本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)的preS衍生肽的环状NTCP靶向肽。本发明进一步涉及包括至少一个环状肽的药物组合物。本发明进一步涉及环状肽和药物组合物在诸如肝病或者肝脏疾病或者状况的诊断、预防和/或治疗、和/或HBV和/或HDV感染的抑制中的医疗用途。本发明进一步涉及肝病或者肝脏疾病或者状况的诊断、预防和/或治疗、和/或HBV和/或HDV感染的抑制的方法。
背景技术：
当今，约20亿人携带HBV的血清标志物。其中约4亿人被HBV慢性感染。根据疾病控制中心(CDC)，如果不接受适当治疗，15-25％的慢性HBV感染者倾向于在十年内发展成肝细胞癌(HCC)(Shephard et al.，2006)。HBV相关的HCC具有不良预后并且因此HBV被世界卫生组织(WHO)分类为最重要的自然存在的人类致癌物。尽管存在预防性疫苗，但是由于世界人口的增长和贫穷国家预防的限制，在接下来的几十年里感染者的数量将上升。
HBV主要经由非肠道途径传播。90-95％急性感染的、完成免疫的个体清除了病毒，从而获得终生的免疫保护。约5-10％的感染者发展成慢性乙型肝炎(在德国300,000-500,000人)。与之相反，在高疟区，尤其是中非和东亚，传播的主要方式是由母亲传给孩子的围产期。不幸地，未完全地成功免疫的儿童感染导致90-98％的慢性病程。因此乙型肝炎相关的HCC是这些国家中的大多数的最常见恶性肿瘤。
用于治疗慢性的乙型肝炎病毒(HBV)感染者的现行经核准的治疗方案指向已经建立感染后的病毒基因组的复制步骤(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦)或者用作免疫系统的调节剂(干扰素α)。不幸地，仅10-25％的患者对这样的疗法保持持续的病毒学应答。因此至关重要的是发展能够帮助消除病毒并治疗感染的迄今为止的不受影响的复制步骤(例如病毒进入)的新颖的疗法。
尽管能获得预防性疫苗和反转录酶(RT)抑制剂，全球HBV感染者的数量和HBV相关的死亡数量(目前每年约500,000)增加。约三分之二的原发性肝癌归因于持续性HBV感染(Chan&Sung，2006)。
病毒进入的特异性抑制是用于控制和最终消除不同病毒的急性和慢性感染的有吸引力的治疗理念。由于进入抑制近来在HCV感染的老鼠模型中的论证(Mailly et al.,2014)而具有治疗潜力。
人乙型肝炎病毒(HBV)是肝脱氧核糖核酸病毒的成员。肝脱氧核糖核酸病毒是经由pgRNA中间体的逆转录复制的最小的包膜DNA病毒。在装配期间，核壳体获取称作大(L)、中(M)和小(S)的三个病毒包膜蛋白。它们在开放阅读框中编码并共享膜锚着点需要的S域。除了S域，M包含55个氨基酸的N端亲水性延长(preS2)，同时L被称为preS1的107、117或者118个氨基酸(基因型依赖)进一步延长(Urban et al.,2014)。丁型肝炎病毒(HDV)是利用HBV包膜蛋白进入肝细胞的卫星拟病毒。L的豆蔻酰化preS1域已知在HBV和HDV感染中发挥关键作用。
发明人已经预先识别阻断PHH和HepaRG细胞的HBV和HDV感染的脂肽衍生的HBV L蛋白(Gripon et al.,2005,Schulze et al.,2010,WO 2009/092611A1)。它们由HBV基因D型(HBVpreS/2-48myr)的preS1域的N端47个氨基酸衍生并且包括天然发生的十四酸的改性。
在通过参考整体并入本文的WO 2009/092612和WO 2012/107579中，发明人描述了疏水改性的HBV的preS衍生肽以及其作为向肝脏特异性运输化合物的载体。
发明人已经进一步预先识别用于负责这些HBV L蛋白衍生的脂肽的结合的受体，即牛磺胆酸钠共运输多肽(NTCP/SLC10A1)。(WO 20014/072526、WO 2014/072524和WO 2015/014830)。也见Ni et al.(2014)和Yan et al.(2012)。
本发明旨在改进用于用抑制作为HBV和HDV受体的NTCP和NTCP介导的天然底物和外源性物质的运输的方法和手段。
因此，本发明目的提供改进的用于诸如NTCP介导的运输相关的肝病的肝病的诊断、预防和/或治疗手段和方法。
本发明进一步旨在改进HBV感染和现有技术中存在的其他HBV相关疾病的抑制、预防和/或治疗的方法和手段，并且因此，本发明的目的是提供改进的用于HBV感染和相关疾病的有针对性的和有效的抑制、预防和/或治疗的方法和手段。
本发明的进一步的目的是提供改进的HDV感染和HDV相关疾病的抑制、预防和/或治疗的手段和方法。
技术实现要素：
根据本发明，通过提供通式I的环状肽解决该目的
(X)m-P–(Y)n
(I)
其中
P是氨基酸序列NPLGFXaaP(SEQ.ID NO：1)，Xaa为F或者L，
X为具有m个氨基酸长度的氨基酸序列，
其中m为0或者至少1；
Y为具有n个氨基酸长度的氨基序列，
其中n为0或者至少1；
并且其中m+n为0或者至少1；
或其药物学可接受盐。
根据本发明，通过提供药物组合物解决该目的，该药物组合物包括
(i)至少一个本发明的环状肽，
(ii)可选地，药物可接受载体和/或赋形剂。
根据本发明，通过提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在医学中的应用而解决该目的。
根据本发明，通过提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在抑制HBV和/或HDV感染中的应用而解决该目的。
根据本发明，通过提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在预防原发HBV和/或HDV感染中的应用而解决该目的。
根据本发明，通过提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物作为HBV和/或HDV进入抑制剂的应用而解决该目的。
根据本发明，通过提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在肝脏疾病或者状况的诊断、预防和/或治疗中的应用而解决该目的。
根据本发明，通过提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在心血管疾病(CVD)的诊断、预防和/或治疗中的应用而解决该目的。
根据本发明，通过用于抑制HBV和/或HDV感染和/或原发HBV和/或HDV感染的预防的方法而解决该目的，包括治疗有效量的本发明的环状肽或者本发明的药物组合物的施用。
根据本发明，通过用于肝脏疾病或者状况的诊断、预防和/或治疗的方法而解决该目的，包括治疗有效量的本发明的环状肽或者本发明的药物组合物的施用。
根据本发明，通过用于心血管疾病(CVD)的诊断、预防和/或治疗的方法而解决该目的，包括治疗有效量的本发明的环状肽或者本发明的药物组合物的施用。
附图说明
图1 Myrcludex B和衍生物。
图2 Myrcludex B的共价连接的环状衍生物表现出抑制潜力。
A，Myrcludex B的共价连接的环状衍生物的序列和结构(Myr-2-48 Cyc)。
B，Myr-2-48 Cyc的抑制活性与其他Myrcludex B衍生物相当，诸如肽序列具有肉豆蔻酰基的直线型Myrcludex B衍生物(2-Myr-48)和具有C端肉豆蔻酰基的直线型preS-衍生肽2-21(2-21-Myr)。
图3另外的环状Myrcludex B衍生物。
图4另外的环状Myrcludex B衍生物
A，半胱氨酸环化肽和对照肽的合成的概览
B，用于测试肽的实验设定
HepG2 NTCP细胞种入24孔板。当细胞到达60-70％覆盖率时，对其进行HBV感染或者TC摄取测试。收集第5至7日的细胞上清液用于HBeAg测量并且在第7日用4％PFA固定细胞用于抗HBc抗体的免疫荧光。
图5注射68镓标记的肽之后40-60分钟的冠状PET图像。
A，myr-CNPLGFFPDCK(DOTA[68Ga])
B，在注射myr-CNPLGFFPDCK(DOTA[68Ga])前30分钟用11μg/g体重的冷Myrcludex B阻断肝脏
C，Myr-K(DOTA[68Ga])HBVpres3-48y(WT肽)
D，Myr-K(DOTA[68Ga])HBVpres3-48y Ala11-15(结合无用的对照肽)
也见Slijepcevic et al.,2015。
图6在具有Myrcludex B的不同的环状肽的HepG3 NTCP细胞比较中3H-牛磺胆酸盐摄取。
图7在HepG3 NTCP细胞中的3H-牛磺胆酸盐摄取：具有Myrcludex B的不同的环状肽的IC 50值和曲线
图8HepG2 NTCP细胞的HBV感染抑制试验。
用Myrcludex B(GMP级)，Myrcludex B-y(自制)和(+H)环状肽。
A，IC 50曲线和值。
B，以1:2稀释的上清液的HBeAg测量的绝对值
具体实施方式
在下文更详细地描述本发明之前，应理解的是本发明不限于特定的方法学，本文描述的这些方案和试剂可以变化。也应当理解本文使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不意在限制仅由附随的权利要求限定的本发明的范围。除非另有限定，本文使用的所有科技术语具有本领域普通的技术人员中的一个通常理解的相同的意思。用于本发明的目的，本文引用的所有参考文献通过参考整体并入。
浓度、含量和其他数字数据可以以范围的形式在本文中表达或公开。应理解的是这样的范围形式仅为了方便和简洁而使用，并且因此应当灵活地理解为不仅包括作为范围的限定明确地记载的数值，还包括范围中包含的所有单个数值或子区间，就像每个数值和子区间被明确地记载一样。作为示例，数值范围“7至49”应当理解为不仅包括明确记载的4至19的值，也包括标识的范围内的单个值和子区间。因此这该数值范围内包括单个值诸如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16…37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49，以及子区间诸如7至10、10至15、15至25、28至39、35至4735至49等。该相同的原则适用于仅记载一个数值的范围，诸如“至少1”或“至少一个氨基酸”。此外，这样的解释无论描述的范围或者特征的宽度都应当适用。
