用于制备具有定义的糖基化模式抗体的方法与流程

背景技术：

抗体已成为非常重要的治疗类别，这为患者的治疗提供了重大进展。2012年，最畅销的20种药物中有5种是抗体。轭合抗体可能形成第二代抗体产品的重要部分。

抗体制造相对复杂且昂贵。通常使用哺乳动物细胞系，例如cho细胞系来表达抗体以确保正确的折叠和活性。

在cho细胞中制造的抗体的翻译后修饰是糖基化。糖基化与抗体的免疫识别相关，并且可以影响给定抗体的免疫原性和其他性质，例如效应子功能。更重要的是，给定抗体的抗体糖基化可能不是均一的。这可以导致抗体的分子量落入与离散值相反的范围内。

逐渐提高了生物产品例如抗体的监管标准。在将来提供新抗体产品是必要的，其中糖基化是控制的或定义的。

因此，能够制造具有定义的糖基化模式的抗体将是有用的。更重要的是，如果可以控制糖基化的结构，则可以以适合的形式提供抗体用于进一步加工，例如将抗体与有效载荷轭合。

wo2004/063344披露了通过用半乳糖苷酶处理将聚糖转化成g0形式(特定聚糖形式)的情况。该酶处理去除任何末端半乳糖糖残基并留下末端n-乙酰葡糖胺糖残基。因此，虽然理论上可以使用酶例如β-1,4半乳糖苷酶和其他酶例如endos来修饰抗体上的聚糖，但是这种方法存在若干困难。在商业制造规模上，某些问题比在实验室或研究规模上更为严重。对于在商业制造规模上进行的方法，可能难以确保足够量的纯活性酶。这是因为为了最佳活性，酶必须以适当折叠的天然构象表达。此外，酶需要在适当的条件下储存和运输，以确保保持活性。此外，使抗体经受切割酶(例如endos)，有可能干扰抗体的折叠和活性。即使可以管理这些方面，使抗体以商业规模经受制备型酶处理的步骤也会导致处理时间的增加，使用增加的材料和增加的工时，所有这些都会影响商品的成本。

因此，对于商业规模的抗体制造方法，不希望采用酶处理步骤来切割聚糖以提供均一的抗体产品。

此外，具有不需要修饰多肽或蛋白质的碱性氨基酸序列的位点特异性轭合方法将是有用的。

此外，避免在轭合反应中使用金属和无机催化剂将是有用的，因为这些催化剂可能变成在最终药物产品中难以去除的污染物。去除这些类型的污染物可能需要额外的纯化步骤，并且有时甚至在额外的纯化之后，难以将污染降低到足够低的水平，以满足监管机构的要求。

本发明人已经鉴定了一种方法，该方法不需要酶处理步骤，并且使用该方法可以不改变抗体的碱性氨基酸序列。此外，可以不依赖铜催化化学，而达到抗体与有效载荷轭合。

技术实现要素：

因此，在一个方面，提供了一种方法，该方法包括从编码所述抗体的cho糖基化突变细胞系中表达抗体，其中所述cho细胞系突变，使得由细胞表达的抗体上的n-聚糖具有末端糖，该末端糖为n-乙酰基葡糖胺，例如其中由细胞表达的抗体上n-聚糖的所有末端糖残基都是n-乙酰基葡糖胺。

在一个实施例中，该细胞系是具有在相应的聚糖合成途径中有效的突变的凝集素抗性cho突变细胞系或cho细胞系，例如lec3.2.8、lec4.8、lec4a.8、lec8、lec10.8、lec19和lec20，例如lec3.2.8、lec4.8、lec4a.8、lec8和lec10.8。这些细胞系通常具有影响它们n-聚糖合成途径的突变，

例如至少提供udp-gal高尔基体转运蛋白中下调的突变。

在一个实施例中，细胞系是lec8或cho，其在相关的n-聚糖合成途径中具有相应的一种或多种突变。

在一个实施例中，突变位于基因slc35a中，例如slc35a1、slc35a2或两者，特别是在至少slc35a2中的突变。另外突变可包括选自mgat3、mgat5、gne及其组合的一种或多种基因中的那些。

可替代的或另外的突变可以包含b4galt基因(例如b4galt1、b4galt6及其组合)的下调或失活。这些突变导致β4galt-1和β-1,4-半乳糖基转移酶的下调。

在一个实施例中，该突变导致以下特性中的一种或多种：cmp-唾液酸高尔基体转运蛋白的下调，glcnac-tv的下调或错误定位和/或glcnac-tiii的上调。

在一个实施例中，突变的cho细胞系提供糖基化抗体，其中n-聚糖通过抗体重链的恒定区中的氨基酸asn297附接。

可替代地的或此外，可将氨基酸(例如天冬酰胺(asn))工程化到抗体中，例如在铰链区或恒定区中，以提供n-糖基化的底物。

在一个实施例中，所述细胞系是制造细胞系，修饰以包含在n-聚糖合成途径中的突变，特别是本文所述的突变。制造细胞系包括，例如chos细胞系和披露于wo2011/036455、wo2011/086136、wo2011/086138、wo2011/086139和wo2013/007388中的细胞系。

本披露内容在独立方面延伸到在n-聚糖合成途径中修饰的制造细胞，以及制备它们的方法。

在一个实施例中，该方法包括通过将包含轭合底物(在本文中也称为化学官能团)的反应性糖转移到聚糖上在根据本披露的抗体中延伸以n-乙酰基葡糖胺为末端的聚糖的另外的步骤。这种转移可以例如使用转移酶如gal-转移酶进行，以将反应性糖特异性地转移到聚糖上的末端n-乙酰基葡糖胺上。

在一个实施例中，转移酶是galt酶，包括其突变版本，其中一个或两个氨基酸被替换、缺失或添加，例如选自下组，该组包含：y289l、y289f、y289n、y、y289m、289i和r228k，例如y289l，参见例如bojarova等人，glycobiology[糖生物学]2009,19,509通过引用并入本文。

有利的是，即使在使用温和条件时，该方法也导致高水平的特异性转化将反应性糖转移到聚糖上。在一个或多个实施例中，本披露的方法是有效的，例如关于获得的产率和/或所涉及的方法步骤的数量。

在一个实施例中，反应性糖衍生自半乳糖胺。

通常，反应性糖包含选自酮、炔基和叠氮化物的化学官能团，有效载荷可以与其轭合。

在一个实施例中，糖残基选自：

galnaz：

或其单一对映异构体，以及

酮基-gal：

或其单一对映异构体。

上文的反应性半乳糖残基可在本文中表示为galx，其中x为叠氮化物、酮基、醛或炔烃。

可以以udp-糖残基的形式提供糖残基，例如galnaz-udp：

或其单一对映异构体，或

酮基-gal-udp：

或其单一对映异构体。

在一个实施例中，该糖残基作为udp-gal-炔烃提供。

udp在转移中充当离去基团，并且通过酶将反应性糖特异性转移至n-乙酰基葡糖胺。

随后的轭合特异于现在在抗体上聚糖末端的反应性糖中的化学官能团，并且非常有效地进行而不需要使用无机催化剂。有利的是，这几乎不会破坏抗体的天然形式和功能。

因此，在一个实施例中，本披露的方法在本披露的轭合反应中不使用无机催化剂，例如铜催化剂。

此外，由于抗体上的聚糖可被至少两个糖(saccharide/sugar)分子截短，因此与天然存在的聚糖相比，为有效载荷提供了增加的空间。因此，本方法允许大的有效载荷的轭合而不破坏抗体结构和/或功能。

因此，在一个实施例中，该方法包括将有效载荷轭合至根据本披露制备的抗体分子的聚糖上的反应性糖残基中的化学官能团的另外的步骤。

在一个实施例中，该有效载荷选自下组，该组包含毒素、药物分子(例如细胞毒性剂)、聚合物、抗体或其结合片段。在一个实施例中，该药物分子选自下组，该组包含例如美登木素生物碱，例如n2'-脱乙酰基-n2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(dm1)、n2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(dm3)和n2'-脱乙酰基-n2'(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(dm4)。在一个实施例中，该有效载荷是毒素。在一个实施例中，该有效载荷是聚合物，例如该聚合物是天然聚合物，例如淀粉或白蛋白或合成聚合物，例如聚乙烯(peg)。

在一个实施例中，用于将有效载荷连接至本披露的抗体的轭合化学是点击化学，例如无铜点击化学。

在一个方面，本披露延伸至从本文所述方法获得的或可获得的抗体或抗体分子，并延伸至包含其的组合物。

本披露还延伸至本文披露的抗体或抗体分子或组合物，用于治疗，特别是用于治疗癌症。

具体实施方式

cho细胞是本领域技术人员理解的术语，并且如本文所用，是指衍生自中国仓鼠的卵巢的细胞。

如本文所用的n-聚糖是与抗体附接的多糖链，例如通过asn(例如asn297)的侧链。

本文使用的g0聚糖术语可以从附图中确定。除非上下文另有说明，否则该术语一般用于也是指g0f结构。通常，从聚糖附接的氨基酸开始的聚糖结构是：glcnac-glcnac-man(man-glcnac)man-glcnac。第一个glcnac可任选地带有海藻糖残基并且这是g0f。第一个甘露糖残基可任选地带有另外的glcnac残基。

本文中的数字与g1的确切结构相冲突。然而，本文所用的术语是指其中结构g0的每个分支还包含半乳糖残基，即聚糖中存在两个半乳糖残基。g1f构建体在第一个glcnac残基(类似于g0f)上包含海藻糖残基。除非上下文另有说明，否则本文所用的术语g1通常是指g1f。

本文所用的定义的糖基化模式是指例如在重组蛋白(例如抗体)中定义和表达一种或多种聚糖结构的能力。特别地，定义的糖基化模式确保大多数抗体分子具有预期的聚糖结构(在本文中也称为糖基化模式)。

在一个实施例中，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％所表达的抗体分子具有预期或预测的聚糖结构。

因此，在一个方面，提供了具有定义的糖基化模式的抗体群，例如其中群体中的大多数抗体包含g0聚糖，例如其中抗体糖基化模式由g0聚糖，特别是位于asn297上的g0聚糖组成。

