用于神经逆向示踪的CTB‑AuNDs复合物、制备方法及其应用与流程

本发明属于荧光金纳米材料技术领域，具体涉及一种用于神经逆向示踪的ctb-aunds复合物、制备方法及其在神经逆向示踪方面的应用。

背景技术：

金属纳米点(nds)作为一种尺寸接近于费米波长的粒子而展现出的新颖光学、电学、磁学等性质，成为已报道的众多荧光纳米材料中不可或缺的组成部分(chem.soc.rev.，2012，41，3594-3623)。其中荧光au纳米点可调的荧光、良好的生物相容性，特别是优异的荧光稳定性，使其可以广泛应用于诸如生物传感、癌症治疗、生物体成像等生物医药领域(small.，2013，9，413-420)。

神经系统在人体生命活动中起着主导的调节作用。神经示踪技术是神经解剖学和神经再生研究中最常用的方法之一，与其他已报道的检测手段相比，该方法可更直观地检测出神经损伤部位，准确地反应神经再生水平和神经功能恢复的程度。由于传统神经示踪剂合成过程复杂、检测耗时长、荧光信号弱以及荧光稳定性低等原因，限制了其在临床诊断中的应用(science，1972，176，1416-1417)。所以急需开发一种合成过程简单、检测耗时短、荧光量子效率高且稳定性强的新型神经示踪剂。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于神经逆向示踪的ctb-aunds复合物、制备方法及其在神经逆向示踪方面的应用。本发明首先制备用于神经逆向示踪的红色荧光金纳米点具有高荧光效率，高稳定性和低毒性；进一步将红色荧光au纳米点与无细胞毒性的霍乱毒素b亚基(ctb)相连接，形成ctb-aunds复合物。将这种复合物注射入大鼠的坐骨神经处，其能够靶向性地与神经细胞的细胞膜发生特异性结合，并沿着细胞膜逆向传输，并且金纳米点的荧光性质可在大鼠体内神经部位长时间保持。这种兼具高稳定性、特异性结合细胞膜的ctb-aunds，可以作为一种逆向神经示踪剂，用于示踪神经细胞。

制备的荧光au纳米点粒径均匀且尺寸小于3nm(图1)，具有良好的红色荧光(图2)。将荧光au纳米点与ctb相连，形成ctb-aunds复合物。将其注射入大鼠背根神经节后，该ctb-aunds复合物可以沿着大鼠背根神经节逆向传输，最后到达脊髓部位(图3)。这种兼具有荧光效率高、荧光稳定性好的ctb-aunds可以作为一种逆行传输的荧光神经示踪剂应用于神经示踪领域。

本发明所述的一种用于神经逆向示踪的红色荧光金纳米点的制备方法，其步骤如下所述：

1)在浓度为0.1～500mmol/l(优选为0.1～100mmol/l，进一步优选为10～100mmol/l)的含有巯基的水溶性化合物(可以是谷胱甘肽，含巯基的氨基酸，含巯基的蛋白等)作稳定剂的水溶液中，加入与含有巯基的水溶性化合物等摩尔的ag⁺离子溶液(可以是agno3、ch3cooag、agf、ag2so4、agclo4等的水溶液)，常温搅拌10～30min后，加入1mol/lnaoh溶液，调节ph至5～8(优选为6～7)，至溶液无色透明；再向上述溶液中加入水合肼作为还原剂，水合肼(n2h4·h2o)与ag⁺离子的摩尔比为1～10：1；然后在常温下搅拌12h～48h(优选为24h～48h，进一步优选为36h～48h)，反应结束后，向溶液中加入异丙醇(其体积为溶液体积的2～20倍)作为沉淀剂，沉淀离心后得到的固体产物即为ag纳米点，将ag纳米点分散在水溶液中(总体积为1～50ml)，备用；

