本发明涉及中药药品
技术领域：
，具体地说，涉及一种由乌药经醇提水沉离心制得的、具有显著促进胆固醇逆转运的乌药部位及其在制备预防、改善和治疗高脂血症、动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝的药物方面的应用。
背景技术：
：高脂血症(hyperlipidemia,hlp)是由于机体脂质代谢异常，引起血浆中一种或几种脂质结构失衡的代谢性疾病，hlp是动脉粥样硬化(as)的首要危险因素，与心脑血管疾病的发生直接相关，在as基础上发生的心脑血管病高居死亡前列。对脂质代谢异常的达标治疗能够有效减少外周动脉病、心肌梗死和缺血性脑卒中的发生，减少由于高脂血症引起的心血管病的发生。目前临床常用降血脂药以他汀类、烟酸类、贝特类、多烯类等化学药为主，化学药降脂疗效肯定，但长期应用多存在肝肾损伤、胃肠道反应等不同程度的不良反应。中药具有多靶点、整体协同等作用特点，在高脂血症等慢性代谢疾病的治疗上具有独特的优势。对具有确有降脂疗效的中药开展系统深入的制备工艺、作用机制等研究，对于临床as的防治及抗高脂血症中药新药的研发具有重要现实意义。高脂血症可表现为高胆固醇(tc)血症、高甘油三酯(tg)血症或两者兼而有之(混合型高脂血症)。研究发现，高血清tc和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平是我国血脂异常患者的特点之一，大量流行病学与高胆固醇临床治疗资料显示，ldl-c是心血管疾病最重要的危险因子之一，每降低1.0mmol/lldl-c，可降低20％主要心血管事件，ldl-c是血脂异常导致心血管疾病治疗的首要干预目标。因此，降低血浆ldl-c水平，调节胆固醇代谢的平衡，是防治高脂血症及其导致的心血管疾病的有效途径。研究表明，体内胆固醇水平主要通过胞内合成、肠道吸收和胆固醇清除来维持相对恒定，而机体多余胆固醇清除主要通过胆固醇逆转运(reversecholesteroltransport,rct)来实现，rct对体内胆固醇稳态的维持起着重要的积极作用。因此，药物干预rct对于高脂血症及各种心脑血管病的治疗具有重要意义。胆固醇逆转运(rct)是血脂代谢的中心环节，可以防止脂质沉积。它是指体内多余的胆固醇经转运体介导从外周细胞流出，转移至hdl，随血液循环至肝脏，与肝细胞表面受体结合，被选择性摄取后转变为胆汁酸盐，继而由粪便排除体外。其中胆固醇由巨噬细胞流出是rct的第一步，也是其限速步骤。目前发现有多种因子参与了胆固醇从巨噬细胞的流出。b族清道夫受体i(sr-bi)是第一个在分子水平上确定的hdl受体，与hdl具有高度的结合力，介导胆固醇酯的选择性摄取，在hdl的代谢中起重要作用，刺激肝脏sr-bi的表达可以促进体内巨噬细胞胆固醇逆转运。atp结合盒转运子1(abca1)属于abc基因家族的一员，它介导脂质从细胞外流至贫脂或无脂的高密度脂蛋白(hdl)前体或apoa-i，在胆固醇和hdl生成的起始步骤中起重要作用，被称作胆固醇逆转运的守门人；同时，abca1也能减少apoa-1在肝分解，提高血apoa-1的水平，进一步促进hdl-c的形成。abcgi是atp结合盒转运蛋白家族一员，主要表达于巨噬细胞及各器官的吞噬细胞系统。研究发现，abcgi也可以作为转运体将巨噬细胞中的胆固醇转移至成熟型hdl。abcgi-基因敲除鼠中巨噬细胞胆固醇大量积聚，提示abcgi途径在巨噬细胞胆固醇流出中有重要的地位。lxra是配体活化的转录因子，在体内胆固醇转运的平衡调控中起着十分重要的作用。lxra通过对三磷酸腺苷转运体超家族(abca1、abcgi、abcg5和abcg8)以及载脂蛋白e、载脂蛋白基因簇apocii、ci、civ的表达调节来直接或间接地调控巨噬细胞、肝细胞及脂肪细胞等外周细胞的胆固醇代谢，lxra的活化可以促进rct。pparγ是lxra的上游基因，属于核内受体超家族成员。pparγ能够刺激lxra的基因表达，进而调控靶基因abc超家族介导胆固醇流出，实现胆固醇逆转运。