环状NTCP靶向肽
如上文概述的，本发明提供环状肽。
所述环状肽是乙型肝炎病毒(HBV)的preS衍生肽。
本发明的环状肽具有通式I
(X)m-P–(Y)n
(I)
其中
P是氨基酸序列NPLGFXaaP(SEQ.ID NO：1)，Xaa为F或者L，
X为具有m个氨基酸长度的氨基酸序列，
其中m为0或者至少1；
Y为具有n个氨基酸长度的氨基序列，
其中n为0或者至少1；
并且其中m+n为0或者至少1；
或其药物学可接受盐。
优选地，m+n为0至42，
和/或其中m＝0至8和/或n＝0至34，假设m+n为0或者至少1。
在实施例中，
当m+n＝0，肽具有7个氨基酸的长度/包含7个氨基酸(即P)；
当m+n＝1，肽具有8个氨基酸的长度/包含8个氨基酸；
当m+n＝2，肽具有9个氨基酸的长度/包含9个氨基酸；
当m+n＝3，肽具有10个氨基酸的长度/包含10个氨基酸；
当m+n＝4，肽具有11个氨基酸的长度/包含11个氨基酸；
当m+n＝5，肽具有12个氨基酸的长度/包含12个氨基酸；
当m+n＝6，肽具有13个氨基酸的长度/包含13个氨基酸；
当m+n＝7，肽具有14个氨基酸的长度/包含14个氨基酸；
当m+n＝8，肽具有15个氨基酸的长度/包含15个氨基酸；
当m+n＝15，肽具有22个氨基酸的长度/包含22个氨基酸；
当m+n＝40，肽具有47个氨基酸的长度/包含47个氨基酸；
当m+n＝42，肽具有49个氨基酸的长度/包含49个氨基酸。
-环化
本发明的环状肽能够以不同方式环化，优选地
(a)经由肽中包含的两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)，
诸如经由(环化前的肽序列的)N端处或附近的C或者C端处或附近的C；
(b)两个氨基酸侧链的氨基缩合(内酰胺)，
诸如经由赖氨酸(K)侧链和天冬氨酸(D)侧链，
诸如
经由(环化前的肽序列的)N端处或附近的K侧链和C端处或附近的D侧链；
(c)经由头尾环化，
诸如
经由(环化前的肽序列的)N端和C端处的赖氨酸(K)，
经由(环化前的肽序列的)N端，即N端氨基酸的氨基，和C端，即C端氨基酸的羧基，
(d)经由骨干环化，
(e)经由形成硫醚，
和/或
(f)经由形成氢键和/或氨基酸衍生物的成键，
诸如氨基酸形成色氨酸拉链。
优选地，本发明的环状肽不包括在P的氨基酸序列内(即SEQ ID NO.1的7个氨基酸(NPLGFXaaP，Xaa＝F或L)的药效基团内)环化的肽。即经由P的氨基酸侧链。
然而，P序列能够经由头尾环化而环化。
例如，在一个实施例中，环状肽包括Xaa＝F的P NPLGFXaaP，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且m和n分别为0。该肽经由通过N端，即N端天冬酰胺(N)的氨基，和C端，即C端氨基酸脯氨酸(P)的羧基的头尾环化而环化。
在一个实施例中，环状肽包括Xaa＝F的P NPLGFXaaP，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且X＝Cys且Y＝Cys，m和n分别为1。肽能够经由两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)而环化。
在一个实施例中，环状肽包括Xaa＝F的P NPLGFXaaP，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且X＝Cys且Y＝Asp-Cys，m＝1且n＝2。肽能够经由两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)而环化。
在一个实施例中，环状肽包括Xaa＝F的P NPLGFXaaP，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且X＝Cys且Y＝His-Asp-Cys，m＝1且n＝3。肽能够经由两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)而环化。
在一个实施例中，环状肽包括Xaa＝F的P NPLGFXaaP，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且X＝Cys-Pro且Y＝Asp-Cys，m＝2且n＝2。肽能够经由两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)而环化。
在一个实施例中，环状肽包括Xaa＝F的P NPLGFXaaP，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且X＝Cys-Pro且Y＝His-Asp-Cys，m＝2且n＝3。肽能够经由两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)而环化。
在一个实施例中，环状肽包括具有Xaa＝F的P NPLGFXaaP的Myrcludex B序列，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，并且m＝7且n＝33。该肽能够经由通过N端，即N端甘氨酸(G)的氨基，和C端，即C端氨基酸甘氨酸(G)的羧基的头尾环化而环化。
在一个实施例中，环状肽包括具有Xaa＝F的P NPLGFXaaP的Myrcludex B序列，即NPLGFFP(SEQ.ID NO：2)，以及两个额外的半胱氨酸，使得m＝8且n＝34。肽能够经由两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)而环化。
在其他实施例中，环状肽分别包含Xaa＝L的P NPLGFXaaP，即NPLGFLP(SEQ.ID NO：3)，并且可选地进一步包含额外的氨基酸，如上所述。
-疏水改性
在优选实施例中，本发明的环状肽是疏水改性的，即其携带至少一个共价键接的疏水改性。
疏水改性的位置能够在肽序列中变化。
优选地，疏水改性位于X和/或Y的氨基酸侧链处。
在一个实施例中，疏水改性位于P的氨基酸侧链处。
优选地，疏水改性是疏水组成部分的酰化和/或添加，
更优选，是与C8至C22脂肪酸的酰化，
诸如肉豆蔻酰(C14)、棕榈酰(C16)或者硬脂酰(C18)，
进一步更优选为肉豆蔻酰(C14)，
或者疏水组成部分选自胆固醇、胆固醇衍生物、磷脂质、糖脂、甘油酯、类固醇、神经酰胺、异戊二烯衍生物。
本发明的环状肽能够携带超过一个疏水改性，诸如两个、三个、四个以上可以为相同或不同的疏水改性。
例如，本发明的环状肽携带一个肉豆蔻酰基(C14)和一个硬脂酰(C18)基。
优选地，本发明的环状肽携带一或者两个疏水改性。
在一个实施例中，本发明的环状肽具有通式Ia
cyclo[(X)m-P–(Y)n]
(Ia)
并且在X和/或P的氨基酸侧链处携带至少一个疏水改性。
通式Ia还能够示出为
具有通式Ia的环状肽能够经由头尾环化获得，头尾环化诸如
-由肽中包含的两个半胱氨酸(C)的巯基氧化(形成二硫键)，
即(环化前的肽序列的)N端处的半胱氨酸和C端处或者C端附近的半胱氨酸；
-经由(环化前的肽序列的)N端处的赖氨酸(K)或N端本身以及C端，
例如，具有通式Ia的环状肽能够为：
H-cyclo[(X)m-P–(Y)n]
诸如
其中H为疏水改性，优选为肉豆蔻酰(C14)。
例如
myr-cyclo[(X)m-P–(Y)n]
-NTCP靶向
本发明的环状肽优选为适于靶向NTCP(基因名SLC10A1)，牛磺胆酸钠协同转运多肽
人牛磺胆酸钠协同转运多肽NTCP/SLC10A1是HBV preS1-特异性受体，其在乙型肝炎病毒(HBV)和/或丁型肝炎病毒(HDV)感染中发挥关键作用，如发明人最近识别的(见例如WO 2014/072526、WO 2014/072524和WO 2015/014830)。特定非人对应物的该受体的表达使得预先不能特异性地结合HBV和/或HDV或者不易受HBV和/或HDV感染的细胞转化为能够结合HBV和/或HDV和/或易感染HBV和/或HDV的细胞。分化之后变得易感染HBV和/或HDV的细胞(HepaRG细胞)表现出在NTCP表达时易感性显著增加。
NTCP是整体(integral)跨膜蛋白，不在HepG2、HuH7中表达，DMSO处理之后在HepaRG细胞诱导(Kotani et al.,2012)并且在去分化期间在原代肝细胞中下调(Doring et al.,2012)。
如本文所述的，“靶向NTCP”或者“NTCP靶向”是指本发明的环状肽向各个肝脏细胞/肝细胞上的NTCP受体的特异性结合，优选在宿主(受试者或者患者)中，但也可以在虽然不支持感染但能结合NTCP的一些动物(例如小鼠、大鼠、狗)中。
在一个实施例中，NTCP介导的胆汁酸的运输由本发明的环状肽降低或阻碍(在NTCP被环状肽饱和的情况下)。
然而，即使NTCP未被环状肽饱和的情况下，NTCP的HBV/HDV受体功能也被阻断，表示病毒抑制或者底物运输的抑制要求不同的药理学剂量。
-辅助区域
在一个实施例中，本发明的环状肽还包括(辅助)区域。
这样的辅助区域增加本发明的环状肽的功能性。
优选地，辅助区域提供利用额外的HBV和HDV的中和潜力引起抗体应答的表位。
例如，研究得很透彻的氨基酸序列基序19-LDPAFG-24的引入。
这样的辅助区域能够是环状肽的部分或者能够是非环状的。
例如，在环状的辅助区域的实施例中，环状肽包含preS序列的氨基酸残基8至16以及作为辅助区域的额外的例如preS序列的氨基酸残基20至26或者20至48。
