本申请要求澳大利亚临时申请号2015904678和美国临时申请号62/321377的优先权，两篇申请的全部内容通过引用以其全文特此结合。
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的组合物、方法、用途和试剂盒。
背景技术：
一段时间以来，人们就建议使用蛋白酶来治疗癌症。最初新鲜的胰酶提取物被认为是一种可能的癌症治疗方法，并且用杰森氏小鼠肉瘤模型(Jersen's mouse sarcoma model)进行了一些成功的实验。用蛋白酶胰蛋白酶注射小鼠后，观察到了肿瘤消退。得到的结果引起了人们极大的兴趣，并且使用从绵羊胰腺中制备的粗酶提取物来治疗人类癌症患者以减少肿瘤进展并延长存活时间。
已经使用酶原(酶的无活性前体形式)来尝试克服具有混合结果的酶的口服给予所遇到的问题。包含胰蛋白酶原的酶原混合物(其为丝氨酸蛋白酶抑制剂胰蛋白酶的酶原形式)已被证明可用于治疗癌并据信在肿瘤细胞表面被选择性激活。胰蛋白酶的作用机制据信是通过肿瘤细胞的蛋白酶解发生的。包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的组合物已被证明在包括胰腺癌和结肠癌的癌症测定中是有效的(WO 2011/047434)。
但是，需要提供新的或改进的癌症治疗方法。
说明书中参考任何现有技术不是承认或暗示该现有技术在任何判定中形成公知常识的一部分，或者该现有技术可合理预期地被本领域技术人员理解为，认为是与其他现有技术相关的和/或组合的。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于治疗癌症的组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物被调节用于以等于或大于0.1mg/kg的量给予胰凝乳蛋白酶原和以等于或大于0.02mg/kg的量给予胰蛋白酶原。
本发明还提供了用于治疗受试者的癌症的组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中该组合物包含大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原。
在本发明的任何方面中，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原或由其组成，其中胰凝乳蛋白酶原的量是大于1.5mg/kg、2mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、135mg/kg、250mg/kg或500mg/kg。胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的量可以是等于或大于本文所描述的，包括在表1、4、8、10和实例，特别是实例5中的任一mg/kg值。
在本发明的任何方面中，用于治疗人类的癌症的组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原或由其组成，其中胰凝乳蛋白酶原的量大于0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.25mg/kg、0.4mg/kg、1.2mg/kg、3.5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg。胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的量可以等于或大于本文所描述的，特别是实例5描述的任一mg/kg值。
在本发明的任何方面中，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原或由其组成，其中胰蛋白酶原的量大于0.25mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg。胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的量可以是等于或大于本文所描述的，包括在表1、4、8、10和实例，特别是实例5中的任一mg/kg值。
在本发明的任何方面中，用于治疗人类的癌症的组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原或由其组成，其中胰蛋白酶原的量大于0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg。胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的量可以等于或大于本文所描述的，特别是实例5描述的任一mg/kg值。
本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症的药物组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，或是本文所描述的，特别是实例5描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。在一个实施例中，组合物中存在的唯一的活性抗肿瘤成分是胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。
本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症的药物组合物，其包含活性成分胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，该组合物进一步包含一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，或本文所描述的，特别是实例5描述的其他的量的胰蛋白酶原。在一个实施例中，组合物中存在的唯一的活性抗肿瘤成分是胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。
本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症的药物组合物，其包含主要成分胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，该组合物进一步包含一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，或本文所描述的，特别是实例5描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。在一个实施例中，组合物中存在的唯一的活性抗肿瘤成分是胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。
本发明提供了一种用于治疗受试者的胰腺癌的药物组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含至少大于10mg/kg，优选地大于13mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于1.5mg/kg，优选地大于2mg/kg的胰蛋白酶原。优选41mg/kg或更高的量的胰凝乳蛋白酶原和7mg/kg或更高的量的胰蛋白酶原。
本发明提供了一种用于治疗受试者的卵巢癌的药物组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含大于3mg/kg，优选大于4mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.4mg/kg，优选大于0.7mg/kg的量的胰蛋白酶原。优选地13mg/kg或更高的量的胰凝乳蛋白酶原和2.2mg/kg或更高的量的胰蛋白酶原。
本发明还提供了一种用于治疗受试者的癌症的药物组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，或是本文所描述的，特别是实例5描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。
本发明还提供了一种用于治疗受试者的癌症的药物组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该组合物包含大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，或本文所描述的，特别是实例5描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。
本发明还提供了一种单位剂量组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中该单位剂量被调节用于给予大于或等于6mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于或等于1mg/kg的量的胰蛋白酶原，或本文所描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。优选地，胰凝乳蛋白酶原的量是大于或等于9mg、15mg、24mg、72mg、210mg、600mg、1200mg、2400mg。优选地，胰蛋白酶原的量是大于或等于1.5mg、3mg、3.5mg、12mg、36mg、90mg、180mg或360mg。
本发明还提供了一种用于治疗癌症的组合物，该组合物包含浓度为0.25mg/ml的胰蛋白酶原和浓度为1.5mg/ml的胰凝乳蛋白酶原。优选地，胰蛋白酶原的浓度是4.3mg/ml、8.7mg/ml或30mg/ml并且胰凝乳蛋白酶原的浓度是25mg/ml、50mg/ml或100mg/ml。胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原可以是如本文所述的任何其他的浓度，例如实例中的那些。
在本发明的任何方面中，该药物组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，由其组成，或被调节给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中胰凝乳蛋白酶原的量是大于1.5mg/kg、2mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、135mg/kg、250mg/kg或500mg/kg。胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的量可以是等于或大于本文所描述的，包括在表1、4、8、10和实例，特别是实例5中的任一mg/kg值。
在本发明的任何方面中，用于人类用途的药物组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，由其组成，或被调节用于给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中胰凝乳蛋白酶原的量是大于0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.25mg/kg、0.4mg/kg、1.2mg/kg、3.5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg。胰凝乳蛋白酶原的量可以等于或大于本文所描述的，特别是实例5描述的任一mg/kg值。
