双硫仑是一种商业化的抗酒精中毒药物，已被证明是一种潜在的抗癌剂，具有强烈的癌细胞毒性，但对体内重要器官的毒性非常有限。此外，双硫仑已被证明可以根除乳腺癌和胶质母细胞瘤干细胞。然而，由于其在血流中的半衰期短，双硫仑转化为临床癌症治疗受到严重限制。因此，需要开发更稳定的临床适用的双硫仑制剂，其显示延长的体内半衰期。
根据本发明的第一方面，提供了纳米颗粒，包括被共聚物聚(乳酸-co-羟基乙酸)(plga)或聚乳酸(pla)包封的双硫仑或其衍生物。
根据本发明的第二方面，提供了纳米颗粒组合物，包括一种或多种纳米颗粒，该纳米颗粒包括双硫仑或其衍生物，其中，双硫仑或其衍生物被共聚物聚(乳酸-co-羟基乙酸)(plga)或聚乳酸(pla)包封。
根据本发明的第三方面，提供了药物组合物，包括：一种或多种纳米颗粒，该纳米颗粒包括双硫仑或其衍生物，其中，双硫仑或其衍生物被共聚物聚(乳酸-co-羟基乙酸)(plga)或聚乳酸(pla)包封；以及药学上可接受的载体。
“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的任何颗粒，例如，约10nm至300nm。例如，纳米颗粒可具有小于约300nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约30nm、小于约10nm或小于约3nm的直径。在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒具有的直径为约60nm至约120nm、约60nm至约140nm、约60nm至约150nm、约70nm至约120nm、约70至约130nm或80nm至约200nm或约100nm至约200nm。
双硫仑具有化学式：
双硫仑的衍生物可以包括二乙基二硫代氨基甲酸或二乙基二硫代碳酸酯(ddc)或其代谢物，或双硫仑的代谢物。优选该衍生物不包括铜。
本发明的纳米颗粒可包括约0.2至约35重量百分比、约3至约40重量百分比、约1至约30重量百分比、约5至约30重量百分比、约10至约30重量百分比、约15至约25重量百分比或甚至约4至约25重量百分比的双硫仑或其衍生物。
在一种实施方式中，双硫仑或其衍生物可以或者可以不缀合(例如共价结合，例如直接或通过连接部分)至plga或聚乳酸(pla)，或共聚物(诸如plga-peg)的plga部分。
本文所用的“plga”是指乳酸和羟基乙酸的生物相容的和生物可降解的共聚物，并且各种形式的plga的特征在于乳酸:羟基乙酸的比例。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸或d,l-乳酸。plga的降解可以通过改变乳酸-羟基乙酸的比例来调节。在一些实施方式中，根据本发明使用的plga的特征在于乳酸:羟基乙醇的比例为大约85:15、大约75:25、大约60:40、大约50:50、大约40:60、大约25:75或大约15:85。优选地，乳酸:羟基乙酸的比例为大约50:50。
在一些实施方式中，可以选择乳酸与羟基乙酸的比例来优化各种参数，诸如可以优化吸水率、治疗剂(双硫仑或其衍生物)释放和/或聚合物降解动力学可以优化。
如本文所用的“pla”是指乳酸的生物相容的且可生物降解的聚合物。
本发明的纳米颗粒可以包括约10至约99重量百分比、或约20至约80重量百分比、约40至约80重量百分比、或约30至约50重量百分比、或约70至90重量百分比的plga。
plga可具有约5至约15kda或约5至约12kda的数均分子量。优选地，plga可以具有约8至约12kda的数均分子量。
在一些实施方式中，根据本发明使用的plga和双硫仑或其衍生物的特征可以在于plga:双硫仑或其衍生物的比例为约4:1、3:1或2:1。优选地，plga:双硫仑或其衍生物比例为约2:1。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒还可以包括可以增加药物释放速率的脂肪醇。例如，本发明的纳米颗粒可以包括c8-c30醇，诸如十六烷醇、辛醇、十八醇、二十烷醇、二十二烷醇(docosonal)或二十八醇(octasonal)。
本发明的纳米颗粒可以与选自由阿法替尼(afatinib)、伯舒替尼(bosutinib)、达沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、帕纳替尼(ponatinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替拉替尼(telatinib)、或凡德他尼(vandetanib)组成的组的酪氨酸激酶抑制剂联合给药。优选地，酪氨酸激酶抑制剂是索拉非尼。
在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒组合物包括具有约60nm至约150nm直径的纳米颗粒。这种纳米颗粒可以包括约40重量百分比的双硫仑或其衍生物和约60重量百分比的plga共聚物。
在优选实施方式中，纳米颗粒的载药含量在约10％至约30％之间。
在优选实施方式中，载药含量为约27mg双硫仑/mgplga。
在优选实施方式中，纳米颗粒的包封效率在约68％至约97％之间。
在优选实施方式中，本发明提供了一种纳米颗粒，在其中包封的唯一活性成分是双硫仑或其衍生物。优选地，纳米颗粒不包封铜。