在非环状的辅助区域的一个实施例中，辅助区域连接/附接至X和/或Y的氨基酸侧链，诸如赖氨酸侧链。
优选地，辅助区域不连接/附接至P的氨基酸侧链。
优选地，本发明的环状肽包含选自以下的组的氨基酸序列或者由选自以下的组的氨基酸序列构成
(其中P，SEQ ID NO.1是下划线的并且辅助区域是斜体的)
-氨基酸残基9至15 (SEQ.ID NO：2)
HBVpreS9-15 NPLGFFP
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝Cys，Y＝Cys，m＝1且n＝1
Cys-preS9-15-Cys C-NPLGFFP-C (SEQ.ID NO：4)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS9-15-Cys-D-Tyr C-NPLGFFP-C-y (SEQ.ID NO：5)
-氨基酸残基9至16
HBVpreS9-16 NPLGFFPD (SEQ.ID NO：6)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝Cys，Y＝Cys，m＝1且n＝2
Cys-HBVpreS9-16-Cys C-NPLGFFPD-C (SEQ.ID NO：7)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS9-16-Cys-D-Tyr C-NPLGFFPD-C-y(SEQ.ID NO：8)
-氨基酸残基8至16
HBVpreS8-16 PNPLGFFPD(SEQ.ID NO：9)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝Cys-Pro，Y＝Cys，m＝2且n＝2
Cys-HBVpreS8-16-Cys C-PNPLGFFPD-C (SEQ.ID NO：10)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS8-16-Cys-D-Tyr C-PNPLGFFPD-C-y (SEQ.ID NO：11)
-氨基酸残基9至17
HBVpreS9-17 NPLGFFPDH (SEQ.ID NO：12)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝Cys，Y＝His-Cys，m＝1且n＝3
Cys-HBVpreS9-17-Cys C-NPLGFFPDH-C (SEQ.ID NO：13)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS9-17-Cys-D-Tyr C-NPLGFFPDH-C-y (SEQ.ID NO：14)
-氨基酸残基8至17
HBVpreS8-17 PNPLGFFPDH (SEQ.ID NO：15)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝Cys-Pro，Y＝His-Cys，m＝2且n＝3
Cys-HBVpreS8-17-Cys C-PNPLGFFPDH-C (SEQ.ID NO：16)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS8-17-Cys-D-Tyr C-PNPLGFFPDH-C-y (SEQ.ID NO：17)
-氨基酸残基2至21
HBVpreS2-21 GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP (SEQ.ID NO：18)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝CGTNLSVP，Y＝DHQLDPC，m＝8且n＝7
Cys-HBVpreS2-21-Cys C-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-C (SEQ.ID NO：19)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS2-21-Cys-D-Tyr C-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-C-y
(SEQ.ID NO：20)
-基因型C的氨基酸残基2至48
HBVpreS2-48
GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG (SEQ.ID NO：21)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝CGTNLSVP，Y＝DHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVGC，
m＝8且n＝34
Cys-HBVpreS2-48-Cys
C-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG-C(SEQ.ID NO：22)
诸如C端D-Tyr
Cys-HBVpreS2-48-Cys-D-Tyr
C-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG-C-y(SEQ.ID NO：23)
-Myrcludex B的氨基酸残基
GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG(SEQ.ID NO：24)
以及例如额外的氨基酸，
诸如包含(环化前的肽序列中的)N端和C端半胱氨酸
X＝CGTNLSVP，Y＝DHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVGC，
m＝8且n＝34
Cys-Myrcludex B-Cys
C-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG-C (SEQ.ID NO：25)
诸如C端D-Tyr
Cys-Myrcludex B-Cys-D-Tyr
C-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG-C-y (SEQ.ID NO：26)
优选的本发明的环状肽的实例是：
cyclo[NPLGFFPD] (SEQ.ID NO：6)
cyclo[PNPLGFFPD] (SEQ.ID NO：9)
cyclo[NPLGFFPDH] (SEQ.ID NO：12)
cyclo[PNPLGFFPDH] (SEQ.ID NO：15)
cyclo[GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP] (SEQ.ID NO：18)
cyclo[GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG] (SEQ.ID NO：21)
cyclo[GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG] (SEQ.ID NO：24)
或者
优选地上述包含C端D-氨基酸，诸如D-酪氨酸，例如
优选的具有N端疏水改性(例如豆蔻酰化)的本发明的环状肽的实例是：
Myr-cyclo[HBVpreS9-15] (SEQ.ID NO：2)
myr-cyclo[NPLGFFP]
Myr-cyclo[HBVpreS9-16] (SEQ.ID NO：6)
myr-cyclo[NPLGFFPD]
Myr-cyclo[HBVpreS8-16] (SEQ.ID NO：9)
myr-cyclo[PNPLGFFPD]
Myr-cyclo[HBVpreS9-17] (SEQ.ID NO：12)
myr-cyclo[NPLGFFPDH]
Myr-cyclo[HBVpreS8-17] (SEQ.ID NO：15)
myr-cyclo[PNPLGFFPDH]
Myr-cyclo-[HBVpreS2-21] (SEQ.ID NO：18)
myr-cyclo[GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP]
Myr-cyclo-[HBVpreS2-48] (SEQ.ID NO：21)
myr-cyclo[GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG]
Myr-cyclo-[HBVpreS2-48]＝cyclic Myrcludex B (SEQ.ID NO：24)
myr-cyclo[GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG]
在其他实施例中，环状肽包含Xaa＝L的P NPLGFXaaP，即NPLGFLP(SEQ ID NO.3)。
优选的本发明的环状肽的各个实例是：
cyclo[NPLGFLP] (SEQ ID NO.3)
cyclo[NPLGFLPD] (SEQ ID NO.27)
cyclo[PNPLGFLPD] (SEQ ID NO.28)
cyclo[NPLGFLPDH] (SEQ ID NO.29)
cyclo[PNPLGFLPDH] (SEQ ID NO.30)
cyclo[GTNLSVPNPLGFLPDHQLDP] (SEQ ID NO.31)
cyclo[GTNLSVPNPLGFLPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG] (SEQ ID NO.32)
cyclo[GTNLSVPNPLGFLPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG] (SEQ ID NO.33)。
在一个实施例中，本发明的环状肽另外包含组成部分。
这样的另外的组成部分能够为
-药物或者其各自的前体药物；
-标记；
-标签，
诸如萤光染料、放射性同位素和造影剂；
