本申请主张于2015年12月15日提交的美国临时申请号62/267,676和于2016年6月13日提交的美国临时申请号62/349,538的权益，上述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
政府支持
本发明是在由国立卫生研究院颁发的合同号为ca199081的政府支持下做出。政府享有本发明的某些权利。
序列表
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本发明大体上涉及用于在不同淋巴引流途径之间进行图形地区分的方法，以及用于例如在外科手术期间在不同组织(例如，神经，例如，甲状旁腺)之间进行图形地区分的方法。更具体地，在某些实施例中，本发明涉及了反向淋巴多路定位、用于在外科手术期间区分淋巴结例如以避免发生淋巴水肿或鉴定在淋巴水肿的治疗过程中要移植的淋巴结的多路实时方法。此外，在某些实施例中，本发明涉及了用于神经重建和其它外科手术的神经之间(例如，感觉与运动)的视觉区分。
背景技术：
神经退化降低了外科医生识别手术区内的神经结构的能力，这可能使外科手术修复工作变得复杂和/或造成限制。例如，由癌症切除造成的慢性神经切除损伤引起单侧肌肉麻痹，其限制了运动并且造成功能障碍(即，丧失眨眼反射)。对神经的外科重建可以重建功能。合适的重建方法的选择取决于在受伤后的缺陷定位和定时间隔。
例如，在外科手术后的医源性神经损伤是高度病态的并发症，其常引起永久残疾。如果涉及到了运动神经，医源性神经损伤就可能会引起瘫痪，或如果涉及到了感觉神经，就可能会引起感觉丧失或严重慢性疼痛。如果外科医生可更好地观察手术区中的神经，那么就可显著降低这些并发症的风险。例如，腮腺切除术后临时或永久面部麻痹的发生率分别高达45％和17％(《颅颌面外科手术杂志(jcraniomaxillofacsurg.)》2015年1月15日，pii:s1010-5182(15)00012-8，[在付印之前以电子文档公开]《全保守腮腺切除术与腮腺良性肿瘤的浅表腮腺切除术的治疗效果的比较：系统性综述(comparisonoftheeffectoftotalconservativeparotidectomyversussuperficialparotidectomyinmanagementofbenignparotidglandtumor:asystematicreview)》elfolha,beheirimj,zaqriwa)。
使面部肌肉有力量的面部神经分支较小并且延伸穿过腮腺，从而使神经易损伤。由于面部神经分支在颜色上与周围组织类似，因此这些神经可能难以识别，尤其是在有血的情况下。通过使用具有缀合到运动神经特定的抗体片段(例如，chat)的染料的局部试剂和缀合到所有神经特定的抗体片段(例如，nbp)的不同的着色染料，外科医生不仅能够清楚识别神经，而且也还能够区分必须保留的关键运动神经和可以牺牲的感觉神经。然而，缀合到运动神经或所有神经特定的抗体片段的染料受到这些组合物向外科医生提供的可见度、以及这些组合物的被所述类型的神经组织吸收的可选择性限制。
手部外科手术是其中识别运动神经与感觉神经(特别地是在进行神经转移时)很重要的另一应用。例如，正中神经有不同的运动单位和感觉单位。当尝试用神经移植物修复受损神经或使用神经的一部分来提高弱肌肉群的力量时，选择合适的运动束或感觉束是关键的。这当前通过基于形貌特征推测这些束的可能位置来执行，但最终地，外科医生无法确定。
另外，通常执行面部复苏手术以治疗面部麻痹并且涉及肌肉和神经的移植。这些高技术性病例需要成功清晰地看到和区分感觉神经和运动神经。
此外，血管化淋巴结移植涉及将淋巴结从身体的一部分转移到患淋巴水肿的患肢或在发展为淋巴水肿的压倒性的风险下的患者。此过程的一个重大挑战是，当从颈部、腋窝或腹股沟收集淋巴结时可能导致淋巴水肿。已经尝试用于进行淋巴结转移来治疗淋巴水肿的反向淋巴定位技术。然而，这些技术依赖放射性同位素(例如，锝硫胶体)来使用γ探针(例如，产生音频信号的盖革计数器样装置)而识别对四肢引流的淋巴结。使用这些技术的靶淋巴结是使用吲哚菁绿染料定位的，该染料不是特定的并且自由地泄漏到手术区中，从而模糊治疗所需的图像。
已描述了使用锝和蓝色染料的反向定位用于在乳腺癌治疗过程中去除腋窝淋巴结。在这种情况下，乳房外科医生必须唯一地依靠锝来识别乳腺的前哨淋巴结，其灵敏度低于组合的染料和锝并且可能具有将会造成在患者体内留下转移性淋巴结的假阴性的严重后果。
类似地，神经退化降低了外科医生识别手术区内的神经结构的能力，这使外科手术修复工作变得复杂和/或造成限制。例如，由癌症切除造成的慢性神经切除损伤引起单侧肌肉麻痹，其限制了运动并且造成功能障碍(即，丧失眨眼反射)。对神经的外科重建可以重建功能。合适的重建方法的选择取决于在受伤后的缺陷定位和定时间隔。然而，不存在容易地提供在不同神经之间的视觉区分的技术。外科医生在外科手术期间难以看到神经组织，并且在外科手术期间不正确地切割或损伤神经可能会对患者产生终身不利影响。
因此，需要具有增强的选择性的组织结合的试剂(神经结合的试剂)以在此类手术期间对不同类型的组织(例如，不同类型的神经)(例如运动神经与感觉神经)进行区分。此外，需要在外科手术期间区分关键神经运动分支与感觉神经运动分支以促成确定在外科手术期间哪个神经或其部分可被牺牲。
此外，仍然需要用于淋巴定位的灵敏、多路实时方法，例如，以便促成在淋巴水肿的外科手术治疗中的淋巴结转移。另外，在外科手术过程期间区分不同类型的神经(例如，运动神经与感觉神经)的需要是至关重要的。
技术实现要素：
如本文所述，不同染料可附着于组织结合的肽(例如，神经结合的肽，例如甲状旁腺结合的肽)和/或结合到肽官能化纳米颗粒(例如，具有小于30nm、小于20nm、小于10nm的直径的超小颗粒；例如c或c'点)内以容许针对“有标签的”各种组织(例如，神经)结构的基于荧光的多路测定。所使用的呈其天然形式或附着于颗粒的环状(或线性)肽的序列和/或构象可针对不同组织和/或神经类型来调整，例如，以使得能够在外科手术期间对神经类型进行视觉区分(例如，不同的神经类型具有不同颜色)。这在各种神经修复外科手术(例如，面部下垂外科手术)期间是重要的，其中外科医生试图找到要移植到受影响的区域(“不良侧”)的正常神经片段(“良侧”)。很少有外科医生可执行这些类型的外科手术，因为难以区分移植所需的特定类型的神经组织。神经结合的肽(和/或荧光颗粒)组合物将通过允许对特定神经组织类型的视觉区分来促进/简化此类外科手术。
此外，本文描述一种多路平台，所述多路平台使用超小纳米颗粒(例如，c点和c'点)来图形地区分用于神经移植和其它外科手术的特定神经(例如，感觉神经与运动神经)。本文还描述了一种多路平台，其使用超小纳米颗粒(例如，c点和c'点)来在不同类型的淋巴结和/或淋巴途径之间进行图形地区分，从而例如在治疗淋巴水肿过程中安全且有效地执行带血管淋巴结移植。
例如，本文称为“反向淋巴多路定位(rlmm)”的技术使用在两个不同波长下发出荧光的超小纳米颗粒(例如，c点和/或c'点)。在某些实施例中，rlmm允许外科医生以图形地区分对四肢引流的淋巴结和对肿瘤部位引流的淋巴结的方式来定位淋巴结。这种增强的可视化允许外科医生避免可能引起淋巴水肿的关键的淋巴结损伤。此外，使用这些超小纳米颗粒的rlmm可以用于在淋巴水肿治疗过程中安全地执行血管化淋巴结移植(例如，以识别适合移植的淋巴节)。例如，可以用使用不同颜色的染料的纳米颗粒识别对躯干引流的用于淋巴结采集的靶向淋巴结，从而允许外科医生仔细挑选将不影响相邻肢体的引流的淋巴结。此技术允许在淋巴结移植过程中安全地采集淋巴结以免发生淋巴水肿。
关于rlmm的外科技术在肿瘤切除和淋巴结清扫以及淋巴结移植中相当类似，差别在于注射位置。对于肿瘤去除和淋巴结清扫，一种颜色的纳米颗粒被注射到肿瘤部位中，这将照射靶向去除的淋巴结。然后，具有不同颜色的纳米颗粒在发生淋巴水肿风险下被注射到相邻肢体中。关键的淋巴管和淋巴结以对比色被强烈地照射，从而允许外科医生清晰地观察这些淋巴结并且避开它们来最小化医源性淋巴水肿风险。对于淋巴结移植，唯一差别是第一次注射是在引流靶向采集的淋巴结的的躯干中。(达扬(dayan)等人，“《反向淋巴定位：用于最大化血管化淋巴结转移的安全性的新的技术(reverselymphaticmapping：anewtechniqueformaximizingsafetyinvascularizedlymphnodetransfer)》”，《整形修复外科手术(plastreconstrsurg.)》，2015年1月；135(1)：277-85)。在没有此技术的情况下，外科医生确定哪些淋巴结可安全地去除和哪些可能导致永久残疾是有挑战性的。
例如，患有需要进行腋窝淋巴结患者去除的特定癌症的接受第一类型的c点的第一次注射，第一类型的c点在第一光谱上不同的波长下发出荧光，其中第一次注射被注射到肿瘤部位中或肿瘤部位附近。患者还接受第二类型的c点的第二次注射，第二类型的c点的在与第一波长光谱上不同的第二波长处发出荧光，其中第二次注射被注射到四肢(例如，肿瘤部位附近的上肢或下肢)，如果影响该四肢的淋巴引流途径受到该途径的淋巴结移除的干扰，那么这将可能会受淋巴水肿的影响。例如，在黑素瘤的情况下，第一注射部位可以在黑素瘤部位处(例如，在躯干、腹部、骨盆上)，而第二部位将会在有可能受影响的四肢处。例如，在乳腺癌的情况下，第一注射部位可以是胸腔；在妇科癌症的情况下，第一注射部位可以是骨盆区域。第二次注射然后将会有可能受淋巴水肿的影响的四肢中。通过避免去除引流淋巴结，能够区分第一类型和第二类型的c点降低了四肢发生淋巴水肿的风险。
例如，需要去除腋窝淋巴结的乳腺癌患者具有注射到乳房中的发出绿色荧光的一种类型的c点(例如，其中荧光团是颗粒本身的一部分或附着于与颗粒或以其它方式与颗粒相关联)。发出蓝色荧光(或以其它方式与第一c点光谱上区分)的另一c点被注射到可能受影响的四肢(例如，下肢或上肢)(例如在肿瘤部位附近的四肢)中。例如，当去除腋窝淋巴结时，外科医生可专门地仅去除对乳房引流的绿色淋巴结，并且避开对上肢引流的蓝色淋巴结。成像技术可作为外科手术的一部分来执行，或可以被执行来用于术前成像。此技术可针对其中淋巴结被去除或移植的任何癌症执行。