本发明的纳米颗粒可具有控释特性，例如，可以能够向受试者递送一定量的活性剂，例如，递送到受试者中的特定部位和/或经过延长的时间，例如，经过1天、1周或更长时间。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒立即释放(例如经过约1分钟至约30分钟)，小于约2％、小于约5％或小于约10％的双硫仑或其衍生物，例如当置于室温和/或37℃的磷酸盐缓冲溶液中。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒在置于水溶液中时可以释放双硫仑或其衍生物，例如在25℃速度大致相当于a)在约1小时后释放了约0.01至约20％的总二硫仑或其衍生物；b)在约8小时后释放了约10至约50％的总双硫仑或其衍生物；c)12小时后释放了约30至约50％的总双硫仑或其衍生物；以及d)在约24小时后释放了不少于约50％的总双硫仑或其衍生物。
根据本发明的另一方面，本发明的纳米颗粒可以与药学上可接受的载体组合以形成药物组合物。如本领域技术人员将理解的，可以基于如下所述的给药途径、目标组织的位置、药物递送的时间过程等来选择载体。随后描述了载体的实例。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式向受试者给药，包括肠胃外途径。如本文所用，术语“受试者”是指人类和非人类，包括例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类和鱼类。例如，非人类可以是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、灵长类动物或猪)。在某些实施方式中，胃肠外途径是期望的，因为它们避免与消化道中发现的消化酶接触。
根据这样的实施方式，本发明的组合物可以通过注射给药，例如静脉内注射。
在具体实施方式中，本发明的纳米颗粒全身给药至有需要的受试者，例如通过静脉内(iv)输注或注射。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中可以使用的是水、林格氏(ringer's)溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸用于制备注射剂，诸如油酸。在一种实施方式中，将本发明的缀合物悬浮在包括1％(w/v)羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)tweentm80的载体流体中。可注射制剂可以灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或加入无菌固体组合物形式的消毒剂，使用前可将该消毒剂溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
在一些实施方式中，构想了适合冷冻的组合物，包括本文公开的纳米颗粒和合适冷冻的溶液，例如，将蔗糖和/或环糊精溶液添加到纳米颗粒悬浮液中。蔗糖可以例如作为冷冻保护剂以防止颗粒在冷冻时聚集。例如，本文提供了包括多种公开的纳米颗粒、蔗糖和水的纳米颗粒制剂。
本发明的方法可以包括给药本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物，其中组合物在三周、一个月或两个月或更多的时间内给药。例如，本文公开了治疗癌症方法，包括在至少两周、三周、一个月的时间内给药本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物或在约2周至约6个月或更长的时间内给药，其中每次给药之间的间隔不超过约每天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次，并且其中在每次给药时双硫仑或其衍生物的剂量约为，优选约1mg/千克至约20mg/千克之间，更优选约10mg/千克。
本发明提供了治疗或预防癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者给药治疗有效量的本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物。通过类推，使用本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物来制备用于治疗癌症的药物也在本发明的范围内。类似地，通过类推，本发明还提供了用于在癌症治疗中使用的本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物。
在一些实施方式中，根据本发明的纳米颗粒可用于治疗、减轻、改善、缓解癌症、延缓癌症的发病、抑制癌症的进展、降低癌症的严重程度和/或减少癌症的一种或多种症状或特征的发病率。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了治疗有需要的受试者中癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量包括被共聚物聚(乳酸-co-羟基乙酸)(plga)或聚乳酸(pla)包封的双硫仑或其衍生物的纳米颗粒的纳米颗粒组合物或药物组合物。
根据本发明的另一方面，本发明提供了根据本发明的纳米颗粒，纳米颗粒组合物或药物组合物，其用于治疗有需要的受试者中的癌症。
根据另一个方面，本发明提供了将根据本发明的纳米颗粒、纳米颗粒组合物或药物组合物用于制备癌症治疗药物的用途。
癌症可以是任何合适的癌症，例如肾癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、淋巴瘤、甲状腺癌、骨癌、cns癌、白血病、肝癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、脑癌或黑素瘤。优选地，癌症是肝癌。更优选地，癌症是脑癌。