衍生一些lec细胞系的亲本细胞系是pro^-5，其具有导致b4galt6不表达的遗传改变，参见lee等人，jbiolchem[生物化学杂志]2001，4月27日；276(17)；13924-34，通过引用并入本文。

lec3.2.8细胞系在cmp-唾液酸高尔基体转运蛋白和udp-gal高尔基体转运蛋白的表达中下调。在遗传水平上，基因gne和slc35a1以及slc35a2中存在突变，参见hong和stanley2003j.biol.chem.[生物化学杂志]278，53045-53054，通过引用并入本文。

lec4.8细胞系在cmp-唾液酸高尔基体转运蛋白、udp-gal高尔基体转运蛋白、glcnac-ti、glcnac-tv和错误定位的glcac-tv的表达中下调。在遗传水平上，slc35a2和mgat5中存在缺失，参见olemann等人，2001j.biol.chem.[生物化学杂志]276,26291-26300，通过引用并入本文。

lec4a.8细胞系在udp-gal高尔基体转运蛋白中下调并且相对于glcac-tv错误定位。在遗传水平上，slc35a2和mgat5中存在缺失，参见olemann等人，2001j.biol.chem.[生物化学杂志]276,26291-26300。

lec8细胞系在udp-gal高尔基体转运蛋白中具有下调。在遗传水平上，它们在slc35a2orf中发生突变，参见olemann等人，2001j.biol.chem.[生物化学杂志]276,26291-26300，通过引用并入本文。从该细胞产生的抗体具有以n-乙酰葡糖胺为末端的n-聚糖，即是g0或g0f聚糖。

lec10.8细胞系在udp-gal高尔基体转运蛋白中具有下调以及在glcnac-tiii中具有上调。在遗传水平上，在mgat3和slc35a2中存在突变，参见stanley等人，1991glycobiology[糖生物学]1,307-314，通过引用并入本文。

lec19在β-1,4-半乳糖基转移酶中下调。在遗传水平上，存在六种b4galt6基因表达的下调，参见lee等人，2003biochemistry[生物化学]42,12349-12357，通过引用并入本文。

lec20在β4-galt1中下调。在遗传水平上，存在基因b4galt1的表达失活或下调，lee等人，2001j.biol.chem.[生物化学杂志]276,13924-13934，通过引用并入本文。

在一个实施例中，提供了突变的cho细胞系，例如具有至少一个突变的制造细胞系，该至少一个突变独立地选自下组，该组包含其中b4galtb不表达或不以活性形式表达的突变；提供cmp-唾液酸下调的突变；提供udp-gal高尔基体转运蛋白下调的突变；提供g1cnac-ti下调的突变；提供g1cnac-tv和错误定位的g1cac-tv下调的突变；提供β-1,4半乳糖基转移酶下调的突变；提供β4-galt1下调的突变；以及所述突变中两个或更多个的组合。

在一个实施例中，提供了突变的cho细胞系，例如制造细胞系，其中突变在至少一个独立地选自以下的基因中：b4galt6、gne、slc35a1、slc35a2、mgat5、mgat3以及它们中的两个或更多个的组合。

仅使用常规技术，存在许多技术人员可以使重组细胞系，例如cho细胞系工程化以具有本文所述的官能团(functionality)的方法。

如本文所用的制造细胞系是一种细胞系，其被充分表征并且对于制造用于人类治疗(例如抗体及其结合片段)的重组蛋白是安全的。该细胞系可能已被监管机构批准，例如用于制备抗体。通常，制造细胞系已经针对商业规模制造进行了优化，并且通常将提供“良好”产量的具有所需折叠和活性的重组蛋白(例如抗体及其结合片段)。

本文披露的酶的突变版本是活性酶，其中与野生型未突变酶相比，酶序列中的一个或两个(例如一个)氨基酸被独立地替换、添加或缺失，同时保留或增强酶的功能。如本文所用的“活性酶”是催化反应并具有相应的未突变酶(起始或野生型酶)的至少50％活性的酶。

保留或增强如本文所用酶的功能是指其中酶是‘如上定义的活性酶’或其中突变酶与未突变/野生型酶相比具有更高活性或另外活性。如本文所用的‘另外活性’是未突变的酶不具有的活性。更高的活性是指与相应的未突变酶相比，突变酶中的活性增加、加强或改进。

在一个实施例中，酶是galt酶，即半乳糖-1-磷酸尿苷基转移酶(ec2.7.7.12)，例如galt野生型或β-(1,4)gal-t1突变体，如其中野生型氨基酸序列中的y289被可替代的氨基酸替换，具体地是galt(y289l)、galt(y289n)、galt(y289f)和galt(y289m)，更具体地是galt(y289l)。突变的酶能够转移反应性糖，例如galnaz(例如来自udp-galnaz)和酮基-gal(例如来自udp-酮基-gal)。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”可在本文中互换使用，并且包括全长抗体及其任何抗原结合片段，单链和包含它们的多特异性(例如双特异性)抗体分子。

在一个实施例中，该galt是重组的。在一个实施例中，该酶是哺乳动物，例如人或牛。

在一个实施例中，根据本披露编码和表达的抗体包含至少一个，例如一个n-糖基化位点，例如asn297。在一个实施例中，本披露的抗体包含ch2结构域或包含asn297残基的其片段。在一个实施例中，该ch3结构域存在。在一个实施例中，该ch3结构域不存在。

在一个实施例中，本披露的抗体分子包含fc区。

该fc区包括包含抗体除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽及其片段。因此，对于igg，“fc区”是指ch2和ch3，并且任选地在这些结构域的n-末端的全部或部分柔性铰链区。术语“fc区”可以指分离的这个区域，或在抗体、抗体片段、或fc融合蛋白的背景下的这个区域。

在一个实施例中，本披露的抗体分子包含轻链。

每个轻链包含轻链可变区(本文缩写为vl、vl区或vl结构域)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域cl构成。

在一个实施例中，本披露的抗体分子包含具有可变重链区(本文缩写为vh、vh区或vh结构域)的重链。

vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其间插入更保守的称为构架区(fw)的区域。每个vh和vl由三个cdr和四个fw构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fw1、cdr1、fw2、cdr2、fw3、cdr3、fw4。可以根据它们各自的vh和vl区指定框架区。因此，例如，vh-fw1将是指vh的第一框架区。

重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因素(包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。

典型的全长抗体包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链。每个重链包含重链可变区(本文缩写为vh、vh区或vh结构域)和重链恒定区。重链恒定区包含三个或四个恒定结构域ch1、ch2、ch3和ch4。

术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子或其抗原结合片段的可变区内的至少一个抗原识别位点(也称为结合位点)识别并特异性地结合靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、或上述物质的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，抗体片段(例如fab，fab'，f(ab')2和fv片段)，单链抗体片段(scfv和二硫键稳定化的scfv(dsfv))，多特异性抗体(例如从至少两种不同抗体产生的双特异性抗体或从抗体片段形成的多特异性抗体)(参见，例如，pct公开wo96/27011、wo2007/024715、wo2009018386、wo2009/080251、wo2013006544、wo2013/070565和wo2013/096291)，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包含抗体的抗原结合片段的融合蛋白，以及包含抗原结合片段的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出所希望的生物学活性。

抗体可以是以下五大类免疫球蛋白中的任一种：iga、igd、ige、igg和igm，或亚类(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)，或同种异型(例如gm，例如g1m(f、z、a或x)、g2m(n)、g3m(g、b或c)、am、em和km(1、2或3))。不同类别的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、美洲驼、骆驼、兔、狗、猫、小鼠等等，或其他动物，如鸟类(例如鸡)。

术语“抗原结合片段”是指包含完整抗体的抗原性决定可变区的片段。本领域已知，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2，fv片段，scfvs，线性抗体，单链抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。

因此，在一个实施例中，本发明中使用的抗体可包含具有全长重链或轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于fab、修饰的fab、fab'、修饰的fab'、f(ab’)2、fv、单结构域抗体(例如vh或vl或vhh)、scfv、二、三或四价抗体、bis-scfv、双抗体、三抗体、四抗体、其组合和以上中任一种的表位结合片段。

然而，抗体及其结合片段必须包含至少一个糖基化位点，例如n-糖基化位点。

在一个实施例中，糖基化位点不位于cdr中。

在一个实施例中，对于小抗体结合片段，例如scfv，在接头中工程化的糖基化位点。

在一个实施例中，本披露的抗体是单克隆的。

特别考虑的其他抗体是“寡克隆”抗体，它是不同单克隆抗体的预定混合物。参见，例如，pct公开wo95/20401；us5,789,208和us6,335,163。适合的寡克隆抗体由针对在单个细胞中产生的一个或多个表位的抗体的预定混合物组成。更适合地，寡克隆抗体包含能够与共同轻链配对以产生具有多种特异性的抗体的多个重链(例如，wo04/009618)。当需要靶向单个靶分子上的多个表位时，寡克隆抗体是特别有用的。本领域技术人员将知道或可以确定哪种类型的抗体或抗体混合物适用于预期目的和所希望的需要。

特别考虑用于本披露的方法的其他结合蛋白部分是小的工程化蛋白结构域，例如骨架(参见例如，us2003/0082630和us2003/0157561)。骨架是基于已知的天然存在的非抗体结构域家族，特别是蛋白质细胞外结构域，其通常具有小尺寸(约100aa至约300aa)并且包含与具有允许插入、缺失或其他取代的高构象耐受性的可变结构域缔合的高度结构化的核心。这些可变结构域可以为任何靶蛋白创建推定的结合界面。通常，通用蛋白骨架的设计由两个主要步骤组成：(i)选择具有所希望特征的适合的核心蛋白质和(ii)通过诱变接受高结构变异性的部分或全部结构域产生复杂的组合文库，以适当的形式展示这些文库(即噬菌体、核糖体、细菌或酵母)和筛选具有所希望的结合特征(例如靶特异性和/或亲和力)的诱变骨架的文库。亲本骨架的结构可以是高度多样化的并且包括高度结构化的蛋白质结构域，包括但不限于fniii结构域(例如，adnectins，参见例如proteineng.des.sel.[蛋白质工程，设计和选择]18,435-444(2005)，us2008/00139791，和wo2005/056764，tn3，参见例如，wo2009/058379和wo2011/130324)；蛋白质a的z结构域(affibody，参见，例如，proteineng.des.sel.[蛋白质工程，设计和选择]17,455-462(2004)和ep1641818a1)；来自ldl受体的结构域a(avimers，参见，例如，naturebiotechnology[自然生物技术]23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs[对研究药物的专家观点]16(6),909-917(2007年6月))；锚蛋白重复结构域(darpins，j.mol.biol.[分子生物学杂志]332,489-503(2003)，pnas(2003)和biol.[生物学]369,(2007)和wo02/20565)；c型凝集素结构域(tetranectins，参见，例如，wo02/48189)。如果需要，可以将两个或多个这样的工程化骨架结构域连接在一起，以形成多价结合蛋白。根据使用途/疾病适应症，单个结构域可靶向单一类型的蛋白质或若干种类型的蛋白质。

