专利名称：类人胶原蛋白及注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制作方法
类人胶原蛋白及注射型类人胶原蛋白软组织填充材料技术领域
本发明属于蛋白质工程、生物医用材料领域，具体涉及类人胶原蛋白、注射型类人胶原蛋白软组织填充材料及其制备方法。
背景技术：
整形美容行业正随着人们生活水平的不断提高而快速发展，隆胸、隆鼻、除皱、脸部整形等都受人追捧。目前面部整形的需求包括祛除皱纹，改善面部轮廓，填平凹陷瘢痕或唇部，修复受伤的组织等。因此，软组织填充材料市场需求量大。
在19世纪90年代至今，人们先后研究了白蜡、脂肪移植、硅树脂、凝胶植入体等材料用于软组织整形，临床应用发现都存在着硬化，瘤状肿块、吸收过快、慢性炎症等问题。 近些年来，美国FDA相继批准了几个用于软组织填充的产品，其主要成分为牛胶原、透明质酸钠、PMMA小球等，已经有了较好的效果，对于部分使用者仍然存在着使用部位红肿、过敏及降解过快等情况。
胶原蛋白，又称为胶原，是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白， 是脊椎动物身体结构的重要材料，也是在哺乳动物中含量最丰富的蛋白。胶原由多糖蛋白分子组成，是结缔组织的主要蛋白成分，占机体总蛋白的20 30%。机体中大约一半的胶原蛋白存在于皮肤中，胶原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相当于体重的6%。类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰， 转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得，由西安巨子生物基因技术股份有限公司发明并独家生产(中国发明专利号ZL. 01106757. 8)。它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患(疯牛病、猪瘟疫、禽流感)。
透明质酸钠是广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布。其溶液具有高黏弹性及仿形性，是目前公认的生物相容性极好的生物医用材料，为眼科手术的辅助剂，并有保护角膜内皮细胞及眼内组织，减少手术并发症，促进伤口愈合的作用。
羟基磷灰石，又称羟磷灰石，是钙磷灰石(Qi5(PCM)3(OH))的自然矿物化。但是经常被写成(Qiici(PO4)6(OH)2)的形式以突出它是由两部分组成的羟基与磷灰石。羟基磷灰石具有良好的理化性质和生物学性质，使它广泛地应用于许多领域。羟基磷灰石作为无机材料的涂层和复合材料的无机基体的使用材料，赋予了材料良好的生物学性质和一定的机械力学性质而广泛应用于生物材料，现在广泛应用于人工骨等产品的开发。发明内容
本发明的目的是提供一种注射型类人胶原蛋白软组织填充材料及其制备方法，该材料制备工艺简单，所制备的类人胶原蛋白软组织填充材料稳定新好、生物相容性优异，无病毒隐患，软组织填充及修复效果好。
本发明人经过深入研究发现类人胶原蛋白、透明质酸钠和羟基磷灰石均具有良好的生物相容性，三者以适当的配比进行复合，制备得到的类人胶原蛋白软组织填充材料具有无病毒隐患、生物相容性好，可刺激手术部位细胞适量增殖等特点，具有良好的软组织填充效果，从而完成了本发明。
SP，本发明如下
1. 一种重组胶原蛋白，其由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成。
2.编码项1所述的重组胶原蛋白的核酸。
3.导入了项2所述的核酸的载体。
4.用项3的载体转化宿主细胞而得到的转化体。
5. 一种注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤
1)将类人胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为1. 0% 5. 0%的溶液；
2)将医用透明质酸钠用注射用水溶解成质量分数为0. 5% 2. 0%的溶液；
1)将上述两种溶液按一定比例混合后再加入一定量的医用级羟基磷灰石，混合搅拌，在搅拌的过程中添加适量的医用级甘油，混合均勻后真空脱泡，得到成品。
6.根据权利要求5所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于所述类人胶原蛋白是权利要求1所述的重组胶原蛋白。
7.根据权利要求5所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于所述医用透明质酸钠的分子量为100万 250万。
8.根据权利要求5所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于所述医用级羟基磷灰石为球形，其直径是20 80 μ m。
9.根据权利要求5所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于所述类人胶原蛋白溶液与透明质酸钠溶液的体积比为1 1 10。