又如，rlmm允许外科医生降低涉及神经的手术风险和神经损伤的后果，特别地是面部神经损伤。例如，将具有促成(至少暂时)纳米颗粒与运动神经结合的配体的第一类型的纳米颗粒施用给患者，并且将具有促成纳米颗粒与感觉神经结合的配体的第二类型的纳米颗粒施用给患者，其中第一类型的纳米颗粒和第二类型的纳米颗粒是彼此光谱上可区分的。用于将纳米颗粒结合到特定神经类型的配体的实例在美国临时申请号62/267,676“《包括环状肽的组合物及其在外科手术过程期间用于神经组织的视觉区分的用途(compositionscomprisingcyclicpeptides,anduseofsameforvisualdifferentiationofnervetissueduringsurgicalprocedures)》”中进行描述，该申请随附在此并且其全文以引用的方式并入本文。在外科手术期间，运动神经发出一种颜色(例如，绿色)的荧光，而感觉神经则发出另一颜色(例如，蓝色)的荧光，从而为外科医生提供了识别不同神经和/或避免切割某些神经的增强的能力。所述技术在外科手术环境和非外科手术(例如，术前成像)环境两者中可能是有用的。
本申请中描述的rlmm技术维持高敏感性，并且降低在这些过程期间引起淋巴水肿或影响另外神经的风险。
在一方面，本发明针对了一种方法，其包括：向淋巴系统施用两种或更多种不同的探针物种，每种探针物种包括光谱上可区分的荧光报道体；以及将激发光导引到淋巴结中，由此激发具有光谱上可区分的发射波长的所述荧光报道体。
在某些实施例中，所述施用包括静脉内施用两种或更多种不同的探针物种。在某些实施例中，所述两种或更多种不同的探针物种包括纳米颗粒。在某些实施例中，将至少第一探针施用给肿瘤部位，并且将至少第二探针施用给将有可能受淋巴水肿影响的四肢。在某些实施例中，所述肿瘤部位包括选自由以下组成的群组中的成员：乳房、躯干、腹部、骨盆和胸腔。在某些实施例中，所述四肢包括选自由以下组成的群组中的成员：上肢和下肢。
在某些实施例中，所述激发光包括两种或更多种波长，由此激发所述不同的荧光报道体。
在某些实施例中，所述方法包括识别在淋巴水肿治疗过程中要移植的适当的淋巴结。
在某些实施例中，所述方法包括同时检测光谱上不同的发射波长的荧光，所述检测到的荧光因激发光的照射而已经由所述淋巴结和/或引流途径中的相应的探针物种的所述荧光报道体发射，以便区分接收自每个探针物种的信号。
在某些实施例中，所述方法包括相较已经接收所述激发光的另一探针物种的第二荧光报道体来说，已经接收所述激发光的第一探针物种的所述荧光报道体在光谱上可区分的波长下发出荧光。
在某些实施例中，在显示器上呈现包括所述光谱上可区分的发射波长的信号以图形地区分两种淋巴结和/或引流途径。
在某些实施例中，所述方法包括识别要切除的适当的淋巴结。
在某些实施例中，所述显示器的上部部分显示第一探针物种，并且所述显示器的底部部分显示第二探针物种。在某些实施例中，所述显示器显示所述第一探针物种和所述第二探针物种的叠加图像。
在某些实施例中，所述方法包括显示所述淋巴系统的淋巴结和/或淋巴途径的图，其中所述图图形地区分各个特定淋巴结和/或各个特定淋巴结类型。
在某些实施例中，至少一个淋巴结对所述四肢引流并且至少一个淋巴结对肿瘤部位引流。在某些实施例中，所述肿瘤部位包括选自由以下组成的群组中的成员：乳房、躯干、腹部、骨盆和胸腔。在某些实施例中，一种探针物种的所述荧光报道体指示对所述四肢的引流。在某些实施例中，一种探针物种的所述荧光报道体指示对所述肿瘤部位的引流，由此避开可能引起淋巴水肿的关键的淋巴结。
另一方面，本发明针对了一种方法，其包括：向神经施用两种或更多种不同的探针物种，每种探针物种包括光谱上可区分的荧光报道体；以及将激发光导引到所述神经中，由此激发具有光谱上可区分的发射波长的所述荧光报道体。
在某些实施例中，所述施用包括静脉内施用两种或更多种不同的探针物种。
在某些实施例中，所述两种或更多种不同的探针物种包括纳米颗粒。
在某些实施例中，所述神经包括选自由以下组成的群组中的成员：运动神经和感觉神经。
在某些实施例中，将至少第一探针施用给运动神经，并且将至少第二探针施用给感觉神经。
在某些实施例中，所述激发光包括两种或更多种波长，由此激发所述不同的荧光报道体。
在某些实施例中，所述方法包括识别要神经移植或进行其它外科手术的适当的神经。
在某些实施例中，所述方法包括同时检测光谱上不同的发射波长的荧光，所述检测到的荧光因激发光的照射而已经由所述神经中的相应的探针物种的所述荧光报道体发射，以便区分接收自每个探针物种的信号。
在某些实施例中，所述方法包括相较已经接收所述激发光的另一探针物种的第二荧光报道体来说，已经接收所述激发光的第一探针物种的所述荧光报道体在光谱上可区分的波长下发出荧光。
在某些实施例中，在显示器上呈现包括所述光谱上可区分的发射波长的信号以图形地区分两种或更多种神经。在某些实施例中，所述方法包括识别要切除的适当的神经。在某些实施例中，所述显示器的上部部分显示第一探针物种，并且所述显示器的底部部分显示第二探针物种。在某些实施例中，所述显示器显示所述第一探针物种和所述第二探针物种的叠加图像。
在某些实施例中，所述方法包括显示所述神经的图，其中所述图视觉上区分各个特定神经类型。在某些实施例中，一种神经是感觉神经，并且一种神经是运动神经。在某些实施例中，一种探针物种的所述荧光报道体指示运动神经。在某些实施例中，一种探针物种的所述荧光报道体指示感觉神经，由此区分各个神经类型。
在某些实施例中，所述两种或更多种探针物种包括二氧化硅。在某些实施例中，所述两种或更多种探针物种包括具有二氧化硅体系结构和富含染料的核的纳米颗粒。在某些实施例中，所述纳米颗粒包括c或c'点。在某些实施例中，富含染料的核包括所述荧光报道体。在某些实施例中，所述荧光报道体是近红外或远红色染料。在某些实施例中，所述荧光报道体选自由以下组成的群组：荧光团、荧光物、染料、颜料、荧光过渡金属和荧光蛋白。在某些实施例中，所述荧光报道体选自由以下组成的群组：cy5、cy5.5、cy2、fitc、tritc、cy7、fam、cy3、cy3.5、德克萨斯红、rox、hex、ja133、alexafluor488、alexafluor546、alexafluor633、alexafluor555、alexafluor647、dapi、tmr、r6g、gfp、增强型gfp、cfp、ecfp、yfp、黄水晶、venus、ypet、cypet、amca、光谱绿、光谱橙、光谱浅绿、丽丝胺、铕、dy800染料和licor800染料。
在某些实施例中，使用手持荧光相机系统实时检测和绘制来自所述荧光报道体的所述荧光。
另一方面，本发明针对了一种试剂盒，其包括：多个容器，其中每个容器具有选自由以下组成的群组中的类型：安瓿、小瓶、药筒、贮器、lyo-ject和预填充注射器；第一探针物种，每个第一探针物种包括第一荧光报道体；第二探针物种，每个第二探针物种包括第二荧光报道体，其中所述多个容器中的第一容器容纳所述第一探针物种，并且所述多个容器中的第二容器容纳所述第二探针物种。
在某些实施例中，所述试剂盒用于识别要切除的适当的淋巴结。在某些实施例中，所述试剂盒用于治疗淋巴水肿。在某些实施例中，所述试剂盒用于识别要移植的适当的神经。
在某些实施例中，所述神经包括选自由以下组成的群组中的成员：运动神经和感觉神经。
在某些实施例中，所述第一探针物种和所述第二探针物种包括选自由以下组成的群组中的成员：纳米颗粒、c点和c'点。在某些实施例中，所述第一探针物种和第二探针物种分别地进一步包括第一神经结合的肽和第二神经结合的肽。
在某些实施例中，所述第一神经结合的肽和第二神经结合的肽包括选自由以下组成的群组中的肽序列：肽序列ntqtlakapeht(seqidno:3)、tytdwlnfwawp(seqidno:4)、kslsrhdhihhh(seqidno:5)和dftktsplgih(seqidno:6)。
另一方面，本发明针对了一种成像方法，其包括：将多种组合物施用给受体，每种组合物包括至少一种肽并且允许使所述组合物选择性地结合到所述受体的组织，其中所述多种中的第一组合物包括选择性地结合到第一组织类型的第一肽，并且其中所述多个中的第二组合物包括选择性地结合到第二组织类型的第二肽；将所述受体的组织暴露于激发光；以及检测由所述第一组合物的第一荧光剂和所述第二组合物的第二荧光剂发射的光以产生图像并显示所述图像。
在一些实施例中，所述第一组织类型包括感觉神经组织。在一些实施例中，所述第二组织类型包括运动神经组织。
在一些实施例中，所述第一组织类型包括甲状旁腺组织。
在一些实施例中，所述第一组织类型包括淋巴结。
在一些实施例中，所述暴露是术中执行的。
在某些实施例中，由所述第一荧光剂发射的光具有与由所述第二荧光剂发射的光是视觉上可区分的。在某些实施例中，由所述第一荧光剂发射的光具有与由所述第二荧光剂发射的光是视觉上可区分的。在某些实施例中，由所述第一荧光剂发射的光具有与由所述第二荧光剂发射的光不同的色彩。
另一方面，本发明针对了一种成像方法，其包括：将受体的组织暴露于激发光，其中所述组织包括某种制剂，所述制剂包括已经被施用给所述受体的组织结合的组合物，所述组织结合的组合物优先地结合到特定组织类型；以及检测由所述组合物的荧光剂发射的光，由此视觉上将包括所述组织结合的组合物的所述特定组织类型与周围组织区分开来。
在某些实施例中，所述特定组织类型是神经组织。在某些实施例中，所述特定组织类型是淋巴结组织。在某些实施例中，所述特定组织类型是甲状旁腺组织。
在某些实施例中，所述组织结合的组合物包括：组织结合的肽缀合物，其包括：肽；纳米颗粒；荧光剂；以及连接基部分。
在某些实施例中，所述肽包括α-螺旋结构。在某些实施例中，所述肽包括选自由以下组成的群组中的成员：环状肽和线性肽。在某些实施例中，所述肽包括n-甲基化氨基酸。
在某些实施例中，所述组织结合的肽缀合物包括选自由以下组成的群组中的成员：神经结合的肽缀合物、淋巴结结合的缀合物和甲状旁腺结合的缀合物。
在某些实施例中，中所述成像方法将神经组织从其它组织区分出来。
在某些实施例中，所述组织结合的组合物包括：线性肽或环状肽，所述线性肽或环状肽包括选自由以下组成的群组中的肽序列：tqtlakapeht(seqidno:3)、tytdwlnfwawp(seqidno:4)、slsrhdhihhh(seqidno:5)和dftktsplgih(seqidno:6)。