在本发明的任何方面中，该药物组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，由其组成，或被调节用于给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中被给予的胰蛋白酶原的量是大于0.25mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg。胰蛋白酶原的量可以是等于或大于本文所描述的，包括在表1、4、8、10和实例中的任一mg/kg值。
在本发明的任何方面中，用于人类用途的药物组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，由其组成，或被调节用于给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中被给予的胰蛋白酶原的量是大于0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg。胰蛋白酶原的量可以等于或大于本文所描述的，特别是实例5描述的任一mg/kg值。
本发明包括一种治疗受试者的癌症的方法，其包括给予大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，从而治疗癌症。
在本发明的任何方法中，在24小时的时间段内以单个剂量或多个剂量给予的胰凝乳蛋白酶原的量是大于1mg/kg，但小于500mg/kg。
在本发明的任何方法中，在24小时的时间段内以单个剂量或多个剂量给予的胰蛋白酶原的量是至少大于0.2mg/kg，但小于90mg/kg。
本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括给予500mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和83mg/kg的量的胰蛋白酶原，从而治疗癌症。优选地，该癌症是胰腺癌或卵巢癌。甚至更优选地，胰腺癌是腺癌。
本发明提供了一种治疗人类的癌症的方法，其包括给予40mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和7mg/kg的量的胰蛋白酶原，从而治疗癌症。优选地，该癌症是胰腺癌。甚至更优选地，胰腺癌是腺癌。
本发明提供了一种治疗人类的癌症的方法，其包括给予4mg/kg或13mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和0.7mg/kg或2mg/kg的量的胰蛋白酶原，从而治疗癌症。优选地，该癌症是卵巢癌。
在本发明的任何方法中，胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的量的给予不会在给予1周后，给予1天后，或优选地给予1小时后在受试者中产生任何临床上可观察的不良事件。该临床上可观察的不良事件可以是以下中的一个或多个：重量损失、注射部位变红和行为改变、或本文特别是实例中描述的任何其他的事件。
在本发明的任何方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原以1:1或约1:1至10:1或约10:1、4:1或约4:1至8:1或约8:1、5:1或约5:1至7:1或约7:1、或以约6:1的范围的重量比给予。此外，上述的任一组合物具有1:1或约1:1至10:1或约10:1、4:1或约4:1至8:1或约8:1、5:1或约5:1至7:1或约7:1、或以约6:1的范围的重量比的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。
本发明还提供了胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该药物被调节用于给予大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原，或本文所描述的特别是实例5中描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。
本发明还提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含至少一个剂量单位，其中该剂量单位包含胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和一种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该剂量单位被调节用于给予等于或大于本文所述的包括在表1、4、8和10特别是实例5中的任何量或mg/kg值的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。
任选地，该试剂盒还包括书面说明，其指导用户给予一剂量单位的大于1mg/kg的量的胰凝乳蛋白酶原和大于0.2mg/kg的量的胰蛋白酶原、或本文所描述的特别是实例5中描述的任何其他的量的胰蛋白酶原。
本发明的方法和药物组合物可用于治疗癌症和转移癌，包括胰腺癌、食管癌、结肠癌、肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤或肺癌。优选地，该癌症是胰腺癌、结肠癌或卵巢癌。更优选地，该癌症是胰腺癌。
在本发明的方法或用途的任何方面，该方法或用途进一步包括鉴定患有癌症或有发展癌症风险的受试者的步骤。优选地，该癌症是本文所描述的任何一个。
在本发明的任何方面中，该组合物不包含或者该方法或用途不给予淀粉酶。
在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰凝乳蛋白酶原的量可以是大于或等于1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、135mg/kg、250mg/kg或500mg/kg。给予的胰凝乳蛋白酶原可以是等于或大于本文所描述的包括在表1、4、8和10特别是实例5中的任一mg/kg值。
在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰蛋白酶原的量可以是大于或等于0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg。给予的胰蛋白酶原可以等于或大于本文所描述的包括在表1、4、8和10特别是实例5中的任一mg/kg值。
在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予人类的胰凝乳蛋白酶原的量可以是大于或等于0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.25mg/kg、0.4mg/kg、1.2mg/kg、3.5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg。胰凝乳蛋白酶原的量可以等于或大于本文所描述的，特别是实例5描述的任一mg/kg值。
在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予人类的胰蛋白酶原的量可以是大于或等于0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg。胰蛋白酶原的量可以等于或大于本文所描述的，特别是实例5描述的任一mg/kg值。
优选地，在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰凝乳蛋白酶原的量可以是1mg/kg至41mg/kg、1.5mg/kg至500mg/kg、2mg/kg至250mg/kg、3.5mg/kg至135mg/kg、5mg/kg或15mg/kg至45mg/kg的范围。给予的胰凝乳蛋白酶原可以是本文描述的包括在表1、4、8、10和实例特别是实例5中的任何两个mg/kg之间的范围内。
优选地，在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰蛋白酶原的量可以是大于0.2mg/kg至7mg/kg、0.25mg/kg至80mg/kg、0.4mg/kg至40mg/kg、0.6mg/kg至20mg/kg、0.8mg/kg至8mg/kg、或2.5mg/kg至8mg/kg。给予的胰蛋白酶原可以是在本文描述的包括在表1、4、8、10和实例特别是实例5中的任何两个mg/kg值之间的范围内。
在以上发明的任何组合物中，该组合物可以被调节用于给予受试者胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的相关的mg或mg/kg。
本发明还提供了，包括值的以上本发明的任何方面是“约为”以上所陈述的值。例如，本发明的另外的方面是以上方面中的任一个，其中提及500mg/kg是约500mg/kg。这被设想用于本发明的所有方面或实施例以及所有值。
本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症的组合物，其包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是大于8:1(即，8或更多:1)。优选地，该重量比是大于10:1。优选地，该重量比是10:1。该重量比可以是8:1、10:1或8:1和10:1之间。在实施例中的任何一个中，该组合物优选地不包含淀粉酶，即，它包括给予一种无淀粉酶组合物。
本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是大于8:1，从而治疗该受试者的癌症。优选地，该重量比是大于10:1。优选地，该重量比是10:1。该重量比可以是8:1、10:1或8:1和10:1之间。在一个实施例中，该方法不包括给予淀粉酶，即，它包括给予一种无淀粉酶组合物。
本发明提供了胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是大于8:1。优选地，该重量比是大于10:1。优选地，该重量比是10:1。该重量比可以是8:1、10:1或8:1和10:1之间。在一个实施例中，该药物不包含淀粉酶。
优选地，该癌症是胰腺癌、食管癌、结肠癌、肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤、纤维肉瘤或肺癌中的一个或多个。优选地，该癌症是卵巢癌、黑色素瘤、脑瘤、前列腺癌、结直肠癌、肝癌或肺癌。优选地，该癌症是胰腺癌、结肠癌或卵巢癌。更优选地，该癌症是胰腺癌。
在本发明的任何方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原是静脉内、肌肉内或皮下给予的。
在本发明的任何方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原可以同时或顺序给予。
