本发明涉及生物材料学领域，特别是一种i型胶原蛋白，及由其制备的液态黏膜下填充剂。
背景技术：
目前，随诊内镜检查的普及，癌前病变与早癌检出率逐渐升高。内镜黏膜下层剥离术(esd)或内镜黏膜下层切除术(emr)逐渐成为一种切除消化道癌前病变与早癌的一种标准微创治疗手段，它能够将病变完整地整块切除，从而大大降低了肿瘤复发的风险。
esd手术也存在较大风险，可能发生一些并发症，主要包括消化道穿孔和出血。针对患者发生穿孔这一现象，为了使其更加安全和方便，目前国内外多数学者研究证实，在手术切除之前进行黏膜下注射可以减少此类并发症的发生。
目前研究涉及到的黏膜下注射液有生理盐水、高渗盐水、葡萄糖、甘油果糖、不同浓度的透明质酸钠及羟甲基纤维素、纤维蛋白原等。但这些黏膜下注射液在临床应用中仍存在一些不足。例如生理盐水注射后液体向周围组织扩散快且维持病变黏膜隆起的时间短，大多数在切除手术还没有完成时由生理盐水注射形成的局部隆起形状已经部分消失。而高渗盐水等其他注射液则会存在不同程度的组织损伤作用。
因鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新型的i型胶原蛋白，开发i型胶原蛋白的新功能结构。
本发明的另一目的是提供上述新i型胶原蛋白在制备黏膜下注射液方面的新用途。
本发明的第三个目的是提供一种新的黏膜下注射液，以克服现有的黏膜下注射液在使用中存在的问题。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种i型胶原蛋白，胶原蛋白具有完整的天然的三螺旋结构，其中羟基脯氨酸含量大于11％(i型胶原蛋白中羟脯氨酸约占胶原蛋白的9～13％，参见《中华人民共和国医药行业标准：组织工程医疗产品第6部分：i型胶原蛋白》)。研究发现该胶原蛋白热稳定性好，空间支撑作用持久，对病灶隆起作用时间长度适中，不需要后期取出，而且对手术创口处渗血起到及时止血作用，有助于伤口的快速修复。
基于这些特性，本发明提供了上述i型胶原蛋白在制备液态黏膜下填充剂中的应用。
液态黏膜下填充剂是被注射到病变黏膜下层，在病变和固有肌层之间形成一个黏膜下液体垫层，将病变黏膜托起，当病变黏膜被切除时可以防止穿孔的发生、起到止血作用并促进被切除表面的愈合。液态黏膜下填充剂可被用于发生病变的消化器官粘膜处。
虽然目前市场上以胶原为基质的生物材料不少，例如胶原蛋白海绵、可吸收胶原蛋白缝合线、医用胶原膜、胶原帖敷料、胶原蛋白植入剂(双美)、医用胶原充填剂(肤美达)等，但对于esd或emr手术来说，既要求黏膜下液体垫能够在手术期间持续支撑，又要求在手术完成后能被组织自行吸收而不必取出以避免给患者造成二次损伤，所以现有的胶原基质生物材料都无法适用，本发明的i型胶原蛋白制备成液态黏膜下填充剂则符合这样的要求，持续时间适当，胶原蛋白可在体内自行降解，使用效果好。
本发明还提供了一种i型胶原蛋白粉，最适用于制备液态黏膜下填充剂，制备方法具体包括以下步骤：
(1)权利要求1所述的i型胶原蛋白加入中性缓冲液中，搅拌均匀，静置浸泡；
(2)加入甲醛，35～39℃条件下搅拌进行交联反应；
(3)反应产物使用中性缓冲液清洗，再用去离子水冲洗；
(4)冷冻干燥，粉碎至颗粒粒径为200～300μm，得胶原蛋白粉。
作为一种优选方案，上述i型胶原蛋白粉，制备方法具体包括以下步骤：
(1)i型胶原蛋白加入中性缓冲液中，搅拌均匀，静置浸泡；
(2)加入甲醛，35～39℃条件下搅拌进行交联反应；
(3)反应产物使用中性缓冲液清洗，再用去离子水冲洗；
(4)冷冻干燥，粉碎至颗粒粒径为200～300μm，得胶原蛋白粉。
加入中性缓冲液并静置浸泡可以使溶液的整个体系处于均一稳定的ph环境中，在向其中加入偏酸或偏碱的物质时，可以对其ph值起一定的缓冲作用，使ph值不会引起很大的变化。
因为胶原在液体中存放一定时间会发生降解，导致其三螺旋结构的破坏，使其实际应用功效减弱或者丧失。所以需要加入甲醛进行交联，这样可以延长其降解时间。不交联的胶原制备得到的填充剂从原理上来讲也就可以使用，但是由于不交联的胶原在液体中降解相对交联后的胶原要快，因此产品有效期会很短；同时交联与否会对最终液态填充剂的黏度有一些影响。中性缓冲液清洗和去离子水冲洗的目的是除去未参加反应而残留的甲醛。
