一种采用调幅电场增强药物疗效的装置的制作方法

本发明属于医疗器械的技术领域，涉及一种采用调幅电场增强药物疗效的装置。

背景技术：

自1980年起，电场就被普遍用于生物和医学领域，涵盖杀死微生物、细胞融合、基因转化和肿瘤治疗等。1987年日本学者Okino首创了电脉冲化学疗法(EPCT)，EPCT是采用电场强度高达每厘米千伏、持续时间为微秒甚至纳秒级的电脉冲与化学药物结合的肿瘤治疗方法，此方法仅需小剂量的药物就能高效、低毒地杀死肿瘤细胞，大大地提高了化疗药物的作用疗效，降低了其毒副作用。

电场治疗可联合化疗运用于肿瘤的维持治疗和放疗难以实施的紧急治疗。在与化疗联用的研究方面，Miklos等的临床试验证实，电场治疗结合培美曲塞可安全有效地治疗进展性肺小细胞肺癌(SCLC)。同时，电场与培美曲塞结合治疗晚期非小细胞肺癌的I/II临床试验也证明了电场治疗的高效性与安全性，患者的中位生存期在较常见的8.3个月基础上延长了5.5个月，治疗的总有效率也从9.1％上升到14.6％，因此电场联合培美曲塞治疗方案优于单药。Kirson等在应用紫杉醇+阿霉素+环磷酰胺+达卡巴嗪联合电场处理乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)和人胶质瘤细胞系(U-118)时发现，结合电场后上述肿瘤细胞对化疗的敏感性上升了1～3个数量级，化疗功效与敏感性均得到提高。Morant等还开展了对电场结合4疗程新辅助化疗(表柔比星+多西他赛)治疗恶性乳腺癌的研究，以评估电场对乳腺癌术前化疗的影响。