上面讨论的部分需要至少一个糖基化位点，如果合适，可以使用常规方法将其工程化到重组分子中。

因此，在一个独立的方面，本文提供了工程化到结合蛋白分子适合的糖基化位点(例如n-糖基化位点)的预备步骤。

几乎任何分子(或其部分，例如亚基、结构域、基序或表位)可以被抗体靶向，该抗体包括但不限于：包括离子通道、离子泵、g蛋白偶联受体、结构蛋白质的整合膜蛋白；粘着蛋白，例如整联蛋白；转运蛋白；参与信号转导的蛋白质和脂质锚定蛋白(包括g蛋白)、酶例如激酶(包括膜锚定激酶、膜结合酶)、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、脂肪酸合成酶、消化酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)、溶菌酶、聚合酶；受体如激素受体、淋巴因子受体、单核因子受体、生长因子受体、细胞因子受体；细胞因子；和更多。

在一些方面，本披露的方法中使用的抗体靶向和/或并入选自如下的生长因子、细胞因子、细胞因子相关蛋白、生长因子、受体配体或受体的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)，例如：bmp1、bmp2、bmp3b(gdf10)、bmp4、bmp6、bmp8、csf1(m-csf)、csf2(gm-csf)、csf3(g-csf)、epo、fgf1(αfgf)、fgf2(βfgf)、fgf3(int-2)、fgf4(hst)、fgf5、fgf6(hst-2)、fgf7(kgf)、fgf9、fgf10、fgf11、fgf12、fgf12b、fgf14、fgf16、fgf17、fgf19、fgf20、fgf21、fgf23、fgfr、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fgfrl1、fgfr6、igf1、igf2、igf1r、igf2r、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifnar1、ifnar2、ifnb1、ifng、ifnw1、fil1、fil1(epsilon)、fil1(zeta)、il1a、il1b、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il10、il11、il12a、il12b、il13、il14、il15、il16、il17、il17b、il18、il19、il20、il22、il23、il24、il25、il26、il27、il28a、il28b、il29、il30、il2ra、il1r1、il1r2、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il7r、il8ra、il8rb、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17r、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il18r1、il20ra、il20rb、il21r、il22r、il22ra1、il23r、il27ra、il28ra、pdgfa、pdgfb、pdgfra、pdgfrb、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr3、acvrl1、gfra1、lta(tnf-β)、ltb、tnf(tnf-α)、tnfsf4(ox40配体)、tnfsf5(cd40配体)、tnfsf6(fasl)、tnfsf7(cd27配体)、tnfsf8(cd30配体)、tnfsf9(4-1bb配体)、tnfsf10(trail)、tnfsf11(trance)、tnfsf12(apo3l)、tnfsf13(april)、tnfsf13b、tnfsf14(hvem-l)、tnfsf15(vegi)、tnfsf18、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf10a(trail-受体)、tnfrsf10b(trail-受体2)、tnfrsf10c(trail-受体3)、tnfrsf10d(trail-受体4)、figf(vegfd)、vegf、vegfb、vegfc、kdr、flt1、flt4、nrp1、il1hy1、il1rap、il1rapl1、il1rapl2、il1rn、il6st、il18bp、il18rap、il22ra2、aif1、hgf、lep(瘦素)、ptn、alk以及thpo。

在一些方面，本披露的方法中使用的抗体靶向和/或并入选自如下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白质的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)，例如ccl1(i-309)、ccl2(mcp-1/mcaf)、ccl3(mip-1a)、ccl4(mip-1b)、ccl5(rantes)、ccl7(mcp-3)、ccl8(mcp-2)、ccl11(嗜酸性粒细胞活化趋化因子)、ccl13(mcp-4)、ccl15(mip-1d)、ccl16(hcc-4)、ccl17(tarc)、ccl18(parc)、ccl19(mip-3b)、ccl20(mip-3a)、ccl21(slc/二级淋巴组织趋化因子(exodus-2))、ccl22(mdc/stc-1)、ccl23(mpif-1)、ccl24(mpif-2/嗜酸性粒细胞活化趋化因子-2)、ccl25(teck)、ccl26(嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3)、ccl27(ctack/ilc)、ccl28、cxcl1(gro1)、cxcl2(gro2)、cxcl3(gro3)、cxcl5(ena-78)、cxcl6(gcp-2)、cxcl9(mig)、cxcl10(ip10)、cxcl11(i-tac)、cxcl12(sdf1)、cxcl13、cxcl14、cxcl16、pf4(cxcl4)、ppbp(cxcl7)、cx3cl1(scyd1)、scye1、xcl1(淋巴细胞趋化因子)、xcl2(scm-1b)、blr1(mdr15)、ccbp2(d6/jab61)、ccr1(ckr1/hm145))、ccr2(mcp-1rb/ra)、ccr3(ckr3/cmkbr3)、ccr4、ccr5(cmkbr5/chemr13)、ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)、ccr7(ckr7/ebi1)、ccr8(cmkbr8/ter1/ckr-l1)、ccr9(gpr-9-6)、ccrl1(vshk1)、ccrl2(l-ccr)、xcr1(gpr5/ccxcr1)、cmklr1、cmkor1(rdc1)、cx3cr1(v28)、cxcr4、gpr2(ccr10)、gpr31、gpr81(fksg80)、cxcr3(gpr9/ckr-l2)、cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)、hm74、il8ra(il8ra)、il8rb(il8rb)、ltb4r(gpr16)、tcp10、cklfsf2、cklfsf3、cklfsf4、cklfsf5、cklfsf6、cklfsf7、cklfsf8、bdnf、c5r1、csf3、grcc10(c10)、epo、fy(darc)、gdf5、hif1a、il8、prl、rgs3、rgs13、sdf2、slit2、tlr2、tlr4、trem1、trem2、以及vhl。

在一些方面，本披露的方法中使用的抗体靶向和/或并入选自如下的蛋白质的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素a-链；胰岛素b-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子vii、因子viiic、因子ix、组织因子(tf)和血管性假血友病因子(vonwillebrandsfactor)；抗凝血因子，例如蛋白质c；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原活化剂(t-pa)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；rantes(通常在活化时调节所表达和分泌的t细胞)；人巨噬细胞炎症蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；缪勒管激素(muellerian)-抑制物质；松弛素a-链；松弛素b-链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素关联肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；dna酶；ige；细胞毒性t-淋巴细胞相关抗原(ctla)，例如ctla-4；抑制素；激活素；蛋白质a或d；类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(bdnf)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)，或神经生长因子；表皮生长因子(egf)；胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白质例如cd2、cd3、cd4、cd8、cd11a、cd14、cd18、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd33、cd34、cd40、cd40l、cd52、cd63、cd64、cd80和cd147；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；超氧化物歧化酶；t-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如像aids包膜的部分，例如gp120；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；细胞黏附分子例如lfa-1、mac1、p150.95、vla-4、icam-1、icam-3和vcam、a4/p7整合素，和(xv/p3整合素，其包括a或其亚基，整合素α亚基例如cd49a、cd49b、cd49c、cd49d、cd49e、cd49f、α7、α8、α9、αd、cd11a、cd11b、cd51、cd11c、cd41、αiib、αielb；整合素β亚基例如cd29、cd18、cd61、cd104、β5、β6、β7和β8；整合素亚基组合包括但不限于，αvβ3、αvβ5和α4β7；凋亡途径的成员；ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(ob)受体；mpl受体；ctla-4；蛋白质c；eph受体例如epha2、epha4、ephb2等；人白细胞抗原(hla)例如hla-dr；补体蛋白例如补体受体cr1、c1rq和其他补体因子例如c3和c5；糖蛋白受体例如gpibα、gpiib/iiia和cd200。

还考虑了特异性结合和/或包含癌抗原的抗体，癌抗原包括但不限于alk受体(多效蛋白受体)、多效蛋白、ks1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(ca125)；前列腺酸磷酸盐；前列腺特异性抗原(psa)；黑色素瘤相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(hmw-maa)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(cea)；多形上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结直肠肿瘤相关抗原例如：cea、tag-72、co17-1a、gica19-9、cta-1和lea；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；cd19；人b-淋巴瘤抗原-cd20；cd33；黑色素瘤特异性抗原例如神经节苷脂gd2、神经节苷脂gd3、神经节苷脂gm2和神经节苷脂gm3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(tsta)；病毒诱导的肿瘤抗原包括t-抗原、dna肿瘤病毒和rna肿瘤病毒的包膜抗原；肿瘤胚胎抗原-甲胎蛋白如结肠cea、5t4肿瘤胚胎滋养细胞糖蛋白和膀胱肿瘤肿瘤胚胎抗原；分化抗原如人肺癌抗原l6和l20；纤维肉瘤抗原；人白血病t细胞抗原-gp37；拟糖蛋白；鞘脂；乳腺癌抗原如egfr(表皮生长因子受体)；ny-br-16、ny-br-16、her2抗原(p185her2)和her3；多形上皮粘蛋白(pem)；恶性人淋巴细胞抗原-apo-1；发现于胎儿红细胞中的分化抗原例如i抗原；发现于成人红细胞中的原内胚层i抗原；植入前胚胎；发现于胃腺癌中的i(ma)；发现于乳腺上皮中的m18、m39；发现于骨髓细胞中的ssea-1；vep8；vep9；myl；vim-d5；发现于结直肠癌中的d156-22；tra-1-85(血型h)；发现于睾丸和卵巢癌中的scp-1；发现于结肠腺癌中的c14；发现于肺腺癌中的f3；发现于胃癌中的ah6；y半抗原；发现于胚胎癌细胞中的ley；tl5(血型a)；发现于a431细胞中的egf受体；发现于胰腺癌中的e1系列(血型b)；发现于胚胎癌细胞中的fc10.2；胃腺癌抗原；发现于腺癌中的co-514(血型lea)；发现于腺癌中的ns-10；co-43(血型leb)；发现于a431细胞的egf受体中的g49；发现于结肠腺癌中的mh2(血型aleb/ley)；发现于结肠癌中的19.9；胃癌黏蛋白；发现于骨髓细胞中的t5a7；发现于黑色素瘤中的r24；发现于胚胎癌细胞中的4.2、gd3、d1.1、ofa-1、gm2、ofa-2、gd2和m1:22:25:8以及发现于4至8-细胞阶段胚胎中的ssea-3和ssea-4；皮肤t细胞淋巴瘤抗原；mart-1抗原；sialytn(stn)抗原；结肠癌抗原ny-co-45；肺癌抗原ny-lu-12变体a；腺癌抗原art1；副肿瘤相关脑-睾丸-癌抗原(副肿瘤性抗原ma2；副肿瘤神经元抗原)；神经肿瘤腹抗原2(nova2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原co-029；肿瘤相关抗原mage-c1(癌/睾丸抗原ct7)、mage-b1(mage-xp抗原)、mage-b2(dam6)、mage-2、mage-4a、mage-4b和mage-x2；癌症-睾丸抗原(ny-eos-1)和任何以上列出的多肽的片段。

