本发明涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法。
背景技术：
关节问题比较常见，其发生在人的各个年龄阶段，关节软骨缺损可导致受伤，关节受伤由超出正常的的运动引起，或过度使用、肌无力、一般磨损引起，不同的软骨缺损需要不同的治疗。
目前软骨缺损常用的治疗方法包括骨髓刺激法、同种骨软骨移植、同种软骨细胞移植法、自体软骨细胞移植、组织工程修复法等，但这些技术依然存在各种各样的问题。
骨髓刺激法破坏软骨缺损部位的软骨下骨的连续性，来自骨髓的基质干细胞及生长因子促进软骨修复，具体实施方法有：磨削关节成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术，其中微骨折术较为容易实施，因此应用最为广泛，但修复结果并不理想，多数为纤维软骨修复，而不是透明软骨修复，纤维软骨修复在后期极易引起骨关节炎的发生。
同种骨软骨移植是一种将非负重区及非重要关节部分的骨或软骨植入软骨缺损表面以达到修复目的的技术，具有保持软骨生物化学和生物机械特性的优点，但低温冷冻保存的软骨极易坏死，且极易出现感染症状，而且出现大面积软骨缺损失时，很难找到合适的供体软骨，目前该方法进一步优化，将缺损区域清创，从非负重关节区域取相应大小的柱状软骨移植到缺损区域，但这仍然无法修复大面积软骨缺损，也有一些移植物会脱落。
同种软骨细胞移植法是将分离培养的软骨细胞直接注射到软骨缺损部位，但修复效果并不能令人满意，主要是由于移植软骨细胞无法在移植部位固定和生长。后来纤维蛋白胶的应用改良了固定的效果，修复效果也因此得到提高。但同种软骨细胞移植可能引起免疫排斥反应及感染或引起疾病传播。
自体软骨细胞移植是从关节软骨活体组织中分离软骨细胞并进行扩增，然后将扩增的自体软骨细胞注射到缺损区域并用骨膜瓣覆盖，优点是不存在免疫排斥及感染问题，临床上应用比较容易，缺点是采集软骨而对正常软骨造成损伤，且软骨细胞分布不均匀等。
组织工程修复关节软骨缺损是在体外培养扩增软骨组织细胞，并且以较高浓度将其种植在具有良好的生物兼容性和降解性的合适支架材料上构建组织工程软骨，然后植入组织缺损部位，软骨组织工程有三个要素：一定数量的种子细胞、合适的支架材料、体外培养条件优化，近来人们在人工合成材料表面复合生物高分子，如胶原蛋白、琼脂糖凝胶、藻酸盐、壳聚糖等，使其兼具生物和人工合成材料的优点，目前仍存在一些问题，如种子细胞选择以及体外培养体系不成熟、构建的支架材料不理想、体内吸收过快、机械性能不理想、形成的软骨组织力学性能差、后期容易退化、对修复的分子机制还不清楚等，尚需进一步研究。
如前所述，以上治疗方法存在着各种各样的问题，限制了这些技术的临床应用，需要进行改进。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中的治疗效果不好的缺陷，提供一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法来解决上述问题。
本发明公开了一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、取患者非承重区的关节软骨约200-300mg，剔除干净软组织，将剩余透明的软骨组织块放入盛有pbs缓冲液的离心管中，震荡清洗，直至残留的血液漂洗干净为止；
（2）、在无菌平皿中，用眼科剪刀将软骨组织剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎块30min，吸弃上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶5ml于37℃，5%的co2培养箱中对碎片消化8-10h，其中每隔1小时震荡一次，直至成絮状，得到细胞悬液；
（5）、采用100um滤网对细胞悬液进行过滤，加入含fbs的高糖dmem培养基终止消化，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，在1000-1500rpm的条件下,离心5min，弃上清，沉淀即为软骨细胞；
（6）、将软骨细胞用含fbs、庆大霉素的高糖dmem培养基悬浮，调节至1×108/l，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，高糖dmem培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml，然后接种于25cm2培养瓶内，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培养箱培养，每隔3天更换高糖dmem培养基一次，其中该高糖dmem培养基中也含10%fbs、45ug/ml庆大霉素；
（7）、待软骨细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（8）、向培养瓶内加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（9）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（11）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次，可扩增至15-20×106；
（12）、吸干培养液，培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（13）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（14）、用0.3-1ml生理盐水重悬细胞；
（15）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，再根据膜的面积，细胞数为0.5-2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（16）、待胶原膜吸附细胞10-15min后，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的pbs缓冲液中含有庆大霉素，所述的pbs缓冲液中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
作为优选，所述的步骤（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培养基进行配制；
作为优选，所述的步骤（15）中，所述的无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜在无菌塑料平皿中的放置方式为无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
作为优选，所述的步骤（16）的时间为15min。
作为优选，本发明所述的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的使用方法为：将本发明制备得到的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，即可修复软骨损伤。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明采用了一种猪腹膜源的ⅰ/ⅲ型胶原双分子层膜结构，其一面具有相对较高密度的胶原纤维，表面摩擦较低，细胞不通透，可阻止细胞向关节腔扩散，另一面为粗糙的表面，上面空隙较大，有利于软骨细胞附着其中，这种膜具有持久性、耐撕裂，其可承受切割、打孔、缝合等操作，其具有弹性，可修成不同形状，不会随着时间的推移而收缩，其具有可吸收性，移植2周后可被降解吸收，治疗效果好可作为极佳的组织工程支架材料；
2、无菌干燥猪胶ⅰ/ⅲ型胶原膜接种高浓度软骨细胞，细胞数约0.5-2×106/cm2使其达到饱和湿度，使胶原膜吸附细胞10-15min，细胞即可均匀吸附，可用于临床手术；
3、本发明简化了外科手术操作，缩短了手术时间，创伤小，减轻了患者的痛苦，可生成更多透明软骨，这种技术不会有软骨细胞泄露和分布不均匀的风险；
4、本发明可用于治疗3-20cm2的软骨损伤面积，修复面大。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、取患者非承重区的关节软骨约200-300mg，剔除干净软组织，将剩余透明的软骨组织块放入盛有pbs缓冲液的离心管中，震荡清洗，直至残留的血液漂洗干净为止；
（2）、在无菌平皿中，用眼科剪刀将软骨组织剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎块30min，吸弃上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶5ml于37℃，5%的co2培养箱中对碎片消化8-10h，其中每隔1小时震荡一次，直至成絮状，得到细胞悬液；
（5）、采用100um滤网对细胞悬液进行过滤，加入含fbs的高糖dmem培养基终止消化，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，在1000-1500rpm的条件下,离心5min，弃上清，沉淀即为软骨细胞；
（6）、将软骨细胞用含fbs、庆大霉素的高糖dmem培养基悬浮，调节至1×108/l，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，高糖dmem培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml，然后接种于25cm2培养瓶内，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培养箱培养，每隔3天更换高糖dmem培养基一次，其中该高糖dmem培养基中也含10%fbs、45ug/ml庆大霉素；
（7）、待软骨细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（8）、向培养瓶内加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（9）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（11）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次，可扩增至15-20×106；