如在此所使用的，除非上下文中另有要求，否则术语“包括(comprise)”及其变体，例如“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised)”，并不旨在排除进一步的添加剂、组分、整体、或步骤。
前述段落中所述的本发明其他方面和这些方面的其他实施方案将从以举例方式给出的以下描述中并且参考附图而变得清楚。
附图说明
图1：在研究#1期间，每组的平均体重±SEM(g)。治疗以单次静脉内注射给予，每天一次，连续七天。以交错的方式对每组开始治疗，以最低剂量开始，并且然后在随后的每一天增加剂量。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
图2：在研究#2期间，每组的平均体重±SEM(g)。治疗以单次静脉内注射给予，每天一次，连续七天。以交错的方式开始对每组的治疗，在第一天以最低剂量开始并且然后在第二天增加剂量至86.8/500mg/kg的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A。第三天开始用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以43.4/250mg/kg进行治疗。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
图3：实例3中描述的研究中的PBS对照小鼠(组1，n＝8)和接受T:C，27.5mg/kg:165mg/kg的小鼠(组2，n＝9)或T:C，83.3mg/kg:500mg/kg的小鼠(组3，n＝10)的平均肿瘤重量±SEM(mg)的结果，进行本实例用来评估针对在雌性C57BL/6小鼠中原位接种的Pan02小鼠胰腺癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。治疗以单次静脉内注射给予，在研究第0至25天每天进行一次。在研究第26天将动物处死。
图4：从实例3描述的研究第26天的组1(PBS，10ml/kg，每天静脉内)的小鼠中切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性C57BL/6小鼠中原位接种的Pan02小鼠胰腺癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图5：从实例3描述的研究第26天的组2(T:C，27.5mg/kg:165mg/kg)的小鼠中切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性C57BL/6小鼠中原位接种的Pan02小鼠胰腺癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图6：从实例3中描述的研究第26天组3(T:C，83.3mg/kg:500mg/kg)中的小鼠切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性C57BL/6小鼠中原位接种的Pan02小鼠胰腺癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图7：实例4中所述的研究中的组2：载体对照(PBS)、组3：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A，83.3/500mg/kg、组4：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A，27.5/165mg/kg、组5：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A，9.1/54mg/kg的平均肿瘤重量±SEM(g)，进行本实例用来评估针对在雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠中原位接种的A2780人类卵巢癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。治疗以单次静脉内注射给予，每天一次(研究第0至20天)。在研究第21天将这些动物处死。
图8：在实例4中描述的研究中的组2：载体对照(PBS)研究终止时切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠中原位接种的A2780人类卵巢癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图9：在实例4中描述的研究中的组3：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A，83.3/500mg/kg的研究终止时切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠中原位接种的A2780人类卵巢癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图10：在实例4中描述的研究中的组4：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A，27.5/165mg/kg的研究终止时切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠中原位接种的A2780人类卵巢癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图11：在实例4中描述的研究中的组5：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A，9.1/54mg/kg的研究终止时切除的肿瘤的图像，进行本实例用来评估针对在雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠中原位接种的A2780人类卵巢癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
图12：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对A2780人类卵巢肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(3.174mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图13：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对C8161.9人类黑色素瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(3.917mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图14：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对DAOY人类脑肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(2.654mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率，进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图15：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对DU145人类前列腺肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(3.843mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图16：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对HCT 116人类结直肠肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(16.43mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率，进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图17：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对Hep3B2.1-7人类肝肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(2.483mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图18：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对HT-29人类结直肠肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(15.12mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图19：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对HuH-7人类肝肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(3.934mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
图20：胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对NCI-H460人类肺肿瘤细胞的生长的影响。基于前述测定的胰蛋白酶原(4.028mg/ml)的IC50，以1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10的比率进行胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合测定。CDI值如上所述来计算。
具体实施方式
应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。这些不同组合的全部构成本发明的多个替代性方面。
现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是，应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明意图涵盖可包含在如权利要求书所限定的本发明的范围内的所有替代方案、修改方案以及等效方案。
本领域技术人员将认识到类似于或等同于在此所述的那些的可在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。这些不同组合的全部构成本发明的多个替代性方面。
在此提及的所有专利和公开物均通过引用以其全文结合在此。
出于解释本说明书的目的，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。
