黄芪甲苷Ⅲ在制备药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种中药活性成分在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途以及含有该活性成分的药物组合物，具体涉及黄芪甲苷ⅲ或其盐在制备预防和治疗疾病的药物中的用途以及含有黄芪甲苷ⅲ或其盐的药物组合物。

背景技术

癌症的传统疗法是通过化疗诱导对癌细胞的细胞毒性。然而，化疗也对健康细胞产生一系列的副作用。因此，免疫疗法是癌症治疗的一个迅速发展的领域，在近代的临床试验中展示了极大的潜力。而免疫疗法治疗包括以下几步：从血液中分离免疫细胞，体外细胞扩增和将免疫细胞导入病人体内。各种各样的免疫细胞可以被细胞因子诱导，包括自然杀伤细胞(nk细胞)、nkt细胞，γδ-t淋巴细胞和其它淋巴细胞。nk细胞(cd3-/cd56+)是淋巴细胞体外培养产生的并且是以白细胞介素-2和白细胞介素-12初代培养得到的。作为一个重要的种群，nk细胞是细胞诱导杀伤细胞的重要子集，其在抗病毒和监视癌细胞爆发中起着决定性作用。nk细胞倾向于与辅助t细胞的免疫应答有关，其可以优先地产生白细胞介素-2和白细胞介素-12。众所周知，白细胞介素-12在肿瘤免疫应答中具有重要的作用，由此nk细胞可以有益于癌症治疗。

nk细胞是与t、b细胞并列的第三类群淋巴细胞。nk细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的15％，在脾内约有3％～4％，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。nk细胞较大，含有胞浆颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。nk细胞可非特异性直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无mhc限制。nk细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如细菌，真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等，但不伤及正常细胞。nk细胞表面受体(nkr)可以识别被病毒感染的细胞表面表达的多糖分子。nk细胞的杀伤效应是由其活化后释放出的毒性分子介导，如穿孔素、颗粒酶和tnfα(肿瘤坏死因子)等。

nk细胞抗肿瘤的机理可能经过三个步骤：(1)nk细胞与靶细胞结合，nk细胞表面有识别靶细胞的受体，而靶细胞表面有被受体识别的决定簇；(2)靶细胞刺激nk细胞释放nk细胞毒性因子；(3)nk细胞毒性因子与靶细胞结合，促使某些酶发生变化，导致靶细胞溶解。

此外，nk细胞通过自然杀伤和adcc发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。(1)抗病毒感染：nk可选择性地杀伤病毒感染的靶细胞。由辅佐细胞或nk细胞所产生的ifn可协同nk的抗病毒作用，而对正常细胞有保护作用。另一方面，病毒感染细胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其对nk的杀伤细胞作用变得更加敏感。在体外，nk可溶解疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。体内试验表明，nk低活性小鼠品系对某些病毒感染更加敏感；注射抑制nk细胞的抗asialogml抗体可加重小鼠流感病毒性肺炎。此外，nk细胞在体外还可杀伤细菌、真菌、原虫等，可能与nk细胞释放某些杀伤介质有关。(2)nk细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比t细胞具有更重要的作用。某些疾病如chediak-higashi或x性联淋巴增殖综合征患者，由于nk功能缺陷对恶性淋巴细胞增殖疾病特别易感。(3)参与骨髓移植后移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemiaeffect，gvl)：在体外nk细胞可杀伤某些淋巴样和髓样白血病细胞。骨髓移植后数周内，来自供体的nk细胞在pbl中占相当高的比例。此外，在体内nk细胞还可杀伤某些不成熟细胞如胃髓干细胞、胸腺细胞亚群等。

从传统中草药中分离提取单体化合物是获得有效天然产物的一个重要来源，目前这些中草药的活性成分以及作用机制绝大部分还不清楚，因此确定这些活性成分的作用机制也具有十分重要的理论以及现实意义。黄芪是我国经典传统补益中药,具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌之功效,《本草纲目》记载“可治一切气衰血虚之症”。现代研究表明,黄芪主要含有三萜皂苷、黄酮类化合物以及多糖等成分，其中黄芪皂苷为黄芪主要活性成分。黄芪皂苷ⅲ(astragalosideⅲ，asⅲ)是黄芪皂苷的一种。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供能够预防和/或治疗癌症的中草药活性成分以及含有该活性成分的药物组合物，该中草药活性成分能够促进nk细胞增殖，从而有助于抗肿瘤的免疫反应。