应该理解，本文使用的术语“治疗”和“治疗”是指为了对抗某一病症诸如疾病或疾患而对受试者进行的管理和护理。该术语旨在包括针对受试者所处的给定病症的全范围治疗，诸如给药纳米颗粒以缓解症状或并发症，以延缓疾病、疾患或病症的进展，以减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、疾患或病症，以及预防病症，其中预防应被理解为对抗疾病、病症或疾患而对受试者进行的管理和护理，并且包括给药纳米颗粒以防止症状或并发症的发作。待治疗的受试者优选是哺乳动物，特别是人类，但它还可以包括动物，诸如狗、猫、马、牛、绵羊和猪。
许多疾病在治疗中使用多于一种药物治疗，或者同时给药或者依次给药。因此，将本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物作为通常用于治疗癌症的其他既定疗法的辅助或配合该其他既定疗法用于治疗癌症的治疗方法中在本发明的范围内。通过类推，将本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物与通常用于治疗癌症的其它治疗活性化合物组合用于制备用于治疗癌症的药物，也在本发明的范围内。此外，通过类推，本发明还提供了根据本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物与通常用于治疗癌症的其它治疗活性化合物的组合，用于治疗癌症。
在一种实施方式中，本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物可以与手术或放疗或化疗组合使用。化学治疗剂可以是
组合处理可以以本领域技术人员认为必要或方便的任何方式进行，并且为了本说明书的目的，对组合使用的化合物的顺序、数量、重复次数或相对数量没有限制。
在本上下文中，术语“药学上可接受的盐”旨在表示对患者无害的盐。这样的盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。合适的无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合适的有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、扑酸、双亚甲基水杨酸、乙二磺酸、葡糖酸、柠康酐、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、edta、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。
药学上可接受的无机或有机酸加成盐的其他实例包括j.pharm.sci.1977,volume66,issue2中列出的药学上可接受的盐。金属盐的实例包括锂、钠、钾、镁盐等。铵和烷基铵盐的实例包括铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、乙基铵、羟乙基铵、二乙基铵、丁基铵、四甲基铵盐等。
根据本发明的药物组合物可以与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂一起根据常规技术配制，诸如公开于remington:thescienceandpracticeofpharmacy,19thedition,gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa,1995的那些。
合适的药物载体包括惰性固体稀释剂或填充剂、无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体的实例是乳糖、白土、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸和纤维素的低级烷基醚。液体载体的例子是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。另外，本发明的化合物可以与水或普通有机溶剂形成溶剂化物。这样的溶剂合物也包括在本发明的范围内。
该组合物可以进一步包括技术人员熟知的缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。为了方便起见，参考thescienceandpracticeofpharmacy,20thedition,2000。该组合物还可以进一步包括一种或多种对相同疾病状态具有活性的治疗剂。
该组合物可以进一步包括铜。在一种实施方式中，铜可以与根据本发明的组合物共同给药。
生产可用于本发明组合物的控释体系的方法包括但不限于结晶、冷凝、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压均化、包封、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以产生微球体、挤出和超临界流体工艺。一般参考药物控释手册(wise,d.l.,ed.marceldekker,newyork,2000)anddrugandthepharmaceuticalsciencesvol.99:proteincompositionanddelivery(macnally,e.j.,ed.marceldekker,newyork,2000)。
用于口服给药的药物组合物包括固体剂型，诸如硬胶囊或软胶囊、片剂、含片、糖锭剂、丸剂、锭剂、粉剂和颗粒剂，而用于口服给药的液体剂型包括溶液剂、乳剂、水性或油性混悬剂、糖浆剂和酏剂，各自包含预定量的活性成分，并且可以包括合适的赋形剂。