本发明是基于以下惊人的发现：胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原可以按显著高于从前所用的量给予。这可以发生在单次给予，或在一天的一段时间中。令人惊讶地是，可以给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的这些显著更高的量，甚至百倍高的量，而不产生任何显著的不良临床事件。此外，这些更高的量被示出减少了体内若干个肿瘤类型的重量。本发明在治疗癌症方面提供了重要的益处，因为可以安全地给予比以前使用的更大的有效剂量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而提供更大的治疗窗。
胰凝乳蛋白酶原(在本文中其可缩写为“C”)是酶胰凝乳蛋白酶的一种酶原形式，其优先地在以下氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸处切割蛋白。胰凝乳蛋白酶可以被称为或包括胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B(包括B1和B2形式)、胰凝乳蛋白酶C、a-糜蛋白酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳酶、蛋白质溶解酶、α-胰凝乳酶(quimar)、糜蛋白酶(quimotrase)、α-胰凝乳蛋白酶(α-chymar)、α-胰凝乳蛋白酶A、α-胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶C可以从猪胰凝乳蛋白酶原C或从羧肽酶原A的牛亚基II形成，并且优先地在以下氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺处切割蛋白。胰凝乳蛋白酶原包括胰凝乳蛋白酶原B1和胰凝乳蛋白酶原B2。
胰蛋白酶原(在本文中其可被缩写为“T”)是胰蛋白酶的酶原形式，其优先地在精氨酸和赖氨酸处切割蛋白。胰蛋白酶可以被称为或包括α-胰蛋白酶、β-胰蛋白酶、茧酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶(parenzymol)、胰蛋白酶(tryptar)、胰蛋白酶(trypure)、胰蛋白酶(pseudotrypsin)、类胰蛋白酶、胰蛋白酶(tripcellim)、精子受体水解酶β-胰蛋白酶，可以从胰蛋白酶原通过切割一个肽键形成。进一步的肽键切割产生α和其他的同种型。多种阳离子和阴离子胰蛋白酶可以从许多脊椎动物的胰腺中和更低等的物种(包括小龙虾、昆虫(茧酶)和微生物(灰色链霉菌)中分离出来。在消化的正常过程中，无活性胰蛋白酶原被存在于肠黏膜中的肠肽酶活化以形成酶胰蛋白酶，其然后作为丝氨酸蛋白酶起作用在碱性氨基酸/蛋白质的羧基侧切割肽键。
用于本发明的任何方面的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原可以是被分离的，纯化的，基本上纯化的，重组的或合成的。
酶原胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原可以是选自胰凝乳蛋白酶类别3.4.21.1或3.4.21.2的酶，或来自类别3.4.21.4、或选自任何其他适合的来源(根据国际生物化学与分子生物学联合会的命名委员会的分类分组的类别)的胰蛋白酶的前体。这些酶是可商购的并且可以是人类、牛或猪来源的。
如本文所使用的，“如本文所描述的任何其他的量”或“如本文所描述的任何mg/kg值”包括：包括在表1、4、8和10中的实例中的任何一个描述的任何量或mg/kg值。
本发明包括基于人类体重50、60、70、80、90、100或更多kg和体表面积1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或更多m2的本文所指的所有量以mg/kg的人类转换。具体而言，实例5中涉及用于人类给予的每kg量和计算方法。
如所提到的，该酶原形式主要地提供原位(例如，体内或体外活化)活化的酶的无活性形式。例如，酶原的活化(酶原向活性酶的转化)可以在与肿瘤细胞表面接触时发生。据信，该酶原胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原在与肿瘤细胞接触并且不与健康细胞接触时被选择性地活化为酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。酶原的使用减少了与提供原位活性酶相关的问题，例如在到达肿瘤细胞的预期的靶之前或酶的不期望的反应或失活。
关于肿瘤细胞，蛋白酶可以起作用通过切割存在于细胞壁的肽链上的酰胺键(蛋白酶解)分解恶性细胞的细胞壁。还可以理解的是，蛋白酶抑制剂(其存在于非-恶性细胞并且抑制或减少酶在分解细胞壁中的作用)不存在于恶性肿瘤细胞中。除了提供蛋白酶解活性，蛋白酶酶原可以上调肿瘤细胞中β-联蛋白和E-钙黏着蛋白的表达。通过β-联蛋白和E-钙黏着蛋白在细胞表面的复合物形成或结合促进细胞与细胞的黏附，并且因此β-联蛋白和E-钙黏着蛋白的增加的表达导致增强的细胞与细胞黏附并且从而减少了肿瘤细胞的转移。蛋白酶原酶还可以提供其他的细胞活性，例如增加的免疫识别或分化。
一个显著的不良事件、经历或反映是在任何剂量下导致死亡，是威胁生命的(将受试者置于接近死亡的风险)，要求受试者/受试者住院或延长已有的住院，冬至顽固性或显著的残疾、无能或是先天性异常/出生缺陷的任何不利的医疗事件。
临床上可观察的不良事件是给予药物产品的受试者中的或临床观察受试者中的任何不利的医疗事件。临床上可观察的不良事件可以包括本文所描述的，特别是在实例中描述的事件或观察中的任一者。典型地，观察期为给予后约1周、给予后约1天或优选地给予后约1小时。观察期可以是剂量给予之间的时间。
“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗处理和预防疾病的或预防性措施，其中目标是预防、改善、减少或减缓(减轻)癌症或其扩散(转移)。
在本发明的任何方法中，可以观察到以下作用中的一种或多种：恶性肿瘤复发的减少、恶性肿瘤转移的减少、肿瘤数量或尺寸、肿瘤细胞分化的减小、β-联蛋白和E-钙黏着蛋白在恶性肿瘤中的表达以促进细胞与细胞的黏附和转移的减少、防止免疫识别的肿瘤细胞能力的减少。
“防止(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性(preventative)”或“预防疾病的(prophylactic)”是指病症、疾病、障碍或表型(包括异常或症状)的避免发生，或妨碍，防御或防止发生。需要预防的受试者可能易于发展该病症。
术语“改善(ameliorate)”或“改善(amelioration)”是指减少，减小或消除病症、疾病、障碍或表型，包括异常或症状。需要治疗的受试者可能已经具有该病症，或者可能易于患有该病症，或者可能是要预防该病症的受试者。
该“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是人类，或者可以是家养动物、动物园动物或宠物。虽然特别考虑到本发明的方法适用于人类的医学治疗，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗宠物如狗和猫以及家养动物如马、牛和绵羊，或者动物园动物如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物。受试者可能患有癌症或其他障碍，或者可能不患有癌症或其他障碍(即，没有可检测到的疾病)。
人类受试者的典型体重可以是大于或等于60kg、65kg、70kg、75kg、80kg、85kg、90kg、95kg、100kg、105kg或110kg。
术语“治疗有效量”是指能够治疗，预防或改善癌症或其扩散(转移)的组合物或药剂或化合物的量。治疗有效量可以凭经验并且以与治疗癌症有关的常规方式确定，并且会导致怎增加的预期寿命。
如本文所使用的，“被调节用于给予”是指具有以在单剂量或多剂量中指定的量或浓度给予胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的能力的组合物。
如本文所述，本发明的方法包括治疗赘生物和相关病症、癌症、肿瘤、恶性和转移性病症。与可以用本发明的方法或药物组合物治疗的与实体瘤和转移瘤相关的组织和器官包括但不限于：胆道、膀胱、血液、脑、乳房、子宫颈、结肠、子宫内膜、食管、头、颈、肾、喉、肝、肺、髓质、黑色素、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾脏、视网膜、皮肤、胃、睾丸、甲状腺、尿路和子宫。该癌症可能是癌，并在上皮细胞中或从上皮细胞中发展。该癌症可能是肉瘤并发展成结缔组织。
本发明的方法和药物组合物可以用于治疗以下类型的癌症和转移癌：胰腺癌、食管癌、结肠癌、肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤或肺癌。优选地，该癌症是胰腺癌、结肠癌或卵巢癌。更优选地，该癌症是胰腺癌。
本发明的方法和药物组合物可以提供治疗癌症的多效方法，例如通过增加肿瘤细胞凋亡、细胞与细胞的黏附、分化和免疫原性(通过免疫系统靶向和去除)。因此，在没有可能抑制或损害免疫系统的任何其他治疗的情况下进行治疗是有益的。
本发明的方法或用途可以通过针对治疗或预防增殖性障碍(例如肿瘤)的其他常规抗癌治疗方法来补充。例如，这些方法可用于预防疾病的癌症预防、预防手术后癌症复发和转移，以及作为其他常规癌症疗法的辅助剂。
本发明的药物组合物可以例如通过采用常规的固体或液体载体或稀释剂连同适合于所需给予方式的类型的药物添加剂(例如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)，根据例如药物配制品领域中熟知的技术进行配制。
本发明的药物组合物可以通过任何适合的方式给予，例如口服，例如以片剂、胶囊、颗粒或粉末的形式；舌下；经颊；肠胃外的，例如通过皮下、静脉内、肌内或脑池内注射或输注技术(例如，作为无菌注射水溶液或非水溶液或悬浮液)；经鼻，如吸入喷雾；局部，例如以霜或软膏的形式；或直肠，例如以栓剂的形式；在包含无毒的药学上可接受的载体或稀释剂的剂量单位配制品中给予。它们可以例如以适合立即释放或延长释放的形式给予，例如通过使用例如皮下植入剂、封装的球状体或渗透泵的装置。
除了灵长类例如人类以外，，可以根据第十方面的方法治疗多种其他哺乳动物。例如，可以治疗哺乳动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛科、绵羊类、马科、犬科、猫科动物、啮齿类动物或鼠科动物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂对其接受者无害。
术语“给予(administration of)”和/或“给予(administering)”应理解为意味着提供给需要治疗的个体。
需要治疗的个体可以是诊断患有本文描述的癌症中的任一种或处于发展其中中的任何一种癌症的风险中的个体。
本发明的药物组合物、和其制剂或配制品可以通过使组合物的组分即胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原混合在一起来制备。该混合可以顺序地或同时进行。