文献报导的EPCT的作用机制是对细胞膜的电穿孔效应和改变细胞的生存环境。高电场强度的电脉冲导致细胞膜发生构型变化，出现大量微孔，使得细胞膜的电导率与通透性发生显著提高，使药物能顺利地通过细胞膜进入细胞内，在一适当的强度下，电脉冲的电穿孔作用是可逆的，在停止电脉冲作用后，细胞膜的微孔又会重新关闭而不会对细胞造成损害。电脉冲作用肌体组织，会造成绝缘电极作用区域细胞外液的pH值剧烈改变而损伤肿瘤细胞。EPCT的缺陷是使用电压高存在一定的安全隐患，需要微创将绝缘电极直接插入体内的有创性，pH值的剧烈变化可能产生对正常组织的毒副作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种采用调幅电场增强药物疗效的装置，一是用以克服脉冲疗法使用电压高不安全、绝缘电极直接插入体内的有创性、电极作用区域细胞外液间pH值等剧烈改变而损伤正常组织的缺点；二是通过在一对绝缘电极间产生电场强度连续强弱剧烈突变的调幅电场，用于药物治疗的增强作用，在保证药物同等疗效下可显著减少药物的用量而降低药物的毒副作用，在同等使用剂量下药物因透过细胞膜量增加而疗效显著增强。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种采用调幅电场增强药物疗效的装置，该装置包括：中央控制单元，用于各个单元协调控制；调频信号发生单元，用于产生所需波形的频率信号；幅度调制单元，用方波调制产生幅度连续剧烈突变的调幅波信号；功率放大单元，用于放大幅度调制单元产生的调幅波信号；输出分配单元，用于放置的调幅信号的分配与输出；绝缘电极，用于形成连续强弱剧烈突变的调幅电场；绝缘电极定位系统，根据由电脑模态图提供的病灶的体积、位置、深度、病灶区域机体外形特征等信息，确定绝缘电极的最佳分布位置。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，其调频信号发生单元采用直接数字频率合成器或由变容二极管组成的调频电路，其幅度调制单元采用方波晶体管调幅电路或方波集成电路调幅电路，其功率放大单元采用中频功率放大电路，输出分配单元采用分配控制电路和电子开关来实施。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，其调频信号发生单元产生的频率信号，在幅度调制单元采用方波形的低频(或超低频)调制波调制成调幅波，调幅波的包络线波形与调制波相同，频率与载波相同，幅度随载波与调制波幅度的矢量增减变化；调幅波的功率放大单元放大后施加到绝缘电极上，则在一对绝缘电极间产生电场强度连续强弱剧烈突变的调幅电场，这种调幅电场作为外电场施加到病灶区，使病灶区细胞的细胞膜遭受电场强度的强弱剧烈突变的外电场的刺激而产生连续交替的除极与复极现象，细胞膜除极时膜的通透性显著提高，细胞膜复极时膜的通过性恢复正常。细胞膜通透性增高时则药物进入细胞内的量增多，药物的疗效相应增强。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，其不同方向分布的两对以上绝缘电极间同时产生所需要的电场强度连续强弱突变的调幅电场，两个以上的调幅电场作为外电场交叉重叠覆盖病灶区，使两个以上的外电场重叠的合成矢量电场的强弱变化幅度成倍加大，以增加合成矢量电场覆盖区细胞细胞膜的通透性，使膜外的药物能顺利地进入细胞内，同时不会对病灶邻近区域的细胞造成损害。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，其绝缘电极由导电材料制造，外表为绝缘层，绝缘电极的朝外一面设置扣式导线连接点，绝缘电极上下分别有上固定桩和下固定桩，上固定桩和下固定桩均采用绝缘材料；上固定桩为套管弹簧顶压结构，套管弹簧顶压结构包括套管、凸字形桩头和弹簧，凸字形桩头和弹簧被封装在上端开口口径小于内径的套管内，凸字形桩头的小头被弹簧以较大压力顶出套管上端开口；绝缘电极安装到绝缘电极底座上，上固定桩卡入绝缘电极底座的上安装糟，下固定桩卡入绝缘电极底座的下安装糟，弹簧使上固定桩和下固定桩分别紧紧顶住绝缘电极底座内的上安装糟和下安装糟，绝缘电极可绕上固定桩和下固定桩形成的轴转动以适应人体不同部位的外形。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，绝缘电极定位系统采用适形模态计划系统；适形模态计划系统根据患者影像信息提供的病灶体积、位置、深度，结合病灶区机体外形特征，由电脑合成模态图；通过电脑模态图优选出一对或多对绝缘电极在病灶部位的最佳绝缘电极分布图，以实现绝缘电极位置相对精准的分布。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，其绝缘电极固定支架为由多节单元结构组成的链条式支架，用于抵靠固定在人体上，绝缘电极固定支架采用不导电材料，绝缘电极固定支架的每一节单元结构有一个绝缘电极底座；绝缘电极固定支架裸用，或者绝缘电极固定支架置于头盔或衣服内使用。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，中央控制单元采用微型触屏工业平板电脑、或单片机、或PC电脑或者手机终端；中央控制单元还包括人机交互单元；装置还包括电源。

本发明的采用调幅电场增强药物疗效的装置，在中央控制单元控制下，调频信号发生单元产生的频率信号，直接传导到功率放大单元，通过控制功率放大单元的放大倍数连续交替变化使频率信号产生所需要的幅度变化。

本发明的一种采用调幅电场增强药物疗效的装置，其作用机制是在不同方向分布的多对绝缘电极间产生电场强度连续强弱剧烈突变的调幅电场，多个调幅电场交叉重叠在病灶区，使重叠区域的合成矢量电场强度在多个调幅电场的强度同时变化到强时则成倍增强，并电场强度强与弱的差距大，强与弱之间的变化为剧烈陡变。当合成矢量电场 强度强到一定程度时，使细胞膜除极化后出现通透性显著增加；当合成矢量电场强度减弱到一定程度时，细胞膜产生复极，细胞膜通透性恢复到正常状态。这种可逆性改变细胞膜通透性的方法，一方面可显著增加细胞膜的通透性，使药物透过细胞膜的量显著增加，同时不会对病灶邻近区域细胞造成损害。

本发明的技术效果：

本发明的一种采用调幅电场增强药物疗效的装置，其在不同方向分布的两对以上绝缘电极间产生强度连续强弱剧烈突变的调幅电场作为外电场同时施加到细胞上，重叠区的合成矢量电场强度强与弱的差距加大、强与弱之间产生剧烈的陡变，对细胞膜产生除极与复极作用，使细胞膜的通透性出现可逆性增加，使膜外的药物能大量进入细胞内(包括细菌细胞内)，具有对化疗药物及抗菌等药物治疗的增强作用。与现有的EPCT相比，不需上百伏的高压，不需要微创将绝缘电极插入体内，不改变组织的pH值，对正常组织细胞的损害小。

