本发明涉及含有具有水生菌感染抑制效果的天然硫磺水作为有效成分的环保鱼卵消毒剂及利用上述环保鱼卵消毒剂的水生菌感染抑制方法。
【背景技术】
虹鳟鱼(以下简称鳟鱼)性成熟个体身上有一条红色带，似彩虹，故名虹鳟鱼。稚鱼身体表面约有812条和三文鱼相同的淡红色宽横纹，但随着生长，纹理逐渐变得不透明，一年多以后消失。虹鳟鱼是冷水性鱼，韩国引进的品种终生在淡水中生活，主要栖息于江河上游或山内湖泊中。虹鳟鱼主要以水生昆虫、浮游动物、小软体动物、小甲壳类和小鱼等为食。韩国引进的养殖种虹鳟鱼每年10月～3月产卵，北美野生鳟鱼则于每年春天(4～6月)产卵。与其他鱼种相比，虹鳟生长速度快，繁殖能力强，味美，是十分受欢迎的养殖鱼种。虹鳟鱼寿命为7～8年左右，目前分布在韩国的虹鳟鱼品种终生在淡水中生活，寿命为3～4年。
虹鳟鱼卵若感染寄生水霉(saprolegniaparasitica)，则无法孵化而死亡。为了抑制寄生水霉感染，养殖场主要使用福尔马林进行鳟鱼鱼卵消毒。福尔马林去除及抑制鳟鱼鱼卵的寄生水霉感染效果十分优秀。福尔马林虽然有优秀的消毒效果，但被分类为强致癌物质，使用受到很多限制。
对此，本发明使用能代替福尔马林的通过寄生水霉感染抑制效果优秀的环保消毒剂去除毒性的天然硫磺水证实了其效果。
韩国注册专利第0782500号揭示了“利用天然植物提取物的寄生水霉抑制剂”，韩国公开专利第2013-0013965号揭示了含有从苦参、大黄、覆盆子组成的群中选择的一种以上的提取物作为有效成分的“鱼类细菌性病原菌的抗真菌及抗菌兼用组合物”，但对本发明的含有具有水生菌感染抑制效果的天然硫磺水作为有效成分的环保鱼卵消毒剂及其用途没有记载。
技术实现要素：
【要解决的技术问题】
本发明针对上述要求，发明者们为了开发能代替福尔马林的环保鱼卵消毒剂，制备了天然硫磺水，并使用不同浓度的上述天然硫磺水对感染寄生水霉的鳟鱼鱼卵进行处理和消毒，结果证实随着天然硫磺水处理浓度的增加，寄生水霉感染率显著降低，完成了本发明。
【技术方案】
为解决上述技术问题，本发明提供含有具有水生菌感染抑制效果的天然硫磺水作为有效成分的环保鱼卵消毒剂。
另外，本发明提供用上述环保鱼卵消毒剂处理鱼卵，抑制水生菌感染的方法。
【有益效果】
本发明的环保鱼卵消毒剂能有效降低鱼卵的寄生水霉感染率，提高稚鱼孵化率，作为能代替致癌物质福尔马林的环保消毒剂，未来将能有效应用于整个养殖产业。
【附图说明】
图1是本发明中使用的鳟鱼发眼卵。
图2是使鳟鱼鱼卵感染寄生水霉后6天拍摄的照片。
【具体实施方式】
为了达成本发明的目的，本发明提供含有具有水生菌感染抑制效果的天然硫磺水作为有效成分的环保鱼卵消毒剂。
对于本发明的一个实施例中的环保鱼卵消毒剂，上述水生菌可以是水霉目(saprolegn-iales)菌，或更理想的是寄生水霉(saprolegniaparasitica)，但并不仅限于此。
另外，对于本发明的鱼卵消毒剂，上述天然硫磺水是指含有被去除毒性的硫磺的硫磺水，其具体制备方法如下。
(a)用碳源发酵含有绿茶叶和女贞叶的混合培养基；
(b)在上述(a)步骤的发酵混合培养基中添加经高温灭菌的糖蜜稀释液后，将有效微生物接种到培养基中进行培养；
(c)在上述(b)步骤的有效微生物培养液中添加有毒硫磺粉，进行第一次发酵分解；
(d)用湿式胶磨机粉碎上述(c)步骤的第一次发酵分解物；
(e)对上述(d)步骤粉碎的第一次发酵分解物进行固液分离(solid-liquidseparation)，在分离得到的沉淀物中添加有效微生物培养液后，进行第二次发酵分解；
(f)对上述(e)步骤得到的第二次发酵分解物进行固液分离，将分离得到的固体干燥后制得去除毒性的硫磺粉，将去除毒性的硫磺粉与氢氧化钠、亚磷酸(h3po3)、岩盐混合制得第一混合物，然后将该混合物与硅酸钠溶液、帕氏乳酸杆菌(lactobacillusparafarra-ginis)培养液的混合溶液进行混合，使其液化。
更具体的制备方法可以包括以下步骤，但不仅限于此。