本发明的药物组合物可以常规地以剂量单位形式存在，并且可以通过制药领域中熟知的任何方法来制备。所有方法包括使活性剂和蛋白酶酶原结合，至与构成一种或多种辅助成分的载体关联的步骤。通常，该药物组合物通过以下步骤来制备：使活性剂和蛋白酶酶原均匀地并密切地与液体载体或精细分散的固体载体或两者结合，以及然后如果需要的话，将产品成型为所希望的配制品。该活性剂和蛋白酶酶原以剂量单位形式提供，其量足以在单次或重复给予后对疾病的过程或状况产生所希望的作用。
本发明的药物组合物可以处于适合口服使用形式，例如，片剂、糖锭剂、锭剂、水性的或油性的悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。旨在用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且为了提供药学上精致的并且适口的制剂，此类组合物可以包含一种或多种选自下组的试剂，该组由以下各项组成：甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂，这些赋形剂适合片剂的制造。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。这些片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知的技术来包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此在一个更长时期提供持久的作用。例如，可以采用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可被包衣以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。
口服使用的配制品还能以硬明胶胶囊的形式呈现，其中第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者以软明胶胶囊的形式呈现，其中第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性悬浮液包含与适于制造水性悬浮液的赋形剂相混合的活性剂和蛋白酶酶原。此类赋形剂是助悬剂，例如，羧甲纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、n-甲基-吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然磷脂，例如卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如，十七亚乙基氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，比如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇脱水物的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂、以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
含油悬浮液可以这样配制：将活性剂和蛋白酶酶原悬浮于植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或于矿物质油例如液状石蜡中。所述油悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可以添加如上文所述的甜味剂，和调味剂来提供美味的口服制品。这些可以通过添加抗氧化剂，如抗坏血酸来保存。
通过添加水，适合制备水性悬浮液的可分散粉以及颗粒提供了与分散剂或湿润剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂。适合的分散剂或润湿剂和助悬剂例如上文已经提及的那些。也可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以处于水包油乳液的形式。所述油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油；或矿物油，例如液态石蜡或这些物质的混合物。适合的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如单油酸山梨聚糖，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯单油酸山梨聚糖。所述乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖进行配制。它们还可以包含润药剂、防腐剂和调味剂和着色剂。
本发明的这些药物组合物可以处于无菌的可注射水性或油性悬浮液形式。这种悬浮液可以根据本领域已知的使用上面已经提及的那些适合的分散剂或润湿剂以及助悬剂来配制。第一和第二方面的药物组合物还可以是在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的一种无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的一种溶液。可采用的可接受的载体以及溶剂有水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的非挥发油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，发现脂肪酸(如油酸)可用于注射剂的制品中。
在一个具体的实施例中，本发明的药物组合物被配制成用于直肠给予药物的栓剂。可以通过将第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂与一种适合的非刺激性赋形剂混合来制备这些配制品，该赋形剂在室温下是固体并且在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔化从而释放药物。这类物质包括可可脂以及聚乙二醇。直肠给予可以用于消除与口服给予酶相关的胃肠道中的肠-肝首过效应。
本发明的药物组合物也可以配制成脂质体。如本领域中所已知，脂质体通常源自磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散在一种水性介质中的单层或多层水合液体晶体形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。脂质体配制品可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱。形成脂质体的方法是本领域中已知的。
本发明的药物组合物可以与给药的说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。该药物组合物的蛋白酶酶原和活性剂和任选的另外的活性剂可以在容器、包装或分配器中作为分离的组分提供，以分别或一起在相同或不同的时间用于本文所述的发明的用途或方法。
应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。这些不同组合的全部构成本发明的多个替代性方面。
实例
实例1
完成剂量研究以确定最大耐受和可行剂量，其中未观察到不良临床事件，或者其中通过随后给药解决任何不良临床事件。剂量研究方案如下所示。
在每个治疗日将胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以给出1mg/mL的储备溶液。所要求浓度的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液通过一起稀释PBS中的储备溶液来实现各自的所希望的最终浓度。
对于研究#1，按0.0254/0.1521mg/mL、0.0381/0.2282mg/mL、0.0572/0.3423mg/mL和0.0858/0.5135mg/mL制备胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液。
对于该研究，每组每天给予一次治疗，连续7天，给药量为10mL/kg。计算给予每只动物的给药溶液的体积并基于即将给药前测量的个体体重进行调整。
对于研究#1，将小鼠按体重随机分为四组，每组四只小鼠。表1总结了用于该研究的给药方案。以10mL/Kg的剂量将胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A作为单次静脉内尾静脉注射(i.v.)组合给予。每组的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的最终浓度是0.254/1.521mg/kg、0.381/2.282mg/kg、0.572/3.423mg/kg和0.858/5.135mg/kg(分别为组1、2、3和4)。
以交错的方式开始对研究#1的每组的治疗，以胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的最低剂量开始，并且然后在研究的随后每一天增加剂量。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
在每一个研究的第一天，组1的一只小鼠用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以最低剂量(研究#1，0.254/1.521mg/kg)治疗。由于在治疗的两个小时内没有持续的严重不良反应，这些组中每一组的其余三只小鼠都进行类似的治疗。
由于组1小鼠在初始治疗24小时内没有持续的严重不良反应，在研究#1中组2的一只小鼠用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以0.381/2.282mg/kg治疗。由于在该治疗的两小时内没有可见的毒性迹象，所以这些组中的每一个的剩余小鼠接受相同的治疗。
以这种方式继续分别对组3和4中的动物以研究#1的剩余的两个剂量的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A(0.572/3.423mg/kg和0.858/5.135mg/kg)的治疗。
每个研究中每组中的所有动物接受七次连续的每日治疗。
死亡率死亡率检查在研究期间每天早上进行一次。
临床观察在研究期间每天两次检查动物的临床症状(如不健康和行为改变)。
体重在第一个治疗日，然后在治疗期间每天并在最终治疗后七天记录所有动物的体重。
临床观察：
从远处
步态 正常或异常
立毛 正常或异常
呼吸类型 正常或异常
处理时
其他物种中的观察
皮肤变红/刺激，例如放射疗法副作用 正常或异常
身体状况 BC1、BC2、BC3、BC4、BC5
临床观察的评估标准：
步态：跛行、瘫痪、麻痹＝异常
体温：暖或冷＝异常
呼吸类型：快速；浅或吃力＝异常
腹泻：笼子地板上的粪便松散，笼子地板上的粪便稀薄或处理时会流动＝异常
