一种用于石斑鱼的当归多糖免疫增强剂及其应用的制作方法

本发明涉及水产养殖
技术领域：
，进一步涉及针对鱼类的免疫调节技术，具体涉及一种用于石斑鱼的当归多糖免疫增强剂及其应用。
背景技术：
：石斑鱼(epinephelussp.)肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，为名贵的海水鱼。随着养殖密度的不断扩大，石斑鱼健康水平和抗病能力显著下降，病害频发。而抗生素和化学消毒剂不仅增加致病病原菌的耐药性，而且造成药物污染水体，破坏生态环境。更严重的是，抗生素和化学消毒剂在鱼体内富集，危害人类健康。当归作为中国传统中草药，入药首载于《神农本草经》，治疗疾病已有2000年历史，其药用部位主要是当归的根。当归具有活血、补血、调经止痛等作用。随着现代分离技术和仪器的进步，当归的多种成分被分离出来，其中当归多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)是当归的主要有效成分之一。近年国内外学者对当归多糖进行的大量研究表明：当归多糖是一种大分子物质，可作为一种免疫增强剂，可以调节陆生高等动物的免疫系统和造血系统，具有抗肿瘤、抗辐射、抗氧化和镇痛等药理学作用。然而当归多糖对水产动物免疫力的影响研究很少，如何利用当归多糖调节水产动物免疫力，还缺乏技术支持。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于石斑鱼的当归多糖免疫增强剂，以解决现有技术的石斑鱼养殖过程中，缺乏一种针对石斑鱼的免疫促进手段的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是常规的石斑鱼抗病治疗药物若长期使用可能产生耐药性。本发明要解决的再一技术问题是常规的石斑鱼抗病治疗药物可能在石斑鱼体内富集，进而影响人类的食用健康。本发明要解决的又一技术问题是当采用当归多糖对石斑鱼进行免疫干预时，缺乏一种有效的使用手段。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种用于石斑鱼的当归多糖免疫增强剂，包括当归粗多糖和脱蛋白当归多糖。作为优选，所述当归粗多糖的注射剂量为37.5～300mg/kg鱼体重。作为优选，所述脱蛋白当归多糖的注射剂量为120～180mg/kg鱼体重。同时，本发明提供了上述当归多糖免疫增强剂用于制备石斑鱼免疫促进药物的应用。作为优选，所述药物是注射剂。作为优选，所述注射剂中当归粗多糖的用量为37.5～300mg/kg鱼体重，所述注射剂中脱蛋白当归多糖的用量为120～180mg/kg鱼体重。作为优选，所述药物是提高石斑鱼白细胞吞噬活力的药物。作为优选，所述药物是提高石斑鱼血浆溶菌酶活力的药物。作为优选，所述药物是提高石斑鱼血浆中白蛋白/球蛋白比值的药物。同时，本发明提供了上述当归多糖免疫增强剂用于预防石斑鱼感染迟缓爱德华氏菌的应用。本发明提供了一种用于石斑鱼的当归多糖免疫增强剂及其应用，该技术方案以动物实验为基础研究了当归多糖对石斑鱼的免疫干预作用，在此基础上明确了以当归粗多糖和脱蛋白当归多糖为核心成分的免疫增强剂配方，并进一步研究了二者的有效剂量及其药理作用。实验发现，以casp(当归粗多糖)剂量为37.5～300mg/kg鱼体重、asp(脱蛋白当归多糖)剂量为120～180mg/kg鱼体重对石斑鱼执行腹腔注射后，在3～14d内其血红蛋白含量，nbt阳性细胞数，血浆溶菌酶活力、白蛋白/球蛋白(a/g)、血浆sod超氧化物歧化酶(sod)活力和过氧化氢酶(cat)活力显著升高；血浆丙二醛(mda)含量显著降低；白细胞增殖、吞噬和呼吸爆发活力显著提高，并显著降低感染迟缓爱德华氏菌石斑鱼的累积死亡率。基于以上有益的发现，本发明确定了以当归粗多糖、脱蛋白当归多糖复合物作为石斑鱼免疫促进药物的应用，可在调节石斑鱼的非特异性免疫力的基础上有效提升其抗病性能。本发明基于严谨的实验手段获得了有益的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的推广前景。附图说明图1是casp对点带石斑鱼血液nbt阳性细胞的影响图。图2是asp对点带石斑鱼血液nbt阳性细胞数的影响图。图3是casp对点带石斑鱼血液血红蛋白含量的影响图。图4是asp对点带石斑鱼血液血红蛋白含量的影响图。图5是casp对点带石斑鱼血浆lzm活力的影响图。图6是asp对点带石斑鱼血浆lzm活力的影响图。图7是casp对点带石斑鱼血浆a/g的影响图。图8是asp对点带石斑鱼血浆a/g的影响图。图9是casp对点带石斑鱼血浆t-sod活力的影响图。图10是asp对点带石斑鱼血浆t-sod活力的影响图。图11是casp对点带石斑鱼血浆cat活力的影响图。图12是asp对点带石斑鱼血浆cat活力的影响图。图13是casp对点带石斑鱼血浆mda含量的影响图。图14是asp对点带石斑鱼血浆mda含量的影响图。图15是casp对头肾白细胞增殖的影响图。图16是csap对头肾白细胞的吞噬活力的影响图。图17是casp对头肾白细胞的呼吸爆发活力的影响图。图18是注射casp14天后，每尾注射100μl迟钝爱德华菌(1.4×108cfu/ml)，点带石斑鱼的累积死亡率比较图。