本发明的一种采用调幅电场增强药物疗效的装置，其绝缘电极定位系统采用适形模态计划系统；适形模态计划系统根据患者影像信息提供的病灶体积、位置、深度，结合病灶区机体外形特征，由电脑合成模态图；通过电脑模态图优选出一对或多对绝缘电极在病灶部位的最佳绝缘电极分布图，以实现绝缘电极位置相对精准的调幅电场增强药物疗效的作用。

本发明的一种采用调幅增强药物疗效的装置，在调幅单元将中频载波采用低频(或超低频)调制波调制时，调制的中频电流克服了中频电流的幅度无变化不易为人体感知的缺点，同时，当绝缘电极绝缘层失效或绝缘电极被击穿时，防止低频电流施加到人体导致潜在危害发生(例如细胞内离子浓度变化和在组织的介质中发生电解形成有害物质)，提高临床使用的安全性。

本发明的一种采用调幅增强药物疗效的装置，主要采用交流电源，同时又使用电池作电源，在没有交流电源的环境下采用锂电池作电源使用2～4小时，在电池备份的情况下连续使用4～8小时，方便携带式使用。

附图说明

图1A人细胞膜分子结构模式图；

图1B细菌细胞膜分子结构模式图；

图2A在均匀的外电场下偶极子所受的力矩示意图；

图2B在均匀的外电场下偶极子转向示意图；

图3A在非均匀的外电场下偶极子所受的力矩示意图；

图3B在非均匀的外电场下偶极子所受的转向示意图；

图4本发明装置的架构示意图；

图5幅度调制单元的电路工作示意图；

图6方波形调制波示意图

图7正弦波波形的载波示意图

图8方波调制的调幅波形态示意图

图9功率放大单元示意图；

图10输出分配单元示意图；

图11链条式绝缘电极固定支架未安装绝缘电极的整体示意图；

图12链条式绝缘电极固定支架安装不同形状与大小的绝缘电极的整体示意图；

图13绝缘电极底座结构示意图；

图14绝缘电极结构示意图；

图15绝缘电极安装于绝缘电极底座的示意图；

图16多对绝缘电极交叉重叠病灶时绝缘电极对应位置示意图。

具体实施方式

图1A人细胞膜分子结构模式图；图1B细菌细胞膜分子结构模式图；图2A在均匀的外电场下偶极子所受的力矩示意图；图2B在均匀的外电场下偶极子转向示意图；图3A在非均匀的外电场下偶极子所受的力矩示意图；图3B在非均匀的外电场下偶极子所受的转向示意图；图4装置的架构示意图；图5幅度调制单元的电路工作示意图；图6方波形调制波示意图；图7正弦波波形的载波示意图；图8方波调制的调幅波形态示意图；图9功率放大单元示意图；图10输出分配单元示意图；图11链条式绝缘电极固定支架未安装绝缘电极的整体示意图；图12链条式绝缘电极固定支架安装不同形状与大小的绝缘电极的整体示意图；图13绝缘电极底座结构示意图；图14绝缘电极结构示意图；图15绝缘电极安装于绝缘电极底座的示意图；图16多对绝缘电极交叉重叠病灶时绝缘电极对应位置示意图。