在一个实施例中，根据本披露的方法包括用半乳糖苷酶或其突变版本处理从本披露的过方法达的糖基化抗体的预备步骤，以确保抗体上的聚糖是均一的。然而，通常不需要该步骤，因为有利地是，通过本披露的方法表达的抗体相对于产生的抗体群体的聚糖翻译后修饰模式是均一的。

除非上下文另有说明，否则本文所用的底物是指酶作用的分子或其片段。

在本方法中，(通过转移酶转移反应性糖到底物上的)底物中的特征实体是它包含与抗体连接的n-聚糖上的末端n-乙酰基葡糖胺残基。

n-乙酰基葡糖胺具有以下结构：

本文所用的反应性糖是指包含化学官能团的糖残基，例如叠氮化物、酮基或炔基基团，它们能够参与化学轭合反应，并且通过它们最终有效负载将与抗体上的聚糖连接。

如本文所用的糖残基中的化学官能团是能够通过化学键(特别是共价键)与有效载荷中的官能团轭合的基团。

叠氮化物、酮基、醛和炔基在本说明书的上下文中给出了它们的普通化学含义。

通常将化学官能团附加到糖环上，使得糖保持其特性/名称(后者基于环结构)。因此，衍生自糖，例如本文所用的半乳糖是指保留原始糖环结构并且官能团附加到环上的情况，参见例如实例中提供的合成路线。因此，通常官能团不是糖环构造的一部分。

能够在轭合反应中形成适合的共价键的化学品的实例是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于下面例举的那些。

当功能性化学基团是叠氮化物点击化学时，例如无铜点击化学可以与有效载荷中的适当官能团结合使用用于轭合，例如可以使用dibo修饰的有效载荷。

本文所用的轭合的是指通过形成化学共价键将两种化合物或分子或片段连接在一起。点击化学已被设计为快速轭合两个实体，每个实体包含适当的化学官能团。

本领域技术人员将清楚，一个在抗体中和一个在有效载荷中的一对官能团反应形成共价键并将两个实体轭合在一起，例如叠氮化物可以在轭合反应中与炔烃反应。当设计抗体和合成或半合成有效载荷分子时，可以选择将哪个功能性化学基团并入哪个实体中。

在一个实施例中，将反应性糖中的叠氮化物实体与本披露的抗体分子上的聚糖附接。在相应的有效载荷中，官能团可以是适合与叠氮化物反应的多个反应配偶体之一，包括例如但不限于炔基。

在一个实施例中，可以使用酮基官能团，例如在与本披露的抗体上的聚糖附接的反应性糖中包含-c(o)ch3的酮基官能团，例如在肟化反应中将抗体与有效载荷轭合。

在一个实施例中，与本披露的抗体上的聚糖附接的反应性糖中的醛官能团可以用于与有效载荷中的胺(例如有效载荷中的伯胺或仲胺)反应。

在一个实施例中，与本披露的抗体中的聚糖附接的反应性糖中的炔基官能团可以在与有效载荷中的叠氮化物的反应中使用，例如使用化学物如点击化学，特别适合的是无铜点击化学。

点击化学

点击化学轭合反应的实例包括使用包含叠氮化物的分子的那些，所述叠氮化物与例如包含click-mates^tm炔烃(例如5-炔丙基氧基-ducep、5-辛二炔基-ducep、炔基改性剂-c6-dtcep、5-(炔丙基氧基)-2'-脱氧尿苷、5-(1,7-辛二炔-1-基)-2'-脱氧尿苷、5-辛二炔基-tms-ducep、5-辛二炔基-tms-dccep、5-辛二炔基-dccep、5-辛二炔基-tips-ducep)的组分反应。该化学使用铜催化剂，并且对于药物制剂，它可能希望避免使用铜催化剂。

如上所述，抗体组分可以根据需要设计为含有叠氮化物、醛或炔基官能团(特别是叠氮化物或醛官能团)，并且有效载荷可以设计为包含相关的轭合配偶体。然而，在一个实施例中，有效载荷包含炔基官能团，并且抗体包含叠氮化物官能团。

适用于无铜反应的试剂可从例如click-炔烃获得，其包括bcncepi、bcncepii、bcn-n-羟基琥珀酰亚胺酯i，bcn-n-羟基琥珀酰亚胺酯ii，mfco-n-羟基琥珀酰亚胺酯和mfcocep。这些试剂通常与目的分子中的叠氮化物反应。

在一个实施例中，例如与有效载荷附接的炔烃点击试剂选自oct、difo、dibo、bcn、barac、difbo、硫代oct、硫代difbo、tmth、二苯并环辛基(dbco)和

这些试剂可以例如用于以下方案中所示类型的反应中，其中生物分子代表抗体-聚糖-反应性糖并且标签代表有效载荷：

这些试剂的化学结构如下所示：

所示结构是来自无铜点击化学的硫代环炔烃的提取物(angew，cheminted.[应用化学-国际版]2012,51,2443-2447)。

dbco具有以下结构：

在一个实施例中，例如包含炔烃作为多环系统的一部分的片段可能最适合并入有效载荷中。

在一个实施例中，有效载荷中的官能团是点击化学试剂的衍生物，例如具有以下结构的生物素dibo炔烃：

其中生物素是有效载荷。

显然，生物素可以被大量合成分子、半合成分子、生物分子、聚合物、毒素、放射性核苷酸、荧光标记等中任一种替换。

click-马来酰亚胺dibo炔烃是可商购的，并且马来酰亚胺可用于将dibo轭合至所希望的有效载荷。

在一个实施例中，本披露的方法在根据本披露的方法中的轭合步骤中使用无铜点击化学，例如本披露的抗体与有效载荷之间的轭合步骤。各种无铜点击化学试剂可商购获得，并且可以用于根据本披露的方法中。以下可从英杰公司(invitrogen)获得(括号中为目录号)：

(c10405)click-dibo-alexa488*用于无铜点击化学*，

(c10406)click-dibo-alexa555*用于无铜点击化学*，

(c10407)click-dibo-alexa594*用于无铜点击化学*，

(c10408)click-dibo-alexa647*用于无铜点击化学*，

(c10410)click-dibotamra*用于无铜点击化学*，

(c10411)click-dibo胺*用于无铜点击化学*，

(c10412)click-dibo生物素*用于无铜点击化学*，

(c10413)click-dibo马来酰亚胺*用于无铜点击化学*，以及

(c10414)click-dibo琥珀酰亚胺酯*用于无铜点击化学*。

包含相关化学官能团的相关产品包括以下荧光标记(即后者是有效载荷)：

(a10044)edu(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)：(a10266)alexa488叠氮化物(alexa4885-甲酰胺基-(6-叠氮基己基)二(三乙基铵盐))：(a10267)alexa488炔烃(alexa4885-甲酰胺基-(炔丙基)，二(三乙基铵盐))：(a20012)alexa555叠氮化物，三乙基铵盐，(a20013)alexa555炔烃，三乙基铵盐；(a10270)alexa594叠氮化物(alexa594甲酰胺基-(6-叠氮基己基)，二(三乙基铵盐))；(a10275)alexa594炔烃(alexa594甲酰胺基-(5-(和6-)炔丙基)，二(三乙基铵盐))；(a10277)alexa647叠氮化物，三乙基铵盐；(a10278)alexa647炔烃，三乙基铵盐；(a10279)炔烃、琥珀酰亚胺酯(3-炔丙基氧基丙酸、琥珀酰亚胺酯)；(a10280)叠氮基(peo)4丙酸，琥珀酰亚胺酯(3-(叠氮基四(乙烯氧基))丙酸，琥珀酰亚胺酯)；(b10184)生物素叠氮化物；(b10185)生物素炔烃；(c10102)click-aha(l-叠氮基高丙氨酸)*用于新生蛋白质合成*；(c10186)click-hpg(l-高炔丙基甘氨酸)*用于新生蛋白质合成*；(c10248)click-法呢基醇，叠氮化物*混合异构体*；(c10249)click-牻牛儿基牻牛儿基醇，叠氮化物*混合异构体*；(c10264)click-海藻糖炔烃(四乙酰基海藻糖炔烃)；(c10265)click-棕榈酸，叠氮化物(15-叠氮基十五烷酸)；(c10268)click-豆蔻酸，叠氮化物(12-叠氮基十二烷酸)；(10269)click-细胞反应缓冲液试剂盒；(c10276)click-蛋白质反应缓冲液试剂盒；(c33365)click-galnaz代谢糖蛋白标记试剂(四乙酰化n-叠氮基乙酰葡糖胺)-用于o-连接的糖蛋白；(c33366)click-mannaz代谢糖蛋白标记试剂(四乙酰化n-叠氮基乙酰基-d-甘露糖胺)-*用于唾液酸糖蛋白；(c33367)click-glcnaz代谢糖蛋白标记试剂(四乙酰化n-叠氮基乙酰葡糖胺)-用于o-glcnac-修饰的蛋白质；(c33368)click-o-glcnacglcnac酶标记系统-用于o-连接的glcnac糖蛋白；(c33370)click-四甲基罗丹明(tamra)蛋白质分析检测试剂盒；(c33371)click-蛋白质分析检测试剂盒；(c33372)click-生物素蛋白质分析检测试剂盒；(10187)edu(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)；(i10188)碘乙酰胺叠氮化物；(i10189)碘乙酰胺炔烃；(o10180)oregon488叠氮化物(oregon4886-甲酰胺基-(6-叠氮基己基)，三乙基铵盐)；(o10181)oregon488炔烃*6-异构体；(t10182)四甲基罗丹明(tamra)叠氮化物(四甲基罗丹明5-甲酰胺基-(6-叠氮基己基))*5-异构体*；(t10183)四甲基罗丹明(tamra)炔烃(5-羧基四甲基罗丹明，炔丙基酰胺)*5-异构体*。