身体状况(参考：Ullman-Cullere&Foltz.Lab.[Ullman-Cullere&Foltz.实验室]Animal Science[动物科学]1999；49:319)：BC1＝动物瘦弱；BC2＝动物发育不足；BC3＝动物发育良好；BC4＝动物过肥；BC5＝动物肥胖
研究#1的临床观察和不良事件
在研究期间，在任何动物中没有观察到不良临床症状。
体重变化
对于每一个组(用胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A以0.254/1.521mg/kg、0.381/2.282mg/kg、0.572/3.423mg/kg和0.858/5.135mg/kg治疗的动物的初始重量的2.59％、7.48％、7.97％和2.03％；分别为组1、2、3和4)在研究过程中(研究第0至13天)有平均体重增长(表2和图1)。没有动物失去超过初始体重的15％的体重(表3)。
实例2
令人惊讶的是，研究#1中胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的量从上述实例2的结果可以看出很好地耐受。鉴于这些量显著高于以前使用的量，这是意想不到的。鉴于这些结果，使用组合的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A以比从前使用的更高的量进行另外的研究，即研究#2。
针对研究#2，胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的储备溶液分别以5mg/mL和6mg/mL制备。将储备溶液进一步在PBS中稀释以制备0.256/1.5mg/ml的组1的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液。对于组2和3，分别以30mg/mL和100mg/mL制备胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的储备溶液。
将储备溶液进一步在PBS中稀释以制备组2的8.68/50mg/ml的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液，和组3的4.34/25mg/ml的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液。注意到在50mg/ml的浓度，胰凝乳蛋白酶原A几乎处于尾静脉注射的黏度极限。
对于研究#2，将12只小鼠按体重随机分为三组，每组四只小鼠。表4总结了用于该研究的给药方案。以10mL/Kg的剂量将胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A作为单次静脉内尾静脉注射(i.v.)组合给予。每组的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的最终浓度是2.6/15mg/kg、86.8/500mg/kg和43.4/250mg/kg(分别为组1、2和3)。
以交错的方式开始对研究#2的每组的治疗，以胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的最低剂量开始，并且然后在研究的随后每一天增加剂量。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
在每一个研究的第一天，组1的一只小鼠用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以最低剂量2.6/15mg/kg治疗。由于在治疗的两个小时内没有持续的严重不良反应，该组的其余三只小鼠进行了类似的治疗。
由于组1小鼠在初始治疗24小时内没有持续的严重不良反应，在研究#2中组2的一只小鼠用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以86.8/500mg/kg治疗。由于在该治疗的两小时内没有可见的毒性迹象，所以这些组中的每一个的剩余小鼠接受相同的治疗。
以这种方式继续对组3中的动物以研究#2(43.4/250mg/kg)的剩余的剂量的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的治疗。
研究#2的临床观察和不良事件
用胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A以2.6/15mg/kg和43.4/250mg/kg；分别为组1和3)(表5)治疗的动物中没有观察到不良的临床症状。
在注射部位的尾部皮肤变红和尾静脉临时小血块形成是观察到的唯一不良症状，其以最高剂量组(以86.8/500mg/kg的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)给药后立即发生并且在下一次剂量给予时解决(表5)。该临床症状不会干扰适当的剂量给予。
体重变化
对于每一个组(用胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A以2.6/15mg/kg、86.8/500mg/kg和43.4/250mg/kg治疗的动物的初始重量的6.98％、4.30％和6.61％；分别为组1、2和3)在研究过程中(研究第0至13天)有平均体重增长(表6和图2)。没有动物失去超过初始体重的15％的体重(表7)。
表1：研究#1的给药方案
以交错的方式对每组开始治疗，以最低剂量开始，并且然后在随后的每一天增加剂量。
对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
表2：研究#1的起始和终止时的每个治疗组的平均体重测量值±SEM(g)
治疗以单次静脉内注射给予，每天一次，连续7天。
以交错的方式对每组开始治疗，以最低剂量开始，并且然后在随后的每一天增加剂量。
对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
表3：研究#1的过程中每只动物的初始体重和最低体重(g)的出现
治疗以单次静脉内注射给予，每天一次，连续7天。
以交错的方式对每组开始治疗，以最低剂量开始，并且然后在随后的每一天增加剂量。
对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
表4：研究#2的给药方案
以交错的方式开始对每组的治疗，在第一天以最低剂量开始并且然后在第二天增加剂量至86.8/500mg/kg的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A。第三天开始用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以43.4/250mg/kg进行治疗。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
表5：研究#2的临床观察和不良事件
组1：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A 2.6/15mg/kg
组2：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A86.8/5005mg/kg
组3：胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A 43.4/250mg/kg
以交错的方式开始对每组的治疗，在第一天以最低剂量开始并且然后在第二天增加剂量至86.8/500mg/kg的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A。第三天开始用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以43.4/250mg/kg的治疗。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
表6：研究#2的起始和终止时的每个治疗组的平均体重测量值±SEM(g)
治疗以单次静脉内注射给予，每天一次，连续7天。
以交错的方式开始对每组的治疗，在第一天以最低剂量开始并且然后在第二天增加剂量至86.8/500mg/kg的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A。第三天开始用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以43.4/250mg/kg的治疗。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
表7：研究#2的过程中每只动物的初始体重和最低体重(g)的出现
治疗以单次静脉内注射给予，每天一次，连续7天。
以交错的方式开始对每组的治疗，在第一天以最低剂量开始并且然后在第二天增加剂量至86.8/500mg/g的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A。第三天开始用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以43.4/250mg/kg的治疗。对于所有的数据计算和表示，每组的治疗的第一天被指定为研究第0天。
实例3
进行本研究以评估针对在雌性C57BL/6小鼠中原位接种的Pan02小鼠胰腺癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
细胞系
Pan02小鼠胰腺肿瘤细胞来自美国国家癌症研究所(弗雷德里克，马里兰州，美国)。
肿瘤细胞培养
Pan02小鼠胰腺肿瘤细胞(工作储备VP-储备1235)在补充有10％FBS、1％GlutaMAXTM和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640细胞培养基中培养，并且在37℃在补充有5％CO2的加湿的细胞培养箱中生长。通过胰蛋白酶化收获细胞(第7代)，在HBSS中洗涤两次并计数(使用台盼蓝排除法)。用HBSS：MatrigelTM(1∶1，v/v)调节最终细胞密度至5×107Pan02细胞/mL。
已知在接种悬浮液中使用MatrigelTM可支持可增加肿瘤获取率的早期血管形成，并因此具有降低肿瘤尺寸变化性的潜力。
肿瘤细胞接种
在腹膜内注射麻醉(氯胺酮(14mg/mL)/甲苯噻嗪(0.9mg/mL))下接种四十只C57BL/6雌性小鼠。接种前，切口部位的皮肤用外用聚维酮碘溶液擦拭并且然后用酒精擦拭。制造切口来暴露出胰腺。将针头直接引入胰腺尾部，其中20μL由1×106个Pan02细胞组成的细胞悬浮液被排出。
小鼠在手术时和第二天皮下给予200μL推注剂量的Buprenex(盐酸丁丙诺啡，0.01mg/mL)以缓解疼痛。
肿瘤获取率测定
在接种后七天将十只随机选择的动物(组0)安乐死，以评估胰腺肿瘤的尺寸和获取率。切除胰脏并检查是否存在肿瘤。
在所有10只这些动物的胰腺中证实存在肿瘤。
随机化
确认成功的肿瘤获取率后两天，基于体重，将其余30只动物随机分为三组，每组10只(接种后9天；研究第0天)。
化合物配制