图19是注射asp14天后，每尾注射100μl迟钝爱德华菌(1.4×108cfu/ml)，点带石斑鱼的累积死亡率比较图。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。在以下实施例中，所用到的当归粗多糖(crudeangelicasinensispolysaccharide,casp)，可以是利用乙醇沉淀法提取得到的；所用到的去蛋白当归多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)，可以是利用seveg法去除当归多糖中的蛋白质而得到的。1、当归粗多糖(casp)的制备提取方法i：将风干后的当归加蒸馏水，料液比为1:30，煮沸30min，过滤，向水煮液中加无水乙醇，使乙醇在混合液中的浓度为80％，搅拌均匀，4℃静置6h，4000r/min离心10min。提取方法ii：将新鲜当归自然风干并处理成小片，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡一周，料液比为1：10，浸泡并不时搅动。醇提后残渣先用水煮沸30min，料液比为1:30，上清液中加入无水乙醇使乙醇终浓度至80％，搅拌均匀后4℃冷藏静置6h后离心(4000r/min，10min)。提取方法iii：将自然风干后的新鲜当归处理成小块状，用78％的乙醇浸泡一周，料液比为1：10，要经常搅拌，浸泡好后用76％的乙醇进行渗漉，直到渗出液无色为止，将渗漉后的当归用蒸馏水煮沸30min，料液比为1:30，水煮后得到的提取液加入无水乙醇使乙醇终浓度至80％，搅拌，4℃冷藏静置后离心(4000r/min，10min)。以上三种提取方法制备的沉淀，均反复用95％的乙醇脱色，直到上清液无色，沉淀冷冻干燥后均为casp。2.脱蛋白当归多糖(asp)的制备以上方法制备的当归粗多糖(casp)加三蒸水溶解(浓度为2mg/ml)，采用sevag法脱蛋白：当归多糖粗提物溶液中按体积比为3:1加入sevag试剂，放在磁力搅拌器上搅拌45min后离心(4000r/min，10min)。离心后溶液分为三层，上层为多糖溶液，中层为蛋白质凝胶层，底层为有机溶剂。取上层多糖溶液重复上述步骤，直到蛋白质凝胶层消失。多糖溶液在280nm波长附近无特征吸收峰，说明多糖中的蛋白质已经去除。将脱蛋白后的多糖溶液移到处理好的透析袋中，放入三蒸水中透析3-4d。透析过程中，要注意勤换水。透析好的多糖溶液经旋转蒸发仪浓缩后冷冻干燥得到当归多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)。3、腹腔注射当归多糖对石斑鱼体液非特异性免疫指标的影响选取选取规格一致、活泼健康的石斑鱼，体质量50～80g。分组(每组4个箱子，每个箱子45尾鱼)，分别注射casp或asp，注射剂量分别为37.5mg/kg、75mg/kg、150mg/kg和300mg/kg鱼体重，对照组注射无菌生理盐水。注射前以及注射后第3、7、14、21、28d取样(取样前停食1d)，可以检测到注射casp或asp显著增加石斑鱼血液血红蛋白含量，nbt阳性细胞数量，血浆溶菌酶活力、a/g、sod活力和cat活力、mda含量，结果如说明书附图1-14所示。注射casp还可以增强石斑鱼白细胞的增殖、吞噬和呼吸爆发活力，结果如说明书附图15-17所示。4、腹腔注射当归多糖对石斑鱼体抗爱德华氏菌能力的影响石斑鱼注射casp或asp14d后，用迟缓爱德华氏菌(edwardsiellatarda)进行攻毒，菌体浓度度1.4×108cfu/ml，每尾鱼注射100μl迟缓爱德华氏菌液。每天喂食2次，每天观察鱼的死亡情况并记录死亡数，连续观察7d，以计算累积死亡率，计算公式为：第n天的累积死亡率(％)＝n天总共死亡的鱼数目÷攻毒鱼总数目×100。未注射多糖的石斑鱼，累计死亡率在攻毒第2天即达到80％，第4天接近100％，而注射casp的石斑鱼，攻毒4d内累计死亡率低于20％，5天内低于40％。注射asp的石斑鱼，攻毒后2d内死亡率低于60％，3d低于80％。具体结果如说明书附图18、19所示。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。应用实例1：在石斑鱼疾病易发季节，选2池体重为20-30g/尾的石斑鱼幼鱼。用无菌生理盐水将当归粗多糖配成26mg/ml。1号池每尾鱼腹腔注射当归粗多糖0.2ml，2号池每尾鱼腹腔注射无菌生理盐水0.2ml。每天记录每池石斑鱼发病和死亡情况，连续饲养30天。结果表明，腹腔注射当归粗多糖能显著降低石斑鱼的发病率和死亡率(表1)。表1当归粗多糖腹腔注射试验结果池号注射药物开始鱼数发病鱼数死亡鱼数发病率％死亡率％1#当归粗多糖247684733834.213.72#生理盐水24821433108357.743.6应用实例2：在石斑鱼疾病易发季节，选2池体重为45-65g/尾的石斑鱼幼鱼。用无菌生理盐水将脱蛋白当归多糖配成45mg/ml。1号池每尾鱼腹腔注射当归粗多糖0.2ml，2号池每尾鱼腹腔注射无菌生理盐水0.2ml。每天记录每池石斑鱼发病和死亡情况，连续饲养30天。结果表明，腹腔注射脱蛋白当归多糖能显著降低石斑鱼的发病率和死亡率(表2)。表2脱蛋白当归多糖腹腔注射试验结果当前第1页12