如果炔基官能团存在于与本披露的抗体上的聚糖附接的反应性糖中，则可以在有效载荷中使用例如click的叠氮化物化学。用于并入到有效载荷中的适合的试剂包括：(bt-107s)脱硫生物素-teg叠氮化物；(bt-1085)生物素-teg叠氮化物；(fc-8150)叶酸-teg叠氮化物；(bt-8160)生育酚-teg；(fd-13005)水可溶性丹酰-teg叠氮化物；(ff6110)6-羧基荧光素-teg叠氮化物；(lk4270)氨氧基-teg叠氮化物；(bl3030)bbq-650^tm-teg叠氮化物；(ff6130)6-tet-teg叠氮化物；(lk4310)基-teg叠氮化物；(fc8170)pqq-teg叠氮化物；(fc8180)胆甾醇-teg叠氮化物；(ps5030)补骨脂素-teg叠氮化物；(db8010)dabcyl-teg叠氮化物；(fc8190)dtpa-喹诺酮-teg叠氮化物；(fc8200)叠氮基香豆素n-羟基琥珀酰亚胺酯；(f8205)叠氮基香豆素-间隔子-12-甲酸胺；(fc8210)叠氮基香豆素-间隔子-6甲酸酯；(fc8215)叠氮基香豆素-间隔子-12马来酰亚胺。

工艺参数

表达抗体后的工艺参数可用于控制获得的聚糖和轭合的产物。如图10所示，可以使用突变酶如gait的的浓度来将反应性糖添加到抗体中可用的所有4种可能的n-聚糖底物中。因此，4.0μm和更高的浓度(例如4.5μm)的酶提供4个反应性糖/抗体的分子比。

通过使用小于4μm的酶浓度，例如3.5μm，可以提供3个反应性糖/抗体的分子比。

反应性糖试剂(例如udp-galnaz)的浓度也可用于控制转移至每种抗体的反应性糖的比例，例如，0.5mm或更高的浓度提供4种反应性糖/抗体的比例。相反，约0.4mm和更低，例如0.3mm的浓度提供了3个反应性糖/抗体分子的比例。

在一个实施例中，轭合反应中使用的有效载荷的分子当量可用于控制在最终产物中获得的有效载荷/抗体分子的比例，例如5或更高的比例，例如至少6个有效载荷分子/抗体提供最终产物，其中4个有效载荷分子与抗体轭合。当然，这需要在每个抗体分子中存在4个反应性糖(并且如上所述，这可能是或也可能不是这种情况)。相反，在轭合反应中使用少于5个有效载荷分子/抗体的比例可用于提供具有3个有效载荷分子/抗体的最终抗体轭合物。

有效载荷分子

本文所用的有效载荷是指分子或组分(包括片段或化学实体)，该分子或组分旨在通过与抗体轭合而“递送”到靶标区域，所述抗体将该分子或组分“引导”到所需位置的靶标区域。通常，有效载荷将是效应分子，例如选自下组，下组由以下组成：毒素，例如细胞毒素，包括化学治疗剂、药物、前药、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、抗体或其片段、合成或天然存在的聚合物、多核苷酸或寡核苷酸及其片段，例如dna，rna及其片段(例如，反义分子或基因)、放射性核素，特别是放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子和报告基团如荧光化合物或可通过nmr或esr光谱检测的化合物。

在一个实施例中，该有效载荷选自下组，该组包含：毒素、药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、dna、rna、sirna、rnai、微小rna、肽核酸、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、非天然氨基酸、肽、脂质、聚合物、碳水化合物、支架分子、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期延长剂、捕获标签、螯合剂、固相支撑体、或其组合。

在一个实施例中，有效载荷是药物分子(在本文中也称为药物)。本披露中使用的药物分子的实例包括氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、cox-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位化合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mtor抑制剂、热休克蛋白(hsp90)抑制剂、蛋白体抑制剂、hdac抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、cpt-11、或其组合，并且其中轭合是。

在具体方面中，该药物是氨磷汀、顺铂、达卡巴嗪、更生霉素、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(carrnustine)、洛莫司汀、阿霉素脂、吉西他滨、柔红霉素、柔红霉素脂、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、10-羟基-7-乙基-喜树碱(sn38)、吉非替尼、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、依立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙立德、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥芳香酶抑制剂，以及其组合。

在一个实施例中，该药物选自包含以下的组，该组包含：烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶i抑制剂、紫杉烷和苏拉明。

在一个实施例中，毒素是指细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死)的任何试剂。实例包括aplidin、阿那曲唑、氮杂胞苷、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、风车子抑碱、卡莫司汀、多拉司他汀、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物碱、海绵毒素(spongistatins)、根霉素、软海绵素(halichondrins)、杆孢菌素(roridins)、hemiasterlins、紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。

在一个实施例中，所述药物(在此情况下也为细胞毒素)包含抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷基化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素c和顺式二胺二氯铂(ii)(ddp)顺铂)、卡铂、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(旧称道诺霉素)和多柔比星或多柔比星葡糖苷酸)、抗生素类(例如放线菌素d(旧称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素(amc)、刺孢霉素(calicheamicin)或duocarmycins)以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。

在一些方面中，该药物是奥瑞斯他汀(us5,635,483；us5,780,588)，例如mmae(单甲基奥瑞斯他汀e)或mmaf(单甲基奥瑞斯他汀f)。在其他方面中，该药物是多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物或衍生物。多拉司他汀和奥瑞斯他汀已显示干扰微管动力学、gtp水解以及核与细胞分裂(woyke等人，antimicrob.agentsandchemother[抗微生物制剂与化学疗法]45:3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(us5,663,149)。多拉司他汀或奥瑞斯他汀药物部分可以通过肽药物部分的n(氨基)末端或c(羧基)末端附接到轭合化合物。参见wo2002/088172，其通过引用以其全文并入本文。

在其他方面中，该药物是美登木素生物碱。在一些方面中，该美登木素生物碱是

n2'-脱乙酰基-n2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(dm1)、n2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(dm3)或n2'-脱乙酰基-n2'(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(dm4)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素从东非灌木齿叶美登木(maytenusserrata)中首次分离(美国专利号3,896,111)。随后地，发现某些微生物也产生诸如美登醇和c-3美登醇酯的美登木素生物碱(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如us4,137,230；us4,248,870；us4,256,746；us4,260,608；us4,265,814；us4,294,757；us4,307,016；us4,308,268；us4,308,269；us4,309,428；us4,313,946；us4,315,929；us4,317,821；us4,322,348；us4,331,598；us4,361,650；us4,364,866；us4,424,219；us4,450,254；us4,362,663；和us4,371,533中，其通过引用以其全文并入本文。

美登木素生物碱药物部分是抗体药物轭合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生相对易于制备，(ii)可以与适于通过非二硫化接头轭合至抗体的官能团进行衍生作用，(iii)在血浆中稳定，以及(iv)有效抵抗各种肿瘤细胞系。例如，在us5,208,020、us5,416,064和ep0425235；liu等人，proc.natl.acad.sci.usa[国国家科学院院报]93:8618-8623(1996)(描述的包含名为dm1的美登木素生物碱的免疫轭合物)；以及chari等人，cancerresearch[癌症研究]52:127-131(1992)中披露了含有美登木素生物碱的轭合物、制备该轭合物的方法以及它们的治疗性用途，其通过引用以其全文并入本文。

美登木素生物碱是本领域中熟知的并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。适合的美登木素生物碱披露于例如us5,208,020中。示例性美登木素生物碱药物部分包括具有修饰芳环的那些，诸如：c-19-脱氯(us4,256,746)(通过氢化锂铝还原安丝菌素(ansamytocin)p2来制备)；c-20-羟基(或c-20-脱甲基)+/-c-19-脱氯(us4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌进行脱甲基作用或使用lah进行脱氯作用来制备)；以及c-20-脱甲基、c-20-酰氧基(-ocor)、+/-脱氯(us4,294,757)(通过使用酰氯进行酰化作用来制备)，以及具有在其他位置处的修饰的那些药物部分。示例性美登木素生物碱药物部分还包括具有诸如以下修饰的那些：c-9-sh，过美登醇与h2s或p2s5反应来制备(us4,424,219)；c-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/ch2or)(us4,331,598)；c-14-羟甲基或酰氧基甲基(ch2oh或ch2oac)，由诺卡氏菌属制备(us4,450,254)；c-15-羟基/酰氧基，通过由链霉菌属转化美登醇来制备(us4,364,866)；c-15-甲氧基，从滑桃树(trewianudlflora)分离(us4,313,946和us4,315,929)；c-18-n-脱甲基，通过由链霉菌属脱甲基美登醇来制备(us4,362,663和us4,322,348)；以及4,5-脱氧，通过三氯化钛/lah还原美登醇来制备(us4,371,533)。根据连接的类型，已知美登素化合物上的许多位置适用作连接位置。例如，对于形成酯键，具有羟基的c-3位置、用羟甲基修饰的c-14位置、用羟基修饰的c-15位置以及具有羟基的c-20位置均是适合的。

在一些方面中，该药物是刺孢霉素。抗生素的刺孢霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链dna断裂。对于刺孢霉素家族的轭合物的制备，参见例如us5,712,374、us5,714,586、us5,739,116、us5,767,285、us5,770,701、us5,770,710、us5,773,001、us5,877,296，其通过引用以其全文并入本文。可以使用的刺孢霉素结构类似物包括但不限于γ1i、α2i、α3i、n-乙酰基-γ1i、psag以及θ11(hinman等人，cancerresearch[癌症研究]53:3336-3342(1993)；lode等人，cancerresearch[癌症研究]58:2925-2928(1998)；以及上述的美国氰胺公司(americancyanamid)的美国专利)。

在一些方面中，该药物是微管溶素。微管溶素是从粘细菌物种分离出的一类天然产物中的成员(sasse等人，j.antibiot[抗生素杂质]53:879-885(2000))。作为细胞骨架相互作用剂，微管溶素是抑制微管蛋白聚合并且导致细胞周期停滞和细胞凋亡的有丝分裂毒物(steinmetz等人，chem.int.ed[国际版应用化学]43:4888-4892(2004)；khalil等人，chembiochem.[生物化学]7:678-683(2006)；kaur等人，biochem.j.[生物化学杂志]396:235-242(2006))。微管溶素是极强的细胞毒性分子，超过了任何临床相关传统化学治疗剂(例如，埃博霉素、紫杉醇和长春碱)的细胞生长抑制。此外，它们有效抵抗多重耐药性细胞系(domling等人，mol.diversity[分子多样性]9:141-147(2005))。这些化合物在低皮摩尔范围中显示针对具有ic50值的一组癌细胞系测试的高细胞毒性；因此，它们作为抗癌治疗是有意义的。参见例如国际公开号wo2012/019123，其通过引用以其全文并入本文。例如在us7,776,814披露了微管溶素轭合物。