在某些实施例中，所述组织结合的组合物包括：神经结合的肽缀合物，其包括：线性肽或环状肽组合物，所述线性肽或环状肽组合物包括：荧光剂；以及线性肽或环状肽，所述线性肽或环状肽包括选自由以下组成的群组中的肽序列：ntqtlakapeht(seqidno:3)、tytdwlnfwawp(seqidno:4)、kslsrhdhihhh(seqidno:5)和dftktsplgih(seqidno:6)。
在某些实施例中，所述肽包括选自由以下组成的群组中的成员：抗胆碱乙酰转移酶(抗chat)和抗降钙素基因相关肽。
在某些实施例中，所述组织结合的肽缀合物包括甲状旁腺结合的缀合物并且将甲状旁腺组织与其它组织区分开来。
在某些实施例中，所述肽包括选自由以下组成的群组中的成员：抗甲状旁腺激素(pth)和gata抗体(例如gata1抗体、例如gata2抗体、例如gata3抗体、例如gata4抗体、例如gata5抗体)。
在某些实施例中，所述抗pth靶向具有某个序列的pth蛋白，所述序列包括ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-his-asn-phe(seqidno：1)。
在某些实施例中，所述肽包括gata3抗体。
在某些实施例中，所述施用包括局部施用某种溶液(例如，其中所述溶液包括所述两种或更多种不同的探针物种)(例如，其中所述溶液包括所述多种组合物)(例如，其中所述溶液包括所述制剂)。
在某些实施例中，所述施用包括经由装置(例如，纳米级喷雾装置，例如雾化器装置)将所述溶液局部地沉积到组织。
在某些实施例中，所述装置雾化所述组织结合的组合物的所述溶液(例如，雾化为喷雾)并且以低流速将所述溶液分配到所述组织。
在某些实施例中，所述低流速在约1微升/分钟至约100微升/分钟的范围(例如约10微升/分钟至约75微升/分钟的范围、例如约15微升/分钟至约50微升/分钟的范围)内。
在某些实施例中，所述方法包括调节电源以调节所述溶液中的至少一种组合物的表面(例如，纳米颗粒表面)的电荷，由此更改所述至少一种组合物的组织渗透和/或结合性质。
另一方面，本发明针对了一种用于局部应用所述溶液的装置(例如，纳米级空气喷雾器，例如雾化器装置)，其包括：在标称地较大的管(例如，喷雾器)内的毛细管；空气或气体压力源(例如，其中空气或气体压力是可控制的)；以及泵(例如，蠕动泵，例如注射器泵)。
在某些实施例中，所述泵是可调整的(例如，可调整以将流速控制为从约1微升/分钟至约100微升/分钟)。
在某些实施例中，所述气体压力源施加在约1升/分钟至约20升/分钟(例如，约1psi至约20psi)的范围内的气体压力。
在某些实施例中，所述装置在约25℃至约60℃的温度(例如，可控制的温度)下施用所述溶液。
在某些实施例中，所述较大的管的出口具有在约80μm至约200μm的范围内的直径。
在某些实施例中，电源(例如，其中所述电源(例如，低电压)施加在约0v至约+/-10v的范围内的电压)。
涉及本发明的一个方面(例如，方法)的实施例的要素可应用于涉及本发明的其它方面的实施例，反之亦然。
定义
为了使本公开更容易理解，以下首先定义某些术语。在整个的说明书中阐述以下术语和其它术语的附加定义。
在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。如本申请中所用，术语“包括(comprise)”和该术语的变型(例如“包括(comprising,comprises))并不打算排除其它添加物、组分、整数或步骤。如本申请中所用，术语“约”和“近似”用作等同物。本申请中使用的具有或不具有约/近似的任何数字表示涵盖相关领域的普通技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，除非另有说明或以其它方式从上下文清楚(除非这个数字将会超过可能值的100％)，否则术语“近似”或“约”是指在所陈述参考值的任一方向上(大于或小于)落在25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％内的值的范围。
“施用”：术语“施用”是指将物质或调配物引入受试者中。一般来讲，可以使用任何施用途径，包含例如肠胃外(例如，静脉内)、口服、局部、皮下、腹膜、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻腔、引入脑脊液或滴入体内隔室。在一些实施例中，施用是口服的。另外或可选地，在一些实施例中，施用是肠胃外的。在一些实施例中，施用是静脉内的。在某些实施例中，物质或调配物是经由局部注射与iv施用进行施用。例如，具有含肽的组合物(例如，含颗粒和不含颗粒的组合物)的物质或调配物可以以足够高的浓度被局部注射来用于成像目的。在某些实施例中，含非颗粒肽的组合物经由iv施用。
“生物相容”：如本文所用，术语“生物相容”打算描述在体内不会引起实质上有害的反应的材料。在某些实施例中，如果材料对细胞是无毒的，那么它们是“生物相容”的。在某些实施例中，如果材料在体外添加到细胞造成小于或等于20％的细胞死亡，和/或材料在体内的施用不会引发炎症或其它此类不利效应，那么它们是“生物相容”的。在某些实施例中，材料是生物可降解的。
“生物可降解”：如本文所用，“生物可降解”材料是当被引入细胞中时通过细胞机制(例如，酶促降解)或通过水解成细胞可重新使用或处置而对细胞没有明显毒性效应的组分而分解的材料。在某些实施例中，通过分解生物可降解材料而产生的组分在体内不引发炎症和/或其它不利效应。在一些实施例中，生物可降解材料被酶分解。可选地或另外地，在一些实施例中，生物可降解材料通过水解进行分解。在一些实施例中，生物可降解聚合物材料会分解成其组分聚合物。在一些实施例中，生物可降解材料(包含例如生物可降解聚合物材料)的分解包含酯键的水解。在一些实施例中，材料(包含例如生物可降解聚合物材料)的分解包含氨基甲酸酯键的裂解。
“癌症”：如本文所用，术语“癌症”是指恶性瘤或肿瘤(stedman'smedicaldictionary，第25版；hensly编；williams&wilkins：费城，1990)。示范性癌症包括但不限于：听神经瘤；腺癌；肾上腺癌；肛门癌；血管肉瘤(例如，淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤)；阑尾癌；良性单克隆γ球蛋白病；胆道癌(例如，胆管癌)；膀胱癌；乳腺癌(例如，乳房腺癌、乳房乳头状癌、乳房癌、乳房髓样癌)；脑癌(例如，脑膜瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤)、成神经管细胞瘤)；支气管癌；类癌肿瘤；宫颈癌(例如，宫颈腺癌)；绒毛膜癌；脊索瘤；颅咽管瘤；结缔组织癌；上皮癌；室管膜瘤；内皮肉瘤(例如，卡波西肉瘤、多发性特发性出血性肉瘤)；子宫内膜癌(例如，子宫癌、子宫肉瘤)；食管癌(例如，食道腺癌、巴雷特氏腺癌)；尤因肉瘤；眼睛癌症(例如，眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤)；所熟悉的嗜酸粒细胞增多症；胆囊癌；胃癌(例如，胃腺癌)；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞癌；头颈部癌(例如，头颈部鳞状细胞癌、口腔癌(例如，口腔鳞状细胞癌)、喉癌(例如，喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌))；造血系统癌症(例如，急性淋巴细胞白血病(all)(例如，b细胞all、t细胞all)、急性髓细胞白血病(aml)(例如，b细胞aml、t细胞aml)、慢性粒细胞白血病(cml)(例如，(例如，b细胞cml、t细胞cml)和慢性淋巴细胞白血病(cll)(例如，b细胞cll、t细胞cll))；淋巴瘤诸如霍奇金淋巴瘤(hl)(例如，b细胞hl、t细胞hl)和非霍奇金淋巴瘤(nhl)(例如，b细胞nhl，诸如弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)(例如，弥漫性大b细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(cll/sll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区b细胞淋巴瘤(例如，粘膜相关淋巴组织(malt)淋巴瘤、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤、脾脏边缘区b细胞淋巴瘤)、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、毛细胞白血病(hcl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤和原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤；以及t细胞nhl，诸如前体成t淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、外周t细胞淋巴瘤(ptcl)(例如，皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)(例如，蕈样霉菌病、塞扎里综合征)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、结外自然杀伤t细胞淋巴瘤、肠病型t细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤)；如上所述的一或多种白血病/淋巴瘤的混合物；以及多发性骨髓瘤(mm))、重链疾病(例如，α链病、γ链病、mu链病)；血管母细胞瘤；下咽癌；炎性肌纤维母细胞肿瘤；免疫细胞性淀粉样变性；肾癌(例如，肾母细胞肿瘤(又称wilms肿瘤)、肾细胞癌)；肝癌(例如，肝细胞癌(hcc)、恶性肝细胞瘤)；肺癌(例如，支气管癌、小细胞肺癌(sclc)、非小细胞肺癌(nsclc)、肺腺癌)；平滑肌肉瘤(lms)；肥大细胞增多症(例如，系统性肥大细胞增多症)；肌肉癌；骨髓增生异常综合征(mds)；间皮瘤；骨髓增殖性疾病(mpd)(例如，真性红细胞增多症(pv)、原发性血小板增多症(et)、原因不明的骨髓外化生(amm)(又名骨髓纤维化(mf))、慢性特发性骨髓纤维化、慢性髓细胞白血病(cml)、慢性嗜中性白血病(cnl)、嗜酸性粒细胞增多症(hes)；神经母细胞瘤；神经纤维瘤(例如，神经纤维瘤病(nf)1型或2型、神经鞘瘤病)；神经内分泌癌(例如，胃肠胰神经内分泌肿瘤(gepnet)、类癌肿瘤)；骨肉瘤(例如，骨癌)；卵巢癌(例如，囊腺癌、卵巢胚胎癌、卵巢腺癌)；乳头状腺癌；胰癌(例如，胰腺癌、胰管内乳头状粘液瘤(ipmn)、胰岛细胞瘤)；阴茎癌(例如，阴囊阴茎佩吉特氏病)；松果体瘤；原始神经外胚层肿瘤(pnt)；浆细胞瘤形成；副肿瘤综合征；上皮内肿瘤；前列腺癌(例如，前列腺腺癌)；直肠癌；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；皮肤癌(例如，鳞状细胞癌(scc)、角化棘皮瘤(ka)、黑素瘤、基底细胞癌(bcc))；小肠癌(例如，阑尾癌)；软组织肉瘤(例如，恶性纤维组织细胞瘤(mfh)、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(mpnst)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤)；皮脂腺癌；小肠癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌(例如，精原细胞瘤、睾丸胚胎癌)；甲状腺癌(例如，甲状腺乳头状癌、乳头状甲状腺癌(ptc)、甲状腺髓样癌)；尿道癌；阴道癌；以及外阴癌(例如，外阴佩吉特氏病)。
