金雀根抗骨质疏松有效部位的制备方法与流程

本发明属于中药制药领域，具体涉及具有防治骨质疏松作用的金雀根有效部位的制备方法。

背景技术：

资料公开了金雀根是豆科植物锦鸡儿(caraganasinica(buc′hoz)rehd)的根或根皮，资源丰富，在我国大多数省区均有分布。金雀根最早收载于《本草纲目拾遗》，具有“清肺益脾，活血通脉”之功效，民间主要用于治疗虚损劳热、咳嗽、高血压、妇女白带、血崩、关节痛风、跌打损伤等。目前对金雀根的化学成分、药理作用及作用机理的研究已取得长足进展：金雀根中的二苯乙烯类(stilbenoids)是其化学成分主要结构类型，已发现26种，其中kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中具有较大含量，且carasinolb尚未在其它天然产物中发现，为其专有成分。药理研究发现金雀根提取物具有刺激成骨细胞增殖、抑制破骨细胞的分化等活性；体内试验证实其可以改善卵巢摘除sd大鼠的骨密度，逆转糖皮质激素诱导的斑马鱼骨量减少。因此，金雀根提取物有望发展成为一种抗骨质疏松药物。实践显示，中药中大多具有低毒性、高安全性的特点，因此在相关领域中正获得越来越多的认可和青睐。近年来，不断有抗骨质疏松的中成药获得国家新药审批，如淫羊藿总黄酮胶囊、通络生骨胶囊、杜仲壮骨胶囊等，显示出国内对中药抗骨质疏松作用的关注和认可。现有技术中对金雀根有效部位的提取工艺有，采用ab-8大孔树脂纯化金雀根有效部位，得到的提取物其有效成分含量大于50％，基本可满足药物开发的要求，但所述提取方法尚存在载样量小，柱体易被样品堵塞，耗时较长等弊端，且常无法满足生产和实际应用的需求。

鉴于现有技术的现状，本申请的发明人拟探求更合理的金雀根有效部位的纯化工艺，提供新的金雀根抗骨质疏松有效部位的制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种新的金雀根有效部位的纯化工艺，具体涉及一种金雀根抗骨质疏松有效部位的制备方法。本制备方法简便易行、效率高、安全性好。

本发明采用溶剂萃取法制备金雀根有效部位，其包含步骤：

取金雀根药材，粉碎，按药材重量加数倍量的乙醇或甲醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到适当浓度的提取物浓缩液，以溶剂脱脂去除油脂等低极性杂质或直接离心处理后，加萃取剂萃取，回收萃取溶剂，真空干燥，得金雀根有效部位提取物。

本发明中，所用的乙醇的浓度为5％～95％，甲醇的浓度为5％～100％；乙醇或甲醇的用量为药材重量的2～10倍。

本发明中，脱脂溶剂选自石油醚、氯仿、环己烷单一试剂或混合溶剂，用量为1～8倍量(v/v)，萃取1～4次。

本发明中，萃取溶剂为乙酸乙酯或正丁醇，萃取剂用量为1～8倍量(v/v)，萃取1～4次。

本发明中，真空干燥温度为30～100℃。

更具体的，本发明的制备金雀根有效部位的方法，其包括步骤：

(1)制备浓缩提取物：

取金雀根药材，粉碎，按药材重量加2～10倍量的5％～95％的乙醇或5％～100％的甲醇提取，减压浓缩回收醇，得适当浓度金雀根浓缩提取物；

(2)脱脂：

将金雀根浸膏以1～8倍量(v/v)的脱脂溶剂萃取，静置，分层，萃取1～4次，除去脂溶性色素及油脂性成分；

所述的脱脂溶剂选自石油醚、氯仿、环己烷单独应用或混合使用；

(3)纯化：将脱脂后的浸膏以1～8倍量(v/v)溶剂萃取，静置，分层，萃取1～4次，得含有金雀根有效部位的萃取液；

所述的萃取溶剂选自乙酸乙酯或正丁醇；

(4)干燥：将金雀根有效部位的萃取液减压回收有机溶剂，浸膏于30～100℃ 真空干燥，得金雀根有效部位提取物。

本方法制得的金雀根有效部位提取物，按照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部，附录vid)进行测定，测定结果显示，有效成分含量大于60％，保留率高达80％以上；制得的金雀根有效部位提取物中二苯乙烯类成分carasinolb、kobophenola、(+)-α-viniferin不低于总量的50％。

本发明的优点在于：

1、本发明采用溶剂萃取法纯化金雀根有效部位，相对于大孔树脂法，工艺简单，效率高，易于实现产业化。

2、本方法制得的金雀根提取物有效成分含量大于60％，保留率高达80％以上(结果如表1所示)，且工艺稳定。

表1是本发明制得的三批金雀根有效部位样品检测结果，其中，批号20140601、20140602、20140603为按照实施例5，分3次制备获得的金雀根有效部位提取物。

表1

以下，结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

附图说明

图1为实施例9金雀根有效部位提取物在不同肠段的吸收速率常数ka对比图。

图2为实施例9金雀根有效部位提取物在不同肠段的表观渗透系数papp对比图。

具体实施方式

实施例1

称取金雀根药材500g，粉碎，加50％乙醇回流提取2次，乙醇每次用量为药材用量的8倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收乙醇，得到比重0.975的浸膏，用浓缩液体积2倍量的石油醚脱脂2次，水相用2倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩后70℃真空干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达62.3％。

实施例2

称取金雀根药材500g，粉碎，加80％乙醇回流提取2次，乙醇每次用量为药材用量的6倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收乙醇，得到比重0.985的浓缩液，用1倍量的环己烷脱脂3次，脱脂后水相用1倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯萃取，80℃真空干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量为59.8％。

实施例3

称取金雀根药材500g，粉碎，加95％乙醇回流提取2次，乙醇用量为药材用量的6倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收乙醇，得到比重0.970的浓缩液，以3倍量氯仿脱脂1次，水相用2倍量正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，70℃真空干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达66.1％

实施例4

称取金雀根药材500g，粉碎，加40％甲醇回流提取2次，甲醇每次用量为药材用量的10倍(v/m，体积质量比)。回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收甲醇，得到比重0.975的浓缩液，用2倍量石油醚脱脂2次，水相用1倍量正丁醇萃取4次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，80℃真空干燥，得金雀根有效 部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达61.8％。

实施例5

称取金雀根药材500g，粉碎，加70％甲醇回流提取2次，甲醇用量为药材用量的8倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收甲醇，得到比重0.975的浓缩液，用2倍量石油醚脱脂2次，水相用2倍量乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，75℃干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达63.1％。

实施例6

称取金雀根药材500g，粉碎，加甲醇回流提取2次，甲醇每次用量为药材用量的6倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收甲醇，得到比重0.980的浓缩液，用3倍量石油醚脱脂1次，脱脂后水相用2倍量乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩挥去溶剂，60℃真空干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达66.8％。

实施例7

称取金雀根药材500g，粉碎，加80％甲醇回流提取2次，甲醇用量为药材用量的6倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并2次提取液，回收甲醇，得到比重0.980的浓缩提取液，浓缩提取液用2倍量环己烷萃取2次，脱脂后水相用2倍量乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩挥去溶剂，70℃真空干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达65.7％。

实施例8

称取金雀根药材500g，粉碎，加60％甲醇回流提取3次，甲醇用量为药材用 量的6倍(v/m，体积质量比)，回流时间为每次2h。合并3次提取液，减压浓缩挥去甲醇，得到比重0.980的浓缩提取液，浓缩提取液分别用2倍量石油醚萃取2次，脱脂后水相用2倍量乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩挥去溶剂，70℃真空干燥，得金雀根有效部位提取物；

hplc定量分析kobophenola、(+)-α-viniferin及carasinolb在金雀根提取物中含量达62.8％。

实施例9

本实施例采用大鼠在体肠吸收试验对实施例1制得的金雀根有效部位提取物的体内吸收情况进行评价，以验证本发明的体内吸收行为。

试验方案：选取实验前禁食过夜的健康sd大鼠20只，体重250±20g，随机分成4组，即十二指肠、空肠、回肠、结肠组，考察金雀根有效部位在大鼠不同肠段的吸收情况，以kobophenola为指标性成分进行分析；腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，麻醉后将大鼠固定于恒温手术台板上，以保持37℃体温；待大鼠痛觉消失，沿腹中线剪开3～4cm的开口，分别截取十二指肠(距幽门2cm)，空肠(距幽门15cm)，回肠(距盲肠20cm)，结肠(距盲肠2cm))各10cm，用37℃生理盐水缓缓洗净肠管内容物。将肠管两端的玻璃管与蠕动泵的胶管连接，开动蠕动泵。用含酚红的k-r缓冲液配制金雀根有效部位的供试药液，先以1ml·min^-1的流速灌流10min，再流速调为0.2ml·min^-1，同时开始计时，约30min后，吸收达稳定状态，每隔15min收集灌流液，即分别于计时后45、60、75、90、105min收集灌流液，样品12000rpm离心15min，hplc测定不同时间点药物浓度，紫外分光光度法测酚红浓度；实验结束后，常规处理大鼠，取灌流肠段，测量并记录其长度和内径；实验结果表明，金雀根有效部位提取物中的carasinolb、kobophenola、(+)-α-viniferin等主要活性成分在各肠段均有吸收，在四个肠段的吸收为回肠>结肠>空肠>十二指肠(p<0.05)(如图1、图2所示)。