在每个治疗日将胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以给出1mg/mL的储备溶液。以2.75/16.5mg/mL和8.33/50mg/mL(比率为1:6)，通过首先在PBS中稀释胰蛋白酶原溶液并且然后添加胰凝乳蛋白酶原A来制备胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液。
化合物给予
表8总结了用于该研究的给药方案。
分配给获取率评估的动物(组0)仍未得到治疗。
以27.5/165(组2)和83.3/500mg/kg(组3)的剂量，每天一次静脉内(i.v.)以10mL/kg的给药量给予载体对照(PBS；Groups 1)和胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A(在单次注射中组合)。计算给予每只动物的给药溶液的体积并基于即将给药前测量的个体体重进行调整。
治疗开始于研究第0天(接种后九天)。在组1、2和3中的动物给予治疗连续26天的治疗。
终止程序
所有获取率评估动物和组1、2和3中的那些动物通过经批准的标准程序通过吸入二氧化碳而进行安乐死。
样品收集
终止后，将胰腺从具有完整肿瘤的所有动物中切除。将肿瘤从胰腺组织中分离出来，称重并且然后拍照(图4至图6)。将组4和组5中的各个样品的肿瘤的25mg部分在-80℃储存并且运送至适应生物科技公司(Adaptive Biotechnologies Corp.)用于进一步分析。
计算
使用以下公式计算第0天和任何给定日(第X天)之间的平均体重变化百分比变化(％BW变化)：
％BW变化＝平均(BW研究第X天)/平均(BW研究第0天)×100％-100％
其中BW研究第0天＝第0天的初始值并且BW研究第X天＝第X天的当前值。
使用以下等式计算治疗组相对于对照组的平均肿瘤重量的百分比变化：
百分比变化＝((平均值对照-平均值治疗)/平均值对照)×100
统计计算
所有统计计算均使用Mac OS X的Prism6(GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc)，拉荷亚,加利福尼亚州,美国)进行。
使用科-斯二氏(Kolmogorov-Smirnov(KS))正态性检验测试所有数据集的正态性。
使用配对t检验来确定在每组的研究第0天和终止日之间治疗组内体重是否显著改变。
使用单向方差分析(ANOVA)在组1、2和3之间比较研究终止时的肿瘤重量。使用Holm-Sidak的多重比较检验确定组间的显著差异。
≤0.05的p值被认为是显著的。
结果和观察
体重变化
用载体对照治疗26天(PBS；组1)的动物中有小(不显著)的平均体重损失(初始重量的0.54％)。
所有其他组显示平均体重增长；用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以27.5/165mg/kg和83.3/500mg/kg治疗26天的组(分别为组2和3)为初始重量的0.82％和2.72％。
化合物的功效
用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以83.3/500mg/kg(30.2mg；85.9％抑制；组3)治疗26天相比用载体对照(PBS；214.8mg；组1)治疗26天的动物的平均肿瘤重量有显著(p≤0.05)的减少，但是用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A以27.5/165mg/kg(196.5mg；8.5％抑制；组2)和用载体对照(表9和图3)治疗的动物平均肿瘤重量之间没有显著减少。
结论
针对在雌性C57BL/6小鼠中原位接种的Pan02小鼠胰腺癌细胞，评估了每天用胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A治疗的抗肿瘤功效，其以27.5/165mg/kg或83.3/500mg/kg的剂量作为单次静脉内注射组合给予。
终止时肿瘤重量的测量值显示在用高剂量胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A治疗的动物中，与对照治疗的动物相比，在该研究中治疗26天后，抗肿瘤效力显著(p≤0.05)。
表8：给药方案
表9：各组终止时的平均肿瘤重量±SEM(mg)
治疗以单次静脉内注射给予，每天一次(组1、2和3的研究第0至25天)。在研究第26天将组1、2和3终止。
未从发现死亡的动物收集肿瘤(组1和2各一只)。分析中没有包括在研究第6天被安乐死的组1中的一只动物的值。
a与组1相比较，p≤.05(p<0.05；Holm-Sidak的多重比较检验)。
b与组2相比较，p≤0.05(p<0.05；Holm-Sidak的多重比较检验)。
图3描绘了每组的平均肿瘤重量±SEM。
*使用组1作为对照计算组2和组3的％肿瘤抑制。
N/A：不适用
实例4
进行本研究以评估针对原位接种于雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠的A2780人类卵巢癌细胞，组合给予的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A的抗肿瘤功效。
细胞系
A2780人类卵巢癌细胞来自美国国家癌症研究所(弗雷德里克，马里兰州，美国)。
肿瘤细胞培养
A2780人类卵巢癌细胞(工作储备VP-储备1277)补充有10％FBS、1％GlutaMAXTM和1％青霉素-链霉素的DMEM中培养，并且在37℃在补充有5％CO2的加湿的细胞培养箱中生长。通过胰蛋白酶化收获细胞(第8代)，在HBSS中洗涤两次并计数(使用台盼蓝排除法)。用HBSS:MatrigelTM(1:1，v/v)调节最终细胞密度至2.0×108细胞/mL。
已知在接种悬浮液中使用MatrigelTM可支持可增加肿瘤获取率的早期血管形成，并因此具有降低肿瘤尺寸变化性的潜力。
肿瘤细胞接种
在腹膜内注射麻醉(氯胺酮(14mg/mL)/甲苯噻嗪(0.9mg/mL))下接种六十只无胸腺裸-Foxn1nu小鼠。接种前，切口部位的皮肤用酒精擦拭。制造切口来暴露出卵巢。将针头直接引入卵巢，其中5μL由1×106个A2780细胞组成的细胞悬浮液被排出。
小鼠在手术时和第二天皮下给予200μL推注剂量的Buprenex(盐酸丁丙诺啡，0.01mg/mL)以缓解疼痛。
随机化
基于体重，在接种7天后(研究第0天)将动物随机分为五个12只组和一个24只组。
化合物配制
在每个治疗日将胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以分别给出30mg/mL和100mg/mL的储备溶液。以8.33/50mg/mL、2.75/16.5mg/mL和0.91/5.4mg/mL(比率为1:6)，通过首先在PBS中稀释胰蛋白酶原溶液并且然后添加胰凝乳蛋白酶原A来制备胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的给药溶液。
化合物给予
表10总结了用于该研究的给药方案。
组1中的动物保留不治疗用于肿瘤获取率评估。
载体对照(PBS；组2)和胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A以83.3/500mg/kg、27.5/165mg/kg和9.1/54mg/kg的剂量(分别为组3、4和5；在单次注射中组合)每天一次以10mL/kg(每组12只动物)的给药量静脉内(i.v.)尾静脉注射给予。计算给予每只动物的给药溶液的体积并基于即将给药前测量的个体体重进行调整。治疗在研究第0天开始，并连续21天给予治疗。
肿瘤获取率测定
在治疗开始后七天(接种后14天)对组1中未治疗的动物实施安乐死以评估卵巢中肿瘤的尺寸和获取率。
在所有12只动物的卵巢中证实存在肿瘤，然后对于所有动物，从切下的卵巢分离肿瘤并称重。图8至图11中呈现了肿瘤摄影图像。
终止程序
通过批准的标准程序(组1至组5)经由二氧化碳吸入使所有动物安乐死。
样品收集
终止后，将卵巢从具有完整肿瘤的所有动物中切除。将肿瘤从卵巢组织中分离并称重。接受了21天治疗(组2至组5)的动物的肿瘤也拍了照片。
计算
使用以下公式计算第0天和任何给定日(第X天)之间的平均体重变化百分比变化(％BW变化)：
％BW变化＝平均(BW研究第X天)/平均(BW研究第0天)×100％-100％
其中BW研究第0天＝第0天的初始值并且BW研究第X天＝第X天的当前值。
使用以下等式计算治疗组相对于对照组的肿瘤生长百分比抑制：
百分比抑制＝((平均值对照-平均值治疗)/平均值对照)×100
统计计算
所有统计计算均使用Mac OS X的Prism6(GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc)，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)进行。
使用D’Agostino和Pearson综合正态检验测试所有数据集的正态性。
使用配对t检验来确定在研究第0天和研究终止之间在接受21天治疗的组(组2至组5)内体重是否显著改变。在数据不正态分布的情况下，使用威尔科克森(Wilcoxon)配对符号秩检验确定显著性。
使用单向方差分析(ANOVA)在接受21天治疗的组(组2至组5)之间比较在研究终止时的肿瘤重量。
≤0.05的p值被认为是显著的。
结果和观察
体重变化
在未治疗的动物中的研究第0天和第7天之间有显著(p≤0.05)的平均体重增长(初始体重的4.33％；组1)。
在研究第0天和第21之间，在用载体对照(PBS；初始体重的6.56％，组2)和所有剂量的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A(83.3/500mg/kg、27.5/165mg/kg和9.1/54mg/kg；初始体重的8.60％、6.00％和3.89％；分别为组3、4和5)治疗了21天的组中有平均体重增长。除低剂量治疗(组5)外，所有组的体重增长均显著(p≤0.05)。
化合物的功效
用中和低剂量的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A(27.5/165mg/kg和9.1/54mg/kg；957.3mg和1074.2mg；53.6％和47.9％；分别为组4和5)相比用载体对照(PBS；2062.2mg；组2)，治疗21天动物的平均肿瘤重量有显著的减少(p≤0.05)，但是高剂量的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A(83.3/500mg/kg；1762.2mg；14.5％；组3)治疗的动物平均肿瘤重量之间没有显著减少(表11和图7)。
在第7天安乐死用于获取率评估的未经治疗的动物(组1)的肿瘤重量未包括在分析中。
结论
针对在雌性无胸腺裸-Foxn1nu小鼠中原位接种的A2780人类卵巢癌细胞，评估了每天用胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A治疗的抗肿瘤功效，其以83.3/500mg/kg、27.5/165mg/kg或9.1/54mg/kg的剂量作为单次静脉内注射组合给予。