“载体”：如本文所用，“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的水和油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选地采用了水或水性溶液盐水溶液、以及右旋糖和甘油水性溶液作为载体，特别地是对于注射溶液来说。合适的药物载体在e.w.martin的“《雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》”中进行描述。
“检测器”：如本文所用，“检测器”是指电磁辐射的任何检测器，包括但不限于ccd相机、光电倍增管、光电二极管和雪崩光电二极管。
“图像”：如本文所用，术语“图像”被理解为表示视觉显示或可任何被解释用于进行视觉显示的数据表示。例如，三维图像可以包括在三个空间维度上变化的给定量的值的数据集。三维图像(例如，三维数据表示)可以以二维(例如，在二维屏幕上或在二维打印输出上)显示。术语“图像”可以是指例如光学图像、x射线图像、通过以下方式而产生的图像：正电子发射断层摄影(pet)、磁共振(mr)、单光子发射计算机断层摄影术(spect)和/或超声，以及这些的任何组合。
“肽”或“多肽”：术语“肽”或“多肽”是指通过肽键连接在一起的至少两个(例如，至少三个)氨基酸的串。在一些实施例中，多肽包括天然存在的氨基酸；可选地或另外地，在一些实施例中，多肽包括一或多个非天然氨基酸(即，非天然存在但可结合到多肽链中的化合物；参见例如http://www.cco.caltech.edu/～dadgrp/unnatstruct.gif，其显示了可另选地使用已经成功地结合到官能化离子通道中的非天然氨基酸的结构)和/或本领域已知的氨基酸类似物)。在一些实施例中，蛋白中的一或多个氨基酸可被改性，例如，通过添加化学实体诸如碳水化合物基、磷酸基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基，用于缀合、官能化或其它改性的连接基等进行。
“放射性标记物”：如本文所用，“放射性标记物”是指包括至少一种元素的放射性同位素的部分。示范性合适的放射性标记物包括但不限于本文所述的那些。在一些实施例中，放射性标记物是在正电子发射断层摄影(pet)中使用的放射性标记物。在一些实施例中，放射性标记物是在单光子发射计算机断层摄影(spect)中使用的放射性标记物。在一些实施例中，放射性同位素包括99mtc、111in、64cu、67ga、186re、188re、153sm、177lu、67cu、123i、124i、125i、11c、13n、15o、18f、153sm、166ho、149pm、90y、213bi、103pd、109pd、159gd、140la、198au、199au、169yb、175yb、165dy、166dy、67cu、105rh、111ag、89zr、225ac和192ir。
“受体”：如本文所用，术语“受体”包括人类和哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在许多实施例中，受体是哺乳动物，特别地是灵长类动物，尤其是人类。在一些实施例中，受体是：牲畜，诸如牛、绵羊、山羊、母牛、猪等；家禽，诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及家养动物，特别地是宠物，诸如狗和猫。在一些实施例中(例如，特别地是在研究的上下文下)，受体哺乳动物将是例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物、或猪，诸如近交猪等。
“基本上”：如本文所用，术语“基本上”是指呈现感兴趣的特征或性质的总或接近总范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物现象和化学现象很少(若有的话)趋于完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，术语“基本上”用于捕集许多生物和化学现象中固有的潜在的完整性缺乏性。
“治疗剂”：如本文所用，短语“治疗剂”是指当被施用给受体时具有治疗效果和/或引起期望生物和/或药理作用的任何试剂。
“治疗”：如本文所用，术语“治疗”(也被称为“治疗”或“治疗”)是指部分地或完全地缓解、改善、解除、抑制特定疾病、病症和/或病况的一或多种症状、特征和/或起因、延缓特定疾病、病症和/或病况发作、降低特定疾病、病症和/或病况的严重性和/或降低特定疾病、病症和/或病况的发生率的物质的任何施用。这种治疗可以针对不呈现相关疾病、病症和/或病况的病征的受体和/或仅呈现所述疾病、病症和/或病况的早期病征的受体。可选地或另外地，这种治疗可以针对呈现相关疾病、病症和/或病况的一或多个确定病征的受体。在一些实施例中，治疗可以针对已经被诊断为患有相关疾病、病症和/或病况的受体。在一些实施例中，治疗可以针对已知具有与相关疾病、病症和/或病况的增加的发病风险统计上相关的一或多个易感性因子的受体。
本文出于说明目的呈现附图，而非为了进行限制。
附图说明
本公开的前述及其它目标、方面、特征和优点将参考以下结合附图而进行的描述更清楚并更好地理解，其中：
图1a-1d示出了nbp-c'点(以60μm)向小鼠体内的坐骨神经的局部应用。图像是用zeissstereolumarv12采集。暴露时间是600ms。
图2a-2b示出了随时间(分钟)变化的坐骨神经和肌肉荧光信号强度(图2a)、以及随时间(分钟)变化的坐骨神经/肌肉比率(图2b)。
图3a-3d示出了使用与神经结合的肽缀合的荧光c'点在小型猪模型中的实时术中神经绘图。
图3a示出了关于c'点应用的坐骨神经暴露。
图3b示出了应用于神经的结合环状肽的c'点。
图3c示出了从远侧解剖的荧光坐骨神经。
图3d在体外用显微镜显示坐骨神经。
图4a-4b示出了相较环状肽-染料缀合物来说，人类面部神经对环状肽、线性肽和乱序肽(对照)官能化c'点(15μm)的摄取。
图5a-5b示出了人类体外面部神经对肽-cy5.5缀合物的摄取对比对环状肽和乱序肽(对照)肽官能化-cy5.5-c'点(15μm)的摄取。
图6a-6c示出了体外人类面部神经对nbp-cy5.5缀合物的摄取对比对nbp-c'点的摄取。
图7a-7c示出了在小鼠面部神经上局部施用c'点(60μm)。图像是用zeissstereolumarv12采集。暴露时间是600ms。
图8a-8c示出了其中局部应用15μm环状nbp-c'点40分钟的小型猪的右侧面部神经的主干和分支的图像。
图9a-9b示出了被切除的面部神经，其示出了延伸到小神经分支中的信号。
图10a示出了在皮肤切开前，在施用99mtc-mibi后20分钟采集的图像。
图10b示出了在甲状旁腺切除后，在放射性同位素施用后90分钟执行的采集。
图10c示出了被切出的物质的体外成像。
图10d示出了在甲状旁腺切除术和甲状腺切除术后执行的图像。
图11示出了根据本发明的说明性实施例的术前pet筛查和实时术中基于荧光的淋巴结转移的多路检测。
图12示出了一种装置，其包括：在标称地较大的管(例如，喷雾器)内的毛细管；空气或气体压力源；泵；以及在需要时可调整的低电压电源。该装置可用于将包括纳米颗粒的溶液局部应用于靶组织。
图13示出了根据本发明的说明性实施例的用于区分淋巴结和/或淋巴结途径的方法。
图14示出了根据本发明的说明性实施例的用于区分一或多个神经的方法。
图15示出了根据本发明的说明性实施例的包括容器以及至少第一探针物种和第二探针物种还有它们相应的载体的试剂盒。
图16示出了根据本发明的说明性实施例的用于检测和/或区分从第一缀合物和第二缀合物发射的光的方法。
具体实施方式
在整个描述中，在组合物被描述为具有、包含或包括特定组分的情况下，或在方法被描述为具有、包含或包括特定步骤的情况下，预期的是，另外地，存在本发明的基本由所表述的组分组成、或由所表述的组分组成的组合物，并且存在根据本发明的基本由所表述的处理步骤组成或由所表述的处理步骤组成的方法。
应理解，只要本发明保持为可操作的，步骤顺序或某些动作的执行顺序就不重要。此外，可同时地进行两个或更多个步骤或动作。
本文提及的任何出版物(例如在背景部分中)并非承认该出版物相对于本文呈现的任何权利要求是现有技术。背景部分是出于清楚阐明目的而呈现，而不表示为相对于任何权利要求的现有技术的描述。
如本文所述，不同染料可附着于神经结合的肽和/或结合到肽官能化c'点内以容许进行基于荧光的多路测定来为各种神经结构“加标签”。所使用的呈其天然形式或附着于颗粒的环状(或线性)肽的序列和/或构象可针对不同神经类型来调整，以使得能够在外科手术期间对神经类型进行视觉区分(例如，不同的神经类型具有不同颜色)。这在各种神经修复外科手术(例如，面部下垂外科手术)期间是重要的，其中外科医生试图找到要移植到受影响的区域(“不良侧”)的正常神经片段(“良侧”)。很少有外科医生可执行这些类型的外科手术，因为难以区分移植所需的特定类型的神经组织。神经结合的肽(和/或荧光颗粒)组合物将通过允许对特定神经组织类型的视觉区分来促进/简化此类外科手术。