在一些方面中，该药物是吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)。pbd是相对小的分子并且一些具有识别并共价结合dna小沟中的特异性序列的能力并且因此展现抗生素/抗肿瘤活性。许多pbd及其衍生物是本领域已知的，例如pbd二聚体(例如，sjg-136或sg2000)、c2不饱和pbd二聚体、带有c2芳基取代的吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(例如，sg2285)、通过水解活化的pbd二聚体前药(例如，sg2285)，以及聚吡咯pbd(例如，sg2274)。在wo2000/012507、wo2007/039752、wo2005/110423、wo2005/085251和wo2005/040170以及us7,612,062中进一步描述pbd，这些专利各自均通过引用以其全部内容并入本文。

在一些方面中，该毒素包含例如相思豆毒素、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒素、番木鳖碱、河豚毒素、皂苷、核糖核酸酶(rna酶)、dna酶i、葡萄球菌肠毒素-a、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、或其组合。在其他方面中，该毒素包含例如蒴莲根毒素a链、α-八叠球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、新霉素、单端孢菌毒素(tricothecenes)或其组合。参见，例如，wo93/021232。

在一些方面中，该螯合剂是dtpa、ec、dmsa、edta、cy-edta、edtmp、dtpa、cydtpa、cy2dtpa、bopta、dtpa-ma、dtpa-ba、dtpmp、dota、trita、teta、dotma、dota-ma、hp-do3a、pnb-dota、dotp、dotmp、dotep、dotpp、dotbzp、dotpme、hedp、dttp、n3s三酰胺硫醇、dads、mama、dadt、n2s4联胺四硫醇、n2p2二硫醇-二膦、6-肼基烟酸、丙烯胺肟、四胺、环拉胺或其组合。

在一个实施例中，该药物是奥瑞斯他汀(auristatin)、微管溶素或吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)。

在一个实施例中，该奥瑞斯他汀(auristatin)是mmae(一甲基奥瑞斯他汀e)或mmaf(一甲基奥瑞斯他汀f)。

在一个实施例中，该药物是美登木素生物碱，例如n2'-脱乙酰基-n2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(dm1)、n2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(dm3)或n2'-脱乙酰基-n2'(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(dm4)。

化学治疗剂是药物，但也可合理地描述为毒素。未注册用作独立或单独治疗剂的毒素在本说明书的上下文中不被认为是药物。

放射性核素的实例包括³h、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸f、³²p、³³p、³⁵s、⁴⁷sc、⁵¹cr、⁵⁴mn、⁵⁷co、⁵⁸co、⁵⁹fe、⁶²cu、⁶⁵zn、⁶⁷cu、⁶⁷ga、⁶⁸ge、⁷⁵br、⁷⁵se、⁷⁶br、⁷⁷br、⁷⁷as、^80mbr、⁸⁵sr、⁸⁹sr、⁹⁰y、⁹⁵ru、⁹⁷ru、⁹⁹mo和^99mtc、¹⁰³pd、^103mrh、¹⁰³ru、¹⁰⁵rh、¹⁰⁵ru、¹⁰⁷hg、¹⁰⁹pd、¹⁰⁹pt、¹¹¹ag、¹¹¹in、¹¹²in、^113min、¹¹³sn、¹¹⁵in、¹¹⁷sn、¹¹⁹sb、^121mte、¹²¹i、^122mte、^125mte、¹²⁵i、¹²⁶i、¹³¹i、¹³³i、¹³³xe、¹⁴⁰la、¹⁴²pr、¹⁴³pr、¹⁴⁹pm、¹⁵²dy、¹⁵³sm、¹⁵³gd、¹⁵⁹gd、¹⁶¹ho、¹⁶¹tb、¹⁶⁵tm、¹⁶⁶dy、¹⁶⁶ho、¹⁶⁷tm、¹⁶⁸tm、¹⁶⁹er、¹⁶⁹yb、¹⁷⁵yb、¹⁷⁷lu、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁸⁸w、^189mos、¹⁸⁹re、¹⁹²ir、¹⁹⁴ir、¹⁹⁷pt、¹⁹⁸au、¹⁹⁹au、²⁰¹t1、²⁰³hg、²¹¹at、²¹¹bi、²¹¹pb、²¹²pb、²¹²bi、²¹³bi、²¹⁵po、²¹⁷at、²¹⁹rn、²²¹fr、²²³ra、²²⁴ac、²²⁵ac、²²⁵fm、²⁵²cf及其组合。

在一个实施例中，该放射性核素选自下组，该组包含以下或由以下组成：铬(⁵¹cr)、钴(⁵⁷co)、氟(¹⁸f)、钆(¹⁵³gd、¹⁵⁹gd)、锗(⁶⁸ge)、钬(¹⁶⁶ho)、铟(¹¹⁵in、¹¹³in、¹¹²in、¹¹¹in)、碘(¹³¹i、¹²⁵i、¹²³i、¹²¹i)、镧(¹⁴⁰la)、镥(¹⁷⁷lu)、锰(⁵⁴mn)、钼(⁹⁹mo)、钯(¹⁰³pd)、磷(³²p)、镨(¹⁴²pr)、钷(¹⁴⁹pm)、铼(¹⁸⁶re、¹⁸⁸re)、铑(¹⁰⁵rh)、钌(⁹⁷ru)、钐(¹⁵³sm)、钪(⁴⁷sc)、硒(⁷⁵se)、锶(⁸⁵sr)、硫(³⁵s)、锝(⁹⁹tc)、铊(²⁰¹tl)、锡(¹¹³sn、¹¹⁷sn)、氚(³h)、氙(¹³³xe)、镱(¹⁶⁹yb、¹⁷⁵yb)、钇(⁹⁰y)、锌(⁶⁵zn)、或其组合。

在一个实施例中，该放射性核素通过螯合剂附接至本披露的轭合化合物。

在一个实施例中，该有效载荷是血清半衰期延长剂，例如包含白蛋白、白蛋白结合多肽、pas、人绒毛膜促性腺激素c-末端肽(ctp)的β亚基、聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten、白蛋白结合小分子、或其组合。

在效应分子是聚合物的情况下，它通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或支链或非支链多糖，例如同-多糖或杂-多糖。

可存在于上述合成聚合物上的具体任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基基团。

特定的天然存在的聚合物包括乳糖、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、海藻酸、纤维素直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。

在一些实施例中，聚合物是聚乙二醇(peg)、支化peg、多唾液酸(psa)、羟基烷基淀粉(has)、羟基乙基淀粉(hes)、碳水化合物、多糖、出芽短梗孢糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、聚亚烷基氧化物(pao)、聚亚烷基二醇(pag)、聚丙二醇(ppg)聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇(pva)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酸酐、聚(1-羟甲基乙烯基羟甲基甲酰基)(phf)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基氨基磷酸酯(mpc)。在一些实施例中，该聚合物是聚乙二醇。在本发明的一个实施例中，聚乙二醇的分子量范围为300da至10,000,000da、500da至100,000da、1000da至50,000da、1500da至30,000da、2,000da至20,000da、3,000da至5,000da和4,000da至5,000da。在其他实施例中，聚乙二醇具有分子量为约1,000da、约1,500da、约2,000da、约3,000da、约4,000da、约5,000da、约10,000da或约20,000da。

在一个实施例中，该有效载荷包含可视化标记。可视化标记包括但不限于，发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、颗粒、半抗原、酶、放射性同位素或其组合。

在一个实施例中，该可视化标记是可视化肽。在一些方面中，该可视化肽能够在体外、体内、离体或其任何组合中可视化或定位轭合化合物。在一些方面中，该可视化肽是例如生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋白、用于连接双砷染料或用于轭合亚稳态锝的含半胱氨酸肽、用于轭合基于荧光共振能量转移(fret)的亲近测定法所用的铕包合物的肽、或其任何组合。在一些方面中，该荧光蛋白是例如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、增强型黄色荧光蛋白(eyfp)、或其任何组合。在一些方面中，该荧光蛋白是藻胆蛋白或其衍生物。

荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，适用于产生叠层染料标记的标记试剂。出于获得较大的斯托克斯位移的目的，这些叠层染料包含荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从荧光蛋白的吸收光谱的波长发生更远的位移。这可以有效于检测样品中的低量的靶标，其中发射的荧光被最大限度地优化，换言之很少甚至没有发射光被荧光蛋白重吸收。为了实现这一点，荧光蛋白和荧光团充当能量转移对，其中荧光蛋白在荧光团所吸收的波长下发射，并且荧光团随后在距离荧光蛋白比仅存在荧光蛋白时所能够获得的波长更远的波长下发射。功能组合可以是本领域中已知的藻胆蛋白和磺基罗丹明荧光团或磺化花青荧光团。该荧光团有时充当能量供体并且荧光蛋白是能量受体。

在其他方面中，作为有效载荷使用的双砷染料是4’,5’-双(1,3,2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素(flash)。在一些方面中，该生物素受体肽有助于基于抗生物素蛋白的试剂和基于链霉抗生物素蛋白的试剂的轭合。在一些方面中，该硫辛酸受体肽有助于硫醇反应性探针轭合至结合硫辛酸或直接连接荧光硫辛酸类似物。

在一个实施例中，有效载荷或多肽包含荧光标签。在一些方面中，该荧光标签包含例如荧光素型染料、罗丹明型染料、丹酰型染料、丽丝胺型染料、花青型染料、藻红蛋白型染料、德克萨斯红型染料、或其任何组合。适于轭合至本文披露的半胱氨酸工程化抗体或其抗原结合片段的荧光团包括不限于；芘(包括任选相应的衍生化合物)、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(nbd)、花青(包括任何相应的化合物)、羰花青(包括任何相应的化合物)、7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮(carbostyryl)、卟啉、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、薁、二萘嵌苯、吡啶、喹啉、硼聚氮杂引达省(包括任何相应的化合物)、呫吨(包括任何相应的化合物)、噁嗪(包括任何相应的化合物)或苯并噁嗪、卡巴秦(包括任何相应的化合物)、芴酮、香豆素(包括披露的相应化合物)、苯并呋喃(包括相应的化合物)以及苯甲酮(benzphenalenone)(包括任何相应的化合物)以及其衍生物。如本文所用，噁嗪包括试卤灵(包括任何相应化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪、以及其苯并取代的类似物、或其任何组合。

在某些方面中，该荧光团包括例如呫吨(对甲氨基酚、罗丹明、荧光素以及其衍生物)、香豆素、花青、芘、噁嗪、硼聚氮杂引达省、或其任何组合。在一些实施例中，此类荧光团是例如磺化呫吨、氟化呫吨、磺化香豆素、氟化香豆素、磺化花青、或其任何组合。还包括以下列商品名出售且通常已知为以下的染料：alexacyoregonpacific和