（12）、吸干培养液，培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（13）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（14）、用0.3-1ml生理盐水重悬细胞；
（15）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，再根据膜的面积，细胞数为0.5-2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（16）、待胶原膜吸附细胞10-15min后，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的pbs缓冲液中含有庆大霉素，所述的pbs缓冲液中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
作为优选，所述的步骤（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培养基进行配制；
作为优选，所述的步骤（15）中，所述的无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜在无菌塑料平皿中的放置方式为无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
作为优选，所述的步骤（16）的时间为15min。
作为优选，本发明所述的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的使用方法为：将本发明制备得到的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，即可修复软骨损伤。
实施例1
本发明公开了一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、取患者非承重区的关节软骨约300mg，剔除干净软组织，将剩余透明的软骨组织块放入盛有pbs缓冲液的离心管中，震荡清洗，直至残留的血液漂洗干净为止；
（2）、在无菌平皿中，用眼科剪刀将软骨组织剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎块30min，吸弃上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶5ml于37℃，5%的co2培养箱中对碎片消化8h，其中每隔1小时震荡一次，直至成絮状，得到细胞悬液；
（5）、采用100um滤网对细胞悬液进行过滤，加入含fbs的高糖dmem培养基终止消化，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，在1200rpm的条件下,离心5min，弃上清，沉淀即为软骨细胞；
（6）、将软骨细胞用含fbs、庆大霉素的高糖dmem培养基悬浮，调节至1×108/l，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，高糖dmem培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml，然后接种于25cm2培养瓶内，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培养箱培养，每隔3天更换高糖dmem培养基一次，其中该高糖dmem培养基中也含10%fbs、45ug/ml庆大霉素；
（7）、待软骨细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（8）、向培养瓶内加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（9）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（11）、细胞培养4周后，细胞传代3次，可扩增至20×106；
（12）、吸干培养液，培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（13）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（14）、用1ml生理盐水重悬细胞；
（15）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，再根据膜的面积，细胞数为2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（16）、待胶原膜吸附细胞15min后，即可。
所述的步骤（1）中，所述的pbs缓冲液中含有庆大霉素，所述的pbs缓冲液中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
所述的步骤（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培养基进行配制；
所述的步骤（15）中，所述的无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜在无菌塑料平皿中的放置方式为无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
本发明所述的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的使用方法为：将本发明制备得到的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，即可修复软骨损伤。
实施例2
本发明公开了一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、取患者非承重区的关节软骨约250mg，剔除干净软组织，将剩余透明的软骨组织块放入盛有pbs缓冲液的离心管中，震荡清洗，直至残留的血液漂洗干净为止；
（2）、在无菌平皿中，用眼科剪刀将软骨组织剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎块30min，吸弃上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶5ml于37℃，5%的co2培养箱中对碎片消化9h，其中每隔1小时震荡一次，直至成絮状，得到细胞悬液；
（5）、采用100um滤网对细胞悬液进行过滤，加入含fbs的高糖dmem培养基终止消化，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，在1200rpm的条件下,离心5min，弃上清，沉淀即为软骨细胞；
（6）、将软骨细胞用含fbs、庆大霉素的高糖dmem培养基悬浮，调节至1×108/l，其中高糖dmem培养基中的fbs的体积浓度为10%，高糖dmem培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml，然后接种于25cm2培养瓶内，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培养箱培养，每隔3天更换高糖dmem培养基一次，其中该高糖dmem培养基中也含10%fbs、45ug/ml庆大霉素；
（7）、待软骨细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（8）、向培养瓶内加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2温箱2.5min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（9）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（11）、细胞培养3周后，细胞传代3次，可扩增至16×106；
（12）、吸干培养液，培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（13）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（14）、用0.5ml生理盐水重悬细胞；
（15）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，再根据膜的面积，细胞数为0.8×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（16）、待胶原膜吸附细胞15min后，即可。
所述的步骤（1）中，所述的pbs缓冲液中含有庆大霉素，所述的pbs缓冲液中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
所述的步骤（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型胶原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培养基进行配制；
所述的步骤（15）中，所述的无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜在无菌塑料平皿中的放置方式为无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
本发明所述的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的使用方法为：将本发明制备得到的猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，即可修复软骨损伤。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。