所提供的神经结合的肽缀合物的另外应用包括在腹股沟疝修复期间识别关键感觉神经，诸如髂腹股沟神经。此神经在外科手术期间的损伤或绞扼可能导致致残性慢性疼痛。在此过程期间局部应用所描述的神经结合的肽缀合物可有助于为外科医生提供在手术区中发光(这可避免)的神经的更大的可件性。
此外，所提供的神经结合的肽缀合物的应用除了区分运动神经和感觉神经之外，还包括了区分神经和非分立内分泌结构诸如甲状旁腺或其它组织。在由所提供的神经结合的肽缀合物(相较仅仅神经结合的肽来说)提供的增强的可见性下，可能难以识别甲状旁腺并且与此外科手术相关的医源性并发症的可能性大大地降低。
在某些实施例中，可以将缀合的纳米颗粒应用在整个人体(例如，包括脊柱)上，以便为外科医生提供对神经的大大地提高的可见性并且区分神经类型和难以识别的其它结构。外科医生最终地受限于他或她可看到的内容，并且扩大外科医生视野可以实现非常显著的进步和新的护理标准。
先前由布拉德伯里(bradbury)等人在于2016年6月23日公布的国际公布号wo2016/100340中公已描述了神经结合的肽(nbp)被缀合到c'点以用于术中靶向/定位全身神经，同时减少与相邻软组织结构的脱靶结合。为了更选择性地区分运动神经和/或感觉神经分支，可以将特定于这些神经结构的新标志物缀合到c'点。因此，对于给定神经，诸如面部神经，这些合成的颗粒缀合物可以改善外科医生区分运动分支与感觉分支的能力。
此外，所提供的神经结合的肽缀合物可应用于手术区，并且然后不久之后进行灌注，从而使缀合的染料快速地结合到其神经靶，并且在区中高亮地突出感觉神经和运动神经。这种增强的可见性可大大地提高腮腺切除术的安全性。
以下可以用于这种视觉区分：
●在肽序列中使用非天然氨基酸诸如n-甲基化氨基酸(例如，环状或线性的)；
●使用具有二级结构基序(例如，α-螺旋结构)的肽(例如，环状或线性的)；以及
●使用噬菌体展示来提高特异性并且区分不同类型的人类神经。
肽类似物文库可以被开发来用于基于颗粒的检测。序列和结构变化可以用于识别优化的神经结合的肽。可以识别亲本肽的呈现与附录中所述的全长17-残基序列类似的结合特性的更短/截短变体。np41的线性类似物可通过固相肽合成方案来合成。首尾相连的环状类似物可以在溶液中获得，接着进行脱保护和hplc纯化。可使用环化化学来评估不同的二级结构基序(例如，α-螺旋)。
噬菌体展示方法可以用于识别新颖的人类神经特定的标志物。多路策略可以通知对染料官能化的神经结合的肽探针和对应的颗粒缀合物的显影，其通过化学修饰(例如，经由环化)现有的鼠神经结合的肽(nbp)来检测正常神经组织标志物以增强结合的亲和力和亲和素。此外，噬菌体展示可以用于筛查特定于鼠神经组织的nbp序列，并且可以用于例如识别特定于人类面部和坐骨神经组织标本的神经结合的肽序列。
除了收集用于治疗神经损伤部位的正常神经片段(即，从面部的一侧到另一侧)之外，也可从远处部位收集正常淋巴结，并且在切除带有癌症的淋巴结后将正常的淋巴结移植到患淋巴水肿的部位。“淋巴结转移”技术也会需要基于荧光的多路策略。以下是用于治疗颈部在切除带黑素瘤的淋巴结之后的淋巴水肿的此技术的实例。来自下腹区域的正常的淋巴结是优选的。然而，此区域的淋巴结也可能对下肢引流。为了避免摄取对下肢引流的淋巴结，向这些区域中的两个不同远处部位(皮下或亚常)注射以使用多通道荧光相机系统(artemisspectrum)来区分这些分布。一个部位被注射了crgdy-peg-cy5.5-c'点，而另一部位被注射了crdgy-peg-cw800-c'点。对下肢引流的淋巴结未被收集。
适用于本文所述的组合物和方法的各种实施例的细节在以下文献中提供：例如，布拉德伯里(bradbury)等人的pct/us14/30401(wo2014/145606)、布拉德伯里(bradbury)等人的pct/us16/26434(2016年4月7日提交的“《纳米颗粒免疫缀合物(nanoparticleimmunoconjugates)》”)、布拉德伯里(bradbury)等人的pct/us14/73053(wo2015/103420)、布拉德伯里(bradbury)等人的pct/us15/65816(wo2016/100340)、布拉德伯里(bradbury)等人的pct/us16/34351(2016年5月26日提交的“《使用超小纳米颗粒经由细胞铁死亡而引起营养缺失的癌细胞的细胞死亡的方法和治疗(methodsandtreatmentusingultrasmallnanoparticlestoinducecelldeathofnutrient-deprivedcancercellsviaferroptosis)》”)、布拉德伯里(bradbury)等人的us62/330,029(2016年4月29日提交的“《用于恶性脑肿瘤的靶向粒子渗入、分布和反应的组成物和方法(compositionsandmethodsfortargetedparticlepenetration,distribution,andresponseinmalignantbraintumors)》”)、和布拉德伯里(bradbury)等人的美国专利号14/969,877(2015年12月15日提交的“《具有增强的神经结合选择性的环状肽、与所述环状肽结合的纳米粒子及其用于实时体内神经组织成像的用途(cyclicpeptideswithenhancednerve-bindingselectivity,nanoparticlesboundwithsaidcyclicpeptides,anduseofthesameforreal-timeinvivonervetissueimaging)》)，以上申请的全部内容以引用的方式并入本文。
例如，本文称为“反向淋巴多路定位(rlmm)”的技术使用在两个不同波长下发出荧光的超小纳米颗粒(例如，c点和/或c'点)。在某些实施例中，rlmm允许外科医生以视觉上(例如，图形地)区分对四肢引流的淋巴结和对肿瘤部位引流的淋巴结的方式来定位淋巴结。这种增强的可视化允许外科医生避免可能引起淋巴水肿的关键的淋巴结损伤。此外，使用这些超小纳米颗粒的rlmm可以用于在淋巴水肿治疗过程中安全地执行血管化淋巴结移植(例如，以识别适合移植的淋巴节)。例如，可以用使用不同颜色的染料的纳米颗粒识别对躯干引流的用于淋巴结采集的靶向淋巴结，从而允许外科医生仔细挑选将不影响相邻肢体的引流的淋巴结。此技术允许在淋巴结移植过程中安全地采集淋巴结以免发生淋巴水肿。
例如，患有需要进行腋窝淋巴结患者去除的特定癌症的接受第一类型的c点的第一次注射，第一类型的c点在第一光谱上不同的波长下发出荧光，其中第一次注射被注射到肿瘤部位中或肿瘤部位附近。患者还接受第二类型的c点的第二次注射，第二类型的c点的在与第一波长光谱上不同的第二波长处发出荧光，其中第二次注射被注射到四肢(例如，肿瘤部位附近的上肢或下肢)，如果影响该四肢的淋巴引流途径受到该途径的淋巴结移除的干扰，那么这将可能会受淋巴水肿的影响。例如，在黑素瘤的情况下，第一注射部位可以在黑素瘤部位处(例如，在躯干、腹部、骨盆上)，而第二部位将会在有可能受影响的四肢处。例如，在乳腺癌的情况下，第一注射部位可以是胸腔；在妇科癌症的情况下，第一注射部位可以是骨盆区域。第二次注射然后将会有可能受淋巴水肿的影响的四肢中。通过避免去除引流淋巴结，能够区分第一类型和第二类型的c点降低了四肢发生淋巴水肿的风险。
例如，需要去除腋窝淋巴结的乳腺癌患者具有注射到乳房中的发出绿色荧光的一种类型的c点(例如，其中荧光团是颗粒本身的一部分或附着于与颗粒或以其它方式与颗粒相关联)。发出蓝色荧光(或以其它方式与第一c点视觉上或光谱上区分)的另一c点被注射到可能受影响的四肢(例如，下肢或上肢)(例如在肿瘤部位附近的四肢)中。例如，当去除腋窝淋巴结时，外科医生可专门地仅去除对乳房引流的绿色淋巴结，并且避开对上肢引流的蓝色淋巴结。成像技术可作为外科手术的一部分来执行，或可以被执行来用于术前成像。此技术可针对其中淋巴结被去除或移植的任何癌症执行。
又如，rlmm允许外科医生降低涉及神经的手术风险和神经损伤的后果，特别地是面部神经损伤。例如，将具有促成(至少暂时)纳米颗粒与运动神经结合的配体的第一类型的纳米颗粒施用给患者，并且将具有促成纳米颗粒与感觉神经结合的配体的第二类型的纳米颗粒施用给患者，其中第一类型的纳米颗粒和第二类型的纳米颗粒是彼此视觉上(或光谱上)可区分的。在外科手术期间，运动神经发出一种颜色(例如，绿色)的荧光，而感觉神经则发出另一颜色(例如，蓝色)的荧光，从而为外科医生提供了识别不同神经和/或避免切割某些神经的增强的能力。所述技术在外科手术环境和非外科手术(例如术前成像)环境两者中可能是有用的。
在某些实施例中，纳米颗粒包括二氧化硅、聚合物(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga))、生物制剂(例如，蛋白载体)和/或金属(例如，金、铁)。在某些实施例中，纳米颗粒是如布拉德伯里(bradbury)等人的美国公布号2013/0039848a1中所述的“c'点”或“c'点”，该公布的全文以引用的方式并入本文。
在某些实施例中，纳米颗粒是球形的。在某些实施例中，纳米颗粒是非球形的。在某些实施例中，纳米颗粒是或包括选自由以下组成的群组中的材料：金属/半金属/非金属、金属/半金属/非金属氧化物、-硫化物、-碳化物、-硝化物、脂质体、半导体和/或它们组合。在某些实施例中，金属选自由以下组成的群组：金、银、铜和/或它们组合。
纳米颗粒可以包括包括金属/半金属/或非金属氧化物和/或非氧化物，金属/半金属/或非金属氧化物包括二氧化硅(sio2)、二氧化钛(tio2)、氧化铝(al2o3)、氧化锆(zro2)、氧化锗(geo2)、五氧化二钽(ta2o5)、nbo2等，非氧化物包括金属/半金属/非金属硼化物、碳化物、硫化物和氮化物，诸如钛和其组合(ti、tib2、tic、tin等)。
纳米颗粒可以包括一或多种聚合物，例如已经被美国食品和药物管理局(fda)依据21c.f.r.§177.2600批准用于人类的一或多种聚合物，包括但不限于聚酯(例如，聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1,3-二恶烷-2-酮))；聚酐(例如，聚(癸二酸酐))；聚醚(例如，聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚氰基丙烯酸酯；peg和聚(环氧乙烷)(peo)的共聚物。