2)应用电化学交换反应，以银纳米点为模板，用金离子刻蚀银纳米点，形成金纳米点：在浓度为10～500mmol/l(优选为50～500mmol/l，进一步优选为50～100mol/l)的ag纳米点水溶液中加入浓度为10～500mmol/l(优选为50～500mmol/l，进一步优选为50～100mmol/l)的含有au³⁺的溶液(可以是haucl4，aucl3等的水溶液)，ag⁺与au³⁺的摩尔比为1～2：1，加入1mol/lnaoh溶液，调节ph至5～11(优选为6～10，进一步优选为8～10)，然后在60～100℃下搅拌2～8小时(优选为2～6小时，进一步优选为2～4小时)，反应结束后离心，向清液中加入异丙醇(其体积为溶液体积的2～10倍)作为沉淀剂，沉淀离心后得到的固体产物即为红色荧光au纳米点，将红色荧光au纳米点分散在水溶液中(总体积为1～20ml)，备用；

3)将步骤2)得到的具有高稳定性、高荧光效率的红色荧光au纳米点与能够特异性结合神经细胞的靶向试剂相连接，制备出一种ctb-aunds复合物，即能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂：将神经靶向试剂霍乱毒素b亚基(ctb)粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta(乙二胺四乙酸)的tris缓冲溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其浓度达到0.1～100mg/ml(优选为0.1～10mg/ml，进一步优选为1～10mg/ml)；在4℃环境下，将上述溶液用3500分子量的渗析袋渗析3～5天，以除去溶液中的金属离子；在浓度为0.01～100mg/ml(优选为0.01～10mg/ml，进一步优选为0.1～1mg/ml)的au纳米点的水溶液中加入浓度为0.1～10mg/ml(优选为0.1～5mg/ml，进一步优选为0.1～1mg/ml)edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)的tris溶液，au³⁺与edc的摩尔比为10～100：1，以及浓度为0.1～10mg/ml(优选为0.1～5mg/ml，进一步优选为0.1～1mg/ml)nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)的tris溶液，au³⁺与nhs的摩尔比为10～100：1，搅拌30～50min；最后加入上述含有神经靶向试剂的溶液，神经靶向试剂霍乱毒素b亚基(ctb)与au纳米点的质量比为0.05～50：1(优选为0.5～20：1，进一步优选为1～10：1)，在摇床上室温反应4h～24h(优选为4h～12h，进一步优选为8h～12h)；将所得产物用3500分子量的渗析袋在4℃下渗析5～10天，以除去体系中的小分子；将渗析后的溶液冻干，并分散于tris缓冲液(1～10ml)中，得到ctb-aunds复合物，即能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂。

一种用于神经逆向示踪的ctb-aunds复合物，其是由上述方法制备得到。

本发明所制备的ctb-aunds复合物用于靶向示踪神经细胞功能具有以下优点：ctb-aunds复合物产物荧光效率高，稳定性优良，表现出良好的光学性质和水溶性，特别是具有靶向神经的功能。将之注射入大鼠的背根神经节，可沿着神经逆向传输至脊髓处，其具有红色荧光(发射波长为607nm)，避免了肌体自发荧光的干扰，生物毒性低，生物相容性好。另外这种制备方法易于操作，条件温和，重复性好，适合大量生产。

附图说明

图1：实施例1所制备的荧光au纳米点tem图，其平均粒径尺寸为2.5nm左右，图1中插图为au纳米点的高分辨透射电镜照片，显示au纳米点的晶格间距为

图2：实施例1所制备的荧光au纳米点的荧光光谱图，光谱表明au纳米点的最佳激发波长为415nm，最佳发射波长为604nm，图2中插图为光学照片，显示au纳米点的水溶液为淡黄色，且在水中分散性较好，在紫外灯照射下，显示明亮的红色荧光；

图3：实施例3所得到的ctb-aunds注射前后组织切片照片，图3a是未注射ctb-aunds的背根神经节切片，从图中只能看到肌体的自发蓝色荧光。图3b是在大鼠的背根神经节处注射ctb-aunds的切片，从图中可以看到整个背根神经节各处都显示ctb-aunds的明亮红色荧光。图3c是注射ctb-aunds五天后，大鼠脊髓的组织切片，从图中可以清晰看到脊髓中分散着ctb-aunds的点状红色荧光。说明ctb-aunds可以特异性靶向神经细胞，且可以从注射点即背根神经节，逆向传输至大鼠脊髓处。