采用电场增强药物疗效的方法主要基于细胞的生物电现象。生物电的产生一方面与细胞内外离子的不同分布有关，另一方面亦与细胞膜在不同状态下对离子选择性通透有关。细胞外液的正离子主要是Na⁺，负离子主要是Cl^-，细胞内液的正离子主要是K⁺，膜对K⁺有较大的通透性，对Na⁺的通透性很差，对大分子有机物则不能透过，膜内的K⁺浓度比膜外高，故倾向于向膜外流出，但带负电荷的大分子有机物却不能随之向膜外流出，膜外高浓度的Na⁺也不能向膜内流入以与K⁺交换，因此，造成了膜内外电位差，膜外为正，膜内为负；由于离子浓度差膜内K⁺向膜外透出，由于电位差膜外K⁺倾向于向膜内透入，两者形成电-化学平衡时，K⁺向膜外透出与向膜内透入的速度相等，不再变化，此时的电位差即静息电位，膜的内外两侧分为两极的这种状态，称为极化状态，故活细胞膜是极化膜，由于膜的阻抗大膜内外一般没有电流通过。此时细胞内电场均一，就整个细胞而言，对外不显电性。当施加外部电场时，若细胞受到足够强度的刺激后(如电场或电流刺激)，膜的通透性可立即发生改变，对Na⁺的通透性突然增加，膜外高浓度的Na⁺快速内流，导致暂时性的膜内电位等于或高于膜外电位，引起细胞膜的极化状态消失或逆转，细胞膜表面由原来的带正电荷的状态转为带负电，膜内侧由负电位转为正电位，这种膜内外电位差消失或反转的现象称为除极化，引起除极化的最小电场或电流强度称为阈强度值。但在单次刺激后的除极是一瞬间的过程，除极后立即恢复原来的极化状态，称为复极。除极现象可以通过电介质的极化理论来阐述。电介质可分为两类，一类是由无极分子组成(如细胞膜内的胆固醇)，在没有外电场作用时，由于每个分子的正、负电荷“重心”重合，偶极矩为零，此类介质的整体或任何一个局部都不显电性；但在外电场的作用时，每个分子的正、负电荷“重心”要向相反方向发生微小位移而不再重合，且偶极矩方向与电场方向一致，这种变化为位移极化，外电场愈强，分子正负电荷“重心”的相对位移愈大，介质被极化的程度就愈高，若撤去外电场，分子正负电荷“重心”又重合在一起，极化消失。另一类是由有极分子组成(如细胞膜内的不饱和脂肪酸)，在无外电场作用时，虽然每个分子的正负电荷“重心”不重合，偶极矩不为零，但由于介质中大量分子的无规则热运动，使分子偶极矩的方向杂乱无章，故介质的整体或任何一个局部也不显电性；但在外电场作用时，分子间电偶极矩要转向外电场方向；不过，由分子热运动的干扰，分子偶极矩又可能与外电场方向不完全一致，外电场愈强，分子偶极矩转向电场方向的程度就愈高，这种变化称为转向极化。

外电场对细胞膜中不饱和脂肪酸的影响，可以通过电偶极分子在外电场中所受的力矩理论来阐述。细胞膜的不饱和脂肪酸可视为偶极子。当外电场均匀时，如附图2A所 示，偶极子轴线L与外电场E方向之间的夹角为Q，偶极子电荷+q、-q所受的力F+、F-大小相等，方向相反，整个偶极子所受合外力为零，但F+、F-的作用线不在一条直线上，它们组成一力偶，偶极子所受力偶矩(T)的大小为T＝FLsinQ＝qELsinQ，力偶矩的方向垂直纸面指向读者，可将P、E、T三者的大小与关系一起表示出来，即T＝qL E＝PE(E为电场、P为极化强度矢量)，这个力偶矩将使偶极子转至与外电场相一致的方向，如图2B所示，当Q＝0，即P与E平行时，T＝0，偶极子达稳定平衡。当外电场不均匀时，偶极子正、负是荷所受电场力的大小和方向都不相同，因此偶极子除受力矩的作用外，还需受到一个不为零的合外力的作用，力矩使偶极子的偶极矩转至与外电场一致的方向，而合外力则使偶极子在外电场中沿场强较强的方向移动，如附图3A、图3B所示。