10.根据权利要求5所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于所述医用羟基磷灰石的质量占成品总质量的3% 20%。
11.根据权利要求5所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于所用的医用甘油质量占成品总质量的0. 5% 2%。
12.根据权利要求5 11中任一项所述一种注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其还包括下述步骤
4)将所述成品在无菌条件下灌装于一次性玻璃注射器中并完成外包装。
13.根据权利要求12所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法，其特征在于步骤4)中，所用的注射器可以根据临床需求做出任意规格。
14.通过权利要求5 13中任一项所述的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料的制备方法得到的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料。
本发明提供的软组织填充材料具有适宜粘度，具有优良的生物相容性和可控的降解速率，对于各种软组织缺损和老化有一定的修复效果。与目前临床广泛应用的软组织填充材料相比，类人胶原蛋白软组织填充材料具有显著的优点它的免疫排异反应更弱，而且彻底杜绝了动物胶原蛋白所不可避免的病毒隐患，而且可在一定程度上刺激注射部位软组织适量增生，具有较为显著的填充和修复效果。
图1注射型类人胶原蛋白软组织填充材料注射小鼠皮下2周时的照片。
图2注射型类人胶原蛋白软组织填充材料注射小鼠皮下4周时的照片。
图3注射型类人胶原蛋白软组织填充材料注射小鼠皮下8周时的照片。
图4注射型类人胶原蛋白软组织填充材料注射小鼠皮下12周时的照片。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义， 如有冲突以本说明书中的定义为准。
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本发明的一个方面涉及一种重组胶原蛋白(简称本发明的重组胶原蛋白)，其由 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成。
SEQID NO:1
HDPVVLQRRDffENPGVTQLNRHLAHAHPPFASD
HPMGAPGPAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
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GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAH
GPAGPLGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA
GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP
GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA
GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS
AGA THG LVT CGL
本发明的重组胶原蛋白是中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1所述的类人胶原蛋白，其具有三链、三螺旋结构，其可以采用例如该中国专利申请公开CN1371919A 中公开的基因工程表达方法来制备。本发明的重组胶原蛋白是由中国西北大学的范代娣教授发明的，因此又称作范氏重组胶原蛋白或范氏类人胶原蛋白(Fan's Human-like Collagen，FHLC)。
此外，本发明还涉及编码上述本发明的重组胶原蛋白的核酸。
此外，本发明还涉及导入了上述核酸的载体。
此外，本发明还涉及用上述载体转化宿主细胞而得到的转化体。
上述核酸、载体、转化体可以基于本发明的重组胶原蛋白的氨基酸序列来制造，其制造方法是本技术领域公知的，例如可以参见分子克隆实验指南第三版[美]J.莎姆布鲁克著黄培堂等译科学出版社2002年9月。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。
制备例1重组胶原蛋白的制备
按中国专利申请公开CN1371919A所述方法制备了类人胶原蛋白(由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成)，确认其分子量为约90kD。这里，将该重组胶原蛋白简称为类人胶原蛋白，并用于下面的实施例。
实施例1
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成1. 0%的溶液，将分子量为250万的透明质酸钠用注射用水溶解为1.0%的溶液，将二者按照体积比为1 1进行混合，然后分别加入适量的医用级羟基磷灰石(直径40μπι)和少量的医用甘油并搅拌均勻并真空脱泡即为成品， 使得最终医用级羟基磷灰石在成品中所占的质量比为10%，医用甘油在成品中所占的质量比为0. 5%。