具体实施方式

实施例1

荧光au纳米点的制备：在制备红色荧光au纳米点之前，首先制备ag纳米点为模板，具体步骤为：称取0.1535g的谷胱甘肽和0.0845g的agno3溶解于10ml水中，搅拌10min后，向体系中逐滴加入浓度为1m的naoh，调节溶液ph为6.5，此时整个体系为无色溶液。再向溶液中加入1mln2h4·h2o，在室温下避光搅拌48h后，得到橙红色溶液，证明ag纳米点已经产生。向溶液中加入50ml异丙醇作为沉淀剂，离心后得到的固体产物即为ag纳米点，将沉淀分散于10ml水中，得到浓度约为50mm的ag纳米点水溶液。

向装有5ml水的烧瓶中加入500μl上述合成的ag纳米点水溶液(50mm)，再加入250μlhaucl4溶液(50mm)(au与ag的摩尔用量比为1：2)，向烧瓶中逐滴加入1m的naoh溶液，至ph为9，然后在80℃及加热条件下搅拌4h，溶液中出现agcl黑色沉淀。将整个溶液在8000rpm转速下离心15min除去沉淀，然后向清液中加入30ml异丙醇作为沉淀剂，离心后得到的固体产物即为au纳米点，将沉淀分散于5ml水中，即得到浓度约为2mm的红色荧光au纳米点水溶液。荧光au纳米点的粒径尺寸为2.5nm左右。

实施例2

ctb-aunds复合物的制备：将ctb粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta的tris缓冲溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其浓度达到1mg/ml。在4℃环境下，将上述溶液用3500分子量的渗析袋渗析3天，以除去溶液中的金属离子后，待用。量取5ml已制备好的红色荧光au纳米点水溶液(0.5mg/ml)加入20ml的烧瓶中，然后依次加入2ml含有3.1mg/mledc的tris溶液、2ml含有2.4mg/mlnhs的tris溶液，搅拌30min。将2ml的1mg/ml的ctb溶液加入烧瓶中后，将烧瓶置于摇床上，室温反应8h。将所得产物用3500分子量的渗析袋在4℃下渗析7天，以除去体系中的小分子。将渗析后的溶液冻干(约为50mg)，并分散于tris缓冲液中，使其浓度为10mg/ml，得到ctb-aunds复合物溶液，即能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂。

实施例3

组织切片的制备及荧光成像。在对大鼠注射ctb-aunds复合物溶液5天后，以质量分数为10％的水合三氯乙醛将大鼠深度麻醉，然后通过其左心室依次静脉注射含有质量分数为0.9％的生理盐水和质量分数为4％的多聚甲醛。小心地切开大鼠腰背部，取出双侧l4和l5背根神经节以及脊髓腰椎节段，以固定剂处理3h，储存在含有质量分数为30％蔗糖的pbs缓冲液(ph＝7.4)中脱水过夜。以冰冻切片机分别切取厚度为15μm的l4和l5背根神经节纵向切片、20μm的腰髓纵向切片和30μm的横向切片。将制备好的组织切片置于荧光显微镜下，分别以4×、10×和20×的放大倍数观察，整个过程在避光条件下操作。

实施例4

荧光au纳米点的制备：在制备au纳米点之前，首先制备ag纳米点为模板，具体步骤为：称取0.1688g的谷胱甘肽和0.103g的agclo4溶解于10ml水中，搅拌10min后，向体系中逐滴加入浓度为1m的naoh，调节溶液ph为7，此时整个体系为无色溶液。再向溶液中加入1mln2h4·h2o，在室温下避光搅拌36h后，得到橙红色溶液，证明ag纳米点已经产生。向溶液中加入50ml异丙醇作为沉淀剂，离心后得到的固体产物即为ag纳米点，将沉淀分散于10ml水中，得到浓度约为50mm的ag纳米点溶液。

