和nih3t3细胞。使用来自promega的试剂盒，根据制造商推荐的方案，通过荧光素酶活性测定来验证荧光素酶在这些细胞系中的表达。通过以moi20对ihv-dc进行ptert慢病毒转导来产生ptert表达性dc。
ihv-dc细胞系的产生。leukopak从纽约血库(newyorkbloodbank)获得。从leukopak分离人外周血液单核细胞(pbmc)，并且用pha(5μg/ml)刺激24小时，随后添加重组il-2(100单位/ml)。将活化的pbmc培养4-5天，并且接着在聚凝胺(10μg/ml)存在下用tax2-gfp慢病毒转导。在含有10％胎牛血清(sigma)和100单位/ml的重组il-2的完全rpmi1640培养基中连续培养经转导的细胞。或者，在补充有5％热失活人ab血清(sigma)的rpmi1640培养基中培养经转导的细胞。在转导之后2至3周，用抗cd3磁珠(lifetechnologies)阴性选择经转导的细胞以使t细胞消减。连续在培养中维持cd3阴性细胞，并且在转导之后约3个月分析它们的免疫表型。从2名供血者建立两个dc细胞系，并且命名为ihv-dc1和ihv-dc2。ihv-dc1细胞在培养传代期间丧失cd40，并且通过cd40慢病毒转导来使cd40恢复。使ihv-dc在il-2(50-100单位/ml)存在下在补充有10％fbs或5％热失活人ab血清的rpmi1640培养基中生长。
为产生单核细胞源性dc，在1:10稀释度下使用gm-csf-fc4/il-4-fc4产生性293细胞的条件培养基，用gm-csf-fc4/il-4-fc4刺激来自400万个pbmc的贴附单核细胞7天。随后用tax2-gfp慢病毒转导分化的dc。在gm-csf-fc4/il-4-fc4存在下在具有10％fbs的rpmi1640培养基中培养tax表达性modc(modc-tax)5-7天，接着继续在100单位/ml的重组il-2存在下在培养中维持。通过用tnfα(50ng/ml)和lps(1μg/ml)刺激经gm-csf-fc4/il-4-fc4分化的modc2天来产生活化的modc。成熟和活化的modc显示典型树突，并且被收集来进行rna和蛋白质提取。
通过流式细胞术进行的免疫表型分析。用facs分析ihv-dc细胞、modc-tax和dc活化的淋巴细胞的免疫表型。根据制造商说明书，用如附图中指示的别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗体(biolegend)对细胞染色。使染色细胞经受facs分析。对于tlr3细胞内染色，使用来自ebioscience的细胞内染色试剂盒，根据制造商说明书，在透化之后用apc缀合的抗tlr3抗体或igg同种型对照抗体对ihv-dc细胞染色。
同种异体混合白细胞反应(mlr)测定。使ihv-dc与从leukopak分离的原初pbmc以1:100的比率混合。在不添加外源性细胞因子的情况下在培养中保持混合细胞2-3天，随后添加重组il-2(100u-200单位/ml)。用facs监测ihv-dc反应性淋巴细胞的增殖，并且使用荧光显微术监测ihv-dc在混合培养物中的存在。在mlr之后2-3周，用facs分析ihv-dc活化的淋巴细胞，并且考查它们对靶细胞的细胞毒性活性。
细胞毒性测定。被修饰以表达荧光素酶的各种细胞系被用作靶标，而从在mlr之后18-21天产生的ihv-dc活化的淋巴细胞充当效应物。首先将癌细胞放置在24孔板中持续2小时以达成完全贴附。接着以指示的e:t比率将ihv-dc活化的淋巴细胞放置在癌细胞上。在共培养效应细胞和靶细胞之后4小时或16小时时间点，用pbs缓冲液洗涤活细胞以移除细胞碎片，并且使用来自promega的试剂盒使活细胞经受荧光素酶活性测定。因此，通过比较不用或用细胞毒性淋巴细胞以指示的e:t比率处理的靶细胞中的荧光素酶活性来确定ihv-dc活化的淋巴细胞的细胞毒性活性。