实施例2:
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成2. 0%的溶液，将分子量为200万的透明质酸钠用注射用水溶解为1.5%的溶液，将二者按照体积比为1 3进行混合，然后分别加入适量的医用级羟基磷灰石(直径60μπι)和少量的医用甘油并搅拌均勻并真空脱泡即为成品， 使得最终医用级羟基磷灰石在成品中所占的质量比为12%，医用甘油在成品中所占的质量比为1. 0%。
实施例3
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成3. 0%的溶液，将分子量为150万的透明质酸钠用注射用水溶解为2.0%的溶液，将二者按照体积比为1 5进行混合，然后分别加入适量的医用级羟基磷灰石(直径50μπι)和少量的医用甘油并搅拌均勻并真空脱泡即为成品， 使得最终医用级羟基磷灰石在成品中所占的质量比为8%，医用甘油在成品中所占的质量比为1. 5%。
实施例4
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成2. 5%的溶液，将分子量为100万的透明质酸钠用注射用水溶解为2.0%的溶液，将二者按照体积比为1 8进行混合，然后分别加入适量的医用级羟基磷灰石(直径20μπι)和少量的医用甘油并搅拌均勻并真空脱泡即为成品， 使得最终医用级羟基磷灰石在成品中所占的质量比为15%，医用甘油在成品中所占的质量比为0. 5%。
实施例5
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成4. 0%的溶液，将分子量为250万的透明质酸钠用注射用水溶解为1.5%的溶液，将二者按照体积比为1 4进行混合，然后分别加入适量的医用级羟基磷灰石(直径30μπι)和少量的医用甘油并搅拌均勻并真空脱泡即为成品， 使得最终医用级羟基磷灰石在成品中所占的质量比为10%，医用甘油在成品中所占的质量比为0. 5%。
实施例6
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成5. 0%的溶液，将分子量为150万的透明质酸钠用注射用水溶解为2.0%的溶液，将二者按照体积比为1 10进行混合，然后分别加入适量的医用级羟基磷灰石(直径80 μ m)和少量的医用甘油并搅拌均勻并真空脱泡即为成品，使得最终医用级羟基磷灰石在成品中所占的质量比为6%，医用甘油在成品中所占的质量比为1.0%。
实施例7:
20只健康成年昆明小鼠用脱毛剂背部脱毛备皮，第二天先用水清洁皮肤后用碘酒对小鼠备皮皮肤消毒，用75%酒精脱碘。一次性注射器吸取实施例1中制备的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料。小鼠皮下每只注射0. 2mL·
将注射过的小鼠放在相同的环境下饲养，分别于2周，4周，8周，12周后处死，每次处死5只。处死采用断颈法，然后取其背部注射处表皮，拍照，将注入部位皮肤手术刀切下中性甲醛中固定。
实验结果如图1、2、3、4所示，注射型类人胶原蛋白软组织填充材料注射小鼠皮下 2周、4周、8周、12周以后，随着时间的延长，材料在皮下有轻微的降解，无明显的炎症反应， 到12周时仍能在皮下实现填充目的，且周围组织适量增生，是一种具有广阔应用前景的新型软组织填充材料。由此可知，注射型类人胶原蛋白软组织填充材料生物相容性好，在体内降解较为缓慢，可以有效解决传统软组织填充材料生物相容性差，不能降解或降解过快的问题。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
以上通过具体实施方式
和实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应该理解的是，这些并非意图对本发明的范围进行限定，本发明的范围应由权利要求书确定。
工业实用性
本发明提供了一种注射型类人胶原蛋白软组织填充材料及其制备方法，该材料制备工艺简单，所制备的类人胶原蛋白软组织填充材料稳定新好、生物相容性优异，无病毒隐患，软组织填充及修复效果好。
权利要求
1.一种重组胶原蛋白，其由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成。
2.编码权利要求1所述的重组胶原蛋白的核酸。
3.导入了权利要求2所述的核酸的载体。
4.用权利要求3的载体转化宿主细胞而得到的转化体。
全文摘要
本发明涉及类人胶原蛋白及注射型类人胶原蛋白软组织填充材料。与目前临床广泛应用的同类软组织填充材料相比，所制备的注射型类人胶原蛋白软组织填充材料生产工艺简单、生物相容性好，彻底杜绝了动物胶原蛋白所不可避免的病毒隐患，安全性高。且可以通过在一定范围内调整羟基磷灰石的尺寸和溶液的配比来控制降解时间。
文档编号A61L27/46GK102492032SQ20111036312
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者严建亚, 范代娣, 马晓轩 申请人:陕西巨子生物技术有限公司