纳米颗粒可以包括一或多种可降解聚合物，例如，某些聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷酸酯、某些聚羟基酸、聚丙基聚丙烯酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚醚、生物可降解聚氰基丙烯酸酯、生物可降解聚氨酯和多糖。例如，可使用的特定生物可降解聚合物包括但不限于聚赖氨酸、聚(乳酸)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(己内酯)(pcl)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plg)、聚(丙交酯-共-己内酯)(plc)和聚(乙交酯-己内酯)(pgc)。另一示范性可降解聚合物是聚(β-氨基酯)，其可适于根据本申请来使用。
在某些实施例中，纳米颗粒可以具有或被改性成具有一或多个官能团。此类官能团(在纳米颗粒的表面内或表面上)可用于与任何试剂(例如，可检测的实体、靶向实体、治疗实体或peg)缔合。除了通过引入表面官能度或使之改性来改变表面电荷之外，引入不同的官能团允许连接基(例如，(可裂解或(生物)可降解)聚合物(诸如但不限于聚乙二醇、聚丙烯乙二醇、plga等)、靶向/归巢剂和/或它们组合的缀合。
附着到纳米颗粒的配体的数量可以在约1至约20、约2至约15、约3至约10、约1至约10或约1至约6的范围内。附着到纳米颗粒的配体的小部分帮助维持本发明的纳米颗粒的符合肾脏清除截留大小范围的流体动力学直径。希尔德布兰德(hilderbrand)等人，《近红外荧光：应用于体内分子成像(near-infraredfluorescence:applicationtoinvivomolecularimaging)》，《化学生物学新见(curr.opin.chem.biol.)》，14:71-9，2010。
在某些实施例中，除了psmai以外的治疗剂可附着到纳米颗粒。治疗剂包括抗生素、抗微生物剂、抗增殖剂、抗肿瘤药、抗氧化剂、内皮细胞生长因子、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、抗血小板聚集剂、胶原合成抑制剂、治疗性抗体、一氧化氮供体、反义寡核苷酸、伤口愈合剂、治疗基因转移构体、细胞外基质组分、血管舒张剂、溶栓剂、抗代谢物、生长因子激动剂、抗有丝分裂剂、他汀类、类固醇、甾族和非甾族抗炎剂、血管紧张素转化酶(ace)抑制剂、自由基清除剂、ppar-激动剂、小干扰rna(sirna)、微rna和抗癌化学治疗剂。本实施例所涵盖的治疗剂还包括了放射性核素，例如，90y、131i和177lu。治疗剂可以是放射性标记的，诸如通过结合到放射性氟18f来标记。
可治疗的癌症包括例如任何癌症。在某些实施例中，癌症是黑素瘤、乳腺癌和妇科癌症。
在某些实施例中，造影剂可附着到本发明的纳米颗粒上以用于医学或生物成像。在某些实施例中，可以包括正电子发射断层摄影(pet)、单光子发射计算机断层摄影(spect)、计算机化断层摄影(ct)、磁共振成像(mri)、光学生物发光成像、光学荧光成像和其组合。在某些实施例中，造影剂可以是本领域已知用于pet、spect、ct、mri和光学成像的任何分子、物质或化合物。造影剂可以是放射性核素、放射性金属、正电子发射体、β发射体、γ发射体、α发射体、顺磁性金属离子和超顺磁性金属离子。造影剂包含但不限于碘、氟、cu、zr、lu、at、yt、ga、in、tc、gd、dy、fe、mn、ba和baso4。可用作附着于本实施例的纳米颗粒的造影剂的放射性核素包含但不限于89zr、64cu、68ga、86y、124i、177lu、225ac、212pb和211at。另选地，造影剂可通过附着于连接基或螯合剂而间接地缀合到纳米颗粒。螯合剂可适于结合放射性核素。可附着到本发明的纳米颗粒的螯合剂可以包含但不限于n,n'-双(2-羟基-5-(羧乙基)-苄基)乙二胺-n,n'-二乙酸(hbed-cc)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、去铁胺(dfo)和三亚乙基四胺(teta)。
在某些实施例中，探针物种包括纳米颗粒。在某些实施例中，纳米颗粒具有二氧化硅构造和富含染料的核。在某些实施例中，富含染料的核包括荧光报道体。在某些实施例中，荧光报道体是近红外或远红染料。在某些实施例中，荧光报道体选自由以下组成的群组：荧光团、荧光物、染料、颜料、荧光过渡金属和荧光蛋白。在某些实施例中，荧光报道体选自由以下组成的群组：cy5、cy5.5、cy2、fitc、tritc、cy7、fam、cy3、cy3.5、德克萨斯红、rox、hex、ja133、alexafluor488、alexafluor546、alexafluor633、alexafluor555、alexafluor647、dapi、tmr、r6g、gfp、增强型gfp、cfp、ecfp、yfp、黄水晶、venus、ypet、cypet、amca、光谱绿、光谱橙、光谱浅绿、丽丝胺和铕。在某些实施例中，在正常照明设置中执行成像。在某些实施例中，在某些至零水平的环境照明设置下执行成像。
本文中的成像方法可与许多不同荧光探针物种一起使用(或如在使用串联生物发光报道体/荧光探针的实施例中则是其荧光物种)，所述不同荧光探针物种例如(1)在靶接触(例如结合或相互作用)后激活的探针(维斯勒德尔(weissleder)等人，《自然生物技术(naturebiotech.)》，17:375-378，1999；布雷默(bremer)等人，《自然医学(naturemed.)》，7:743-748，2001；坎波(campo)等人，《光化学和光生物学(photochem.photobiol.)》，83:958-965，2007)；(2)波长移位信标(提亚吉(tyagi)等人，《自然生物技术(nat.biotechnol.)》，18:1191-1196，2000)；(3)多色(例如，荧光)探针(提亚吉(tyagi)等人，《自然生物技术(nat.biotechnol.)》，16:49-53，1998)；(4)对靶有高结合亲和力的探针，例如，保留在靶区域内而从体内清除非特定探针的探针(阿奇勒夫(achilefu)等人，《调查放射学(invest.radiol.)》，35:479-485，2000；贝克尔(becker)等人，《自然生物技术(naturebiotech.)》19:327-331，2001；布贾依(bujai)等人，《生物光学杂志(j.biomed.opt.)》6:122-133，2001；巴卢(ballou)等人，《生物技术进展(biotechnol.prog.)》13:649-658，1997；以及内里(neri)等人，《自然生物技术(naturebiotech)》15:1271-1275，1997)；(5)基于量子点或纳米颗粒的成像探针，包括多价成像探针，以及荧光量子点，诸如胺t2mp
在某些实施例中，探针物种具有在红色和近红外光谱中的激发波长和发射波长，例如，在550-1300或400-1300nm的范围内或约440nm至约1100nm、约550nm至约800nm或从约600nm至约900nm。使用此部分的电磁波谱通过生理学丰富的吸收剂诸如血红蛋白(<650nm)和水(>1200nm)使组织渗透最大化且使吸收最小化。在其它光谱(诸如可见光和紫外光光谱)中具有激发波长和发射波长的探针物种也可用于本发明的实施例的方法中。具体地讲，可使用荧光团诸如某些荧光羰花青或聚甲炔荧光物或染料来构造光学成像剂，例如，卡普托(caputo)等人的美国专利号6,747,159(2004)；卡普托(caputo)等人的美国专利号6,448,008(2002)；黛拉·恰纳(dellaciana)等人的美国专利号6,136,612(2000)；索思威克(southwick)等人的美国专利号4,981,977(1991)；瓦格纳(waggoner)等人的5,268,486(1993)；瓦格纳(waggoner)等人的美国专利号5,569,587(1996)；瓦格纳(waggoner)等人的5,569,766(1996)；瓦格纳(waggoner)等人的美国专利号5,486,616(1996)；瓦格纳(waggoner)的美国专利号5,627,027(1997)；布拉什(brush)等人的美国专利号5,808,044(1998)；雷丁顿(reddington)等人的美国专利号5,877,310(1999)；沈(shen)等人的美国专利号6,002,003(1999)；莱昂(leung)等人的美国专利号6,004,536(1999)；瓦格纳(waggoner)等人的美国专利号6,008,373(1999)；明登(minden)等人的美国专利号6,043,025(2000)；明登(minden)等人的美国专利号6,127,134(2000)；瓦格纳(waggoner)等人的美国专利号6,130,094(2000)；瓦格纳(waggoner)等人的美国专利号6,133,445(2000)；里查(licha)等人的美国专利号7,445,767(2008)；里查(licha)等人的美国专利号6,534,041(2003)；美和(miwa)等人的美国专利号7,547,721(2009)；美和(miwa)等人的美国专利号7,488,468(2009)；川上(kawakami)等人的美国专利号7,473,415(2003)；还有wo96/17628、ep0796111b1、ep1181940b1、ep0988060b1、wo98/47538、wo00/16810、ep1113822b1、wo01/43781、ep1237583a1、wo03/074091、ep1480683b1、wo06/072580、ep1833513a1、ep1679082a1、wo97/40104、wo99/51702、wo01/21624和ep1065250a1；以及《四面体通讯(tetrahedronletters)》41,9185-88(2000)。