细胞膜主要由类脂和蛋白质组成，细胞膜的外表还有一层大包膜，由糖脂类和蛋白质所组成，形成了亲水的部位，可与细胞外液相接，这个膜与细胞膜的电荷有关。如附图1A所示，细胞膜本身由三层结构所组成，内外两层系由类脂分子的亲水极所组成，中间层是类脂分子的疏水极组成。人与动物的细胞膜的总模式是极其相似的，不同之处是组成的蛋白质种类等有差别。双层类脂质分子由高极性的磷脂(磷酸甘油)与无极性的胆固醇组成，胆固醇的含量较低而磷酯的含量较高。磷脂含有饱和的和不饱和的脂肪酸，不饱和脂肪酸赋予膜具有类似液体性质的流动性，这种液体流动性决定膜的通透性。如果膜的不饱和脂肪酸的含量愈高，其通透性愈高，而胆固醇的作用则与不饱和脂肪酸相反。当向细胞膜施加不均匀的外电场时，与前所述可引起有极分子的不饱和脂肪酸发生转向极化向强度较强的电场方向移动，而无极分子的胆固醇发生位移极化，极化程度低，基本维持原位振动，结果使细胞膜双类脂层处于电场强度大的部位，其不饱和脂肪酸的含量显著升高，其通透性相应显著增加。当施加的电场刺激达到一定强度，造成胆固醇与不饱和脂肪酸完全分离，使细胞膜出现空隙即穿孔，这种空隙当电场强度减弱或消失后，不饱和脂肪酸在浓度差的作用下由高浓度向低浓度部位扩散，膜空隙消失，这一现象即为细胞膜可逆性穿孔。当施加的电场强度足够强(大于0.1KV/cm)，使不饱和脂肪酸分子移动扩散到细胞外液则可造成细胞膜不可逆性穿孔。

这种造成细胞膜通透性增加或穿孔的作用原理，同样适用于细菌的细胞膜。如附图1B所示，细菌细胞膜具有类似的人细胞膜的结构，与人细胞膜的最大差别是细菌细胞膜外有一层细胞壁。革兰氏阳性菌的细胞壁仅为一层粘肽，革兰氏阴性菌的细胞壁由两层组成，外层为近似人体细胞膜外的大包膜，内层为粘肽。粘肽构成细胞器的网格结构，使细胞器布满微细的小孔，主要起承受菌体内的巨大渗透压而维持细菌形状的作用。因此细菌的细胞壁不影响外部电场的作用。

附图7是本发明的一种采用调幅电场增强药物疗效的装置的架构示意图，包括以下功能单元：中央控制单元1、调频信号发生单元2、电源单元3、幅度调制单元4、功率放大单元5、输出分配单元6、以及绝缘电极7组成。调频信号发生单元2采用直接数字频率合成器或由变容二极管组成的调频电路、幅度调制单元4采用晶体管调幅电路或集成电路调幅电路、功率放大单元5采用中频功率放大电路、输出分配单元6采用分配控制电路和电子开关来实施。中央控制单元1采用微型触屏工业平板电脑、或单片机、或PC电脑或者手机终端措施；中央控制单元还包括人机交互单元。

中央控制单元1按设定参数控制调频信号发生单元2产生某一频率固定，或频率在一定范围内变化的波形信号，该频率方波形信号作为载波输入幅度调制单元4。

如附图5所示，中央控制单元1按设定参数控制幅度调制单元4，以方波形的低频信号作为调制波如附图6，将附图7的载波调制成调幅波如附图8，调幅波的包络线波形与调制波的波形相同，其频率与载波频率相同，其幅度随载波与调制波的幅度矢量加减而变化，最终在每对绝缘电极间产生电场强度随调幅波发生相应变化的调幅电场。

如附图9所示，上述调幅波从功率放大单元5的导线11输入，放大倍数由中央控制单元1控制，放大后由导线12输出到输出分配单元6的导线16。如图10所示，中央控制单元1根据需要通过控制输出分配单元6的17控制内部的电子开关，将调幅波分配给一对绝缘电极18、19或多对绝缘电极。

链条式绝缘电极固定支架如图11、图12所示，绝缘电极的固定支架20为柔性绝缘材料制造，长度可以根据需要增加或减少链条节数任意改变，两端由弹性材料制造，围绕在人体的任何部位都可紧贴人体；链条式绝缘电极固定支架固定绝缘电极的底座21，安装绝缘电极后的绝缘电极底座22。图13为绝缘电极底座结构示意图，底座壳体28，绝缘材料制作，上安装槽29，下安装槽30。

图14为绝缘电极结构示意图，绝缘电极本体23，其结构是在导电材料表面涂敷高强度绝缘层，可根据需要做成不同形状和大小；扣式导线连接点24，通过导线与输出分配单元6的对应输出接口相连，绝缘电极连接导线的这一面朝外不与人体接触；下固定桩25、上固定桩26，均为绝缘材料制作，安置到绝缘电极底座上时卡入图11的下安装槽30；上固定桩26安置到绝缘电极底座上时卡入图11的上安装槽29，弹簧27使上固定桩26和下固定桩25紧紧顶住绝缘电极底座内的上安装槽29和下安装槽30，但可以绕上固定桩26和下固定桩25形成的轴转动，如图15，使用时，安装槽开口一侧朝向人体。

