一种丝素荧光探针的制备方法与流程

本发明涉及一种丝素荧光探针的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

生物大分子如蛋白质和多肽，具有生物相容性、功能性和多样性，是自然界生物的重要组成部分，也是人类用于改造自然，提高生活质量的必要的原料。因此，对材料中蛋白质进行定性和定量分析具有及其重要的作用，常要用具有高度灵敏度的生物学方法。对蛋白质含量鉴定和定量的传统方法有双缩脲法、酚试剂法法及紫外吸收法等，但这些传统的方法存在灵敏度低、非特异性测定的缺点。随着科学技术的进步，质谱特别是飞行时间质谱(maldi-tof)已成为鉴定光谱性蛋白质的重要技术。maldi-tof对蛋白质进行检测时主要有2个步骤：离子反射器和延迟提取，从而达到对样本中蛋白质含量的测定。这一技术能够完成对极低含量的蛋白质进行检测，提高了蛋白质的检测灵敏度。

丝素蛋白是一种天然的高分子，由于其独特的力学性能和良好的生物相容性、降解性和稳定性，易于加工与修饰，以及本质是蛋白质的结构特点，成为制药、化工、食品添加剂和组织工程等领域中引人注目的一类生物材料。由于丝素蛋白具有生物降解性、生物相容性、生物可降解性和可加工性等优良性能，可制备成多种形态的材料，如多孔状、膜状、纤维状和管状等，在科学研究中受到广泛的关注和研究。丝素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸等18种氨基酸组成。虽然上述方法或技术能够对蛋白质进行检测，但仍然不能对丝素蛋白进行特异性鉴定，尤其是在含有其它蛋白质的干扰下，不能够对丝素蛋白进行定性及定量。

丝素分子量最高可达350kda，低分子量的丝素蛋白也有20kda，且在这一区间存在很大的一个分子量跨度，因此丝素蛋白一级结构和多级结构复杂；尤其当丝素蛋白与其它蛋白混合后，普通方法难以对丝素进行定性和定量。因此开发出一种针对丝素蛋白进行特异性鉴别的探针具有很大的挑战性。综上所述，至今为止还没有出现一种高效、简单的方法对丝素蛋白或丝素材料进行特异性鉴别和定量。

技术实现要素：

荧光探针技术是影像技术中重要研究内容,通过静电应力、化学反应、氢键作用等方法将拟检测的对象(如生物分子、组织、材料等)在特定波长激发下产生荧光并被肉眼或者仪器检测的过程。

针对传统制备技术中存在的不足，本发明提出了一种丝素荧光探针的制备方法，以噬菌体筛选得到的丝素亲和肽为中心，通过与荧光素接枝，得到特异性检测丝素材料的荧光探针，该方法简单一步合成。

本发明的技术方案是采用如下步骤：

1)用丝素材料对噬菌体库进行筛选，得到与丝素蛋白特异性结合的噬菌体；

2)对步骤2)获得的与丝素蛋白特异性结合的噬菌体进行基因测序，将测序获得的基因对应的氨基酸序列作为丝素亲和肽一级序列；

3)通过多肽合成技术对步骤(2)得到的丝素亲和肽一级序列进行多肽合成，得到丝素亲和肽粉；

4)将步骤(3)得到的丝素亲和肽粉和荧光素结合，得到丝素荧光探针。

本发明实施例中将步骤(4)得到的丝素荧光探针进行鉴定与应用，丝素荧光探针能够对丝素材料或者含有丝素蛋白的材料进行特异性结合并被荧光显微镜检测到。

所述步骤1)具体为：

a.封闭丝素材料：将丝素材料加入含有tbs和bsa的缓冲液，tbs和bsa各自的浓度为0.1-10mg/ml；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：将噬菌体肽加入到丝素膜的缓冲液中，常温摇床中以150-220rpm转速下摇振0.5-8h；