-重组病毒或者其衍生物；
-药物、前体药物或者标签的载体或者贮库；
-免疫原性表位；
-激素；
-抑止剂；
-毒素。
这样的额外组成部分优选为共价键接的，诸如经由连接子、间隔子和/或锚定基团，
例如可剪切连接子。
优选的放射性同位素为131I、125I、99mTc、18F、68Ga、111In、90Y、177Lu。
在一个实施例中，氨基酸残基赖氨酸能够装接/联结至DOTA[68Ga](即K(DOTA[68Ga]))。
优选的萤光染料是Alexa染料、若丹明和荧光素的衍生物、Cy染料。
在一个实施例中，氨基酸残基赖氨酸能够装接/联结至萤光染料Atto 488(即K(Atto488))。
优选的造影剂是钆(Gd)复合物、顺磁铁(Fe)复合物和颗粒、包含高原子序数的原子的化合物，即用于计算机断层摄影术(CT)的碘、包含这些造影剂的诸如脂质体的微泡和载体。
在一个实施例中，环状肽包括抑止剂，诸如衣壳抑止剂，优选为共价键接的。
这样的抑制剂已经表现出通过使包含核壳体的HBV基因组失稳而干涉HBV感染并且由此通过例如扰乱胞内核壳体转运和核壳体的成熟而干涉后进入步骤(Wang et al.,2015；Cho et al.,2013；Stray et al.,2006)。
环状肽和衣壳抑止剂能够作为以下组合抑制剂而作用
(i)定位和抑制NTCP，以及
(ii)经由与NTCP的相互作用而靶向肝脏并且随后影响核壳体的第二活性域进而干涉病毒复制。
HBV包膜包裹称作L(大)、M(中)、S小的三个蛋白质。它们共享具有四个跨膜区的C端S域。M和L蛋白质携带55以及基因型依赖107或者118氨基酸的额外N端延伸(preS2和preS1)。
因此，根据本发明的HBV的“preS衍生”肽的表达是指具有对应于HBV的L蛋白质的N端延伸的氨基酸序列preS1的肽，优选为物种和基因型A至H以及绒毛猴(WMHBV)、黑猩猩和大猩猩乙型肝炎病毒的共有序列，但是其也指其变种，诸如N-端和/或C-端截短变种、氨基酸替换变种。
肽或者氨基酸序列(a)优选为是指具有对应于或基于HBV的L蛋白质的N端延伸的氨基酸序列preS1的肽，优选为基因型A至H以及绒毛猴(WMHBV)、猩猩、黑猩猩和大猩猩乙型肝炎病毒以及最近描述的蝙蝠乙型肝炎病毒的氨基酸序列，但是其也指其变种，诸如C-端截短变种、氨基酸替换变种。
作为必要或者关键序列，用于结合本发明的环状肽的重要的氨基酸残基，如P＝SEQ ID NO：1(NPLGFXaaP)所描述的存在于本发明的环状肽的肽/氨基酸序列中。
特别地，肽基于下列的序列(氨基酸为单字母码；关键区或药效基团下划线标注)。
关键区/药效基团(SEQ ID NO：l)：
NPLGFXP(其中X或者Xaa为任意氨基酸，优选为F或者L，更优选为F)
preS HBV-A(ID：M57663；SEQ ID NO：34)：
MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPQANQVGVGAFGPGFTPPHGGVLGWSPQAQGILATVPAMPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA
preS HBV-B(ID：D00329，SEQ ID NO：35)
MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDAHKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA
preS HBV-C(ID：AB048704，SEQ ID NO：36)
MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDAHKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA
preS HBV-黑猩猩(ID：AB032432，SEQ ID NO：37)
MGQNLSTSNPLGFFPEHQLDPAFKANTNNPDWDFNPKKDYWPEANKVGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA
preS HBV-D(ID：AB048702，SEQ ID NO：38)
MGQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPNKDTWPDANKVGAGAFGLGFTPPHGGLLGWSPQAQGFQTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRTTHPQA
preS HBV-E(ID：X65657，SEQ ID NO：39)
MGLSWTVPLEWGKNISTTNPLGFFPDHQLDPAFRANTRNPDWDHNPNKDHWTEANKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGMLKTLPADPPPASTNRQSGRQPTPITPPLRDTHPQA
preS HBV-F(ID：X69798@8，SEQ ID NO：40)
MGAPLSTTRRGMGQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDSWPMANKVGVGGYGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGVLTTLPADPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLRDTHPQA
preS HBV-G(ID：AF160501，SEQ ID NO：41)
MGLSWTVPLEWGKNLSASNPLGFLPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPKKDPWPEANKVGVGAYGPGFTPPHGGLLGWSPQSQGTLTTLPADPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA
HBV长臂猿(ID：AJ131572,SEQ ID NO：42)
MGQNHSVTNPLGFFPDHQLDPLFRANSNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTLPAAPPPASTNRQSGRKATPISPPLRDTHPQA
HBV-H(ID：Q8JMY6,SEQ ID NO：43)
MGAPLSTARRGMGQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDNWPMANKVGVGGFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTSPPDPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLRDTHPQA
HBV猩猩(ID：AF 193864,SEQ ID NO：44)
MGQNLSVSNPLGFFPEHQLDPLFRANTNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGVTTILPAVPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDTHPQA
HBV绒毛猴(ID：NC 001896,SEQ ID NO：45)
MGLNQSTFPLGFFPSHQLDPLFKANAGSADWDKPKDPWPQAHDTAVGAFGPGLVPPHGGLLGWSSQAQGLSVTVPDTPPPPSTNRDKGRKPTPATPPLRDTHPQA
也存在HBV preS共有序列(氨基酸(-11)至48)
(SEQ ID NO：46)：
(-11)-M GGWSS TPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFRA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
此外肽或者氨基酸序列优选为L氨基酸序列，但是还能够包含D氨基酸或者D氨基酸序列。
此外，肽或者氨基酸序列还能够包含优选为用于环合的非天然氨基酸。
根据本发明，本发明的环状肽具有通式I
(X)m-P–(Y)n
包含具有SEQ ID NO：1的序列的至少7个氨基酸(P)或者由具有SEQ ID NO：1的序列的至少7个氨基酸(P)构成。
此外和如上所述，优选地，m+n为0至42，
和/或m＝0至8和/或n＝0至34，假设m+n为0或者至少1。
本发明的环状肽能够包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49个氨基酸或者由这些数量的氨基酸构成。
-环状肽的合成
能够通过本领域技术人员容易了解的各种流程制备本发明的肽，通常通过化学合成流程。
更具体地，合成化学方法包括固相连续和砌块合成(Erickson&Merrifield，1976)。能够使用诸如通过使用自动化的肽合成器的已建立的自动方法进行固相连续流程。在该流程中，α氨基受保护的氨基酸结合至树脂支撑物。采用的树脂支撑物能够为用于(多)肽的固相制备中惯常采用的任意适合的树脂，优选为已经与聚氧乙烯共聚以提供与最初引入的邻氨基受保护的氨基酸形成酯的位点的聚苯乙烯。本发明人采用的该优化方法已经被清楚地描述了(见例如Gausepohl et al.,1989)。氨基酸一个接一个地引入(逐步地)。对应于氨基酸的引入的各个合成周期包括去保护步骤、连续洗涤步骤、与氨基酸的活化的耦合步骤、以及后续洗涤步骤。这些步骤中的每个之后都进行过滤。用于耦合的反应试剂为用于(多)肽合成的传统反应试剂，诸如二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑、苯并三唑-1-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐、以及叠氮磷酸二苯酯。在树脂上合成多肽之后，通过在苯甲醚、乙二硫醇或者2-甲基吲哚存在的情况下用诸如三氟乙酸的强酸处理而从树脂分离多肽。随后用传统的纯化技术，特别地通过HPLC的方式纯化化合物。