(a)用碳源在23～35℃温度下发酵绿茶叶和女贞叶的重量比为6.5～7.5:2.5～3.5的混合培养基43～48天；
(b)在上述(a)步骤的发酵混合培养基中添加经高温灭菌的糖蜜稀释液后，将有效微生物接种到培养基中，在23～35℃温度下培养92～140小时；
(c)在上述(b)步骤的有效微生物培养液中添加有毒硫磺粉，在25～35℃温度下进行22～26小时的第一次发酵分解；
(d)用湿式胶磨机粉碎上述(c)步骤的第一次发酵分解物；
(e)对上述(d)步骤粉碎的第一次发酵分解物进行固液分离，在分离得到的沉淀物中添加有效微生物培养液后，进行第二次发酵分解；
(f)对在上述(e)步骤得到的第二次发酵分解物进行固液分离，将分离得到的固体干燥后制得去除毒性的硫磺粉，将去除毒性的硫磺粉220～270kg与氢氧化钠230～260kg、亚磷酸(h3po3)9～11kg、岩盐12～17kg混合制得第一混合物，然后将该混合物与硅酸钠溶液18～21l、帕氏乳酸杆菌(lactobacillusparafarraginis)培养液790～830l的混合溶液进行混合，使其液化。
本发明的(b)步骤的有效微生物可以是由乳酸菌、酵母和细菌组成的混合微生物，或者更理想的是由帕氏乳酸杆菌(lactobacillusparafarraginis)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、tolerans乳杆菌(lactobacillustolerans)、布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)、哈尔滨乳杆菌(lactobacillusharbinensis)、perolens乳杆菌(lactobacillusperolens)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、牛痘乳杆菌(lactobacillusvaccinostercus)、罗旺醋杆菌(acetobacterlovaniensis)、过氧化醋杆菌(acetobacterperoxydans)、发酵毕赤酵母(pichiafermentans)、乙醇假丝酵母(candidaethanolica)、saccharomycopsisschoenii、氧化硫硫杆菌(thiobacillusthiooxidans)和苏云金杆菌(bacillusthuringiensis)组成的15种有效微生物混合物，但不仅限于此。
在本发明的上述(c)步骤(第一次发酵分解步骤)中，添加的硫磺粉被去除毒性。
本发明的(f)步骤的上述第一混合物最理想的制备方法是将从第二次发酵分解物中制得的去除毒性的硫磺粉250kg与氢氧化钠250kg、亚磷酸(h3po3)10kg、岩盐15kg混合，在22～28℃温度下搅拌66～78小时，使其液化。
对于本发明的一个实施例中的环保鱼卵消毒剂，上述天然硫磺水浓度可以为45～55ppm，但不仅限于此。天然硫磺水浓度低于45ppm时，鱼卵的水生菌感染抑制效果不佳；浓度超过55ppm时，天然硫磺水具有毒性，增加鱼卵的死亡率。
对于本发明的环保鱼卵消毒剂，上述鱼卵不仅限于此，但理想的是鳟鱼鱼卵。
本发明提供用上述环保鱼卵消毒剂处理鱼卵，抑制水生菌感染的方法。本发明的环保鱼卵消毒剂含有对鱼类水霉病的早期致病因——水生菌感染具有抑制效果的天然硫磺水作为有效成分，使用环保鱼卵消毒剂处理鱼卵，能有效抑制水生菌感染。
本发明的环保鱼卵消毒剂可以根据处理对象，即鱼卵的种类和(或)养殖方式等条件进行调节。
以下通过实施例对本发明进行详细说明。下述实施例只是对本发明的举例说明，本发明的内容不仅限于以下实施例。
1.天然硫磺水的制备