旨在用于口服使用的组合物可以根据任何已知的方法制备，并且这样的组合物可以包含选自由甜味剂、调味剂、着色剂和保鲜剂组成的组的一种或多种剂，以提供药学上美观和可口的制剂。
肠胃外给药可以借助注射器，任选笔状注射器通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行。替换地，肠胃外给药可以通过输液泵进行。另一种选择是一种组合物，其可以是以鼻或肺喷雾剂形式给药催乳素受体拮抗剂的溶液或混悬液。作为更进一步的选择，包含本发明化合物的药物组合物还可以适用于透皮给药(例如，通过无针注射或从贴剂，任选地离子电渗贴剂)或透粘膜(例如颊含)给药。
用于肠胃外给药的药物组合物包括无菌水和非水可注射溶液、分散剂、混悬液或乳剂以及在使用前要在无菌可注射溶液或分散液中重构的无菌粉末。
术语“含水组合物”定义为包括至少50％w/w水的组合物。同样，术语“水溶液”定义为包括至少50％w/w水的溶液，术语“水悬浮液”定义为包括至少50％w/w水的混悬液。如果需要，这种水溶液应该被适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖进行等渗。该水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。所用的无菌含水介质均可通过本领域技术人员已知的标准技术容易地获得。可注射的长效制剂也被认为是在本发明的范围内。
当本发明与针对相同疾病状态有活性的第二治疗剂组合使用时，它们可以方便地单独给药或联合给药，以单剂量或多剂量，顺序的或同时的，通过相同的给药途径或通过不同途径。
通常，取决于期望的给药模式，纳米颗粒组合物或药物组合物将包含约0.005％至95％，优选约0.5％至50％按重量计的本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物。包含在组合物中的活性化合物(例如双硫仑或其衍生物)的百分比取决于组合物的特定性质，以及化合物的活性和受试者的需要。溶液中0.01％至90％的活性成分的百分比通常是可用的，而如果组合物是随后将稀释的固体，则其量可以更高。在一些实施方式中，组合物将包括溶液中从1％至50％的活性化合物，例如双硫仑或其衍生物。
根据本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物通常将以有效实现预期结果的量使用，例如以有效治疗或预防所治疗的特定疾病的量。纳米颗粒组合物或药物组合物可以治疗性给药以获得治疗益处。治疗益处是指根除或改善正在治疗的潜在疾患，和/或根除和/或改善与潜在疾患相关的一种或多种系统。不论是否实现改善，治疗益处还包括阻止或减缓疾病的进展。
确切的剂量将取决于给药的频率和方式、所治疗的受试者的性别、年龄、体重和一般状况、所治疗的病症的性质和严重程度以及任何待治疗的伴随疾病以及其他对于本领域技术人员显而易见的因素。有效剂量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内。
当本发明的纳米颗粒组合物或药物组合物与针对相同疾病状态有活性的第二治疗剂组合使用时，每种化合物的剂量可能不同于纳米颗粒组合物或药物组合物单独使用时的剂量。本领域技术人员将容易理解适当的剂量。
在一种优选实施方式中，纳米颗粒组合物或药物组合物将采取单位剂型的形式。例如，纳米颗粒组合物或药物组合物可以设置在小瓶或其他容器中。小瓶或其他容器可以包含以液体、待悬浮的固体、干粉、冻干物形式或任何其它合适形式的纳米颗粒组合物或药物组合物。
应该理解，可应用于本发明的一方面或实施方式的任选特征可以以任何组合和以任意数量使用。此外，它们还可以以任何组合和任何数量与本发明的任何其他方面或实施方式一起使用。这包括但不限于来自任何权利要求的从属权利要求用作本申请权利要求中任何其他权利要求的从属权利要求。
参考以下附图和实验性实施例，将仅通过非限制性实例进一步描述本发明。
附图说明
图1a至图1f显示了plga-双硫仑的体外表征。
图1a示出了plga空纳米颗粒(空np)和plga包封的双硫仑纳米颗粒(plga-dsnp)的扫描电子显微镜图。比例尺对应1μm。
图1b显示了bsa浓度对纳米颗粒尺寸的影响。
图1c显示了bsa浓度对zeta电位的影响。
图1d显示了双硫仑的体外释放曲线。在37℃下在pbs/0.5％吐温80中温育plga-双硫仑。使用hplc在指定时间点测量溶液中双硫仑的浓度。
图1e显示了双硫仑在马血清中的体外半衰期。plga-双硫仑和未包封的游离双硫仑在37℃下在马血清中温育指定长的时间。
图1f显示了马血清中游离双硫仑和plga-双硫仑的体外半衰期。为了测定双硫仑的体外半衰期，将游离双硫仑和双硫仑-plga分散到马血清(100μg/ml)中并在37℃下温育。在血清中游离双硫仑在30秒内迅速降解到不可检测的水平，这甚至比先前公开的数据(4分钟)短得多。
图2a示出了mtt细胞毒性测定的结果。将肝癌细胞系plc/prf/5暴露于游离的双硫仑和plga-双硫仑72小时。n＝3，竖直条代表sd。
图2b示出了mtt细胞毒性测定的结果。将肝癌细胞系huh7暴露于游离的双硫仑和plga-双硫仑72小时。n＝3，竖直条代表sd。
图3a至图3b示出了plga-双硫仑诱导的肝癌细胞系的细胞凋亡。将plc/prf/5和huh7细胞系暴露于空的plga纳米颗粒加cucl2(5μm)或plga-双硫仑纳米颗粒(50nm)加cucl2(5μm)4小时。通过流式细胞术分析测量dna含量。
图3a示出了不同处理组中的亚g1(凋亡)群体的比较。在暴露于双硫仑-plga(50nm)和cucl2(5μm)4小时后，使用流式细胞术分析通过dna含量测定来确认凋亡细胞(亚g1群)。