本发明的肽也可以通过耦合选择性地受保护的(多)肽片段而获得，该耦合在例如溶液中实现。
对于Myrcludex B的合成，也见Schieck et al.,2010。
肽环化策略
一般地，能够通过任意化学键的形成实现共价肽环化。遵循的主要策略是通过二硫键或者酰胺键的形成而环化。肽环化的一般方面已经被White and Yudin(2011)全面地评论。
对于肽环化，首先合成直线型肽(在绝大多数情况下通过固相肽合成(SPPS))。
如White and Yudin(2011)描述的，形成酰胺键的头尾环化要求羧酸组成部分能够具备适当的收敛(convergent)的保护基团，即连接至烯丙基酯(Alloc基团)的氨基甲酸酯。环化可以使用诸如HBTU的活化剂而在固体支撑物或者溶液的任一中实现。在通过二硫键连接肽的情况下，环合要求两个硫醇基能够具备诸如三苯甲基保护基团的适当的聚集保护基团。通过使用诸如过氧化氢的试剂进行氧化或者通过可由空气氧化的宽松的条件实现环化。
药物组合物
如上文讨论的，本发明提供一种药物组合物。
根据本发明的药物组合物包含
(i)至少一个本发明的环状肽，
(ii)可选地，药物可接受载体和/或赋形剂。
根据本发明的药物组合物非常良好地适用于本文描述的所有应用和方法。
如上文概述的，本发明提供一种疫苗组合物，其包括至少一个本发明的环状肽和可选地包含/包括免疫原性表位的药物可接受载体和/或赋形剂。
根据本发明的疫苗组合物非常良好地适用于本文描述的应用和方法。
“药物可接受载体或者赋形剂”是指其中制剂根据本发明药物或者疫苗组合物或者利用其制剂根据本发明药物或者疫苗组合物的任意载体。其包括诸如磷酸盐缓冲液的盐水。通常，基于施用的方式和途径以及标准药物学实践而选择稀释液或者载体。
在优选实施例中，根据本发明的药物组合物制剂为口服施用，并且因此，包含适合的用于口服施用的药物可接受载体和/或赋形剂。
用于药物可接受载体和/或赋形剂的实例也是脂质体。
医学应用
如上文讨论的，本发明提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在医学中的应用。
因此，本发明的环状肽或者根据本发明的药物组合物是适合的，并且因此提供以用于疾病的诊断、预防和/或治疗。
如上文讨论的，本发明提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在HBV和/或HDV感染抑制中的应用。
如上文讨论的，本发明提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在原发HBV和/或HDV感染预防中的应用。
如上文讨论的，本发明提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物作为HBV和/或HDV进入抑制剂的应用。
优选地，抑制或者防止任意基因型的HBV的HBV感染。
优选地，经由牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP/SLC10A1)的靶向，“NTCP靶向”进行进入抑制。
如上文讨论的，在一个实施例中，环状肽和衣壳抑止剂能够作为组合抑制剂而作用，其
(i)定位和抑制NTCP，以及
(ii)经由与NTCP的相互作用而靶向肝脏并且随后影响核壳体的第二活性域进而干涉病毒复制。
如上文讨论的，本发明提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在肝脏疾病或者状况的诊断、预防和/或治疗中的应用。
在一个实施例中，肝脏疾病或者状况选自肝炎、肝硬化、血色病，优选为甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型、庚型、辛型肝炎病毒导致的肝炎或病毒导致的伴行肝炎。
在一个实施例中，肝病或者紊乱是涉及病毒或非病毒病原体的肝脏状况，诸如热带病、疟疾、血吸虫病、利什曼病、威尔森氏症。
在一个实施例中，肝病或者紊乱是肝脏肿瘤，优选为肝细胞癌(HCC)。
在一个实施例中，肝病或者紊乱是与胆汁通路中胆汁盐累积相关的肝脏移植后的移植后并发症/移植后相关的肝功能不良。
在一个实施例中，肝脏疾病或者状况涉及肝细胞中牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的化合物运输，
或者需要向疾病或者状况的位点或位置输送诸如药物或者标签的化合物。
优选地，肝脏疾病或者状况是选自肝内胆汁郁积、(肝脏毒素引起的)肝脏中毒/肝中毒、药物诱导的胆汁郁积肝病、高血脂、肝后胆汁郁积、代谢综合征、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、糖原沉积病的涉及肝脏的代谢病。
优选地，经由NTCP输送到肝细胞中的化合物优选为胆汁酸、类固醇、共轭和非共轭的甲状腺激素、肝脏毒素、共价结合至牛磺胆酸盐的化合物、bromosulphophthalein、药物。
发明人已经识别并描述了牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)作为靶点并且用于在诸如与化合物(诸如胆汁酸等)向肝细胞中的NTCP介导的运输相关的肝病或者状况的特定肝病或者状况的预防和/或治疗中的应用，优选为涉及肝脏的代谢病(例如肝内胆汁郁积、(肝脏毒素引起的)肝脏中毒/肝中毒、药物诱导的胆汁郁积肝病、高血脂等)和心血管疾病。见WO 2014/072524和PCT/EP2014/066262，其整体包括在本文中。
本文使用的“涉及肝脏的代谢病”是指包括受脂质和胆汁酸的肝脏代谢影响的内脏肥胖、糖尿病和血脂异常的代谢紊乱。
通常，“胆汁郁积”是胆汁组分不能从肝细胞分泌至胆道系统中或者胆汁不能从肝脏流向十二指肠，导致肝细胞胆汁酸累积在肝细胞中的状况。
本文使用的“胆汁郁积”或者“肝内胆汁郁积”是指与胆小管膜中胆汁酸盐输出泵(如BSEP或者MRP)的表达或者活性不足相关的肝细胞胆汁酸累积的肝内毒性作用。
本文使用的“肝后胆汁郁积”是指由于大的胆管堵塞导致的胆汁郁积的肝病。
本文使用的“肝脏中毒”或者“肝中毒”或者“中毒性肝病”是指胆汁酸累积之外的的药物的毒性作用。这些药物经由NTCP介导的运输穿透肝细胞并且通过破坏线粒体或者通过激活导致氧化应激的细胞色素P-450系统中的酶而导致若干直接的毒性作用。
本文使用的“药物诱导的胆汁郁积肝病”是指由于对胆盐输出泵(BSEP)的药效抑制胆汁酸从肝细胞输出。
药物诱导的胆汁郁积可能由抑制BSEP的若干药物导致，诸如利福平、环孢霉素A、利福霉素SV、波生坦、曲格列酮、依托红霉素、以及格列本脲(Fattinger et al.,2001；Funk et al.,2001；Funk et al.,2001；Stieger et al.,2000；Dawson et al.,2012；Morgan et al.,2010；Ogimura et al.,2011)。BSEP是转运蛋白ATP结合盒(ABC)家族的成员(BSEP也表示为ABCB11)并且其涉及将胆汁酸运出肝细胞的过程，由此降低它们对这些细胞的毒性。上文提及的药物因为不能经由BSEP排出胆汁酸而导致过度胆汁酸累积的毒性作用。NTCP介导的胆汁酸吸收的抑制经由脂肽系化合物(诸如MyrB)并且NTCP抵销BSEP抑制，并且从而防止肝中毒或者适用于治疗和/或诊断。
“高血脂”(或者高脂蛋白血、或者高血脂)涉及血液中的任意或全部脂质和/或脂蛋白的水平异常升高。
高血脂分为原发和继发亚型。原发高血脂通常由于遗传原因(诸如受体蛋白质的突变)而引起，而继发高血脂由于其他潜在原因诸如糖尿病而引起。脂质和脂蛋白异常在一般人群中是常见的，并且由于其对动脉硬化的影响而被视为心血管疾病的可修正的风险因素。
“高血胆脂醇”(或者高胆固醇)是血液中存在高水平的胆固醇。其是“高血脂”的一种形式。
本文使用的“高血脂”优选为是指包括LDL胆固醇升高、HDL胆固醇降低、甘油三脂升高的高血胆脂醇；导致高血压的动脉阻塞；心血管疾病(CVD)；心脏病和中风。
“代谢综合征”是指通过下列五个身体状况中的三个同时发生而诊断的能量利用和储存的紊乱：腹部(向心性)肥胖、血压升高、空腹血糖升高、高血清甘油三脂、以及低的高密度胆固醇(HDL)水平。代谢综合征增加发展心血管疾病，特别是心力衰竭，和糖尿病的风险。代谢综合征也已知为代谢综合征X、心血管代谢综合征、综合征X、胰岛素抗性综合征、雷文氏综合征(Reaven's syndrome)、以及CHAOS。
“非酒精性脂肪肝”(NAFLD)是指脂肪肝的一种原因，在脂肪不由于过量饮酒而在肝脏中沉积(脂肪变性)时发生。其涉及胰岛素抗性和代谢综合征。非酒精性脂肪肝(NASH)是NAFLD的最极端的形式，并且被视为未知的肝硬化的主要原因。
优选地，通过本发明的环状肽减少或阻断NTCP介导的运输。
如上文讨论的，在一个实施例中，环状肽和衣壳抑止剂能够作为组合抑制剂而作用，其
(i)定位和抑制NTCP，以及
(ii)经由与NTCP的相互作用而靶向肝脏并且随后影响核壳体的第二活性域进而干涉病毒复制。
如上文讨论的，本发明提供本发明的环状肽或者本发明的药物组合物在心血管疾病(CVD)或者状况的诊断、预防和/或治疗中的应用。
优选为心血管疾病包括胆固醇水平或者胆固醇吸收的控制或者修正，
其中胆固醇水平或者吸收优选为通过(通过环状肽的)NCTP介导的胆汁盐运输的减少或阻断而控制或修正。
胆固醇水平或者吸收通过利用本发明的环状肽的NCTP介导的胆汁盐运输的减少或阻断而控制或修正。
所述应用包括胆固醇水平或者胆固醇吸收的控制或者修正，
其中胆固醇水平或者吸收通过利用本发明的环状肽的NCTP介导的胆汁盐运输的减少或阻断而控制或修正。