由于胶原属于一种对温度很敏感的生物材料，超过一定的温度就会发生变性，因此目前粉碎这种材料都是在液氮条件下进行；另外即使在液氮条件下，其韧性仍然很大。所以目前只是液氮条件下研磨还不能使其平均粒径达到150μm以下。因此还需要后文所述的高压均质过程。
本发明中i型胶原蛋白的交联温度低于其变性温度，同时在冷冻干燥后，在-196℃以下进行粉碎，使i型胶原蛋白中特有的天然三螺旋结构得以保留，避免三螺旋结构因温度过高散开产生变性，达到更好的使用效果。
作为一种优选方案，上述i型胶原蛋白粉，所述中性缓冲液由0.01mol/l的磷酸氢二钠溶液和ph为5～6的mes溶液混合至ph为7后用去离子水稀释20倍制备而成。因为磷酸氢二钠溶液浓度过高或ph过低，会导致胶原溶解，因此采用0.01mol/l的磷酸氢二钠溶液和ph为5-6的mes溶液混合来制备缓冲液。
作为一种优选方案，上述i型胶原蛋白粉，步骤(2)中甲醛的质量与步骤(1)中所用中性缓冲液体积比为0.08％～0.30％。
产物对于交联度没有严格的要求，但是甲醛用量合适的交联可以提高最终液态填充剂的黏度同时延长产品的有效期。
作为一种优选方案，上述i型胶原蛋白粉，步骤(2)中搅拌速度为180～300转/分，反应时间为3～4h。在这反应条件下可以使交联更均一，达到更好的交联效果。
作为一种优选方案，上述i型胶原蛋白粉，步骤(4)中冷冻干燥按照以下步骤进行：
a.预冷冻：先于-40℃下预冷冻60min，再于-20℃下预冷冻150～180min，并保持冷冻干燥机冷柜的温度在-60～-50℃；
b.干燥：先于-10℃干燥7h，然后于0℃干燥7h，再于5℃干燥8h，于10℃干燥8h，最后于1510℃干燥8h，于20℃干燥20h；
预冷冻和干燥阶段环境真空度为200～350毫托。
设置先预冷冻，再干燥，可以使需要冻干的样品中的水份含量降到10％以下，这样更利于下一步的冷冻研磨步骤。
作为一种优选方案，上述i型胶原蛋白粉，步骤(4)的粉碎采用冷冻研磨粉碎，环境温度在-196℃以下，粉碎时间为10～12min。
在极低温度下，样品会变脆，更容易研磨并达到所需的粒径要求；同时该温度下进行研磨使胶原蛋白的三螺旋结构不受到任何破坏。
本发明还提供了一种液态黏膜下填充剂，是由上述的i型胶原蛋白、或以上任一所述的i型胶原蛋白粉，悬浮于磷酸盐缓冲液、或悬浮于生理盐水中制备而成；悬浮液中胶原的平均粒径为50～150μm。
因为在临床上注射时需要通过所配套使用的黏膜切除术中的导管，所以需要达到上述的粒径要求。
作为一种优选方案，上述液态黏膜下填充剂，当使用i型胶原蛋白粉时，先将i型胶原蛋白粉加入到磷酸盐溶液或生理盐水中，在温度0℃以下、压力为800～1000bar条件下进行均质至胶原粒径降至50～150μm，得到液态黏膜下填充剂。
温度设置在0℃以下可以保证蛋白在制备过程中不会发生变性；高压可以降低胶原颗粒均质的平均粒径。
作为一种优选方案，上述液态黏膜下填充剂，均质重复5～10次。
重复均质可以使胶原颗粒的平均粒径均一并使胶原颗粒更好地均匀分散在溶液中。
本发明具有以下有益效果：
本发明用仅含有天然三螺旋结构且羟基脯氨酸含量大于11％的i型胶原蛋白作为原材料制备液态黏膜下填充剂，可用作内镜黏膜下层切除术或内镜黏膜下层剥离术中病灶的隆起剂，维持足够长的时间以保证手术顺利实施而无需多次注射，不会对周围组织造成损伤，有效减少出血和穿孔等并发症；还可以作为手术过程中伤口的修复材料，术后不会发生出血，并能在30天内降解吸收，不用担心其对组织产生不良影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例一
取0.01mol/l的磷酸氢二钠溶液，向其中加入ph＝6的mes溶液，至混合液ph至7，将调至中性的混合液用去离子水稀释20倍制成中性缓冲液。