用上述碳源在23～35℃温度下发酵绿茶叶和女贞叶的重量比为7:3的混合培养基43～48天。然后，在上述发酵混合培养基中添加经高温灭菌的糖蜜稀释液后，将由帕氏乳酸杆菌(lactobacillusparafarraginis)、副干酪乳杆菌(l.paracasei)、tolerans乳杆菌(l.tolerans)、布氏乳杆菌(l.buchneri)、哈尔滨乳杆菌(l.harbinensis)、perolens乳杆菌(l.perolens)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、牛痘乳杆菌(l.vaccinostercus)、罗旺醋杆菌(acetobacterlovaniensis)、过氧化醋杆菌(a.peroxydans)、发酵毕赤酵母(pichiafermentans)、乙醇假丝酵母(candidaethanolica)、saccharomycopsisschoenii、氧化硫硫杆菌(thiobacillusthiooxidans)和苏云金杆菌(bacillusthuringiensis)组成的15种有效微生物混合物接种到培养基中，在23～35℃温度下培养92～140小时。然后，在接种有效微生物培养的上述培养液中添加有毒硫磺粉，在25～35℃温度下进行22～26小时的第一次发酵分解。然后，用湿式胶磨机粉碎上述第一次发酵分解物。对上述粉碎的第一次发酵分解物进行固液分离，在分离得到的沉淀物中再次添加上述有效微生物混合培养液后，进行第二次发酵分解。对第二次发酵分解物进行固液分离，将分离得到的固体干燥后制得去除毒性的硫磺粉，将去除毒性的硫磺粉250kg与氢氧化钠250kg、亚磷酸(h3po3)10kg、岩盐15kg混合制得第一混合物，然后将该混合物与帕氏乳酸杆菌(lactobacillusparafarraginis)菌株培养液790～830l、硅酸钠溶液18～21l的混合溶液进行混合，在22～28℃温度下搅拌66～78小时，使其液化，最终制得含有去除毒性的硫磺的硫磺水。
2.天然硫磺水的鳟鱼鱼卵消毒试验
鳟鱼鱼卵使用了受精后6天形成眼睛的发眼卵(图1)。水槽的水量调节为15l，每个水槽中放入50±10个鳟鱼鱼卵，水槽的溶解氧浓度调节为10～11mg/l，温度调节为18±1℃。
第一天，用寄生水霉(s.parasitica)浸渍感染鳟鱼鱼卵。感染寄生水霉后，从各槽中采集鳟鱼鱼卵，立即(1分钟以内)使用天然硫磺水和福尔马林分别对鳟鱼鱼卵进行处理消毒。鳟鱼鱼卵消毒每2天进行一次，分别在第1天、第3天、第5天进行，共进行3次。消毒时间各20分钟。试验6天后，测量感染寄生水霉的鳟鱼鱼卵，计算感染率。
3.天然硫磺水的毒性试验
每个水槽中放入90±15个鳟鱼鱼卵，试验方法与上述消毒试验相同。试验6天后，测量孵化和死亡个体数，计算孵化率和死亡率。
实施例1.天然硫磺水的寄生水霉感染抑制率分析
使鳟鱼鱼卵感染寄生水霉后，用天然硫磺水消毒鳟鱼鱼卵，结果如下表1所示，随着天然硫磺水浓度的增加，感染寄生水霉的鳟鱼鱼卵个数减少。尤其是从浓度50ppm的天然硫磺水消毒区间起，与不作处理的阴性对照组相比，感染抑制效果达到3倍以上，由此可以确认天然硫磺水能有效防治水霉病。另外还可以知道，随着处理鳟鱼鱼卵的天然硫磺水浓度的增加，确认感染寄生水霉的初始时间推迟。
【表1】
天然硫磺水对感染寄生水霉的鳟鱼鱼卵的消毒试验结果
(寄生水霉感染状态：-，未感染；+，20％以下感染；++，40％以下感染；+++，60％以下感染)
实施例2.天然硫磺水的毒性分析
用寄生霉菌浸渍感染鳟鱼鱼卵后，分别在刚感染后、第3天和第5天用天然硫磺水和福尔马林消毒鳟鱼鱼卵，最终分析了鳟鱼鱼卵的孵化率和死亡率。
结果如表2和表3所示，与无处理组相比，50ppm硫磺水处理组的鳟鱼鱼卵孵化率增加了2倍以上，死亡率减少了约3倍。但是，天然硫磺水的浓度增加到50ppm以上时，与无处理组相比，鳟鱼鱼卵的孵化率呈降低趋势，死亡率也高于无处理组。
【表2】
用天然硫磺水消毒后的鳟鱼鱼卵孵化率
【表3】
用天然硫磺水消毒后的鳟鱼鱼卵死亡率
通过上述结果可知，本发明的天然硫磺水的寄生水霉抑制效果虽然优秀，但使用高浓度反而会对鱼卵的孵化造成不良影响，为了抑制寄生水霉感染，使用没有毒性的50ppm的浓度为最佳。