凝胶电泳迁移率变化测定(emsa)。使用ne-per核和细胞质提取试剂(pierce)，从各种细胞系制备核提取物。寡核苷酸用生物素(integrateddnatechnologies)进行5’末端标记，并且与它的互补链退火。使用光变化化学发光emsa试剂盒(pierce)，遵循先前报道的方案，通过emsa来考查结合活性(jain,p.等dc-signmediatescell-freeinfectionandtransmissionofhumant-celllymphotropicvirustype1bydendriticcells.journalofvirology83,10908-10921(2009).)。寡核苷酸探针是用于stat3的(5’-gatccttctgggaattcctagatc-3’)(seqidno:18)，用于nf-κb的(5’-gat-ccggcaggggaatctccctctc-3’)(seqidno:19)以及用于ap-1的(5’-cgcttgatgactcag-ccggaa-3’)(seqidno:20)。
免疫荧光成像。细胞用pbs洗涤，并且用4％多聚甲醛固定20分钟，以及用0.1％
定量实时pcr(qrt-pcr)。使用rneasy试剂盒(qiagen)分离总rna，并且使用nanodrop1000分光光度计(thermoscientific)测定它的浓度。在1％甲醛-琼脂糖凝胶上评估总rna的品质和完整性。使用omniscript逆转录酶试剂盒(qiagen)，遵循制造商推荐方案合成cdna。使用powersybrgreen(appliedbiosystems)，使模板样品一式三份经受实时定量pcr(stratagenemx3005p系统)。引物序列列于表1中。
表1用于实时pcr分析的引物
动物和异种移植物模型。使用批准的iacuc方案进行动物研究。雌性nsg小鼠(4–6周，18–22g重)从马里兰大学医学院(universityofmarylandschoolofmedicine)的动物中心获得，并且舍饲在特定无病原体房间中。收集mcf-7/adr细胞(400万个)、hcc1554细胞(100万个)，并且再悬浮于具有相等体积的基质胶(bd,usa)的汉克斯缓冲液(hanksbuffer)中，接着注射至雌性nsg小鼠的乳腺脂肪垫中。在癌细胞植入之后，将小鼠随机分入两个组(ctl和对照)中。当肿瘤可触知时开始治疗。治疗组小鼠通过小鼠尾部静脉来注射ihv-dc1活化的ctl(q5d×8，2000万个细胞于100μl中，外加1,000u重组il-2)，并且对照组小鼠通过小鼠尾部静脉来注射汉克斯缓冲液(q5d×8，静脉内，100μl，外加1,000u重组il-2)。每2天测量动物的重量。从治疗的第一天开始记录肿瘤生长，并且每2天测量异种移植物的体积。使用公式v＝πa*b2/6计算肿瘤体积(v)，其中a和b分别是最长直径和最短直径。
免疫组织化学和he染色。在60℃下孵育组织切片10分钟，接着在二甲苯中以及随后在etoh和di水中脱蜡。在脱蜡之后，将组织切片浸渍至预加热的抗原去掩蔽溶液(antigenunmaskingsolution)(vector,ca,usa)中，放置至加压蒸煮器中持续5-10分钟，接着在冷水下冷却至室温。抗人cd3抗体(1:100)用于对预处理的组织切片进行染色。接着，通过使组织切片与含3％过氧化氢的pbs一起孵育10分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。生物素化山羊抗小鼠igg抗体(h+l)(1:200)(vector,ca,usa)被用作二抗。vectastaineliteabchrp试剂盒(vector,ca,usa)被用作色原体，并且也进行苏木精复染。方案详述于表2中。he染色(石蜡包埋)由马里兰大学医学院的病理学电子显微术和组织学实验室(pathologyelectronmicroscopyandhistologylaboratory)进行。
表2
尽管本教义结合各个实施方案联合加以描述，但不意图本教义限于所述实施方案。相反，本教义涵盖如将由本领域技术人员所理解的各种替代方案、修改和等效案。
在本公开通篇中，通过标识引用来引用各种出版物、专利和公开专利说明书。这些出版物、专利和公开专利说明书的公开内容据此以引用的方式并入本公开以更充分描述本发明所属领域的状态。
序列表
<110>universityofmaryland,baltimore
<120>用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法
<130>umb-039pct1
<150>62/243,177
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