hdl是胆固醇逆转运(rct)的主要执行者，sr-bi、abc1参与了rct中胆固醇的流出，而lcat、cetp及胆固醇7ɑ-羟化酶(cyp7a1)则参与了rct和胆固醇的代谢。胆固醇酰基转移酶(lcat)由肝脏分泌，它在血浆中主要通过与apoa-i结合，作用于圆盘状hdl及球形hdl，促进胆固醇酯(ce)的形成和hdl成熟，使hdl成为hdl2，脂质转运蛋白在hdl2和富含tg脂蛋白间进行ce与tg互换，引起rct，从而促进血浆胆固醇下降。胆固醇酯转移蛋白(cetp)在肝脏、小肠等组织中合成，它是hdl中ce与ldl和vldl三酰甘油交换过程中的重要调节因子。进食高脂肪、高胆固醇饮食，或因ldl受体和apoe缺陷而产生的内源性tc血症，均可诱导cetp的表达，从而促进rct速度。胆固醇7α-羟化酶(cyp7a1)是胆固醇代谢转化为胆汁酸途径的主要限速酶，肝cyp7a1rna表达的增加，可促进肝细胞内胆固醇转化为胆汁酸排出体外。综上可知，调节rct过程中关键蛋白的表达水平，可有效调节rct过程，从而维持体内的胆固醇代谢平衡，有效防止高脂血症及相关as等疾病的发生发展。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种促进胆固醇逆转运的提取物及其制备方法与应用。本发明中，乌药经醇提、水沉、离心后，去除了部分杂质，具有显著的促进胆固醇逆转运，降低血脂及防治动脉硬化和非酒精性脂肪肝的作用，改善了中药提取物“粗、大、黑”状况，减少了药物的服用量，易于提高服用者的依从性。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种促进胆固醇逆转运的提取物，包含异乌药醚内酯26-40mg/g，乌药醚内酯15-23mg/g，乌药醇19-30mg/g。一种促进胆固醇逆转运的提取物的提取方法，采用体积浓度为70-90％乙醇溶液对乌药进行提取，减压回收乙醇，获得提取液。将提取液浓缩至1/3体积，然后加入浓缩液3-6倍的水进行沉淀。离心后所得的沉淀物即为提取物。一种促进胆固醇逆转运的提取物在制备调节血脂的药物，预防、改善和治疗动脉粥样硬化的药物以及非酒精性脂肪肝的药物中的应用。进一步地，所述药物中，提取物的质量含量为1－100％本发明的有益效果如下：针对当前高脂血症发病现状，现有改善或治疗高血脂、动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝产品的不足及中药特色和优势，本发明提供了一种具有促进胆固醇逆转运的提取物。所述的提取物，经醇提、水沉、离心，去除了部分杂质，富集了乌药醚内酯、乌药醚内酯、乌药醇等成分的含量，提高了纯度，改善了中药提取物“粗、大、黑”状况，可减少药物服用量，有助于提高使用者的依从性；能促进高脂血症胆固醇逆转运，具有良好的降血脂作用。药理(动物)研究证实，本发明所提供的提取物，具有明显的促进胆固醇逆转运、降血脂和拮抗脂肪肝作用。给予该提取物，能显著降低高脂饮食诱导的高脂血症模型大鼠血清tc、tg、ldl-c及肝脏tc、tg水平，增加血清hdl-c水平、肝脏胆汁酸含量及粪便总胆汁酸及tc的排出量，改善肝细胞脂肪变程度。进一步作用机制研究发现，该提取物能增加小肠绒毛npc1l2表达和肝组织sr-bi、ldlr、apoa-1、胆固醇7ɑ-羟化酶(cyp7a1)、abcg5和abcg8等胆固醇逆转运途径相关蛋白表达，促进胆汁酸合成和tc分解及tc从粪便排出。本发明明确了该提取物降血脂作用的作用机制，即促进胆固醇逆转运，促进胆固醇从粪便、胆汁中的排泄；其作用机制、主要成分及含量相对明确，能更好的促进靶点明确、具有中药特色的抗高脂血症等中药新药等的研发，开发应用前景良好。本发明具有促进胆固醇逆转运的提取物，可单用或配伍应用于抗高脂血症、动脉粥样硬化及非酒精性脂肪肝药品研制，将会带来很好的社会和经济效益。附图说明附图1乌药部位对肝组织sr-bi、apoa-1、fxr(nr1h4)、cyp7a1、abcg5、abcg8、pparγ等胆固醇逆转运相关蛋白表达的影响。