图12为链条式绝缘电极固定支架整体示意图，绝缘电极安装位置由适形模态计划系统根据影像信息确定，可精确定位每对绝缘电极的电场，使其交叉重叠覆盖病灶区。

图16为多电场交叉覆盖病灶时绝缘电极对应位置示意图，每对绝缘电极呈不同的方向分布，高电位绝缘电极，例如绝缘电极A1、B1、C1、D1固定在人体的一侧，低电位绝缘电极，例如绝缘电极A0、B0、C0、D0固定在人体的另一侧，可防止多对绝缘电极同时工作的模式下绝缘电极之间的相互影响。如果有n对绝缘电极轮流工作一次，每对绝缘电极产生的外电场都覆盖了病灶区，病灶区承受了n次外电场作用，增加了对病灶区的作用强度，而病灶临近区的正常细胞只承受了一次外电场作用，减少了对病灶邻近区细胞的损伤。

实验一：验证调幅电场是否具有对药物疗效的增强作用。选择抗癌药物丝裂霉素，因为丝裂霉素的作用机制是在癌细胞内使DNA解聚，同时阻止DNA的复制，并容易产生耐药现象；癌细胞对丝裂毒素产生耐药是由于癌细胞膜通透性下降，进入细胞内药物浓度下降所致；丝裂毒素在临床上的用法与用量是每次20mg静脉注入，血中药物浓度最高为1.5μg/ml。癌细胞选择葡萄膜黑色素瘤，是因为葡萄膜黑色素瘤具有较高的增殖性，显著的耐药性，文献报导恶性黑色素瘤敏感电场强度为1.4V/cm，适用于破坏黑色素瘤细胞的电场频率为120KHZ。

接上所述，癌细胞混悬液的制备方法：取刚摘除的葡萄膜黑色素患者眼球，从瘤体表面及基底部取出新鲜的肿瘤组织，剪成细块在200目的不锈钢筛网上研磨到培养液中，每分钟1000转离心10分钟，弃去上清液，培养基吹匀，取5毫升接种于50毫升培养瓶中，5％二氧化碳培养箱中37℃孵育24小时，去除团块状的半量换液后，继续培养24小时，再同法半量换液后的培养物即为所需的癌细胞混悬液。

接上所述，癌细胞混悬溶液中每1升中含癌细胞个数的计数方法：将癌细胞混悬溶液稀释到不同稀释级数，精密量取不同稀释级数的混悬溶液200微升置盖玻片上(盖玻片的大小与形状相同)，均匀分布后用100微升注射器滴加1滴10％甲醛生理盐水及1滴丙酮，原位固定，采用肿瘤特异性HMB45抗体免疫组织化学染色。在不同位置选取10个视野，计数HMB45阳性细胞。视野中HMB45阳性细胞的特征：癌细胞的细胞质中有均匀分布的红色阳性产物，癌细胞呈梭形或上皮形生长。培养液采用美国GIBCO公 司生产的DMEM/F12(1:1)干粉培养基配制。

接上所述，试验方法：取编号为1号、2号、3号、4号正方形培养瓶，1号培养瓶抵靠瓶的四壁安装两对绝缘电极对A1与绝缘电极对A2，4号培养瓶抵靠瓶的四壁安装两对绝缘电极对B1与绝缘电极对B2，四对绝缘电极频率均为300KHZ，电场强度均为5V/cm～10V/cm之间的连续交替突变，两对绝缘电极同时使用。1号、2号培养瓶各精密加入含药物浓度为1.5μg/ml的培养液45毫升，向3号、4号培养瓶精密加入不含药物的培养液45ml，再分别精密加入每1升含1～9×10⁶个癌细胞混悬液5毫升，1号、2号3号、4号培养瓶同时置5％二氧化碳培养箱37℃孵育48小时，然后进行培养物的癌细胞计数。