心血管疾病(CVD)是西方世界发病率和死亡的主要原因。高水平的胆固醇与作为风险因素中的一个的CVD相关。临床上特别重要的是胆固醇和富胆固醇脂蛋白在冠状动脉中的异常沉积。最后导致动脉硬化的这样的沉积是冠状动脉疾病的主要的促成因素。在此情况下，取决于降脂疗法的CVD的管理是关键的。不同等级的药物可用于该目的，诸如用于通过不同途径降低胆固醇水平而发挥作用的他汀类药物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸树脂、纤维酸类和烟碱酸(Schmitz&Langmann，2006)。这些药物具有若干副作用并且取决于作用于心血管药物的代谢酶和转运蛋白的相对水平。
胆固醇代谢的主要控制是通过作为胆固醇平衡的重要调节剂的胆汁酸进行的。胆汁酸和胆固醇水平通过胆固醇代谢和吸收规则而关联。胆汁酸的合成是哺乳动物中胆固醇分解代谢的主要途径，因为胆固醇利用的最终产物是胆汁酸。用于合成胆汁酸的主要途径是经由在第7位通过胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)的作用而羟基化胆固醇而开始。
该合成胆汁酸的方法是用于排出过量胆固醇的主要机制中的一个。在生理条件下，该规则不足以补偿胆固醇的过度摄入。然而，如果摄取到肝细胞中的胆汁酸被阻断，则胆汁酸形式的胆固醇的排出将足以补偿过量饮食的胆固醇摄入。经由根据本发明的脂肽系化合物和NTCP阻断胆汁酸摄入导致通过增加胆固醇代谢和吸收补偿的胆汁酸胞内不足。
因此，根据本发明，本发明的环状肽适用于降脂疗法以防止CVD。
施用途径
优选地，本发明的环状肽或者药物组合物的施用途径选自口服、皮下、静脉、鼻、肌肉、经皮、吸入、通过栓剂。
优选的施用途径或者应用是口服。
优选经鼻施用的实施例或者应用为鼻喷雾。
治疗有效量
提供本发明的环状肽或者药物组合物使得其包含治疗有效量的环状肽或者药物组合物。
本发明的环状肽或者药物组合物的“治疗有效量”是指足以抑制NTCP受体功能的量。此外，“治疗有效量”取决于抑制、治疗或者接种的各自的应用和期望的结果。
对于下列，需要不同的治疗有效量
(i)抗病毒应用或者进入抑制(诸如每位患者0.01至0.5mg，优选为0.1至1mg/患者)
相比之下
(ii)要求饱和NTCP的应用，诸如例如胆汁酸、药物等的NTCP介导的运输的抑制(诸如每位患者1mg或者1-2mg/患者)。
在一个实施例中，本发明的环状肽或者药物组合物的“治疗有效量”是指足以抑制HBV和/或HDV感染的量；足以防止原发HBV和/或HDV感染的量；足以治疗活体内的乙型和/或丁型肝炎和/或接种和/或HBV和/或HDV的抑制进入的量。
优选的治疗有效量在每kg体重10μg至1mg的范围内，优选为10μg至100μg。
优选地，所治疗有效量为每患者每日约0.01mg至约50mg的范围内，优选为每患者每日约1mg至约20mg
或者以每日每kg100nmol至每kg2μmol的剂量范围应用于患者/或者以每kg10pmol至每kg体重20μmol的剂量范围应用于患者。
在使用的环状肽的IC50值为约10nM的情况下，优选的治疗有效量为每kg体重约100μg或者每位患者1至5mg的范围内。每位患者1至5mg的范围内的优选的治疗有效量能够一天施用一次或者在其他实施例中每2-3天仅一次。
熟练的从业人员能够确定适合的治疗有效量。
疾病的诊断、预防和/或治疗方法
如上文讨论的，本发明提供用于抑制HBV和/或HDV感染和/或预防原发HBV和/或HDV感染的方法。
所述方法包括治疗有效量的本发明的环状肽或者本发明的药物组合物的施用。
其中优选为抑制或者防止任意基因型的HBV的HBV感染。
如上文讨论的，本发明提供用于肝脏疾病或者状况的诊断、预防和/或治疗的方法。
所述方法包括治疗有效量的本发明的环状肽或者本发明的药物组合物的施用。
在一个实施例中，肝脏疾病或者状况选自肝炎、肝硬化、血色病，优选为甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型、庚型、辛型肝炎病毒导致的肝炎或病毒导致的伴行肝炎。
在一个实施例中，肝病或者紊乱是涉及病毒或非病毒病原体的肝脏状况，诸如热带病、疟疾、血吸虫病、利什曼病、威尔森氏症。
在一个实施例中，肝病或者紊乱是肝脏肿瘤，优选为肝细胞癌(HCC)。
在一个实施例中，肝病或者紊乱是与胆汁通路中胆汁盐累积相关的肝脏移植后的移植后并发症。
在一个实施例中，肝脏疾病或者状况涉及肝细胞中牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)介导的化合物运输，
或者需要向疾病或者状况的位点或位置输送诸如药物或者标签的化合物，
并且优选为选自下列的涉及肝脏的代谢病
肝内胆汁郁积，
(肝脏毒素导致的)肝脏中毒/肝中毒，
药物诱导的胆汁郁积肝病，
高血脂，
肝后胆汁郁积，
代谢综合征，
非酒精性脂肪肝(NAFLD)，
糖原沉积病，
并且其中经由NTCP输送到肝细胞中的化合物优选为胆汁酸、类固醇、共轭和非共轭的甲状腺激素、肝脏毒素、共价结合至牛磺胆酸盐的化合物、bromosulphophthalein、药物。
如上文讨论的，在一个实施例中，环状肽和衣壳抑止剂能够作为组合抑制剂而作用，其
(i)定位和抑制NTCP，以及
(ii)经由与NTCP的相互作用而靶向肝脏并且随后影响核壳体的第二活性域进而干涉病毒复制。
如上文讨论的，本发明提供用于心血管疾病(CVD)的诊断、预防和/或治疗的方法。
所述方法包括治疗有效量的本发明的环状肽或者本发明的药物组合物的施用。
所述方法优选为包括胆固醇水平或者胆固醇吸收的控制或者修正，
其中胆固醇水平或者吸收优选为通过(通过环状肽的)NCTP介导的胆汁盐运输的减少或阻断而控制或修正。
在本发明的方法中，并且如上所述，“治疗有效量”取决于抑制、治疗或者接种的各自的应用和期望的结果。
对于下列，需要不同的治疗有效量
(i)抗病毒应用或者进入抑制(诸如每位患者0.01至0.5mg，优选为0.1至1mg/患者)
相比之下
(ii)要求饱和NTCP的应用(诸如每位患者1mg或者1-2mg/患者)。
在一个实施例中，并且如上文讨论的，治疗有效量优选为在每患者约0.01mg至约50mg的范围内，优选为每患者约1mg至约20mg，
或者其中环状肽优选为以每kg10pmol至每kg体重20μmol的剂量范围应用于患者。
在本发明的方法中，并且如上所述，施用途径优选为选自口服、皮下、静脉、鼻、肌肉、经皮、吸入、通过栓剂。
然而，下列的实例和附图在不限制本发明的情况下例示本发明。
实施例
实例1材料&方法
缩写：
COMU (1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲氨基-吗啉代-碳鎓-六氟磷酸盐
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF 二甲基甲酰胺
DOTA 1，4，7，10-轮环藤宁-1，4，7，10-四乙酸
Fmoc 芴甲氧羰酰氯
Ga 镓
HATU 1-[双(二甲氨基)次甲基]-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]3-羟基吡啶六氟磷酸盐
HBeAg 乙型肝炎病毒早期抗原
HBcAg 乙型肝炎核心抗原
HBTU 2-(1H-苯并三氮唑-1-yl)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HBV 乙型肝炎病毒
HPLC 高效液相色谱
LC/MS 液相色谱–质谱分析法
NHS N-羟基丁二酰亚胺
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NTCP 牛磺胆酸钠协同转运多肽
PBS 磷酸盐缓冲液
PET 正电子发射断层显像
PFA 仲甲醛
TC 牛磺胆酸盐
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基硅烷
1.肽合成
1.1二硫键肽
固相肽合成
在肽合成器(Applied Biosystems 443A，Foster City,CA,USA)中使用Fmoc/tBu化学品在固相(Tentagel R RAM树脂，容量0.22mmol/g，Rapp Polymere,Tübingen,Germany)上合成肽。在肽合成开始前，在DCM中预膨胀树脂(0.05mmol)。以10倍的过量(0.5mmol)使用Fmoc保护的氨基酸并且用HBTU/DIPEA在NMP中活化。
也见Schieck et al.,2010。
豆蔻酰化
在固体支撑物上的肽在DCM中膨胀并且用NMP洗涤。在NMP中溶解十四酸(4eq.)和HATU或者COMU(4eq.)并且添加10eq.DIPEA。混合物添加至树脂并且培育30分钟。其后，用NMP洗涤树脂三次，用DCM洗涤三次并且干燥。
去保护并且从树脂剪切
用TFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5)对肽剪切并去保护。用二乙醚沉淀去保护的肽，通过离心(3000rpm，5分钟)成粒用新鲜的二乙醚洗涤两次。干燥肽。
MyrB：
Myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG-酰胺
[SEQ ID NO.24]
形成二硫键
在5ml 80％乙酸中溶解5mg生肽。1mg冰醋酸中的碘缓慢滴入肽溶液。添加10μl饱和的抗坏血酸溶液。蒸发溶剂并且在1:1的乙腈:H2O中重新溶解肽并且用预备的HPLC纯化。通过LC/MS确认反应成功。
萤光染料/化合物的耦合
肽溶解在DMF中并且与NHS酯活化的化合物(2eq.)和DIPEA(10eq.)反应。用HPLC控制反应。
1.2氨基脯氨酸-肽