图3b是图3a的统计分析。柱代表三个测量值的平均值，竖直条代表sd。**p<0.01。
图4a至图4e示出了plga-双硫仑纳米颗粒抑制肝癌细胞系中的癌症干细胞标志物表达。将plc和huh7细胞在正常氧或缺氧条件下培养5天。然后用空plga纳米颗粒加cucl2(5μm)或plga-双硫仑纳米颗粒(20nm)加cucl2(5μm)处理缺氧细胞24小时。使用aldefluor试剂盒和cd133抗体通过流式细胞术测量aldh活性和cd133的表达。暴露72小时后，在正常氧和缺氧培养的hcc细胞系中测定5-fu和索拉非尼的细胞毒性。
图4a示出了代表不同组中aldh活性的点图。
图4b示出了plga-双硫仑纳米颗粒处理组和对照组中aldh阳性细胞的百分比。
图4c示出了代表不同组中cd133阳性细胞的点图。
图4d示出了plga-双硫仑纳米颗粒处理组和对照组中cd133阳性细胞的百分比。
图4e示出了hcc细胞对5-fu和索拉非尼的缺氧诱导化学抗性。暴露72小时后，在正常氧和缺氧培养的hcc细胞系中测定5-fu和索拉非尼的细胞毒性。
图5a至图5d示出了plga-双硫仑纳米颗粒抑制hcc细胞系中的csc标志物和根除hcc细胞系中的克隆发生。
图6a至图6c示出了plga-双硫仑纳米颗粒抑制源自肝癌细胞系的异种移植物的生长。在小鼠的一前侧腹部皮下注射plc/prf/细胞(5×105)。当肿瘤体积达到约200mm3时，将荷瘤小鼠随机分成6组(8只小鼠/组)，例如，对照，cuglu6mg/kg口服；空纳米颗粒+cuglu6mg/kg口服；plga-双硫仑2.5mg/kg静脉注射+cuglu6mg/kg口服；plga-双硫仑5mg/kg静脉注射+cuglu6mg/kg口服；plga-双硫仑10mg/kg静脉注射+cuglu6mg/kg口服。这些药物每周给药3次，持续3周。
图6a示出了来自不同组的异种移植物图像。5mg/kg和10mg/kgplga-双硫仑处理后，一个和两个异种移植物分别完全消失。
图6b示出了肿瘤尺寸的生长曲线。
图6c示出了药物治疗结束时的肿瘤重量。
图7示出了plga-双硫仑纳米颗粒(10mg/kg)加cuglu(6mg/kg)对hcc异种移植物中ki67、bax、nfκb和aldh的蛋白质表达的体内作用(放大倍数400)。
图8示出了在双硫仑-plga纳米颗粒和cuglu处理的小鼠的重要器官中未观察到毒性。双硫仑-plga纳米颗粒加cuglu处理的小鼠中肺、肝和肾的代表性典型组织病理学图像。(h&e染色，放大倍数400)。
图9示出了双硫仑-plga在颅内胶质母细胞瘤模型中的作用。用0.6ml包含水合氯醛(7μl/g)的原液腹腔注射麻醉babl/c裸鼠(5至6周龄)。手术部位剃毛并使用70％乙醇和含碘溶液进行准备。颅内注射是在顶页中线位置右偏向和后偏向的双外眼角连接交点0.5cm处进行的。使用25μl微型注射器钻将u87-萤光素酶-gfp细胞(5μlpbs中2×105个)递送至0.5cm深度。10天后，用双硫仑-plga(10mg/kg静脉注射)加葡萄糖酸铜(6mg/kg口服)处理动物每周3次，持续4周。
图9示出了生物发光图像。
图9b示出了用h&e染色的脑切片。
图10示出了双硫仑-plga对皮下胶质母细胞瘤模型的作用。将u87mg细胞(5×106个/小鼠)注射到babl/c裸鼠(5至6周龄)的前侧腹部。10天后，用双硫仑-plga(10mg/kg静脉注射)加葡萄糖酸铜(6mg/kg口服)处理动物每周三次，持续4周。
图10a示出了皮下异种移植物的形态。
图10b示出了肿瘤重量。
图11示出了通过tunel染色检测异种移植物中的凋亡细胞(箭头)。(放大倍数100)。
图12示出了plga-双硫仑纳米颗粒(10mg/kg)加cuglu(6mg/kg)对胶质母细胞瘤异种移植物中nfκbp65、ki67和aldh的蛋白质表达的体内作用(放大倍数400。
图13示出了在双硫仑-plga纳米颗粒和cuglu处理的小鼠的重要器官中未观察到毒性。示出双硫仑-plga纳米颗粒加cuglu和plga空纳米颗粒处理的小鼠中肺、肝、脾、脑和肾的代表性典型组织病理学图像。(h&e染色，放大倍数400)。
图14示出了在对照小鼠中肿瘤占据了大部分肺组织。相反，从处理的小鼠中解剖的肺中未检测到肿瘤结节。将a549非小细胞肺癌(nsclc)细胞(5×106个/小鼠)注射到尾静脉。3天后，每隔4周用双硫仑-plga5mg/kg静脉注射+cuglu5mg/kg口服或plga空纳米颗粒处理小鼠。4个月后，处死小鼠，解剖肺并切片。载玻片经h&e染色。照片以放大倍数20拍摄。
具体实施方式
现在总体描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解，列入实施例仅为了说明本发明的某些方面和实施方式的目的，且不旨在以任何方式限制本发明。
材料和方法
材料
hcc细胞系huh7和plc/prf/5购自atcc(middlesex,英国)。双硫仑、5-氟尿嘧啶(5-fu)、索拉非尼、氯化铜(ii)(cucl2)、葡萄糖酸铜(cuglu)，聚(乳酸-co-羟基乙酸)(plga)、聚醋酸乙烯酯、二苯基二硫代氨基甲酸氰甲酯(pva)、二氯甲烷购自sigma(dorset,英国)。dmem培养基和胎牛血清(fcs)由英国lonza，wokingham提供。ki67和bax抗体购自cellsignaling。nfκbp65和aldh1抗体来自abcam。索拉非尼购自biovision(ca,美国)。
负载双硫仑的plga纳米颗粒的制备和纳米颗粒的表征