探针物种的示范性荧光染料包括例如以下：cy5.5、cy5、cy7.5和cy7(
用于成像、检测、记录或测量本发明的纳米颗粒的合适手段还可包括例如流式细胞仪、激光扫描细胞计数器、荧光微板读数器、荧光显微镜、共焦显微镜、明场显微镜、高内容扫描系统和相似的装置。可同时地或连续地使用多于一种成像技术来检测本发明的纳米颗粒。在一个实施例中，使用光学成像作为敏感的高通量筛查工具来采集同一受体中的多个时间点，从而容许对肿瘤标志水平进行半定量的估计。这抵消了用pet获得的相对降低的时间分辨率，但是需要pet来实现足够的深度穿透以采集体积数据，并且检测、定量和监测受体和/或其它细胞标志水平的变化作为评估疾病发展或改善的手段，以及将患者分层到合适的治疗方案。
本文所述的组合物和方法可与其它成像方法一起使用，诸如使用装置，包括但不限于各种镜(显微镜、内窥镜)、导管和光学成像设备(例如，用于断层显示的基于计算机的硬件)。
在某些实施例中，方法可以用于检测、表征和/或确定疾病定位(特别地是早期疾病)、疾病或疾病相关病况的严重度、疾病分期，并且监视和指导诸如外科手术的各种治疗干预，以及监测和/或开发药物治疗和递送，包括基于细胞的治疗。在某些实施例中，方法也可用于预后疾病或疾病病况。关于上述中的每个，可检测或监视(在治疗之前、期间或之后)的这种疾病或疾病病况的实例包括炎症(例如，由关节炎引起的炎症，例如，类风湿性关节炎)、癌症(例如，任何癌症，例如，黑素瘤、乳腺癌和妇科癌症，包括转移瘤)、中枢神经系统疾病(例如，神经变性疾病，例如，帕金森病或阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症、朊病毒病)、遗传性疾病、代谢性疾病、环境疾病(例如，铅、汞和放射性元素中毒、皮肤癌)、神经退行性疾病和手术相关并发症(例如，移植排斥、器官排斥、伤口愈合改变、纤维化或与外科植入物有关的其它并发症)。在某些实施例中，方法因此可以用于例如确定肿瘤细胞的存在和肿瘤细胞的定位和转移、炎症的存在和定位(包括活化的巨噬细胞的存在，例如在动脉粥样硬化或关节炎中)、血管疾病的存在和定位(包括处于冠状动脉和外周动脉中的急性闭塞风险的区域(例如，易损斑块)、扩张动脉瘤区域、颈动脉不稳定斑块和缺血区域)和支架血栓形成。
本文呈现的实施例包括例如使用体内成像系统通过在局部注射探针物种后使不同的肿瘤淋巴引流途径和淋巴结分布可视化来评估癌症(例如，乳腺癌、转移性黑素瘤)。可使用靶向双模态探针物种来执行在前列腺癌和其它癌症中周围神经和淋巴结疾病的实时且同时的术中可视化。靶向双模态探针种定位到淋巴结。来自每个探针物种的发射光的波长区分要去除的淋巴结或不去除的淋巴结。例如，第一探针物种可以具有约700nm的发射波长，而第二探针物种则具有约800nm的发射波长。也可针对腮腺肿瘤和喉部肿瘤进行神经术中可视化的实时且同时的可视化以绘制喉部神经。
在某些实施例中，方法和系统用于通过观察在局部注射后不同的肿瘤淋巴引流途径和淋巴结分布来评估淋巴结转移。使用手持artemis荧光相机系统可实时地同步显示多色平台。例如，使用artemistm手持荧光相机系统的实时光学成像可与不同nir染料二氧化硅纳米颗粒一起使用以同时地绘制不同的淋巴结分布。
在某些实施例中，使用靶向双模态二氧化硅纳米颗粒执行/使用方法和系统来实时地术中使神经和淋巴结可视化以进行神经移植。术中可视化和检测工具将改善患者的术后效果，从而使得能够完全切除而对相邻神经肌肉结构(即，神经)无功能性损伤。为实现此目的，可平移双模态二氧化硅纳米颗粒(np)可以术前改进靶向疾病定位，并且使用手持nir荧光相机系统增强对前列腺神经、淋巴结疾病和残余前列腺肿瘤灶或外科手术切缘的实时的可视化。另外的信息可以在美国公开号us2015/0182118a1(附录c)中找到，其全部内容以引用的方式并入本文。
所述方法与先前的方法不同之处在于它们能够实时同时检测不同波长的光信号以治疗淋巴水肿和神经(例如，运动神经与感觉神经)移植。在某些实施例中，所述方法包括多通道荧光相机系统，其同时实时检测来自多种染料的多个波长。在某些实施例中，成像设备包括手持荧光成像系统，其使用可从具有较高的信噪比的多种类型的探针物种收集可区分的信号的多个检测器和相关联的电路系统。在某些实施例中，就如其它先前成像系统一样，所述系统不用光学时分复用来区分在单个检测器处接收到的多种信号类型。
实例
将肽缀合到c'点以在外科手术过程期间对神经组织进行视觉区分
本实施例中使用的肽是17aanp41，其包括核心序列ntqtlakapeht(seqidno:3)。然而，本实施例并不限于所提供的17aa神经结合的肽。例如，在各种实施例中可以使用其它肽(例如，抗甲状旁腺激素(pth)和gata抗体(例如gata1抗体，例如gata2抗体，例如gata3抗体，例如gata4抗体，例如gata5抗体)，例如chat，例如抗cgrp)，如本文所述。
胆碱乙酰转移酶(chat)是催化乙酰胆碱形成的酶，在运动神经诸如面部神经中过度表达。因此胆碱乙酰转移酶用作运动神经元的有吸引力的靶。
胆碱乙酰转移酶
使用市售抗chat抗体片段(例如，scfv或fab)作为用于产生用于运动神经绘图的c'点免疫偶联物的配体。将抗体片段与n-乙酰基-l-半胱氨酸nhs酯(1:10摩尔比)在pbs缓冲液中过夜(ph＝7.5)，并且随后通过生物凝胶柱纯化。然后，将所得到的带有半胱氨酸残基的纯化抗体片段加入到mal-peg-c'点；后者在其表面上引入马来酰亚胺官能团的颗粒缀合物。缀合反应以1:5摩尔比的颗粒与抗体片段在pbs缓冲液(ph＝7.5)中进行。使用凝胶渗透色谱和sephadex柱纯化产物。合成c'点来封装几种近红外染料(例如，cy5.5)以用于术中可视化。
降钙素基因相关肽
降钙素基因相关肽(cgrp)是37-氨基酸神经肽，在感觉神经元中是丰富的，并且因此可以用作识别此神经类型的有吸引力的靶。
市售抗cgrp抗体scfv片段用于缀合到c'点。抗cgrp抗体scfv片段与n-乙酰-l-半胱氨酸nhs酯(1:10摩尔比)在pbs缓冲液中过夜(ph＝7.5)，接着用生物凝胶柱纯化。然后，将纯化的cgrp抗体片段以1:5摩尔比(颗粒：碎片)在pbs缓冲液(ph＝7.5)中过夜缀合到mal-peg-c'点。用gpc和sephadex柱进行另外纯化。合成c'点来包封与用于运动神经的不同的近红外染料(即，cw800)以增强神经辨别。
将c'点缀合物应用于神经的方案
使用人类神经组织样本进行体外实验。所使用的组织样本是由国立疾病研究交流中心(ndri)新鲜切除并获得的尸胺面部神经和面部神经腓神经。在24孔板上制备组织，用pbs洗涤，并且然后与15μmc'点缀合物以及对照物一起在室温下温育30分钟。使用荧光板读数器确定c'点缀合物浓度。与颗粒缀合物一起温育约20-30分钟后，将组织样本用pbs进行几轮洗涤。使用ivis光谱成像系统对板进行成像。使用perkinelmer软件对神经和肌肉标本进行荧光信号的感兴趣区(roi)分析。
执行小型猪的外科手术研究以估计与面部神经和坐骨神经结合的c'点缀合物。术中暴露面部神经，并且以15μm-60μm的浓度局部应用颗粒缀合物。将神经标本温育约30分钟后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗暴露部位。通过手持相机系统采集图像和视频以读出荧光强度并跟踪沿着神经片段的颗粒扩散。为了验证c'点在神经组织中的分布和定位，从小型猪采集神经标本，快速冷冻在oct中，切出剖面(10μm厚)，并且在载玻片上制备用于进行显微显示。
坐骨神经：体内局部施用(小鼠和小型猪研究)
图1a-1d示出了神经结合的肽(nbp-c'点)(以60μm)向小鼠体内的坐骨神经的局部应用。图像是用zeissstereolumarv12采集。暴露时间为600ms。将60μm的17个氨基酸(aa)环状肽缀合的c'点应用在裸鼠的坐骨神经上。将c'点温育达1、3、5和10分钟，接着pbs缓冲液洗涤三次。使用zeissstereolumar镜观察荧光信号的强度和分布。在手术期间使小鼠保持处于异氟烷麻醉下。
图2a-2b示出了随时间(分钟)变化的坐骨神经和肌肉荧光信号强度(图2a)、以及随时间(分钟)变化的坐骨神经/肌肉比率(图2b)。在10分钟的时间间隔(例如，1、3、5、10分钟)上，将60μm的17aa-环状肽缀合的c'点局部应用到正常裸鼠的坐骨神经的近侧部分，接着进行三次pbs洗涤。使用zeissstereolumar镜观察沿着神经的荧光信号的强度和分布。在手术期间使小鼠维持处于异氟烷麻醉下。对神经上以及周围组织(例如，肌肉)中的高荧光信号区域进行感兴趣区分析以随时间而产生神经对背景或神经对肌肉的比率。在温育后约3分钟时发现最高神经/肌肉比率为约3。
图3a-3d示出了使用与神经结合的肽配对的荧光c'点在小型猪模型中的实时术中神经绘图。图3a示出了关于c'点应用的坐骨神经暴露。图3b示出了应用于神经的结合环状肽的c'点。图3c示出了从远侧解剖的荧光坐骨神经。图3d在体外用显微镜显示坐骨神经。
面部神经：三次体外局部实验
如本文所述，提供以下比率(例如，值的范围)：环状肽-c'点与仅环状肽：约2至约6；以及环状肽-c'点与乱序肽-c'点：约3至约6。
实验#1
图4a-4b示出了相较环状肽-染料缀合物来说，人类面部神经对环状肽、线性肽和乱序肽(对照)官能化c'点(15μm)的摄取。体外结合/摄取研究将肽-染料(cy5.5)缀合物与人类神经标本的肽官能化的深红色/含nir染料的(cy5.5)c'点进行比较。将人类面部神经切成0.5cm长的剖面，并且在室温下在15μm肽或结合肽的c'点溶液中温育40分钟，接着多次磷酸盐缓冲盐水多次洗涤。非侵入性感兴趣区(roi)分析通过ivis光谱成像在温育后40分钟获得，并且表明在暴露于结合肽的c'点的神经组织中从高到低的光学信号，如下：使用17aa结合环状肽的c'点检测到的信号>使用17-aa环状肽检测到的信号>使用17-aa结合线性肽的c'点的信号>使用结合乱序环状肽的c'点的信号。
实验#2
图5a-5b示出了相较环状肽-染料缀合物来说，人类体外面部神经对肽-cy5.5缀合物的摄取与对乱序(对照)肽官能化-cy5.5-c'点(15μm)的摄取。体外结合/摄取研究将肽-染料缀合物与人类神经标本的肽官能化的深红色/含nir染料的(cy5.5)c'点进行比较。将人类面部神经切成0.5cm长的剖面，并且在室温下在15μm肽或结合肽的c'点溶液中温育40分钟，接着多次磷酸盐缓冲盐水三次洗涤。利用ivis光谱成像在温育后40分钟获得感兴趣区分析；找到从最高到最低的光学信号，如下：从结合环状肽的c'点检测到的信号>从环状肽检测到的信号>从结合乱序肽的c'点检测到的信号。