将200mg(0.32mmol)2-氯三苯甲基氯树脂和41mg(0.1mmol)Fmoc-Glu(OAll)-OH及52mg(68μL；0.4mmol)DIPEA一起装入2mL二氯甲烷中。在用甲醇封端后，树脂经历自动的肽合成(ABI 433A)。在期望的氨基酸位置通过COMU活化耦合109mg(0.25mmol)Fmoc-L-Pro(4-NH-Alloc)-OH(2S、4S)。在直线组装和用5mg四(三苯基膦)钯(0)和30mg二甲胺基甲硼烷催化烯丙基去保护之后通过2mL NMP中的110mg(86mL；0.4mmol)DPPA和77mg(102μL；0.6mmol)实现固相环化。由95:2.5:2.5的TFA/水/TIS剪切和去保护环状肽并且通过HPLC纯化；间或在纯化之前用DOTA萤光染料活性脂改性部分生肽。
2.68Ga标签及PET成像
Ca.1mL[68Ga]Ga3+洗出液(ca.600-800MBq)添加至20μL DMSO中化合物xy的1mM溶液和10μL抗坏血酸的饱和水溶液的混合物。获得的混合物的pH通过仔细地添加2.5M的醋酸钠水溶液而调整至3.5-4.0。通过在恒定搅拌下加热至超过95℃5-10分钟而实现络合。通过用乙醇固相萃取并随后蒸发而分离产物。在1％牛血清白蛋白中提取残留物并且将适当量(ca.20-50MBq)用于不超过100μl体积的单个实验。用1％七氟烷(Abbott,Wiesbaden,Germany)麻醉小鼠并且使用Inveon小型动物正电子发射断层摄影(PET)扫描仪(Siemens,Knoxville,TN)记录注射后60分钟的图像。
3.3H-牛磺胆酸盐摄取试验
种入24孔板的HepG2NTCP细胞在37℃下在培养基中用指定肽预培育30分钟。150μM牛磺胆酸盐(包含cpm/fmol 3H牛磺胆酸盐)添加至各个孔并且在37℃下额外培育细胞15分钟。通过移除细胞培养基并且添加冰冷PBS而停止摄取。用冷PBS和洗涤细胞三次并且溶解细胞(0.2M NaOH，0.05％SDS)。细胞物与Ultima Gold液体闪烁液(Perkin Elmer,Rodgau,Germany)混合并且在液体闪烁计数器(Packard Instruments,Frankfurt,Germany)中测量放射性。
4.HBV感染抑制试验
种入24孔板的HepG2 NTCP细胞在37℃下在培养基中用指定浓度下的指定肽预培育30分钟。随后，在肽存在的情况下在37℃下包含4％PEG的细胞培养基中用HBV(GE 1.8x108)感染细胞整夜16h，随后是用PBS的洗涤步骤。每两天更换一次培养基并且收集感染后第5至7日的上清液用于HBeAg测量。
可以单独或任意组合的前文描述、权利要求和/或附图中中公开的特征为用于以不同形式实现本发明的材料。
参考文献
Chan,HL.&Sung,JJ.Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus.Semin Liver Dis 26,153-161(2006).
Cho MH,Song JS,Kim HJ,Park SG,Jung G.Structure-based design and biochemical evaluation of sulfanilamide derivatives as hepatitis B virus capsid assembly inhibitors.J Enzyme Inhib Med Chem 2013；28:916-925.
Dawson S,et al.(2012)In vitro inhibition of the bile salt export pump correlates with risk of cholestatic drug-induced liver injury in humans.Drug Metab Dispos 40:130-138.
Doring B,Lutteke T,Geyer J,Petzinger E.The SLC10 carrier family:transport functions and molecular structure.Curr Top Membr 2012；70:105-168.
Fattinger K,Funk C,Pantze M,et al.The endothelin antagonist bosentan inhibits the canalicular bile salt export pump:a potential mechanism for hepatic adverse reactions.Clin Pharmacol Ther.2001；69:223–31.
Funk C,Pantze M,Jehle L,et al.Troglitazone-induced intrahepatic cholestasis by an interference with the hepatobiliary export of bile acids in male and female rats.Correlation with the gender difference in troglitazone sulfate formation and the inhibition of the canalicular bile salt export pump(Bsep)by troglitazone and troglitazone sulfate.Toxicology.2001；167:83–98.
Funk C,Ponelle C,Scheuermann G,et al.Cholestatic potential of troglitazone as a possible factor contributing to troglitazone-induced hepatotoxicity:in vivo and in vitro interaction at the canalicular bile salt export pump(Bsep)in the rat.Mol Pharmacol.2001；59:627–35.
Gausepohl,H.et al..Int.J.Prot.Pept.Res.34,287-294(1989).
Gripon P,Cannie I,Urban S.Efficient inhibition of hepatitis B virus infection by acylated peptides derived from the large viral surface protein.J Virol 2005；79:1613-1622.
Kotani N,Maeda K,Debori Y,Camus S,Li R,Chesne C,Sugiyama Y.Expression and Transport Function of Drug Uptake Transporters in Differentiated HepaRG Cells.Mol Pharm 2012；9(12):3434-41.
Lempp FA,Urban S.Inhibitors of hepatitis B virus attachment and entry.Intervirology 2014；57:151-157.
Mailly L,Xiao F,Lupberger J,Wilson GK,Aubert P,Duong FH,Calabrese D,Leboeuf C,Fofana I,Thumann C,Bandiera S,Lütgehetmann M,Volz T,Davis C,Harris HJ,Mee CJ,Girardi E,Chane-Woon-Ming B,Ericsson M,Fletcher N,Bartenschlager R,Pessaux P,Vercauteren K,Meuleman P,Villa P,Kaderali L,Pfeffer S,Heim MH,Neunlist M,Zeisel MB,Dandri M,McKeating JA,Robinet E,Baumert TF.Clearance of persistent hepatitis C virus infection in humanized mice using a claudin-1-targeting monoclonal antibody.Nat Biotechnol.2015；33(5):549-54.doi:10.1038/nbt.3179.Epub 2015 Mar 23.
Meier A,Mehrle S,Weiss TS,Mier W,Urban S.The myristoylated preS1-domain of the Hepatitis B Virus L-protein mediates specific binding to differentiated hepatocytes.Hepatology 2012；58:31-42.
Mitchell AR,Erickson BW,Ryabtsev MN,Hodges RS,and Merrifield RB,Tert-butoxycarbonylaminoacyl-4-(oxymethyl)-phenylacetamidomethyl-resi n,a more acid-resistant support for solid-phase peptide synthesis.J Am Chem Soc.1976；98(23):7357-62.
Morgan RE,et al.(2010)Interference with bile salt export pump function is a susceptibility factor for human liver injury in drug development.Toxicol Sci 118:485-500.
Müller T,Mehrle S,Schieck A,Haberkorn U,Urban S,Mier W.Liver imaging with a novel hepatitis B surface protein derived SPECT-tracer.Mol Pharm.2013；10(6):2230-6.