通过乳液-溶剂蒸发法制备负载双硫仑的纳米颗粒。将plga(200mg)(丙交酯:乙交酯为50:50)和双硫仑(20、40、50、100或150mg)溶于10ml二氯甲烷中，然后与20ml2.5％pva水溶液混合。该混合物通过涡旋均化1分钟，然后使用设定为70％功率输出的微尖探针超声仪(microtipprobesonicator)(xl2002
检测plga包封的双硫仑纳米颗粒的平均纳米颗粒尺寸、分布和zeta电位。将样品分散在蒸馏水或盐水(0.154m和0.308mnacl溶液)中，并使用zetasizer(zs90,malvern,英国)在25℃下以90°的散射角通过动态光散射(dls)测量。
使用高分辨率扫描电子显微镜(jeoljsmt330a)进行扫描电子显微。将一滴纳米颗粒样品装在金属短柱上，并使用spi模块溅射涂布机系统通过15ma电流溅射60秒，涂覆金/钯薄膜。图像是在15kv的加速电压下获得的。
测量双硫仑体外半衰期
在包含300μl马血清的离心管中加入游离的双硫仑或双硫仑-plga(100μl，浓度为3mg/ml)，在37℃下振荡。收集离心管并通过在不同时间间隔加入300μl无水甲醇沉淀蛋白质。然后对上清液进行hplc测量。
双硫仑-plga的累积释放
在含有0.5％吐温80的0.1m磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph7.4)中于37℃下测量双硫仑-plga的累积释放曲线。将10mg双硫仑-plga悬浮于25mlpbs-tween溶液中，同时在37℃下连续摇动(100rpmmin-1)。在指定的时间间隔，收集500μl释放介质用于经hplc测定含量，并补充等体积的新鲜培养基。
测量包封效率和载药含量
使用hplc通过设置在275nm的uv检测(shimadzulc-20)测定未包载的双硫仑的量。流动相为甲醇:水(70:30％)的混合物，流速设定为1ml/min。使用phenomenexc18柱(250mm×4.6mm，5μm)实现分离。在溶解于二氯甲烷之后测定包载在纳米颗粒中的双硫仑的量。二氯甲烷在室温下蒸发后，将双硫仑溶于纯甲醇中。在通过hplc进行测量之前，将上清液通过膜过滤器(孔径0.22μm，millipore)。
检测aldh活性
按照供应商的说明书，通过aldefluor试剂盒(stemcelltech.,durham，nc，美国)检测aldh阳性群体。在包含测定缓冲液的aldh底物中在37℃下染色30分钟后对细胞(2.5×105)进行分析。用二乙氨基苯甲醛(deab)(一种特定的aldh抑制剂)处理阴性对照。使用具有488nm蓝色激光器和标准fitc530/30nm带通滤波器的facscalibur流式细胞仪检测阳性染色的群体。
流式细胞仪分析cd133表达
将细胞(2.5×105)与cd133抗体(bdpharmingen,oxford,英国)在4℃下温育30分钟。用2％fcshbss(sigma)洗去未结合的抗体，并在bdfacscalibur上染色后不超过1小时检测细胞(10,000个事件)。
流式细胞术检测细胞凋亡
用dna含量测定细胞凋亡。将细胞(1×106)暴露于空的plga纳米颗粒加cucl2(5μm)或plga-双硫仑纳米颗粒(50nm)加cucl2(5μm)4小时并通过胰蛋白酶消化收获。将细胞在70％乙醇中固定，然后与rna酶a(100μg/ml)和碘化丙锭(2.5mg/ml)一起温育30分钟。通过facsscan(bectondickinson,franklinlakes,nj,美国)收集每个样本中10,000个细胞的dna含量数据，并使用cellquest软件(bdbiosciences,oxford,英国)进行分析。
plga-二硫仑对hcc细胞系的体外细胞毒性
将plc/prf/5和huh7hcc细胞系培养在补充有10％fcs、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的dmem(lonza,wokingham,英国)中。将96孔平底微量滴定板中过夜培养的细胞(5,000个/孔)在正常氧或缺氧条件下暴露于指定浓度的药物(游离双硫仑、plga-双硫仑纳米颗粒、5-fu和索拉非尼)中72小时，并进行标准的mtt测定(plumb等人，1989)。
肝癌异种移植实验
五周龄雌性balb/cnu/nu无胸腺裸鼠(biotechology&cellbiologyshanghai,中国)在无病原体条件下饲养。在小鼠的一前侧腹皮下注射plc/prf/5细胞(5×105)。当肿瘤体积(v)达到约200mm3时，将荷瘤小鼠随机分为6组(8只小鼠/组)，并且每周处理3次，例如，对照，葡萄糖酸铜(cuglu)6mg/kg口服；空纳米颗粒+cuglu6mg/kg口服；plga-双硫仑2.5mg/kg静脉注射+cuglu6mg/kg口服；plga-双硫仑5mg/kg静脉注射+cuglu6mg/kg口服；plga-双硫仑10mg/kg静脉注射+cuglu6mg/kg口服。通过以下公式计算肿瘤体积：v＝(l×w2)×0.5，其中l是肿瘤长度，w是肿瘤宽度。每周3次观察异种移植物尺寸并记录，持续3周。3周后处死动物。取出肿瘤和重要器官(肺、肝和肾)，照相并进行进一步分析。
克隆发生测定
将过夜培养的细胞(5×104)暴露于与或不与5-fu(500μm)或索拉非尼(50μm)组合的双硫仑(1μm)/cucl2(1μm)6小时。收集细胞并在包含无药物培养基的6孔板中以103/孔的细胞密度继代培养。培养10天后，通过计数含有至少50个细胞的集落来测定克隆发生细胞。
通过ci等效线图分析5-fu+双硫仑-plga/cu和索拉非尼+双硫仑/cu的组合效应