具体实施方式乌药为樟科植物乌药linderaaggregate(sims)kosterm.的干燥块根，主产浙江天台；富含乌药醚内酯、异喹啉生物碱等成分，为临床常用理气中药，具有调气健脾，行气止痛，疏肝解郁等功效和良好的调节胃肠道功能作用。近年研究发现，乌药能促进胃液、肠液等消化液分泌，对小肠推进和胃排空具有双向调节作用；能有效降低ccl4、乙硫氨酸所致肝损伤动物血清转氨酶水平，保护肝脏免受脂肪浸润；乌药不同提取物能显著降低酒精性肝损伤模型大鼠血清tc、tg、alt、ast含量，改善肝组织病理学改变。发明人所在课题组研究表明，乌药醇提取物对高脂饮食诱导的高脂血症具有良好的拮抗作用，其降血脂作用与促进胆固醇逆转运有关。本发明提供的提取物，在前期研究结果结合成分理化性质基础上，经提取方法等的考察，确定了醇提、水沉、离心制备该部位的方法，经hplc分析，提取物中含异乌药醚内酯26-40mg/g，乌药醚内酯15-23mg/g，乌药醇19-30mg/g。区别于传统水提取，去除了部分水溶性杂质，提高了成分的含量，从而更好地起到降血脂的目的；且减少了服用量，可增加使用者的依从性。本发明更进一步的明确了提取物降血脂作用与促进胆固醇逆转运，促进胆固醇从粪便、胆汁中的排泄有关。区别于大多数降脂中药或提取物作用机制不明的不足，且主要成分及含量相对明确，能更好的促进靶点明确、具有中药特色的抗高脂血症等中药新药等的开发，前景良好。本发明更进一步地提供一种将具有促进胆固醇逆转运的提取物在各种调节血脂、防治动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝药品的剂型上的应用，如颗粒剂、片剂、胶囊剂，适用范围广，适用性强。下面通过以下实施例对本发明作进一步说明，它将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。实施例1：不同醇浓度对乌药提取物中乌药醚内酯等成分提取率的影响研究1、实验材料1.1、色谱条件：色谱仪：agilent1200hplc仪，色谱柱：ultimate-xb-c18(5μm4.6*250nm)，检测波长：235nm，柱温：30℃，流速：1ml/min，流动相：超纯水(a)-乙腈(c)，梯度洗脱：0min，56％c，44％a；50min，56％c，44％a；55min，95％c，5％a；60min，95％c，5％a。1.2、对照品：异乌药内酯(lot：160710)、乌药醚内酯(lot：160421)、乌药醇(lot：160510)购自北京北纳创联生物技术研究院；1.3、不同乌药提取物制备：取乌药饮片适量，分别加10bv水、30％、50％、70％、90％乙醇回流提取2次，每次1h，滤取滤液，减压回收乙醇并浓缩，离线后减压干燥，得各乌药提取物。2、方法与结果2.1、线性关系：分别取上述三个对照品适量，置25ml棕色具塞容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得异乌药醚内酯浓度为0.030mg/ml，乌药醚内酯浓度为0.040mg/ml，乌药醇浓度为0.033mg/ml的混合对照品溶液。取混合对照品溶液，分别进样3、5、7、9、11、13、15μl，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标x，峰面积(area)为纵坐标y绘制标准曲线，得异乌药内酯标准曲线为y＝981.9x-3.0571，r2＝1；乌药醚内酯标准曲线为y＝1053.5x-4.2125，r2＝1；乌药醇标准曲线为y＝659.36x-5.8875，r2＝1。2.2、各乌药提取物中异乌药醚内酯等含量测定：取各乌药提取物约1g，置100ml棕色具塞容量瓶中，加甲醇溶解并定容，进样前过0.45μm滤膜，进样10μl，测定峰面积，计算各提取物中异乌药醚内酯等含量。