经由接头附接的荧光团的选择将确定最终化合物的吸收和荧光发射特性。可以使用的荧光团标记的物理特性包括但不限于，光谱特征(吸收、发射和斯托克斯位移)、荧光强度、寿命、极化以及光致漂白率、或其组合。所有这些物理特性可以用于将一个荧光团与另一个荧光团区分开，并且从而允许多元分析。在某些方面中，荧光团在大于480nm的波长下具有吸收极大值。在一些方面中，荧光团在处于或接近488nm至514nm(特别适用于由氩离子激光激发源的输出激发)或在接近546nm(特别适用于由水银弧光灯激发)处吸收。在一些方面中，荧光团可以针对组织或完整生物体应用在nir(近红外区域)中发射。荧光标记的其他所希望的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或生物体(例如，活体动物)中执行抗体的标记。

在一个实施例中，该多肽或有效载荷包含捕获标签。在一些方面中，该捕获标签是生物素或his6标签。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号并且它还可以充当用于分离目的亲和色谱中使用的标签。出于检测目的，可以使用对于生物素具有亲和力的酶轭合物，诸如抗生物素蛋白-hrp。

随后可以添加过氧化物酶底物以产生可检测的信号。除生物素之外，可以使用其他半抗原，包括激素、天然发生和合成的药物、污染物、过敏原、效应分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及类似物。

在一个实施例中，该有效载荷包含酶。酶是有效标记物，因为可以获得可检测的信号的放大，从而得到增加的测定灵敏度。酶自身通常不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得转化的底物产生荧光信号、比色信号或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生可测量的产物，例如，比色发光、荧光发光或化学发光。这类底物在本领域中广泛使用且是本领域已知的。

在一些实施例中，比色或荧光底物和酶组合使用氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3,3’-二氨基联苯胺(dab)和3-氨基-9-乙基咔唑(aec)，这产生有区别的颜色(分别是棕色和红色)。产生可检测的产物的其他比色氧化还原酶底物包括但不限于：2,2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)、邻苯二胺(opd)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚。荧光底物包括但不限于，高香草酸或4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪和还原的苯并噻嗪，包括red试剂及其变体和还原的二氢呫吨，包括二氢荧光素以及二氢若丹明，包括二氢若丹明123。

本披露还延伸至使用作为酪胺酰胺的过氧化物酶底物，该过氧化物酶底物表示一类独特的过氧化物酶底物，因为它们在酶作用之前可以是固有地可检测，但在如酪胺酰胺信号放大(tsa)所描述的过程中通过过氧化物酶作用“固定在适当位置”。这些底物广泛地用于标记样品(这些样品是细胞、组织或阵列)中的靶标以用于其随后通过显微术、流式细胞术、光学扫描以及荧光测定法进行检测。

本披露还延伸至使用比色(并且在一些情况下是荧光)底物和酶组合，该比色底物和酶组合有时使用磷酸酶诸如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶或这种磷酸酶的重组版本与比色底物诸如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯(bcip)、6-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯、对硝基苯基磷酸酯或邻硝基苯基磷酸酯或者与荧光底物诸如4-甲基伞形酮基磷酸酯、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素基磷酸酯(difmup，us5,830,912)、荧光素二磷酸酯、3-邻甲基荧光素磷酸酯、试卤灵磷酸酯、9h-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(ddao磷酸酯)或elf97、elf39或相关磷酸酯的组合。

本披露还延伸至包含糖苷酶的有效载荷，具体地说β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-葡糖苷酶是另外适合的酶。适当的比色底物包括但不限于，5-溴-4-氯-3-吲哚基β-d-吡喃半乳糖苷(x-gal)和类似的吲哚基半乳糖苷、葡糖苷和葡糖苷酸、邻硝基苯基β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)、以及对硝基苯基β-d-吡喃半乳糖苷。在一些实施例中，荧光底物包括试卤灵β-d-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(fdg)、荧光素二葡糖苷酸以及它们的结构变体4-甲基伞形酮基β-d-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮基β-d-吡喃半乳糖苷、以及氟化香豆素β-d-吡喃半乳糖苷。

另外的酶包括但不限于，水解酶如胆碱酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶、以及还原酶，对于这些酶适合的底物是已知的。

酶以及其产生化学发光的适当底物适用于并入本披露的分子。这些包括但不限于天然和重组形式的荧光素酶和水母发光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，如含有稳定的二氧杂环丁烷、鲁米诺、异氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些也可以是有用的。

所使用的核酸可以选自下组，该组由dna、rna、短干扰rna(sirna)、微小rna、发夹结构或核酸模拟物(诸如肽核酸)组成。在某些方面中，该轭合核酸是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少100、至少200、至少500、至少1000、至少5000或更多个碱基对。该轭合核酸可以是单链的。在不同方面中，该轭合核酸可以是双链的。在一些方面中，该轭合核酸编码开放阅读框。在一些方面中，由该轭合核酸编码的开放阅读框对应于凋亡诱导蛋白、病毒蛋白、酶或癌抑制蛋白。用于递送此类核酸至细胞的技术是本领域已知的。

在一个实施例中，通过反应性糖轭合至本披露的抗体中的聚糖的有效载荷如下所示：

其中asn297代表抗体中位置297处的asn残基。

在一个实施例中，所制备的分子是稳定的，或者例如是物理、化学和/或热稳定的。物理不稳定的证据是例如聚集，其可以通过常规技术，例如尺寸排阻色谱法进行测量。化学不稳定性的证据是例如分子的降解或分解，例如有效载荷的断开。热不稳定性的证据是例如变性。

其他定义

如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”、和“该/这些(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。术语“一个”(或“一种”)、连同术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/一种”在本文可以互换地使用。

此外，当本文使用时“和/或”被理解为这两个指定的特征或组分每一者与或不与另一者的特定披露。因此，术语“和/或”如本文在词组如“a和/或b”中使用时，旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、以及“b”(单独)。同样，术语“和/或”如在词组如“a、b和/或c”中使用时是旨在涵盖以下方面中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，concisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology[生物医学与分子生物学简明词典]，juo、pei-show，第2版，2002，crc出版社；thedictionaryofcellandmolecularbiology[细胞与分子生物学词典]第3版，1999，学术出版社(academicpress)；以及oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology[生物化学和分子生物学牛津词典]，修订版，2000,oxforduniversitypress[牛津大学出版社]为技术人员提供在本披露中使用的许多术语的通用词典注释。

单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(systèmeinternationaldeunites)(si)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。本文提供的标题不是对不同方面的限制，其可以通过参考作为整体的说明书而得到。因此，下面直接定义的术语通过以其全文参考说明书更完整地定义。

氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。

术语“受试者”是指有待成为特定治疗的接受者的任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿类等。典型地，术语“受试者”和“患者”在提及人类受试者时可以互换地使用。

术语“药用组合物”是指一种呈关于允许活性成分(例如，本文披露的抗体轭合物)的生物活性有效的这种形式的制剂，以及不包含对于该组合物将给予的受试者而言具有不可接受毒性的额外组分的制剂。这种组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。这种组合物可以是无菌的。

如本文披露的轭合化合物的“有效量”是足以实施具体阐述目的的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。

术语“治疗有效量”是指本文披露的轭合化合物或其他药物足以“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的量。

当本文使用时，词语“标记”是指一种直接或间接轭合至本文披露的抗体或其片段(例如聚糖工程化抗体或其片段)以便产生“标记的”轭合化合物的可检测化合物或组合物。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。

术语例如“治疗(treating/treatment/totreat)”是指(1)治愈、减缓已诊断病理病状或病症、改善其症状和/或停止其进展的治疗措施，以及(2)防止和/或减缓靶标病理病状或病症进展的预防性或防御性措施。因此，需要治疗的那些包括已具有障碍的那些；倾向于具有以下障碍的那些；以及在他们中需要预防障碍的那些。在某些方面中，如果患者表现出例如，一种疾病或病症(例如某种类型的癌症)的全部、部分或暂时缓解，则受试者根据本披露的方法被成功“治疗”该疾病或病症(例如癌症)。

术语“多核苷酸”或“核酸”在本文可互换使用，并且是指具有任何长度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过dna或rna聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。

如本文所用的术语“寡核苷酸”旨在是指短的多核苷酸，例如长度为100个碱基或更少，例如50个碱基或更少。

如本文使用的，术语“载体”是指一种构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送一个或多个目的基因或序列并且在一些方面中，能够表达这些基因或序列。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体、包封在脂质体中的dna或rna表达载体，以及某些真核细胞(如生产细胞)。

如本文所使用的，在本说明书的上下文中的术语“包含”应解释为“包括”。

如本文所使用的，“在本披露中使用的”是指在本文披露的方法中使用的，在本文披露的包括中间体的分子中使用或两者，适合于所用术语的上下文。

应当理解，当用语言“包含”来说明方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。

本文描述的任何阳性实施例或其组合可以是阴性排除的基础，即免责声明。

组合物

本披露延伸至包含本文所述抗体分子(例如包含有效载荷)的组合物，特别是包含本披露分子和药物赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物(或诊断组合物)。

该组合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，该组合物通常包括药学上可接受的载体。

本披露还延伸至制备所述组合物的方法，例如制备药物或诊断组合物，包括将添加本披露的分子并将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种混合。

本披露的抗体可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其他活性成分。

药物组合物适合的包含治疗有效量的根据本披露的分子。如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶标疾病或病症，或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。治疗有效量可以最初在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长动物)中估算。动物模型也可以用来确定合适的浓度范围和给药途径。然后可以使用这类信息来确定在人中给药的有用的剂量和途径。

对人类受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度，受试者的一般健康状况，受试者的年龄、体重和性别，饮食，给药的时间和频率，一种或多种药物组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本发明活性剂的单位剂型存在。给予本披露分子的实际剂量取决于待治疗病症的性质，例如存在的疾病/炎症的程度以及该分子是否被预防性使用或用于治疗现有病症。

组合物可以单独给予至患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、依次或分别)给药。

药学上可接受的载体本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且不应该是有毒的。适合的载体可以是大的，代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。

治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、ph缓冲液物质可以存在于此类组合物中。这些载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，供患者摄取。

适合的给药形式包括适于肠胃外给药的形式，例如通过注射或输注，例如通过单次快速静脉注射(bolusinjection)或连续输注。当产品用于注射或输注时，它可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可以含有配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，本披露的分子可以处于干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。