将过夜培养的细胞暴露于不同浓度的5-fu、索拉非尼、双硫仑-plga/cu1μm或以5-fu和索拉非尼:双硫仑的恒定比例分别＝1000:1和100:1的5-fu/双硫仑/cu1μm组合或索拉非尼/双硫仑/cu1μm组合。将细胞暴露于双硫仑/cu72小时并进行如上所述的mtt分析。检测单种和两种药物处理细胞的ic50。使用calcusyn软件(biosoft,cambridge,英国)(chou&talalay,1984)通过ci等效线图分析分析5-fu/双硫仑/cu1μm和索拉非尼/双硫仑/cu1μm的组合细胞毒性。组合指数(ci)由互斥方程测定。
h&e染色
石蜡包埋的样品载玻片脱石蜡、水化，然后用苏木精染色1分钟。漂洗后，将载玻片用曙红染色1分钟，然后进行再一次漂洗步骤。用permount(fishersci,loughborough,英国)将盖玻片放置到载玻片上。
免疫组化
石蜡包埋肿瘤和正常组织。脱石蜡和再水化后，用3％过氧化氢阻断载玻片内源性过氧化物酶，与一抗(ki67，1:200；bax，1:200；nfkbp65，1:200；aldh1，1:200)一起温育，然后与生物素化二抗，抗小鼠免疫球蛋白g(h+l)一起温育，随后在abc试剂(亲和素和生物素化辣根过氧化物酶复合物，dakolabs,cambridgeshire,英国)中温育。用3,3'-二氨基联苯胺固定载玻片并在显微镜下观察。
统计学分析
使用student'st检验评估治疗结果的统计显著性；在所有分析中p<0.05被认为是统计学显著的。
结果和讨论
双硫仑-plga纳米颗粒的配方和表征
通过如上文材料和方法部分所述的乳液溶剂扩散方法制备双硫仑-plga纳米颗粒。当双硫仑与plga的进料比为1:2(w/w)时，制备的纳米颗粒空plga和双硫仑-plga具有窄尺寸分布(分别为131.8±6.9和136.2±6.2nm(表1))并且zeta电位为-22.3±0.8和-21.7±0.96mv(图1)。
表1.超声处理时间对纳米颗粒尺寸的影响
通过进行如上文材料和方法中所述的扫描电子显微镜评估纳米颗粒的表面形态。扫描电子显微镜(sem)图像显示双硫仑-plga纳米颗粒呈类球形(图1a)。双硫仑plga纳米颗粒显示高包封效率(78.92±2.16％)，载药含量为(27.67±3.47％)。
表2.plga：双硫仑比例对dlc和ee的影响
dlc：载药含量；ee：包封效率。选择2:1的plga:双硫仑比例用于进一步的实验。
纳米颗粒的稳定性和释放曲线能够显著影响药物活性。为了测定血清对双硫仑稳定性和释放的影响，将双硫仑-plga纳米颗粒在37℃下在1％、5％和10％bsa溶液中温育。在不同的时间间隔检测双硫仑的浓度。颗粒尺寸以时间和bsa浓度依赖性方式增加(图1b和图1c)。在bsa溶液中温育24小时后，还检测了双硫仑-plga纳米颗粒的zeta电位。在bsa的生理浓度(5％)下，双硫仑-plga纳米颗粒维持至少8小时的粒径(162nm)和24小时的zeta电位(-15.8mv)。双硫仑-plga纳米颗粒显示出非常好的分散性。在37℃下0.5％tween80pbs溶液(ph7.4)中进行7天的累积药物释放(图1d)。结果证明在7天内从plga纳米颗粒非常稳定和持续的双硫仑释放。大约20％的双硫仑在24小时内释放并且在第4天达到40％的释放，其保持到第7天实验结束。
双硫仑的体外半衰期
为了测定双硫仑的体外半衰期，将游离双硫仑和双硫仑-plga分散到马血清(100μg/ml)中并在37℃下温育。在血清中游离双硫仑在30秒内迅速降解到不可检测的水平(图1e)。相反，双硫仑在2分钟开始从其plga纳米颗粒的释放，这相当于初始载药含量的34.23±3.38％，并且在4分钟内达到峰值，为初始载药含量的51.27±5.98％。控制释放持续至少24小时。双硫仑-plga在血清中的半衰期大约为6小时(图1f)。重要的是，温育4小时后，血清中双硫仑的浓度仍然保持在约90μm，这明显高于广泛癌症类型(约50-500nm)中双硫仑的ic50s。
双硫仑-plga纳米颗粒的体外细胞毒性
使用mtt分析在plc/prf/5和huh7hcc细胞系中检测双硫仑-plga的细胞毒性，并与游离双硫仑比较。在所有的实验中补充了cucl2(1μm)，因为它对双硫仑的细胞毒性是必不可少的[9,16]。图2显示双硫仑-plga的体外细胞毒性作用与游离双硫仑相当。双硫仑-plga和游离双硫仑的ic50s非常相似(p>0.05)。
plga-双硫仑诱导肝癌细胞系的细胞凋亡
研究了双硫仑-plga纳米颗粒温育后肝癌细胞plc/r7和huh7细胞的细胞凋亡。细胞处理4小时。通过流式细胞术分析评估凋亡细胞(在细胞周期中的亚g1区)。如图3所示，在对照组中，在亚g1部分中plc/r7或huh7细胞的百分比非常低(2.47％或3.31％)，与用空纳米粒和1μmcu2+处理的那些(2.58％或3.14％)相比差异不显著，说明空plga纳米颗粒的生物相容性并且1μm的cu2+对肝癌细胞无毒性。然而，当用50nm双硫仑-plga和1μmcu2+处理时，大量细胞(15.68％或44.47％)进入亚g1期，表明双硫仑-plga显著诱导了肝癌细胞的细胞凋亡。
在hcc细胞系中缺氧诱导的csc特点和常规抗癌药物化学抗性
缺氧培养的plc/prf/5和huh7细胞中aldh活性增强和cd133表达提高说明缺氧环境使csc群体增大(图4a和图4b)。在缺氧条件下，hcc细胞系对5-fu和索拉非尼显著耐受(图4c和图4d)。cscs对传统抗癌药物具有抗性，并成为肿瘤复发的来源[5]。cscs位于缺氧/坏死的肿瘤区域，称为csc生态位。
双硫仑-plga抑制hcc细胞系中csc标志物的表达和根除hcc细胞系中克隆发生。