结果表明，在醇浓度0％～70％范围内，随着醇浓度的增加，提取物中异乌药醚内酯、乌药醚内酯及乌药醇的含量逐渐增加，以70％乙醇浓度提取物中三者的成分为最高(见表1-1)。表1-1.不同醇浓度乌药提取物中异乌药醚内酯等含量测定乌药提取物异乌药醚内酯(mg/g)乌药醚内酯(mg/g)乌药醇(mg/g)水提物1.820.000.0030％醇提物9.930.582.1650％醇提物12.052.403.7070％醇提物12.784.825.1890％醇提物12.154.925.11实施例2：不同制备方法制得的乌药提取物中乌药醚内酯等成分的比较研究1、实验材料1.1、色谱条件及对照品同实施例1。1.2、不同乌药提取物制备取乌药饮片适量，分别按如下制法制备各乌药提取物：(1)乌药饮片加10bv70％乙醇回流提取2次，每次1h，滤取滤液，减压回收乙醇并浓缩至适当体积，浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集各萃取物，减压回收溶剂并浓缩，干燥，得乌药石油醚萃取提取物(a)、乙酸乙酯萃取提取物(b)、正丁醇萃取提取物(c)及水提取物(d)，备用。(2)乌药饮片加10bv70％乙醇回流提取2次，每次1h，滤取滤液，减压回收乙醇并浓缩至1/3体积，浓缩液加入3-6倍水搅拌，离心，分取沉淀物，减压干燥，得乌药提取物(e)。1.3、含量测定：取各乌药提取物适量，称定重量，置100ml棕色具塞容量瓶中，加甲醇溶解并定容，进样前过0.45μm滤膜，hplc进样分析，测定峰面积，计算各提取物中异乌药醚内酯等含量。结果表明，在不同方法制得的乌药提取物中，以醇提水沉法制得的乌药提取物中异乌药醚内酯、乌药醚内酯及乌药醇的总量为最高(见表2-1)。表2-1.不同制备方法制得的乌药提取物中乌药醚内酯等成分含量测定结果实施例3：乌药醇提水沉提取物降血脂作用研究1、实验材料1.1、动物雄性sd大鼠，体重200±20g，购自浙江省医学科学院实验动物中心。1.2、药物与试剂乌药由天台山乌药有限公司提供；乌药饮片加10bv70％乙醇回流提取2次，每次1h，滤取滤液，减压回收乙醇并浓缩至1/3体积，浓缩液加入3-6倍水搅拌，离心，分取沉淀物，减压干燥，得乌药醇提水沉提取物；临用前取上述样品适量，用纯水配置成相应浓度药液，备用。阳性对照：阿托伐他汀。tc、tg、ldl-c、hdl-c、ast、alt等生化试剂盒均购自宁波美康生物科技有限公司；肝组织及粪便中tc、tg、总胆汁酸(tba)检测用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。高脂饲料购自特洛菲饲料科技有限公司。1.3、仪器accutetba-40fr全自动生化分析仪(东芝三厂医疗株式会社)；powerwave340酶标仪(美国bio-tek仪器有限公司)。2、实验方法2.1、分组与给药大鼠适应性喂养7d后，称定体质量，随机分为正常对照组和造模组，除正常对照组大鼠外，其余大鼠给予高脂饲料，2周后禁食12h，眼眶静脉丛采血，测定血清中tc水平，根据tc水平随机分为5组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组(阿托伐他汀6.0mg/kg)、乌药提取物组(4、2、1g/kg)。除正常对照组外，其余各组继续给予高脂饲料，造模同时正常对照组和模型对照组灌服纯水，其余各给药组分别灌胃给予相应剂量药物，每日1次，灌胃容积为1ml/100g体质量，连续5周。2.2、摄食量及体质量测定试验期间每天定量供给饲料，记录剩余量并计算摄食量；每3天记录大鼠体质量一次。2.3、血液生化学指标检测实验期末，采血，分离血清，全自动生化分析仪检测大鼠血清血脂生化指标(tc、tg、ldl-c、hdl-c)。2.4、粪便tc及tba水平检测实验结束前36h，单独饲养于代谢笼中，正常喂食，自由饮水，收集24h大鼠粪便，于80℃烘箱中干燥48h，研磨成粉。称取干燥粪便适量，加10bv无水乙醇超声提取，3000r/min离心10min取上清，cod-pap法检测样品中总胆固醇(tc)水平，酶比色微板法检测总胆汁酸(tba)水平，计算粪便总tc和tba含量。