向装有5ml水的烧瓶中加入500μl上述合成的ag纳米点溶液(50mm)，再加入250μlhaucl4溶液(50mm)(au与ag的摩尔用量比为1:2)，向烧瓶中逐滴加入1m的naoh溶液，至ph为7.5，然后在80℃及加热条件下搅拌3h，溶液中出现agcl黑色沉淀。将整个溶液在8000rpm转速下离心15min除去沉淀，然后向清液中加入30ml异丙醇作为沉淀剂，离心后得到的固体产物即为au纳米点，将沉淀分散于5ml水中，即得到浓度约为2mm的红色荧光au纳米点溶液。荧光au纳米点的粒径尺寸为2.1nm左右。

ctb-aunds复合物的制备：将ctb粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta的tris缓冲溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其浓度达到1mg/ml。在4℃环境下，将上述溶液用3500分子量的渗析袋渗析3天，以除去溶液中的金属离子后，待用。量取5ml已制备好的红色荧光au纳米点(0.5mg/ml)加入20ml的烧瓶中，然后依次加入2ml含有0.6mg/mledc的tris溶液、2ml含有0.5mg/mlnhs的tris溶液，搅拌30min。将2ml的1mg/ml的ctb溶液加入烧瓶中后，将烧瓶置于摇床上，室温反应6h。将所得产物用3500分子量的渗析袋在4℃下渗析5天，以除去体系中的小分子。将渗析后的溶液冻干(约为50mg)，并分散于tris缓冲液中，使其浓度为10mg/ml，即可得到能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂。

实施例5

荧光au纳米点的制备：在制备au纳米点之前，首先制备ag纳米点为模板，具体步骤为：称取0.0678g的半胱氨酸(含巯基的氨基酸)和0.0843g的agno3溶解于10ml水中，搅拌10min后，向体系中逐滴加入浓度为1m的naoh，调节溶液ph为7，此时整个体系为无色溶液。再向溶液中加入1mln2h4·h2o，在室温下避光搅拌36h后，得到橙红色溶液，证明ag纳米点已经产生。向溶液中加入50ml异丙醇作为沉淀剂，离心后得到的固体产物即为ag纳米点，将沉淀分散于10ml水中，得到浓度约为50mm的ag纳米点溶液。

向装有5ml水的烧瓶中加入500μl上述合成的ag纳米点溶液(50mm)，再加入250μlhaucl4溶液(50mm)(au与ag的摩尔用量比为1:2)，向烧瓶中逐滴加入1m的naoh溶液，至ph为7.5，然后在80℃及加热条件下搅拌3h，溶液中出现agcl黑色沉淀。将整个溶液在8000rpm转速下离心15min除去沉淀，然后向清液中加入30ml异丙醇作为沉淀剂，离心后得到的固体产物即为au纳米点，将沉淀分散于5ml水中，即得到浓度约为2mm的红色荧光au纳米点溶液。荧光au纳米点的粒径尺寸为2.3nm左右。

ctb-aunds复合物的制备：将ctb粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta的tris缓冲溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其浓度达到1mg/ml。在4℃环境下，将上述溶液用3500分子量的渗析袋渗析3天，以除去溶液中的金属离子后，待用。量取4ml已制备好的红色荧光au纳米点(0.5mg/ml)加入20ml的烧瓶中，然后依次加入2ml含有0.6mg/mledc的tris溶液、2ml含有0.5mg/mlnhs的tris溶液，搅拌30min。将2.5ml的1mg/ml的ctb溶液加入烧瓶中后，将烧瓶置于摇床上，室温反应6h。将所得产物用3500分子量的渗析袋在4℃下渗析5天，以除去体系中的小分子。将渗析后的溶液冻干(约为50mg)，并分散于tris缓冲液中，使其浓度为8mg/ml，即可得到能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂。