香草木素制备肺癌放疗增敏剂的应用的制作方法

本发明涉及抑制细胞增殖、增强肺癌放疗敏感性、抑制细胞DNA损伤修复能力的香草木素，通过检测某些特定的生物标志物，用于评价香草木素的抑制放疗抵抗肺癌细胞DNA损伤修复能力和放疗增敏效应。

背景技术：

在临床上，放射治疗可以作为早期、晚期肺癌的有意义的治疗策略，特别是对于有手术高风险的肺癌患者。然而，有部分患者，放射治疗之后，仍然会发生肿瘤复发和远处转移的风险，降低放疗疗效，这其中原因之一就是肿瘤内存在一部分亚细胞克隆，具有放疗抵抗性。因而，放疗抵抗已成为临床上治疗肺癌患者所面临的主要挑战，而阐明肺癌细胞放疗抵抗的调控机理，有助于开发有效的放疗增敏剂。

DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)是真核细胞中重要的生命活动过程，其在蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、JAK家族酪氨酸激酶(janus activated kinase，JAK)等多条信号通路的调节作用下，来感应和传递刺激引起的DNA损伤信号，启动DNA损伤修复反应(DNA-damage repair，DDR)，进行有效的DNA损伤修复或诱导细胞发生凋亡，维持基因组稳定性和细胞内稳态。研究发现，异常的DNA损伤修复反应会影响肿瘤的发生发展和治疗预后。损伤的DNA链如果未被正确修复就可能引起细胞内基因组不稳定性，最终增加肿瘤发生的风险；同时，异常的DNA损伤修复能力也影响了肿瘤细胞对放化疗的敏感性。探讨DNA损伤修复机制，将有助于开发有效的DNA损伤修复干预策略，增加放化疗的细胞毒性作用。

Akt在肿瘤细胞内异常活化，有利于成为了肿瘤治疗的潜在靶点。作为重要的细胞内信号通路，Akt信号通路参与细胞增殖、凋亡、DNA损伤反应，进而参与肿瘤的发生发展、放化疗抵抗，而Akt抑制剂表现出有效的拮抗肿瘤活性。例如，Akt抑制剂MK-2206明显地抑制了肺癌肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。某些植物化学成分通过抑制Akt信号通路的活化，进而克服了肿瘤细胞的放疗抵抗。另外，Akt抑制剂也能够下调DNA损伤修复基因的磷酸化活化，增强放疗诱导的DNA损伤和细胞死亡。因而，对Akt信号通路调节机制研究的成果正在转化为肿瘤治疗的新靶点。

香草木素(diosmetin)是豆科、橄榄科植物来源的黄酮类化合物。研究发现，在体内外实验中香草木素表现出良好的抗炎、抗肿瘤活性。在乳腺癌细胞中，香草木素通过诱导细胞色素P450的生物活化，进而导致抗乳腺癌活性。而且，本发明研究发现香草木素也能导致肺癌细胞产生G1/S期阻滞，导致细胞凋亡。然而，尚未有香草木素在肺癌放疗抵抗效应中的研究发现。因而，阐明香草木素增强肺癌细胞放疗敏感性的具体分子机理，将有助于天然化合物香草木素开发成为制备肺癌细胞放疗增敏药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供香草木素作为放疗抵抗肺癌细胞DNA损伤修复抑制剂和放疗增敏剂的应用。所述化合物香草木素为植物来源的天然化合物，其放疗增敏机制主要是改变细胞DNA损伤修复反应相关的生物标志物Akt、ATM、p53、γH2AX中的一种或几种，优选为磷酸化的Akt Ser473、ATM Ser1981、p53 Ser15和γH2AX中的一种或几种。通过检测这些特定的生物标志物的磷酸化水平，用于评价香草木素的抑制放疗抵抗肺癌细胞DNA损伤修复能力和放疗增敏效应。下面对本发明作进一步说明：

本发明确定了香草木素抑制细胞DNA损伤修复能力和增强肺癌放疗敏感性的新的分子机制，明确香草木素的应用改变了细胞DNA损伤修复能力与肺癌细胞放疗敏感性，评价香草木素作为新的DNA损伤修复抑制剂和肺癌放疗增敏剂的可行性。

本发明研究探讨了香草木素增强肺癌细胞放疗敏感性的分子机制，结果显示香草木素通过抑制Akt信号通路活性，进而下调DNA损伤修复能力，诱导肺癌细胞放疗增敏。研究明确了香草木素应用于改变细胞DNA损伤修复水平与肺癌细胞放疗敏感性的相关性。

本发明首先确定肺癌细胞A549/IR的放疗抗性，克隆形成实验和单击多靶模型确认了A549/IR具有明显的放疗抗性表型。

通过细胞克隆形成实验、细胞增殖实验、细胞周期实验等技术，分析香草木素对放疗抵抗肺癌细胞A549/IR的抑制作用，结果发现香草木素显著地抑制肺癌放疗抵抗细胞A549/IR的增殖，诱导G1/S期细胞阻滞。当香草木素与放疗联合作用时，显著提高了电子辐射(ionization radiation，IR)对肺癌细胞的细胞毒作用。

利用Western blot技术评价DNA损伤修复分子，特别是磷酸化的Akt Ser473、ATM Ser1981、p53 Ser15；利用荧光可视化的γH2AX技术评价DNA损伤效应。结果发现香草木素抑制DNA损伤修复相关分子的磷酸化水平(ATM Ser1981、p53 Ser15)，同时上调DNA损伤标记分子γH2AX的荧光信号。提示香草木素抑制了放疗所引起的抵抗细胞系中DNA损伤修复能力，提示香草木素可以作为DNA损伤修复的抑制剂。

由于Akt信号参与DNA损伤反应，利用Western blot技术和Akt的抑制剂(LY294002、MK-2206)作为阳性对照，评价香草木素对Akt信号的影响。结果发现，香草木素能够抑制放疗抵抗细胞A549/IR中的Akt磷酸化水平(Akt Ser473)。同时，香草木素对放疗引起的DNA损伤修复能力的抑制效应与Akt的抑制剂(LY294002、MK-2206)相似。进一步，联合放疗和香草木素，或者Akt的抑制剂(LY294002、MK-2206)，通过细胞增殖实验分析发现香草木素和Akt的抑制剂(LY294002、MK-2206)均能够增强肺癌细胞A549/IR的放疗敏感性，且联合作用更明显。

总之，本发明的研究发现香草木素能够通过抑制放疗引起的DNA损伤修复能力，进而增强肺癌细胞的放疗敏感性。DNA损伤调控信号(Akt Ser473)、DNA损伤相关分子(ATM Ser1981、p53 Ser15)和荧光可视化的γH2AX变化是其作用的分子基础，而细胞增殖、细胞周期、单击多靶模型等功能变化是其作用的生物学表征。因此，肺癌细胞中DNA损伤反应相关的生物标志物Akt Ser473、ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX的变化可以用来评估香草木素对肿瘤细胞DNA损伤修复能力的影响，细胞增殖、细胞周期、单击多靶模型等功能试验可以用来评价香草木素的放疗增敏作用。

附图说明

图1为香草木素抑制肺癌放疗抵抗细胞的增殖。A图显示不同放射剂量下，放疗敏感细胞A549、肺癌放疗抵抗细胞A549/IR的细胞克隆形成；B图单击多靶模型显示A549/IR具有明显的放疗抵抗性；C图显示香草木素浓度依赖性的抑制放疗抵抗细胞A549/IR的增殖率；D-E图显示香草木素抑制放疗抵抗细胞系A549/IR的克隆形成。

图2为香草木素诱导肺癌放疗抵抗细胞A549/IR发生G1/S期阻滞。A图流式细胞术显示香草木素导致A549/IR G1/S期阻滞；B图评价细胞周期检测点相关分子变化，显示香草木素抑制G1/S期细胞周期检测点分子CDK4、CKD6、CyclinD1的表达，而对G2/M期检测点CDC2的表达无影响。且与放疗联合作用时，这种细胞周期阻滞效应最明显。

图3为香草木素增强了肺癌放疗抵抗细胞A549/IR的放疗敏感性。A图显示香草木素增强了放疗对A549/IR细胞增殖抑制效应；B-C图显示香草木素增强了放疗对A549/IR细胞克隆形成能力的抑制效应。

图4为香草木素抑制了肺癌放疗抵抗细胞A549/IR中的细胞DNA损伤修复能力。A图显示香草木素增强了放疗对A549/IR细胞中DNA损伤修复分子ATM Ser1981和p53 Ser15的抑制作用；B-C图显示香草木素增强了放疗诱导A549/IR细胞中DNA损伤标记分子γH2AX的荧光信号。

图5为香草木素通过Akt信号抑制放疗抵抗细胞系的DNA损伤修复能力。A图显示香草木素对Akt信号(Akt Ser473磷酸化活化)的抑制作用；B图显示Akt抑制剂LY294002增强了放疗对A549/IR细胞中DNA损伤修复能力(ATM Ser1981、p53 Ser15磷酸化活化)的抑制作用；C图显示Akt抑制剂MK-2206增强了放疗对A549/IR细胞中DNA损伤修复能力(ATM Ser1981、p53 Ser15磷酸化活化)的抑制作用。

图6为抑制Akt信号增强了肺癌细胞的放疗敏感性。A图显示与放疗联用时，香草木素、LY294002均下调了A549/IR细胞中DNA损伤修复分子ATM Ser1981、p53 Ser15的磷酸化、上调DNA损伤标记分子γH2AX的表达；B图显示与放疗联用时，香草木素、MK-2206均下调了A549/IR细胞中DNA损伤修复分子ATM Ser1981、p53 Ser15的磷酸化、上调DNA损伤标记分子γH2AX的表达；C图显示香草木素、LY294002均能增强放疗对A549/IR细胞的杀伤作用；D图显示香草木素、MK-2206均能增强放疗对A549/IR细胞的杀伤作用。

图中Un代表未处理组(Untreated group)，DIO代表香草木素，LY代表Akt抑制剂LY204002，MK代表Akt抑制剂MK-2206。

具体实施方式

本发明所用肺癌细胞系A549细胞为ATCC细胞系(CCL-185)，A549/IR细胞系为Emory University构建的放疗抵抗细胞系。

实施例1香草木素抑制肺癌放疗抵抗细胞系的增殖

实验方法如下：首先分析A549/IR细胞的放疗抗性表型，肺癌细胞系A549、A549/IR分别经过O、2、4、8Gy的不同放射剂量的照射处理，进行细胞克隆形成实验和单击多靶模型的分析，评价A549/IR细胞的放疗抗性；然后分析香草木素对肺癌细胞系A549、A549/IR的毒性作用，0、5、10、25、50μM的香草木素处理细胞24h，进行细胞增殖实验和克隆形成实验分析。

结果显示，在不同的放射剂量作用下，与放疗敏感细胞A549相比，A549/IR细胞具有显著的放疗抗性表型。而香草木素能够呈现浓度依赖性地抑制肺癌放疗抵抗细胞的增殖率和克隆形成率(结果见图1)。

实施例2香草木素导致肺癌放疗抵抗细胞系G1/S期阻滞

细胞增殖受细胞周期的影响，而研究发现，细胞周期检测点分子CDK4、CKD6和CyclinD1调节细胞从G1期到S期的转换，CDC2调节细胞从G2期到M期的转换。

实验方法如下：A549/IR细胞，在6Gy放疗处理1h、10μM香草木素处理24h、6Gy放疗与香草木素联合处理24h的条件下，流式细胞术评价香草木素对A549/IR细胞周期分布的影响；Western blot检测细胞周期检测点分子CDK4、CKD6、CyclinD1、CDC2的表达。

结果显示，香草木素单独使用，或者与放疗联合使用，均能够导致肺癌放疗抵抗细胞A549/IR发生G1/S期阻滞。同时，显著抑制G1/S期检测点分子CDK4、CKD6、CyclinD1的蛋白表达水平，而不影响G2/M期检测点分子CDC2的蛋白表达水平(结果见图2)。

实施例3香草木素增强肺癌放疗抵抗细胞系的放疗敏感性

实验方法如下：A549/IR细胞，在6Gy放疗处理1h、10μM香草木素处理24h、6Gy放疗与香草木素联合处理24h的条件下，取1×10³状态良好的细胞，接种于96孔板上，加入20μl的MTS试剂，孵育0、24、48、72h，于490nm的波长下测量吸光度值，计算细胞增殖率。取2×10³状态良好的细胞，接种于六孔板上，CO₂细胞培养箱中培养10-15天，冰甲醇固定15min，结晶紫染色，以≥50个细胞为一个克隆，计数每孔的细胞克隆数。以未处理组为对照，计算各组的克隆形成率。

结果显示，香草木素单独使用，或者与放疗联合使用，均能够抑制肺癌放疗抵抗细胞系的增殖率和克隆形成率，且联合作用的抑制效果更明显(结果见图3)，提示香草木素有效地增加了肺癌细胞的放疗敏感性。

实施例4香草木素抑制肺癌放疗抵抗细胞系的DNA损伤修复能力

细胞内异常的DNA损伤修复能力，影响肿瘤细胞对放疗的反应。我们接下来分析香草木素是否影响肺癌放疗抵抗细胞的放疗反应。

实验方法如下：A549/IR细胞，在6Gy放疗处理1h、10μM香草木素处理24h、6Gy放疗与香草木素联合处理24h的条件下，抽取细胞总蛋白，进行ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX的Western Blot分析。取2×10²状态良好的细胞，通过孵育γH2AX一抗和对应的荧光二抗，进行荧光显微镜细胞内γH2AX的荧光强度信号。

结果显示，香草木素单独使用，或者与放疗联合使用，均能够导致肺癌放疗抵抗细胞的DNA损伤修复能力发生变化：ATM Ser1981和p53 Ser15下调、γH2AX上调，同时增加A549/IR细胞中的γH2AX的荧光信号，且联合作用的抑制效率更高(结果见图4)，提示香草木素抑制了放疗抵抗细胞系的DNA损伤修复能力。

实施例5Akt信号通路参与了肺癌放疗抗性细胞中DNA损伤修复能力

实验方法如下：A549/IR细胞，在6Gy放疗处理1h、10μM香草木素处理24h、6Gy放疗与香草木素联合处理24h的条件下，抽取细胞总蛋白，进行Akt磷酸化水平(Akt Ser473)的Western Blot分析，评价香草木素对Akt信号的抑制作用。A549/IR细胞，在6Gy放疗处理1h、10μM Akt抑制剂(LY204002或者MK-2206)处理24h、6Gy放疗与Akt抑制剂(LY204002或者MK-2206)联合处理24h的条件下，抽取细胞总蛋白，进行Akt磷酸化水平(Akt Ser473)、DNA修复能力相关分子(ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX)的Western Blot分析，评价Akt信号对DNA损伤修复能力的影响。

结果显示：香草木素能够显著抑制肺癌放疗抗性细胞系中Akt Ser473的磷酸化水平，同时抑制Akt信号活化，能够显著抑制肺癌放疗抗性细胞系中DNA损伤修复能力(ATM Ser1981和p53 Ser15下调、γH2AX上调)(结果见图5)。

实施例6抑制细胞Akt信号，减弱DNA损伤修复能力，进而增强肺癌细胞的放疗敏感性

实验方法如下：A549/IR细胞，在6Gy放疗处理1h、10μM香草木素联合6Gy放疗处理24h、10μM Akt抑制剂(LY294002、MK-2206)联合6Gy放疗处理24h、6Gy放疗与香草木素/Akt抑制剂联合处理24h的条件下，抽取细胞总蛋白，进行DNA损伤调控信号(Akt Ser473)、DNA损伤相关分子(ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX)的Western Blot分析。取1×10³状态良好的细胞，接种于96孔板上，加入20μl的MTS试剂，孵育0、24、48、72h，于490nm的波长下测量吸光度值，计算细胞增殖率。

结果显示，联合放疗作用时，香草木素与Akt抑制剂(LY294002、MK-2206)，均能够抑制肺癌放疗抵抗细胞中DNA损伤修复能力，同时，明显地抑制A549/IR细胞的增殖率。且香草木素/Akt抑制剂(LY294002、MK-2206)/放疗三者联合作用时，对A549/IR的毒性效果最好(结果见图6)。