接上所述，试验结果：向培养瓶中加入的癌细胞混悬液的浓度是每1升含癌细胞个数为9×10⁶个。三个培养瓶中加入5毫升上述癌细胞混悬液后每1升含癌细胞个数为90×10⁴个。培养48小时后，1号瓶培养每1升癌细胞混悬液含癌细胞为7×10⁴个，2号培养瓶每1升含癌细胞个数为每1升68×10⁴个，3号培养瓶每1升含癌细胞个数为341×10⁴个，4号培养瓶每1升含癌细胞数为53×10⁴个，1号培养瓶的葡萄膜黑色素瘤增殖抑制率为92.2％，2号培养瓶的葡萄膜黑色素瘤增殖抑制率为24.4％，4号瓶的葡萄膜黑色素瘤增殖抑制率为41.1％。试验结果表明，调幅电场可使丝裂霉素在人用剂量下对葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖抑制率提高二倍以上。

实验二：验证绝缘电极间连续强弱剧烈突变的外电场对增加细胞膜通透性的作用效果。试验原理：采用体外抗菌试验的最小抑菌浓度(MIC)的试验方法，因为细菌的细胞分裂方式为无丝分裂，而外部电场仅对细胞有丝分裂具有抑制作用。选择试验菌为革兰氏阴性菌——铜绿假单孢杆菌，如前所述革兰氏阴性菌的细胞膜与人细胞膜相似度高。试验药选择抗菌谱以革兰氏阴性菌为主并作用靶点在细菌细胞内的喹诺酮类抗菌药物——环丙沙星，因为其抗菌作用点以细菌细胞内的脱氧核糖核(DNA)为靶，通过妨碍DNA回旋酶而使细菌细胞不再分裂，其抗菌作用强度与进入细菌细胞内的量呈正相关，并对铜绿假单胞杆菌敏感。如果绝缘电极的强度连续突变的电场能增加细菌细胞膜的通透性，则环丙沙星进入细菌细胞内的量就越多，其最小抑菌的药物浓度随之下降。

接上所述，试验方法：采用二倍稀释法测定，无细菌生长的培养瓶中所含抗菌药物最小浓度即为最小抑菌浓度。首先测定环丙沙星的最小抑菌浓度a，然后以a的浓度为基础，将药物采用胰酪大豆胨液体培养基配制，并通过二倍稀释法再稀释四级，依次以b、c、d、e表示，每一稀释级浓度以及a浓度的培养物总量均为50ml，连同不加药物的培养基50ml阳性对照f，灌装于无菌的100ml的玻璃输液瓶中，在b、c、d、e、f输液瓶外壁，均匀分布抵靠安装三对绝缘电极，绝缘电极间的电场强度在3V/cm～6V/cm之间连续突变，频率为300KHZ；每个培养瓶中加入细菌浓度小于100cfu/ml的菌液0.5ml，在30～35℃培养24小时时进行菌落计数。

接上所述，菌落计数方法：精密量取新鲜培养物适量，经无菌的0.9％氯化钠溶液稀释后，再精密量取0.2ml加到不超过45℃的熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，在30～35℃培养24小时，进行菌落计数。培养基适用性试验即无菌性检查与灵敏度检查，均应符合中国药典的规定要求。

接上所述，试验结果：培养基的适用性试验结果符合中国药典之规定；a浓度为每1毫升4微克，b浓度为每1毫升2微克，c浓度为每1毫升1微克，d浓度为每1毫升0.5微克，e浓度为每1毫升0.25微克；a瓶、b瓶、c瓶各稀释级均未检出菌落数，为无菌状态；阳性对照f培养物在(1:1000)稀释级的菌液浓度为398cfu/ml。试验结果表明：在三对绝缘电极间强度连续突变的外电场共同作用下，环丙沙星对铜绿假单孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)降低了四倍，表明进入铜绿假单孢杆菌细胞内的药物量增加了四倍，提 示调幅电场使铜绿假单孢杆菌的细胞膜的通透性提高了四倍；而单独使用外电场抑制细菌增殖的作用不明显，提示三对绝缘电极间强度连续突变的外电场的共同作用下不能造成细胞膜出现穿孔，因为细菌细胞膜出现穿孔时，细胞内高渗性细胞质易外流而造成细菌死亡。