实验#3
图6a-6c示出了体外人类面部神经对nbp-cy5.5缀合物的摄取对比对nbp-c'点的摄取。结合环状肽的c'点与环状肽比为约6，并且结合环状肽的c'点与结合乱序肽的c'点之也为约6。
面部神经：体内局部(鼠研究)
图7a-7c示出了在小鼠面部神经上局部施用c'点(60μm)。图像是用zeissstereolumarv12采集。暴露时间为600ms。将60μm的17个环状肽缀合的c'点应用在裸鼠的面部神经上。将c'点温育达3分钟，接着pbs缓冲液洗涤三次。使用zeissstereolumar镜观察荧光信号的强度和分布。在外科手术期间使小鼠保持处于异氟醚麻醉下。获得神经或周围肌肉的roi并且经由从zeiss立体视觉范围拍摄的荧光结果图像来比较其荧光强度。面部神经与肌肉比率为约1.5。
图8a-8c示出其中局部应用15μm环状nbp-c'点40分钟的小型猪的右侧面部神经的主干和分支的图像。将右侧面部神经的主干和分支切开并暴露(箭头)。在主干神经和分支神经上局部应用15μm环状nbp-c'点40分钟，接着用pbs多次洗涤。检测涉及神经和其分支的光学信号。
图9a-9b示出了被切除的面部神经，其示出了延伸到小神经分支中的信号。
用于甲状旁腺光学识别的荧光纳米颗粒
甲状腺术是非常常见的手术(在mskcc约15次/周)。甲状腺乳头状癌过度诊断的发病率在过去十年中有所增加。例如，最令人担忧的并发症是喉返神经损伤和甲状旁腺机能亢进。
正常的甲状旁腺非常小(最大尺寸为约5mm至约6mm，并且重量为约50mg)。正常的甲状旁腺很难与脂肪或淋巴结区别。
用99mtc甲氧基异丁基异腈(mibi)的双相闪烁成像是识别甲状旁腺腺瘤最常用的方法(成功率68-86％)。mibi是可用99mtc放射性标记的亲脂性化合物。在iv施用后，放射性药物在代谢活性细胞的线粒体内迅速被动地积累。在注射99mtc-mibi后，其在甲状旁腺机能亢进病变中的滞留时间延长，而mibi是从正常的甲状腺组织中更快地被洗出。保留与嗜酸细胞(富含线粒体)有关。
双相方案在注射后15分钟和1-3小时采集平面图像。示踪剂保留是取决于若干因素，例如，线粒体含量、细胞周期和p-糖蛋白外排蛋白的表达。spect在注射99mtc-mibi后的10至60分钟进行。相较平面闪烁成像来说，使用spect/ct融合图像提高甲状旁腺成像的灵敏度。
在微创甲状旁腺外科手术中，使用便携伽玛探针的术中定位已变得更普遍。
在手术室进行麻醉后，核医学医师使用静脉注射剂量为185mbq(5mci)的99mtc-mibi。颈部的四个闪烁成像图像(图10a-10d)通过将准直器放置在15cm的距离(给定20cm×20cm的视场)处采集：在皮肤切口之前；在注射之后的15-20分钟；在病理性甲状旁腺定位后；在切除腺体后；以及体外。
mibi提供一些优点，包括mibi已经在体内使用并且是小化合物。然而，mibi确实有局限性，包括：特异性(甲状腺结也可能会很热)，mibi对腺瘤(其中存在更多嗜酸细胞)更有用，并且甚至在切除后90分钟时，甲状腺维持其亮度(图10b)。
如本文所述，抗-pth可以用于靶向甲状旁腺。pth被合成为前体蛋白(25个氨基酸的前序列和6个氨基酸的后序列)。pth的成熟形式包括84个氨基酸。pth几乎完全是由甲状旁腺产生。甲状旁腺的钙感测受体由细胞外钙浓度调节。
在某些实施例中，pth(1-34)序列(人类)是：ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-his-asn-phe(seqidno:1)(www.phoenixpeptide.com)。
在某些实施例中，pth(1-34)序列(大鼠)是：ala-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-ala-ser-val-glu-arg-met-gln-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-his-asn-phe(seqidno:2)(www.phoenixpeptide.com)。
如本文所述，可使用gata抗体(例如gata1抗体，例如gata2抗体，例如gata3抗体，例如gata4抗体，例如gata5抗体)来靶向甲状旁腺。gata蛋白具有识别序列(a/t)gata(a/g)的两个锌指dna结合结构域cys-x2-c-x17-cys-x2-cys(zni和znii)。
在某些实施例中，gata3抗体(www.scbt.com；http://biocare.net(gata-3[l50-823])用于靶向甲状旁腺。gata3抗体靶向gat3。也被称为gata结合蛋白3和反式作用t细胞特异性因子的gata3是结合dna序列(a/t)gata(a/g)的转录因子中的成员。gata3在脊椎动物胚胎形成中起重要的作用。gata3在促进和引用许多细胞类型中的细胞增殖发育和分化中是需要的。gata3还参与甲状旁腺的胚胎发育和成人甲状旁腺细胞增殖。gata3蛋白包括443个氨基酸。
在研究中(gata3免疫染色在甲状旁腺肿瘤诊断中的价值)使用hg3-31抗gata3小鼠单克隆抗体。所有5例正常甲状旁腺、10例甲状旁腺增生腺、22例甲状旁腺腺瘤和6例甲状旁腺癌均为gata3阳性。所有38例甲状腺肿瘤、32例肾细胞癌、14例胸腺上皮肿瘤和11例肺类癌瘤均为gata3阴性。
在某些实施例中，可以复合甲状旁腺标志物以便区分多种结构，包括淋巴结神经和正常组织结构。
gata3可以在乳腺癌(47-100％)、尿路上皮癌(67-93％)和副神经节瘤(78％)中进行表达。少见于scc(16-33％)和子宫内膜腺癌(～2％)。
在某些实施例中，可以多路测定甲状旁腺标志物，以便区分多种结构，包括淋巴结神经和正常组织结构。
术前pet筛查和实时术中基于荧光的淋巴结转移的多路检测
图1示出了术前pet筛查和实时术中基于荧光的淋巴结转移的多路检测。图1示出了在用124i-crgdy-cw800-c’点瘤周注射的自发性黑素瘤小型猪模型中对淋巴结转移的双模态术前和术中成像。高分辨率pet扫描表明pet术后淋巴结随后被标记以术中切除。使用手持多通道荧光相机系统和靶向不同受体的光谱上不同的颗粒探针(整联蛋白：红色；mc1r：绿色)，就组织学相关性来实时观察对转移淋巴结的肿瘤淋巴引流。发现淋巴结同时进行差异摄取(黄色)，这表明了对检测每个淋巴结中不同程度的肿瘤负荷的敏感性。
用于将组织结合的肽缀合物溶液局部应用到组织的装置
通过使用特殊的同轴空气喷雾器或雾化器装置可以实现在手术床中将所提供的纳米颗粒精确且受控地局部应用到感兴趣的组织(例如，神经，例如，淋巴结，例如，甲状旁腺)(图12)。在某些实施例中，装置包括：在标称地较大的管(例如，喷雾器)内的毛细管；空气或气体压力源；泵；以及在需要时可调整的低电压电源。纳米颗粒溶液被泵送通过毛细管，而氩气则被泵入到外部套管中。纳米颗粒溶液的流量和气体压力可以各自进行调节。另外，溶液、气体或喷雾器的温度可以根据需要进行调整；喷雾器的电压也可调整。这些特征造成精细且高度受控的喷雾，从而允许将纳米颗粒精确地局部应用到手术区域。在某些实施例中，装置类似于电喷雾离子化质谱仪器中使用的雾化器。
在某些实施例中，纳米颗粒组合物的表面电荷可经调节，由此影响纳米颗粒组合物的表面性质。纳米颗粒组合物的改进的性能包括增加与神经的结合和对神经的渗透。
在某些实施例中，蠕动泵或注射器泵将流速的范围控制为约1微升/分钟至约100微升/分钟。在某些实施例中，气体压力在约1升/分钟至约20升/分钟(例如，约1psi至约20psi)的范围内。在某些实施例中，温度为约25℃至约60℃。在某些实施例中，喷雾出口的直径在约80μm至约200μm的范围内。在某些实施例中，电源(例如，低电压)施加具有从约0v至约+/-10v的范围的电压。在某些实施例中，可以将电荷添加到纳米颗粒组合物以更改渗透性和组织(例如，神经，例如，甲状旁腺，例如，淋巴结)结合特性。
序列表
<110>纪念斯隆凯特林癌症中心
康奈尔大学
<120>2003080-1277
<130>2003080-1277
<150>62/267,676
<151>2015-12-15
<150>62/349,538
<151>2016-06-13
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>34
<212>prt
<213>智人()
<220>
<221>肽
<222>(1)..(34)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(34)
<400>1
servalsergluileglnleumethisasnleuglylyshisleuasn
151015
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202530
asnphe
<210>2
<211>34
<212>prt
<213>黑鼠()
<400>2
alavalsergluileglnleumethisasnleuglylyshisleuala
151015
servalgluargmetglntrpleuarglyslysleuglnaspvalhis
202530
asnphe
<210>3
<211>12
<212>prt
<213>智人()
<400>3
asnthrglnthrleualalysalaprogluhisthr
1510
<210>4
<211>12
<212>prt
<213>智人()
<400>4
thrtyrthrasptrpleuasnphetrpalatrppro
1510
<210>5
<211>12
<212>prt
<213>智人()
<400>5
lysserleuserarghisasphisilehishishis
1510
<210>6
<211>11
<212>prt
<213>智人()
<400>6
aspphethrlysthrserproleuglyilehis
1510