检测了双硫仑-plga对hcc细胞系中缺氧诱导的csc标志物的影响。hcc细胞与浓度为20nm的双硫仑-plga和1μm的cucl2一起温育24小时显著减少plc/prf/5和huh7细胞系中的aldh+和cd133+细胞群(图5a和图5b)，表明双硫仑-plga对缺氧诱导的csc群体的充分抑制作用。进行克隆发生测定以检测双硫仑-plga/cucl2诱导hcc细胞系中“繁殖死亡(reproductivedeath)”的能力。将单层培养的plc/prf/5和huh7细胞暴露于5-fu(200μm)、索拉非尼(20μm)、cucl2(1μm)、双硫仑-plga(200nm)或双硫仑-plga(200nm)加cucl2(1μm)6小时。收集处理的细胞并在含有无药物培养基的6孔板中以500细胞/孔的细胞密度继代培养10天。在对照组与5-fu、索拉非尼和cucl2处理组比较时，没有观察到集落数量的显著差异(图5c和图5d)。相反，双硫仑-plga/cucl2处理组中的集落在两种细胞系中被完全根除。因此，双硫仑-plga/cucl2具有消除hcc细胞系中繁殖的能力，典型的csc特点。没有补充铜时，hcc细胞系中的集落形成能力不受暴露于双硫仑-plga的影响，这表明铜对于双硫仑-plga在hcc干细胞中的毒性是必不可少的。
使用ci等效线图法检测双硫仑-plga/cu和5-fu或索拉非尼的组合效应。表2显示通过组合双硫仑-plga显著增强了5-fu和索拉非尼的细胞毒性。ci-等效线图表明5-fu、索拉非尼和双硫仑-plga之间非常显著的协同组合效应。
表2.5-fu、索拉非尼、ds-plga、5-fu/ds-plga和索拉非尼/ds-plga在hcc细胞系中的细胞毒性
图分别是ic50s和ci值。括号中的数字是sd。n＝3。ci值：0.9-1.1累加效应；0.8-0.9轻微的协同作用；0.6-0.8中度协同作用；0.4-0.6协同作用；0.2-0.4强协同作用。
双硫仑-plga纳米颗粒的体内抗肿瘤活性
为了评估体内抗肿瘤活性，将2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg双硫仑-plga纳米颗粒静脉内注射到荷hcc异种移植物小鼠的尾静脉中。与对照组相比，5mg/kg和10mg/kg双硫仑-plga两者均显著抑制肿瘤大小和肿瘤重量(图6a和图6b)。单独的铜对肿瘤生长没有影响。观察到的结果显示plga包封保护了双硫仑免受血流中的酶降解。
通过双硫仑-plga/cu处理诱导hcc异种移植物中bax的表达表明由双硫仑-plga/cu诱导的体内凋亡效应。异种移植物中ki67表达的抑制表明双硫仑-plga/cu处理的抗增殖活性。双硫仑-plga/cu处理抑制hcc异种移植物中nfκbp65和aldh的表达(图7)。双硫仑-plga/cu处理显示出高癌症特异性。在对照组和处理组之间没有观察到显著的体重差异(图6c)。在重要器官中未观察到细胞毒性作用，例如肺、肝和肾(图8)。
双硫仑-plga在颅内胶质母细胞瘤模型中的抗癌功效
研究了双硫仑-plga在原位胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌模型中的抗癌功效。图9显示双硫仑-plga对颅内胶质母细胞瘤模型的影响。用0.6ml含有水合氯醛(7μl/g)的原液腹腔注射麻醉babl/c裸鼠(5至6周龄)。手术部位剃毛并使用70％乙醇和含碘溶液进行准备。颅内注射是在顶页中线位置右偏向和后偏向的双外眼角连接交点0.5cm处进行的。使用25μl微型注射器钻将u87-萤光素酶-gfp细胞(在5μlpbs中2×105个)递送至0.5cm深度。10天后，用双硫仑-plga(10mg/kg静脉注射)加葡萄糖酸铜(6mg/kg口服)处理动物每周3次，持续4周。生物发光图像显示，4周后，所有对照小鼠均形成渗入脑组织主要部分的颅内胶质母细胞瘤(图9a顶部图组)。相反，处理组中的肿瘤体积显著减小或消失(图9a的底部图组)。生物发光图像进一步被组织化学染色证实(图9b)。
双硫仑-plga在皮下胶质母细胞瘤模型中的抗癌功效
研究了双硫仑-plga在皮下胶质母细胞瘤小鼠模型中的抗癌功效。将u87mg细胞(5×106个/小鼠)注射到babl/c裸鼠(5至6周龄)的前侧腹部。10天后，用双硫仑-plga(10mg/kg静脉注射)加葡萄糖酸铜(6mg/kg口服)处理动物每周三次，持续4周。图10显示双硫仑-plga处理也显著抑制皮下肿瘤生长。图11显示通过tunel染色(箭头，放大倍数100)检测异种移植物中的凋亡细胞。图12显示体内plga-双硫仑纳米颗粒(10mg/kg)加cuglu(6mg/kg)显著抑制gbm异种移植物中nfκbp65、ki67和aldh的蛋白质表达(放大倍数400)。
双硫仑-plga在原位非小细胞肺癌(nsclc)模型中的抗癌功效
将a549nsclc细胞(5×106个/小鼠)注射到balb/c裸鼠的尾静脉中。3天后，用双硫仑-plga5mg/kg静脉注射+cuglu5mg/kg口服或plga空纳米颗粒处理小鼠，每隔4周每周2次。该实验进行了4个月。4个月后，处死小鼠，解剖肺并切片。载玻片经h&e染色。照片以放大倍数20拍摄。图13示出了在对照小鼠中肿瘤占据了大部分肺组织。相反，从处理的小鼠中解剖的肺中未检测到肿瘤结节。
在双硫仑-plga纳米颗粒和cuglu处理的小鼠的重要器官中没有观察到毒性。图14显示了在双硫仑-plga纳米颗粒加cuglu和plga空纳米颗粒处理的小鼠中肺、肝、脾、脑和肾的代表性典型组织病理学图像。(h&e染色，放大倍数400)。
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