适合地，在根据本披露的配制品中，最终配制品的ph与抗体的等电点的值不相似，例如如果配制品的ph为7，那么pi为8-9或更高可能是合适的。虽然不希望受理论束缚，但认为这可最终提供具有改进的稳定性的最终配制品，例如抗体保留在溶液中。

本披露的药物组合物可以通过许多途径给予，这些途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见wo98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下喷射器也可用于给予本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备成注射剂，作为液体溶液或是悬浮液。也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体载体(例如等渗溶液)中的固体形式。

该组合物的直接递送通常通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内，或递送至组织的间隙来完成。该组合物也可以给予至病变或肿瘤中。剂量治疗可以是单剂量方案或者多剂量方案。

应理解，该组合物包含多肽(即抗体或其结合片段)，并且因此，它可能易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物通过使用胃肠道的途径给予，则组合物将需要含有如下试剂，这些试剂保护多肽免于降解，但一旦其从胃肠道吸收它就释放抗体。

药学上可接受的载体的充分讨论在remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学]，(mack出版公司，新泽西州1991)中可获得。

治疗

本披露还延伸至通过给予治疗有效量的根据本披露的分子或组合物(例如包含根据本披露的分子的药物组合物)来治疗有此需要的患者的方法。

在一个实施例中，提供了本披露的分子或包含本披露的分子的组合物，其用于治疗，特别是用于治疗本文所述的疾病或病症，例如癌症。

在一个实施例中，提供了本披露的分子或包含本披露的分子的组合物在制备用于治疗本文所述的病症或疾病(例如癌症)的药物中的用途。

因此，本发明的分子可用于治疗和/或预防病理状况。

因此，通过例如在药物配制品中给予其治疗有效量，提供了用于在治疗中使用的根据本发明的分子。在一个实施例中，将根据本披露的分子局部给予至肺，例如通过吸入。

本发明提供的抗体可用于治疗疾病或病症，包括炎性疾病和病症、免疫疾病和病症、纤维化病症和癌症。

术语“炎性疾病”或“病症”和“免疫疾病或病症”包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、斯提耳氏病、穆-韦综合征(mucklewellsdisease)、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、sle(系统性红斑狼疮)、哮喘，过敏性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、血管炎、i型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。

术语“纤维变性病症”包括特发性肺纤维化(ipf)、系统性硬化症(或硬皮病)、肾纤维化、糖尿病性肾病、iga肾病、高血压、终末期肾病、腹膜纤维化(持续性非卧床腹膜透析)，肝硬化、年龄相关性黄斑变性(armd)、视网膜病、心脏反应性纤维化、瘢痕形成、瘢痕疙瘩、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉搭桥手术、关节成形术和白内障手术。

术语“癌症”包括恶性新增长，该恶性新增长从上皮细胞产生，在皮肤中、或者更常见的是，身体器官(例如：乳房、卵巢、前列腺、结肠、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠)的衬壁中发现。癌症倾向于渗透到相邻的组织和传播(转移)到远端器官，例如：到骨骼、肝脏、肺脏或大脑。

在一个实施例中，对原发性癌症给予治疗。在一个实施例中，该治疗针对转移性癌症。在一个实施例中，该治疗用于原发性癌症和转移性癌症的组合。

待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施例中，所述组合物适于给药于人受试者。

附图

图1图1a和b是各种聚糖的示意图。

图2是在某些cho糖基化突变体中改变的n-聚糖、粘蛋白o-聚糖、o-果糖和o-甘露糖聚糖的示意图。特定位置的特定糖的丢失或减少用减(-)号表示，而糖残基的增加用加(+)号表示。带有不同聚糖的天冬酰胺、苏氨酸或丝氨酸残基用它们的单字母氨基酸代码表示。糖符号：灰色三角形-果糖，灰色圆形-甘露糖，白色圆形-半乳糖；黑色方形-n-乙酰葡糖胺，白色方形-n-乙酰葡糖胺，灰色菱形-唾液酸。

图3示出了n-聚糖，一种由各种特定lec细胞系合成的蛋白质的结构。

图4图4a示出了在cho-lec8细胞中表达为g0f聚糖形式的igg抗体的hplc分析。g0f聚糖片段示于图4b中。

图5图5示出了抗cd105抗体的g0fn-糖型的质谱分析。

图6a示出了udp-酮基gal转移至在实例4的抗体上的g0f形式聚糖的示意图和条件。

图6b示出了转移反应性糖酮基-gal之前g0f抗体的质谱

图6c示出了转移反应性糖酮基-gal后图6b的抗体的质谱。

图7a示出了用galnaz修饰的抗体cd105的质谱。

图7b示出了轭合至dibo后来自图5a的抗体cd105的质谱。

图8示出了从lec8细胞表达并与udp-galnaz反应的g0f形式抗体的示意图。

图9示出了与dbco-488轭合的抗体的sdspage。在lec8细胞中表达的轭合物中抗体的n-聚糖处于g0f形式，其中galnaz通过突变体galt(y289l)随后通过点击化学转移至其上以添加dbco-488。

图10a示出了lec8细胞中表达的抗体的质谱分析，其中反应性糖galnaz已经通过突变体galt转移到其上。

图10b是通过点击化学通过反应性糖与dbco-488轭合的图10a的抗体。

图11a示出了突变体galt酶浓度对所获得的分子比的影响。

图11b示出了反应性糖试剂udp-galnaz浓度对所获得的分子比的影响。

图12示出了有效载荷当量对所得分子比的影响。

实例

糖的合成

实例1audp-galnaz的化学合成

通过两种可替代的方法产生g0f糖基化抗体

实例2cho-lec8宿主细胞能够表达g0fn-糖型的igg抗体

在37℃，8％co2，80％湿度和120rpm下，将悬浮适应的cholec8细胞维持在定轨摇床中的2l排气封端的摇瓶中的m30v2(在室内培养基中)生长培养基中(美国马里兰州劳雷尔inforsusa)。在转染前一天以6x10⁵细胞/ml接种细胞，并调整至1x10⁶细胞/ml以在转染当天将细胞维持在对数期。将peimax(波利塞斯公司(polysciences))和带有目的抗体的质粒dna稀释到150mmnacl中，终浓度分别为240μg/ml和60μg/ml。将等体积的稀释的pei添加到稀释的质粒dna中。在室温下孵育1分钟后，将pei/dna混合物以1μg/ml培养物体积的最终浓度添加至cho-lec8细胞中。从转染后第3天每隔一天，将细胞培养物用0.8％的进料培养基f09(在室内培养基中)和0.05％的进料培养基f10(在室内培养基中)进行补料。在转染后第10天或第14天收获细胞培养物，并使用蛋白a柱通过亲和层析纯化抗体。产生的抗体的hplc分析显示于图4a中。

图4a显示g0f仅在cho-lec8细胞中表达的抗体中发现。从其他哺乳动物细胞(例如，cho和hek293)中产生的抗体的n-聚糖的混合物，其中大部分n-聚糖在g0f、g1f和g2f中。

实例3从实例1a中制备的udp-galnaz转移galnaz的用galt(y289l)处理的来自实例3的底物

将突变体y289lgalt(终浓度，0.20mg/ml，4.5μm)溶解于含有150mmnacl和5mmmncl2的25mmtris缓冲液(ph7.2)中。udp-galnaz和抗体分别添加至终浓度为0.6mm和1.0mg/ml(6.7μm)。将反应物在30℃下孵育16个h。通过使用50kda截留旋转过滤器(ultra-4离心过滤器)用tris缓冲液洗涤去除过量的试剂，之后取出等分试样的叠氮化物修饰的抗体用于通过lc-esi-ms进行产物分析(图5a)。通过二辛可宁酸测定(piercetmbca蛋白测定)确定抗体浓度，并用tris缓冲液(25mmtris-cl，150mmnacl，ph7.2)稀释至1mg/ml浓度。

获得的抗体galnaz产物的malditof分析显示于图7a中。图7b中提供了轭合至dibo修饰的探针后的malditof分析，其中以“星形”为末端的聚糖代表与有效载荷轭合的聚糖。轭合分子的lcms数据如下所示：

该数据支持4个有效载荷分子与抗体轭合的结论。

实例4用galt(y289l)处理的来自实例2的底物以从udp-酮基gal转移酮基-gal

将g0f抗体、人galt(y285l)突变体和udp-2-酮基-gal1添加至含有25mmmncl的30mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)中至终浓度分别为3.4mm、10mm和4mm。将反应混合物在30℃下在黑暗中孵育16h。通过在pbs1x中透析去除过量的试剂。通过降低的ms确认产物，其结果显示于图6a中。

实例5使用点击化学与dibo-alexa488轭合的实例3的抗体

将dibo-alexa488(终浓度，19.8μm)添加到tris缓冲液(25mmtris-cl，150mmnacl，ph7.2)中的galnaz修饰抗体(终浓度，0.5mg/ml，3.3μm)中。将反应混合物在25℃下孵育16h。通过使用50kda截留旋转过滤器(ultra-4离心过滤器)用tris缓冲液洗涤去除过量的试剂，之后取出等分试样的dibo-alexa488修饰的抗体用于通过lc-esi-ms进行产物分析。

实例6

使用实例3中描述的方法，研究了在反应性糖galnaz的酶促转移中使用的突变体galt的优化浓度。用6.7μm浓度的抗体，0.6mm浓度的udp-galnaz进行反应。mncl2以5mm、nacl以150mm、以及tris缓冲液以25mm(ph7.2)。所测试的酶浓度为3.5、4.5和6μm。选择4.5μm的突变galt用于进一步的实验，因为它足以轭合4个galnaz/抗体。

使用以下公式计算比率：

δmw(单位)＝mw(udp_glanaz)-mw(oh)-mw(h)＝245.0886

结果显示于图11a中。

研究了用于反应性糖galnaz的酶促转移的udp-galnaz浓度的优化浓度。抗体浓度为6.7μm。galt以4.5mm的浓度使用。mncl2以5mm、nacl以150mm、以及tris缓冲液以25mm(ph7.2)。所测试的udp糖浓度为0.3、0.6、1.2和1.8mm。0.6mm的udp-糖用于将来的反应。使用如上所示公式计算分子比。结果显示于图11b中。

实例7

叠氮化物-炔烃环加成反应中有效载荷(荧光团-dibo)浓度的最佳浓度。修饰的抗体(包含反应性糖galnaz)以10.1μm的浓度使用。mncl2以5mm、nacl以150mm、tris缓冲液以25mm(ph7.2)。使用4、6、8或10当量测试有效载荷。如上所示计算分子比。结果显示于图12中。