取20g纯度99％以上的具有天然三螺旋结构的i型胶原蛋白(羟脯氨酸含量＞11％)，置于600ml中性缓冲液中，搅拌5～10min至均匀，静置浸泡1.5h。
向中性缓冲液中加入1.25ml38.5％的甲醛溶液，搅拌7min使混合均匀，然后置于37℃恒温水浴锅中以200转/分的速度搅拌反应交联3h。
反应结束后将反应产物取出，用缓冲液洗30min，再用去离子水洗1h。
将清洗后的胶原进行冷冻干燥，先在-40℃下预冷冻1h，再在-20℃下预冷冻3h，期间保持冷冻干燥机冷柜的温度在-60～-50℃。
冷冻干燥过程于-10℃干燥，于0℃干燥7h，再于5℃干燥8h，于10℃干燥8h，最后于15℃干燥8h，于20℃干燥20h。干燥后物料含水量在6％左右。预冷冻和干燥过程中环境真空度为200毫托。
将干燥后的物料在-196℃以下进行冷冻研磨粉碎，粉碎10min，过网筛，得到粒径为200～300μm的0.08％甲醛交联的i型胶原蛋白粉。
实施例二
取0.01mol/l的磷酸氢二钠溶液，向其中加入ph＝6的mes溶液，至混合液ph至7，将调至中性的混合液用去离子水稀释20倍制成中性缓冲液。
取20g纯度在99％以上的具有天然三螺旋结构的i型胶原蛋白，置于600ml缓冲液中，搅拌5～10min至均匀，静置浸泡1.5h。
向缓冲液中加入1.56ml38.5％的甲醛溶液，搅拌10min使混合均匀，然后置于37℃恒温水浴锅中以220转/分的速度搅拌反应交联3.5h。
结束后将胶原取出，用缓冲液洗40min，再用去离子水洗1.5h。
将胶原进行冷冻干燥，先在-40℃下预冷冻1h，再在-20℃下预冷冻3h，期间保持冷冻干燥机冷柜的温度在-60～-50℃。
冷冻干燥过程于-10℃干燥，于0℃干燥7h，再于5℃干燥8h，于10℃干燥8h，最后于15℃干燥8h，于20℃干燥20h。干燥后物料含水量在6％左右。预冷冻和干燥过程中环境真空度为300毫托。
将干燥后的物料在-196℃以下进行冷冻研磨粉碎，粉碎11min，过网筛，得到粒径为200～300μm的0.1％甲醛交联的i型胶原蛋白粉。
实施例三
称取4g实施例一或实施例二中得到的胶原粉，加入到100ml浓度为0.5mmol/l,ph＝7.5的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。
然后将混合液进行低温高压均质，均质温度在0℃以下，均质压力为800bar。重复均质化9次。得到胶原粒径在50～150μm，胶原浓度为40mg/ml的液态黏膜下填充剂。
实施例四
称取5g实施例一或实施例二中得到的胶原粉，加入到100ml浓度为0.5mmol/l,ph＝7.6的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。
然后将混合液进行低温高压均质，均质温度在0℃以下，均质压力为900bar。重复均质化11次。得到胶原粒径在50～150μm，胶原浓度为50mg/ml的液态黏膜下填充剂。
实施例五
称取6g实施例一或实施例二中得到的胶原粉，加入到100ml浓度为0.5mmol/l,ph＝7.8的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。
然后将混合液进行低温高压均质，均质温度在0℃以下，均质压力为900bar。重复均质化13次。得到胶原粒径在50～150μm，胶原浓度为60mg/ml的液态黏膜下填充剂。
表1不同黏膜下注射产品填充效果对比表
参考表1，对比其他的黏膜下注射产品如生理盐水、高渗盐水、葡萄糖、甘油果糖、不同浓度的透明质酸钠及羟甲基纤维素、纤维蛋白原等，本发明提供的i型胶原材料制备的液态黏膜下填充剂有着更好的止血和促进愈合的作用。同时由于胶原蛋白是细胞外基质的一种结构蛋白，因此本发明提供的i型胶原材料制备的液态黏膜下填充剂也具有生物相容性、低免疫原性、生物可降解性。
以上对本发明所提供的一种高纯度的具有三螺旋结构的i型胶原材料，一种由所述的i型胶原材料制备的液态黏膜下填充剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。