2.5、肝指数及肝脂、tba水平测定给药5周后，称定体质量，处死大鼠，摘取肝脏。取肝左叶相同部位肝组织0.5g，加入预冷的0.9％生理盐水4.5ml，冰水浴中制成10％的肝匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，测定肝组织匀浆中蛋白含量。另取，相同部位肝组织0.5g加入无水乙醇4.5ml，冰水浴中制成10％的肝匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，cod-pap法测定肝组织及粪便中tc水平，gpo-pap酶法测定肝组织tg水平，酶比色微板法检测总胆汁酸水平。2.6、胆固醇逆转运相关蛋白表达检测取经甲醛固定的小肠和肝组织，常规石蜡包埋、切片、梯度乙醇脱蜡水化，免疫组化-dab染色法，检测小肠ncp1l1、肝组织ldl-r、sr-bi蛋白表达定位；取液氮冻存的肝组织，蛋白抽提试剂盒提取总蛋白，bca法测定蛋白浓度；蛋白变形，sds-page电泳，wb湿法转膜，5％脱脂牛奶封闭，分别滴加一抗、二抗孵育，ecl显色。以β-actin为内参，计算各处理组目的蛋白的表达。2.7、统计学方法计量资料数据以表示，两组间比较采用t-test，模型组及各给药组间比较采用单因素方差分析多重比较，p＜0.05表示差异有统计学意义。3、实验结果3.1、对高脂血症(hlp)模型大鼠血脂水平的影响表3-1结果显示，与正常组比，模型大鼠血清tc、tg、ldl-c水平显著升高(p<0.01，p<0.05)，hdl-c水平显著降低(p<0.01)；与模型组比，各剂量乌药提取物能不同程度地降低模型大鼠血清tc、tg及ldl-c水平(p<0.01，p<0.05)，升高hdl-c水平(p<0.01，p<0.05)显示了良好的降血脂作用。3-1.乌药提取物对hlp模型大鼠血清血脂水平的影响注：与正常对照组比较，△p<0.05，△δp<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；下同。3.2对模型大鼠肝脂及tba水平的影响表3-2结果显示，与正常组比，模型大鼠肝组织tc及tba含量显著增加(p<0.01，p<0.05)，与模型组比较，各剂量乌药能显著降低模型大鼠肝组织tc含量(p<0.01，p<0.05)，对tg有降低趋势，但差异无统计学意义；对tba含量无显著性差异。3-2.乌药提取物对hlp模型大鼠肝脏tc、tg及总胆汁酸(tba)水平的影响3.3对模型大鼠粪便tc及tba水平的影响表3-3结果显示，与正常组比，模型大鼠粪便中tc及tba含量显著增加(p<0.01，p<0.05)，与模型组比较，各剂量乌药能显著增加模型大鼠粪便tba及tc含量(p<0.01，p<0.05)，提示乌药提取物能促进体内tc及tba从肠道的排泄。3-3.乌药提取物对hlp模型大鼠粪便tba及tc水平的影响3.4对体内胆固醇逆转运(rct)相关蛋白表达的影响表3-4及附图1结果显示，与正常组比较，模型组大鼠小肠ncp1l1、肝组织fxr(nr1h4)表达水平有降低趋势，肝ldl-r表达显著增加(p<0.05)，sr-bi、apoa-1cyp7a1、abcg5、abcg8、pparγ表达显著降低；与模型组比较，乌药提取物能增加小肠ncp1l1表达(p<0.01)及肝组织sr-bi、apoa-1cyp7a1、abcg5、abcg8、pparγ表达水平，降低肝组织ldl-r水平，提示乌药提取物具有促进体内rct作用。3-4.乌药提取物对hlp模型大鼠rct相关蛋白表达的影响上述结果表明，乌药经醇提水沉制得的提取物具有显著的降血脂作用；该降脂作用与促进胆汁酸合成及tc分解、上调rct相关蛋白表达，促进rct及tc从粪便的排泄有关。以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12