终止时肿瘤重量的测量值显示在用中和低剂量胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A治疗的动物中，与载体对照治疗的动物相比，在该研究中治疗21天后，抗肿瘤效力显著(p≤0.05)。高剂量治疗后没有观察到显著的抗肿瘤功效。
表10：给药方案
表11：各组终止时的平均肿瘤重量±SEM(mg)
在研究第7天(接种后14天)对组1中未治疗的动物进行安乐死以用于肿瘤获取率评估。统计分析未包括组1中动物的肿瘤重量。
治疗作为单次静脉内注射给予组2至组5中的动物，每天一次(研究第0至20天)。在研究第21天将这些动物处死。
a：与组2相比较，p≤0.05(Holm-Sidak的多重比较检验)。
图7描绘了每组的平均肿瘤重量±SEM。
N/A：不适用
实例5
人类剂量转换可以通过美国卫生和公众服务部食品和药物管理局药物评估与研究中心(CDER)(U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER))描述的任何相关方法，Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers[在成人健康志愿者的药剂初始临床试验中估计最大安全起始剂量]，Rockville，MD 2005，通过引用结合至本文。
例如，可以如下从已经给予小鼠的剂量确定人类的当量剂量：
人类当量剂量(HED mg/kg)＝动物剂量(mg/kg)×动物K÷人类K，其中K是反映体重与体表面积之间关系的校正因子。
对于典型的成人(体重60kg，体表面积1.6m2)，K是37，并且小鼠K为3。例如，对于等效人类剂量，本文所述的500mg/kg量可以转化为约41mg/kg，并且使用该公式的其他示例性转换包括：
胰凝乳蛋白酶原：
小鼠(mg/kg)：1.5、2、3.5、5、15、45、135、250和500。
人类(mg/kg)：0.12、0.16、0.28、0.4、1.2、3.6、11、20和41
胰蛋白酶原：
小鼠(mg/kg)：0.25、0.4、0.6、0.8、2.5、8、20、40和80。
人类(mg/kg)：0.02、0.03、0.05、0.065、0.2、0.65、1.6、3.2和6.5。
胰凝乳蛋白酶原：
小鼠(mg/kg)：15、54、165、250、500。
人类(mg/kg)：1.2、4.4、13、20和41。
胰蛋白酶原：
小鼠(mg/kg)：2.6、9、27.5、43.4、83.3、86.8。
人类(mg/kg)：0.2、0.7、2.2、3.5、6.75和7。
本发明包括基于人体重50、60、70、80、90、100或更多kg和体表面积1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或更多m2的本文(包括表1、4、8和10以及本文件的其他部分)所指的所有量以mg/kg的人类转换。
本文所述的人类等效剂剂量是使用CDER“在成人健康志愿者的药剂初始临床试验中估计最大安全起始剂量”中描述的用于基于体表面积的剂量转换的方法得出的。应该理解的是，如本文所述，CDER文件中描述的方法的任何变化也可以用于从给予小鼠的剂量确定适当的人类剂量(例如，在一些情况下，基于体重而不是体表面积的剂量衡量可能是适当的)。此外，本领域技术人员还将熟悉用于确定青少年人(即，非成年人)的适当剂量的方法，连同用于确定非人生物体中适当剂量的方法，其中可以应用本发明的方法。本领域技术人员还将熟悉用于根据预期给予方法(例如，静脉内、肌内、皮下、局部、口服或其他给予方法)调整适当剂量的方法。
实例6
进行以下实验以检查胰凝乳蛋白酶原与胰蛋白酶原的比率大于8:1。
材料与方法
材料
细胞培养
下表(表12)显示了在所有IC50测定和组合测定中使用的每孔细胞中的生长条件和初始细胞接种密度。将细胞在37℃在补充有95％空气/5％CO2的加湿的细胞培养箱中培养。
所有以下细胞系源自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(罗克维尔，马里兰州，美国)：786-0、ACHN、BT-474、DAOY、DU 145、G-361、HCT 116、HCT-15、Hep3B2.1-7、HL-60、HT-1080、HT-29、MCF-7、MDA-MB-231、MES-SA、NCI-H460、NCI-H82、PC-3、Raji、SK-OV-3、U-87MG。
A2780细胞系源自美国国家癌症研究所(NCI)(贝塞斯达，马里兰州，美国)。
C8161.9细胞系源自加文·罗伯逊博士实验室(Dr.Gavin Robertson’s Laboratory)(宾夕法尼亚州立大学医学院，赫尔歇，宾夕法尼亚州，美国)。
HuH-7细胞系源自日本研究用生物资源收藏中心(JCRB)(Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB))细胞库(大阪，日本)。
SNB-19细胞系源自德国微生物和细胞培养收藏中心(DSMZ)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(布伦瑞克，德国)。
所有细胞系均用于直至第10代的测定。
测试样品
测试品1
测试品2
测试品配制
将胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原直接溶解在适当的细胞培养基中并立即添加到细胞中。
细胞生长测定
对于组合测定，在接种后24小时将测试品添加到细胞中。对于每个细胞系，测试品浓度一式三份进行测试。添加测试品七十二小时后，在所有平板上进行测定。
在组合测定中使用的胰蛋白酶原浓度基于从单个测试品实验计算的IC50。每个单一细胞系的胰蛋白酶原的浓度按以下比率决定了胰凝乳蛋白酶原的浓度：1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10(胰蛋白酶原:胰凝乳蛋白酶原)。对照仅由生长培养基和未处理的细胞加生长培养基(未处理的对照)组成。
使用的测定对照是作为载体的生长培养基对照和仅生长培养基(本底)，与作为载体的磷酸盐缓冲盐水对照和作为阳性对照的Triton-x 100相反。没有进行本底减除以测定IC50值。
在包含测试品的培养基中的细胞孵化之后，将10μL的添加至每个孔中，然后与细胞一起孵育持续长达6小时。使用Spectramax Gemini XPS荧光计(560nm激发，590nm发射)测量荧光。记录所有的数据，并录入Excel电子表格进行解释。
计算
将从测定法收集的数据绘制为用于IC50测定的剂量响应曲线。针对化合物浓度绘制相对荧光单位(RFU)。在这些图中，X轴(化合物浓度)以对数尺度表示。使用Mac OSX的GraphPad Prism版本6.0e(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)，经由可变斜率曲线拟合算法，计算IC50浓度作为每个化合物的半数最大(50％)抑制浓度(IC)。
对于组合研究，药物相互作用系数(CDI)根据以下等式计算：
其中TC是胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的组合的生长抑制，T是单一试剂胰蛋白酶原的生长抑制，并且C是单一试剂胰凝乳蛋白酶原的生长抑制。低于1的CDI值表示药物协同作用，而大于1的值表示胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的拮抗相互作用。
在人类癌症中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的细胞生长抑制
图12中示出了胰蛋白酶原(T)和胰凝乳蛋白酶原(C)单独或组合对A2780卵巢肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，A2780卵巢肿瘤细胞的生长抑制的最大水平，参见表13(紧接下文)。
图13示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对C8161.9黑色素瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，C8161.9黑色素瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表14(紧接下文)。
图14示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对DAOY脑肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，DAOY脑肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表15(紧接下文)。
图15示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对DU145前列腺肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，DU145前列腺肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表16(紧接下文)。
图16示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对HCT 116结直肠肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，HCT 116结直肠肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表17(紧接下文)。
图17示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对Hep3B2.1-7肝脏肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，Hep3B2.1-7肝脏肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表18(紧接下文)。
图18示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对HT-29结直肠肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，HT-29结直肠肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表19(紧接下文)。
图19示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对HuH-7肝脏肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，HuH-7肝脏肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表20(紧接下文)。
图20示出了胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原单独或组合对NCI-H460肺肿瘤细胞的生长的作用。观察到比率大于1:8(T:C)，例如1:10(T:C)时，NCI-H460肺肿瘤细胞的生长抑制最大水平，参见表21(紧接下文)。