Ni Y,Lempp FA,Mehrle S,Nkongolo S,Kaufman C,Falth M,Stindt J,et al.Hepatitis B and D Viruses Exploit Sodium Taurocholate Co-transporting Polypeptide for Species-Specific Entry into Hepatocytes.Gastroenterology 2014；146:1070-1083.
Ogimura E,et al.(2011)Bile salt export pump inhibitors are associated with bile acid-dependent drug-induced toxicity in sandwich-cultured hepatocytes.Biochem Biophys Res Commun 416:313-317.
Schieck A,Müller T,Schulze A,Haberkorn U,Urban S and Mier W.Solid-Phase Synthesis of the Lipopeptide Myr-HBVpreS/2-78,a Hepatitis B Virus Entry Inhibitor.Molecules 2010,15(7),4773-4783.
Schieck A,Schulze A,Gahler C,Muller T,Haberkorn U,Alexandrov A,Urban S,Mier W.Hepatitis B virus hepatotropism is mediated by specific receptor recognition in the liver and not restricted to susceptible hosts.Hepatology 2013；58(1):43-53.[Epub ahead of print:2013.Jan 4.]
Schulze A,Schieck A,Ni Y,Mier W,Urban S.Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction.J Virol 2010；84:1989-2000.
Shepard,C.W.,Simard,E.P.,Finelli,L.,Fiore,A.E.&Bell,B.P.Hepatitis B virus infection:epidemiology and vaccination.Epidemiol Rev 28,112-125(2006).
Slijepcevic,D.,Kaufman,C.,Wichers,C.G.K.,Gilglioni,E.H.,Lempp,F.A.,Duijst,S.,de Waart,D.R.,Oude Elferink,R.P.J.,Mier,W.,Stieger,B.,Beuers,U.,Urban,S.,van de Graaf,S.F.J.,2015.Impaired uptake of conjugated bile acids and hepatitis b virus pres1-binding in na+-taurocholate cotransporting polypeptide knockout mice.Hepatology 62,207–219
Stieger B,Fattinger K,Madon J,et al.Drug-and estrogen-induced cholestasis through inhibition of the hepatocellular bile salt export pump(Bsep)of rat liver.Gastroenterology.2000；118:422–30.
Stray SJ,Zlotnick A.BAY 41-4109 has multiple effects on Hepatitis B virus capsid assembly.J Mol Recognit 2006；19:542-548.
Urban S,Future Virol.2008,3(3),253-264.
Urban S,Bartenschlager R,Kubitz R,Zoulim F.Strategies to Inhibit Entry of HBV and HDV into Hepatocytes.Gastroenterology 2014；147(1):48-64.
Wang YJ,Lu D,Xu YB,Xing WQ,Tong XK,Wang GF,et al.A Novel Pyridazinone Derivative Inhibits Hepatitis B Virus Replication by Inducing Genome-Free Capsid Formation.Antimicrobial agents and chemotherapy 2015；59:7061-7072.
White CJ and Yudin AK.Contemporary strategies for peptide macrocyclization,Nature Chemistry 2011；3,509–524.
Yan H,Zhong G,Xu G,He W,Jing Z,Gao Z,Huang Y,et al.Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.elife.2012；1:e00049.
Zoulim,F.Antiviral therapy of chronic hepatitis B.Antiviral Res 71,206-215(2006).
序列表
<110> 鲁普莱希特-卡尔斯-海德堡大学
<120> 环状NTCP靶向肽及其作为进入抑制剂的应用
<130> FCT180236-99
<150> EP 15200494.1
<151> 2015-12-16
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 关键区或药效基团， 氨基酸序列P，具有
Xaa = F或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 能够为天然氨基酸
<400> 1
Asn Pro Leu Gly Phe Xaa Pro
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 2
Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 关键区或药效基团， 氨基酸序列P，具有 Xaa
= L
<400> 3
Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-preS9-15-Cys
<400> 4
Cys Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Cys
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS9-15-Cys-D-Tyr
<400> 5
Cys Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Cys Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 6
Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS9-16-Cys
<400> 7
Cys Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Cys
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS9-16-Cys-D-Tyr
<400> 8
Cys Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Cys Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 9
Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS8-16-Cys
<400> 10
Cys Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS8-16-Cys-D-Tyr
<400> 11
Cys Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Cys Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 12
Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS9-17-Cys
<400> 13
Cys Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Cys
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS9-17-Cys-D-Tyr
<400> 14
Cys Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Cys Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 15
Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS8-17-Cys
<400> 16
Cys Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Cys
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS8-17-Cys-D-Tyr
<400> 17
Cys Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Cys Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 18
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS2-21-Cys
<400> 19
Cys Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Cys
20
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS2-21-Cys-D-Tyr
<400> 20
Cys Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Cys Tyr
20
<210> 21
<211> 47
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 21
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
<210> 22
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS2-48-Cys
<400> 22
Cys Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
Cys
<210> 23
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-HBVpreS2-48-Cys-D-Tyr
<400> 23
Cys Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
Cys Tyr
50
<210> 24
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> amino acid residues of Myrcludex B
<400> 24
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 25
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys-Myrcludex B-Cys
<400> 25
Cys Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Cys
<210> 26
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys- Myrcludex B-Cys-D-Tyr
<400> 26
Cys Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Cys Tyr
50
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBVpreS9-16 with Xaa = L
<400> 27
Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBVpreS8-16 with Xaa = L
<400> 28
Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBVpreS9-17 with Xaa = L
<400> 29
Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBVpreS8-17 with Xaa = L
<400> 30
Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5 10
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBVpreS2-21 with Xaa = L
<400> 31
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro
20
<210> 32
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBVpreS2-48 with Xaa = L
<400> 32
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
<210> 33
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> amino acid residues of Myrcludex B with Xaa = L
<400> 33
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 34
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Gln Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Ala Thr Val Pro Ala Met Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 35
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His
35 40 45
Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala His Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ser Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
115
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 36
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His
35 40 45
Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala His Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ser Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
115
<210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 37
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Glu
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Lys Lys Asp Tyr Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Leu Pro Ala Asn
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
100 105
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 38
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Phe Gln Thr Leu Pro Ala Asn Pro
65 70 75 80
Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Pro Pro Leu Arg Thr Thr His Pro Gln Ala
100 105
<210> 39
<211> 118
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 39
Met Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Lys Asn Ile Ser
1 5 10 15
Thr Thr Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala
20 25 30
Phe Arg Ala Asn Thr Arg Asn Pro Asp Trp Asp His Asn Pro Asn Lys
35 40 45
Asp His Trp Thr Glu Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro
50 55 60
Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala
65 70 75 80
Gln Gly Met Leu Lys Thr Leu Pro Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ser Thr
85 90 95
Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Thr Pro Pro Leu Arg
100 105 110
Asp Thr His Pro Gln Ala
115
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 40
Met Gly Ala Pro Leu Ser Thr Thr Arg Arg Gly Met Gly Gln Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp Phe Asn Thr Asn
35 40 45
Lys Asp Ser Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Gly Tyr Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Val Leu Thr Thr Leu Pro Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Arg Ser Gly Arg Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
115
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 41
Met Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Lys Asn Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ser Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala
20 25 30
Phe Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Lys Lys
35 40 45
Asp Pro Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Tyr Gly Pro
50 55 60
Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gln Gly Thr Leu Thr Thr Leu Pro Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ser Thr
85 90 95
Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg
100 105 110
Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210> 42
<211> 108
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 42
Met Gly Gln Asn His Ser Val Thr Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Leu Phe Arg Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala Thr Lys Val Gly
35 40 45
Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Leu Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Lys Ala Thr Pro
85 90 95
Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
100 105
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 43
Met Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Arg Arg Gly Met Gly Gln Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp Phe Asn Thr Asn
35 40 45
Lys Asp Asn Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Gly Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Ser Pro Pro Asp Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Arg Ser Gly Arg Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
115
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 44
Met Gly Gln Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Glu
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Leu Phe Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala Thr Lys Val Gly
35 40 45
Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Val Thr Thr Ile Leu Pro Ala Val
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
100 105
<210> 45
<211> 105
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 45
Met Gly Leu Asn Gln Ser Thr Phe Pro Leu Gly Phe Phe Pro Ser His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Leu Phe Lys Ala Asn Ala Gly Ser Ala Asp Trp Asp
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Pro Trp Pro Gln Ala His Asp Thr Ala Val Gly Ala
35 40 45
Phe Gly Pro Gly Leu Val Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Gln Gly Leu Ser Val Thr Val Pro Asp Thr Pro Pro Pro
65 70 75 80
Pro Ser Thr Asn Arg Asp Lys Gly Arg Lys Pro Thr Pro Ala Thr Pro
85 90 95
Pro Leu Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
100 105
<210> 46
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV preS consensus sequence (for amino acid positions (-11) to
48)
<400> 46
Met Gly Gly Trp Ser Ser Thr Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Arg Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
50 55