c.洗涤：用洗涤液将丝素膜洗涤1-10遍；

d.洗脱：将洗涤液除去，加入洗脱液常温孵育1-20分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来；

e.中和：加入中和液，使得洗脱后的噬菌体液与中和液混匀后呈中性；

f.噬菌体扩增：将中和后的噬菌体液转入到er2738菌中，在37℃温度的摇床中以150-220rpm转速摇振3-24h，得到噬菌体和er2738菌混合液；

g.噬菌体纯化：将噬菌体和er2738菌混合液进行离心，再加入到peg和nacl的混合液中进行纯化，得到亲和丝素材料的噬菌体菌液；

i.上述步骤a～g过程为一次循环，将步骤a～g经过2-6次重复循环之后，得到与丝素材料特异性结合的噬菌体液。

本发明实施例进一步采用以下方式处理，来验证步骤(2)中与丝素材料特异性结合的噬菌体的亲和性：将筛选后的与丝素材料特异性结合的噬菌体进行涂板，具体是将噬菌体再次侵染er2738菌，并均匀涂布在含有xgal/iptg的固体lb板上，如次日lb板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有高亲和性。从而说明并不是由于噬菌体自身出现蓝色斑点，而是通过筛选与丝素材料特异性结合后出现蓝色斑点。

所述步骤a中的丝素、材料采用以下方式进行制备：先将蚕丝蛋白粉末溶于有机溶剂或者水中形成蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板上风干，加酒精处理使蚕丝蛋白固化，得到不溶解于水的丝素膜。

所述的丝素材料包括但不限于丝素膜、丝素多孔支架、丝素粉末、丝素纤维、丝素微球、丝素水凝胶、丝织物等丝素材料或者掺杂有丝素蛋白的材料。

所述步骤1)中的洗涤包括用tbst洗涤，还可选用磷酸盐缓冲液(pbs)、模拟体液(sbf)、生理盐水、tris-hcl缓冲液等非烈性缓冲液，洗涤次数为1-10遍，优选次数为3-7遍。

所述步骤1)中的洗脱包括用gly-hcl洗脱液，还可选用酸性、碱性或者烈性洗脱液。

所述步骤1)中的中和液采用tris-hcl中和液。

所述荧光素选自以下组中的一种或多种：异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明、蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、alexafluor、cy3、cy5荧光素等。

所述的丝素亲和肽粉和荧光素结合是通过化学共价交联或者螯合作用的方式将两者进行连接。

本发明优选的方法为荧光素与丝素亲和肽化学接枝法。当荧光素在碱性溶液中与丝素亲和肽反应时，丝素亲和肽上c端或者n端的氨基与荧光素的硫碳胺键进行结合，形成一种荧光素-丝素亲和肽结合物。同时，荧光素与丝素亲和肽的连接方式还可以为化学共价交联、螯合作用等方式。

本发明制备得到的所述丝素荧光探针用于检测和鉴定丝素材料或者含有丝素蛋白的材料。所述丝素荧光探针能够对丝素膜、丝素多孔支架、丝素粉末、丝素纤维、丝素微球、丝素水凝胶、丝织物等丝素材料或者含有丝素蛋白的材料进行特异性检测，是一种灵敏度高、快速、实用、方便、高效的检测丝素材料的方法。

本发明探针是由包含与丝素蛋白特异性结合的亲和肽和荧光染料所组成。所述亲和肽为通过噬菌体库筛选得到，荧光染料为商业化购买得到。

实验证明，本发明所筛选的噬菌体对丝素材料具有很高的亲和性。此探针灵敏度高，检测速度快，应用前景广泛，为丝素蛋白及丝素材料的高效靶向、鉴定提供更多的选择。

与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：

(1)灵敏度高：相较于传统的方法，本专利的方法能够在微克级别对丝素蛋白进行鉴定；

(2)特异性高：具有与丝素材料结合的专一性，而非特异性蛋白不会被检测到；

(3)方便：不需要复杂的制样过程和繁琐的仪器操作步骤；

(4)快速：丝素鉴定快速，可在半小时内完成；

(5)实用：能够对含有丝素蛋白的材料进行特异性鉴定及定量，不会破坏丝素材料本身的结构完整性；

附图说明

图1为本发明实施例1和实施例2制备的丝素荧光探针鉴定丝素纳米纤维和丝素多孔支架的图片，对照组为聚乙烯片。

图2为实施例1经过4轮筛选后噬菌体的数量柱状图。

图3为实施例3中，丝素fitc荧光探针和对照组(fitc水溶液)在浓度极低(2微克/毫升)的情况下对丝素纳米纤维进行荧光染色图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

本发明的实施例如下：

实施例1：

1)使用商业化的neb生产的噬菌体肽库对丝素膜进行5轮筛选得到与丝素蛋白结合的噬菌体，具体过程如下；

1.1)制备丝素膜：

a.获取蚕丝蛋白水溶液，浓度为1mg/ml；

b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加酒精处理使其固化，得到不溶解于水的家蚕丝素膜。

1.2)筛选与丝素蛋白结合的多肽序列

a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入tbs+bsa(0.5mg/ml)的缓冲液；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：这对每一噬菌体种类，将商业化的m13-12噬菌体随机展示文库10微升加入到丝素膜中，常温摇床中150rpm摇0.5h；

c.洗涤：用tbst洗涤液将丝素膜洗涤1遍；

d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的tbst洗涤液尽量除去，加入gly-hcl洗脱液(加入了bsa)，常温孵育1分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。

e.中和：加入tris-hcl中和液，混匀后为中性；

f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的er2738菌中(od600值约为0.5)，37℃摇床中摇150rpm，3h，得到的噬菌体/er2738菌的混合液。

g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/er2738菌混合液离心，再加入到peg/nacl混合液中进行纯化，peg和nacl混合液中各自的浓度是20g/l和40g/l，得到噬菌体液。

h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过4轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体，并进行计数，四轮的计数分别如图2所示。

1.3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染er2738菌，并均匀涂布在含有xgal/iptg的固体lb板上，如次日lb板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。

2)对筛选的得噬菌体进行基因测序，推出丝素亲和肽的氨基酸序列；

3)通过固相多肽合成技术得到粗分离的丝素亲和肽，再经过纯化处理即得到丝素亲和肽粉末；

4)加入异硫fitc(氰酸荧光素)和diea(二异丙基乙胺)，ftic、diea和丝素亲和肽在避光的dmf(二甲基甲酰胺)溶剂中反应24小时，ftic、diea和丝素亲和肽的浓度/混合比例为5：1，即可制备出丝素ftic探针。

5)将步骤4)中的丝素ftic探针对丝素纳米纤维进行特异性检测，在不同材料之间，能够识别出丝素纳米纤维材料，如图1中的中间图所示，而对照组(tcp塑料材料)如图1中的左侧图，没有发出荧光。证明该丝素ftic探针能够对丝素材料进行特异性鉴定，具有很高的丝素材料特异性。

实施例2：

1)使用商业化的neb生产的噬菌体肽库对丝素膜进行5轮筛选得到与丝素蛋白结合的噬菌体，具体过程如下；

1.1)制备丝素膜：

a.获取蚕丝蛋白水溶液，浓度为10mg/ml；

b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加酒精处理使其固化，得到不溶解于水的家蚕丝素膜。

1.2)筛选与丝素蛋白结合的多肽序列

a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入tbs+bsa(10mg/ml)的缓冲液；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：这对每一噬菌体种类，将商业化的m13-12噬菌体随机展示文库10微升加入到丝素膜中，常温摇床中220rpm摇0.5h；

c.洗涤：用tbst洗涤液将丝素膜洗涤10遍；

d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的tbst洗涤液尽量除去，加入gly-hcl洗脱液(加入了bsa)，常温孵育1分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。

e.中和：加入tris-hcl中和液，混匀后为中性；

f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的er2738菌中(od600值约为0.5)，37℃摇床中摇150rpm，3h，得到的噬菌体/er2738菌的混合液。

g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/er2738菌混合液离心，再加入到peg/nacl混合液中进行纯化，peg和nacl混合液中各自的浓度是20g/l和40g/l，得到噬菌体液。

h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过4轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体，并进行计数。

1.3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染er2738菌，并均匀涂布在含有xgal/iptg的固体lb板上，如次日lb板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。

2)对筛选的得噬菌体进行基因测序，推出丝素亲和肽的氨基酸序列；

3)通过固相多肽合成技术得到粗分离的丝素亲和肽，再经过纯化处理即得到丝素亲和肽粉末；

4)加入异硫fitc(氰酸荧光素)和diea(二异丙基乙胺)，ftic、diea和丝素亲和肽在避光的dmf(二甲基甲酰胺)溶剂中反应24小时，ftic、diea和丝素亲和肽的浓度/混合比例为1：1，即可制备出丝素ftic探针。

5)将步骤4)中的丝素ftic探针对丝素多孔支架进行特异性检测，能够识别出丝素多孔支架材料，如图1中的右边图所示，而对照组(聚乙烯板材料)如图1中的左侧图，没有发出荧光。

实施例3：

1)使用商业化的neb生产的噬菌体肽库对丝素膜进行5轮筛选得到与丝素蛋白结合的噬菌体，具体过程如下；

1.1)制备丝素膜：

a.获取蚕丝蛋白水溶液，浓度为50mg/ml；

b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加酒精处理使其固化，得到不溶解于水的家蚕丝素膜。

1.2)筛选与丝素蛋白结合的多肽序列

a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入tbs+bsa(1mg/ml)的缓冲液；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：这对每一噬菌体种类，将商业化的m13-12噬菌体随机展示文库10微升加入到丝素膜中，常温摇床中220rpm摇0.5h；

c.洗涤：用tbst洗涤液将丝素膜洗涤10遍；

d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的tbst洗涤液尽量除去，加入gly-hcl洗脱液(加入了bsa)，常温孵育1分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。

e.中和：加入tris-hcl中和液，混匀后为中性；

f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的er2738菌中(od600值约为0.5)，37℃摇床中摇220rpm，3h，得到的噬菌体/er2738菌的混合液。

g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/er2738菌混合液离心，再加入到peg/nacl混合液中进行纯化，peg和nacl混合液中各自的浓度是20g/l和40g/l，得到噬菌体液。

h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过4轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体，并进行计数。

1.3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染er2738菌，并均匀涂布在含有xgal/iptg的固体lb板上，如次日lb板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。

2)对筛选的得噬菌体进行基因测序，推出丝素亲和肽的氨基酸序列；

3)通过固相多肽合成技术得到粗分离的丝素亲和肽，再经过纯化处理即得到丝素亲和肽粉末；

4)加入异硫fitc(氰酸荧光素)和diea(二异丙基乙胺)，ftic、diea和丝素亲和肽在避光的dmf(二甲基甲酰胺)溶剂中反应24小时，ftic、diea和丝素亲和肽的浓度/混合比例为1：3，即可制备出丝素ftic探针。

5)将步骤4)中的丝素ftic探针对丝素纳米纤维进行特异性检测，在浓度极低(如2微克/毫升)的情况下，发出强烈的荧光，因此能够识别丝素纳米纤维，如图3中的右侧图所示。而同浓度的对照组(fitc水溶液)没有发出荧光，如图3中的左侧图，因此不能够识别丝素纳米纤维。证明该丝素ftic探针能够对微克级别的丝素材料进行特异性鉴定，具有很高的灵敏度。

实施例4：

1)使用商业化neb生产的噬菌体肽库对丝素膜进行3轮筛选得到与丝素蛋白结合的噬菌体；

1.1)制备丝素膜：

a.获取蚕丝蛋白水溶液，浓度为100mg/ml；

b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加纯酒精处理使其固化，得到不溶解于水的家蚕丝素膜。

1.2)筛选与丝素蛋白结合的多肽序列

a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入tbs+bsa(0.2mg/ml)的缓冲液；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：这对每一噬菌体种类，将商业化的m13-12噬菌体随机展示文库10微升加入到丝素膜中，常温摇床中160rpm摇8h；

c.洗涤：用tbst洗涤液将丝素膜洗涤10遍；

d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的tbst洗涤液尽量除去，加入gly-hcl洗脱液(加入了bsa)，常温孵育20分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。

e.中和：加入tris-hcl中和液，混匀后为中性；

f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的er2738菌中(od600值约为0.5)，37℃摇床中摇220rpm，24h，得到的噬菌体/er2738菌的混合液。

g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/er2738菌混合液离心，再加入到peg/nacl混合液中进行纯化，peg和nacl混合液中各自的浓度是20g/l和40g/l，得到噬菌体液。

h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过6轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体。

1.3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染er2738菌，并均匀涂布在含有xgal/iptg的固体lb板上，如次日lb板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。

2)对筛选的得噬菌体进行基因测序，可推出丝素亲和肽的氨基酸序列；

3)通过固相多肽合成技术得到粗分离的丝素亲和肽，再经过纯化处理即得到丝素亲和肽粉末；

4)将丝素亲和肽在ph9～9.5碳酸盐缓冲液进行反应，将罗丹明标记在丝素亲和肽上，即可制备出丝素罗丹明探针。丝素罗丹明探针能够对微克级别的丝素材料进行特异性鉴定，具有很高的灵敏度。

实施例5：

1)使用商业化neb生产的噬菌体肽库对丝素膜进行3轮筛选得到与丝素蛋白结合的噬菌体；

1.1)制备丝素膜：

a.获取蚕丝蛋白水溶液，浓度为100mg/ml；

b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加纯酒精处理使其固化，得到不溶解于水的家蚕丝素膜。

1.2)筛选与丝素蛋白结合的多肽序列

a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入tbs+bsa(0.2mg/ml)的缓冲液；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：这对每一噬菌体种类，将商业化的m13-12噬菌体随机展示文库10微升加入到丝素膜中，常温摇床中160rpm摇8h；

c.洗涤：用tbst洗涤液将丝素膜洗涤10遍；

d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的tbst洗涤液尽量除去，加入gly-hcl洗脱液(加入了bsa)，常温孵育20分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。

e.中和：加入tris-hcl中和液，混匀后为中性；

f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的er2738菌中(od600值约为0.5)，37℃摇床中摇220rpm，24h，得到的噬菌体/er2738菌的混合液。

g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/er2738菌混合液离心，再加入到peg/nacl混合液中进行纯化，peg和nacl混合液中各自的浓度是20g/l和40g/l，得到噬菌体液。

h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过6轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体。

1.3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染er2738菌，并均匀涂布在含有xgal/iptg的固体lb板上，如次日lb板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。

2)对筛选的得噬菌体进行基因测序，可推出丝素亲和肽的氨基酸序列；

3)通过固相多肽合成技术得到粗分离的丝素亲和肽，再经过纯化处理即得到丝素亲和肽粉末；

4)将丝素亲和肽在ph9～9.5碳酸盐缓冲液进行反应，将罗丹明标记在丝素亲和肽上，即可制备出丝素罗丹明探针；

5)将获得的丝素罗丹明探针对微量丝绸织物进行鉴定，荧光染色为阳性，而对照组(非丝绸织品)染色为阴性，证明本发明的探针可对近代或古代丝绸真伪进行鉴定。