本发明的黄芪甲苷ⅲ的结构式如式(i)所示：

根据本发明提供的用途，其中，式(i)所示化合物(即，黄芪甲苷ⅲ)的药学上可接受的盐可以选自枸橼酸盐、盐酸盐、硫酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐中的一种或多种。

一方面，本发明提供了黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐在制备用于促进nk细胞扩增的药物中的用途以及一种用于促进nk细胞扩增的药物，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐；优选地，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐作为唯一的活性成分。

如上所述，nk细胞是先天免疫的重要组成部分，并极大地有助于抗肿瘤的免疫反应。nk细胞通过释放如γ-干扰素的促炎细胞因子控制肿瘤细胞。在本研究中，发明人发现，黄芪甲苷ⅲ能够通过免疫途径恢复nk损伤小鼠的nk细胞。同时，黄芪甲苷ⅲ还显著增强了对nk细胞增殖有作用的th1型细胞因子产物，包括γ-干扰素，白细胞介素-2和白细胞介素-12等。综上，本发明人通过一系列研究表明：黄芪甲苷ⅲ可以促使nk细胞扩增，同时能够恢复nk细胞缺失的小鼠体内的nk细胞群。

另一方面，本发明提供了黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途以及一种预防和/或治疗癌症的药物，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐；优选地，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐作为唯一的活性成分。

优选地，所述癌症为对nk细胞敏感的癌症；

优选地，所述药物为预防和/或治疗癌症的免疫疗法中使用的药物。

在上述用途中，癌症可以选自胃癌、直/结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肺腺癌、鼻咽癌、肝癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、脑瘤、皮肤癌、白血病、淋巴癌和黑色素瘤。

优选地，所述癌症为肺腺癌或黑色素瘤。

在本研究中，发明人发现，nk细胞的扩增能够抑制体外培养的b16黑色素瘤细胞的增殖。实验结果证明了黄芪甲苷ⅲ在b16黑色素瘤细胞增殖中有重大的抑制作用，其对于lewis鼠源性肺腺癌细胞具有同样的疗效。本发明人还发现，黄芪甲苷ⅲ可以调节th1细胞效应，能够极大的提高th1细胞因子产物，包括γ-干扰素，白细胞介素-2和白细胞介素-12等，综上可以确定黄芪甲苷ⅲ能够杀死肿瘤细胞，从而可以用于预防和/或治疗癌症。

再一方面，本发明提供了黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗感染性疾病的药物中的用途以及一种预防和/或治疗免疫性疾病的药物，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐；优选地，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐作为唯一的活性成分。

优选地，所述药物为预防和/或治疗感染性疾病的免疫疗法中使用的药物。

在上述用途中，所述感染性疾病可以选自任何由病毒、细菌、原生动物、霉菌或真菌引起的感染。

优选地，所述病毒、细菌、原生动物、霉菌或真菌对nk细胞敏感；

所述病毒包括但是不限于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流行性感冒病毒、水痘病毒、腺病毒、i型单纯疱疹、2型单纯疱疹、牛瘟病毒、鼻病毒、欧可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、虫媒病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小儿麻痹症病毒和i型或2型人类免疫缺陷病毒。

所述细菌包括但不限于葡萄球菌；链球菌，包括化脓性链球菌；肠球菌；芽孢杆菌，包括炭疽杆菌和乳酸杆菌；利斯特菌；白喉棒状杆菌；加德纳菌，包括阴道加德纳菌；诺卡氏菌；链霉菌；普通高温放线菌；密螺旋体属；弯曲杆菌；假单胞菌；军团菌；奈瑟菌，包括淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌；黄杆菌，包括脑膜脓毒血性黄杆菌和气味黄杆菌；布鲁氏菌；博德特氏菌，包括百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌；埃希氏菌，包括大肠杆菌、克雷伯菌；肠杆菌、沙雷氏菌，包括粘质沙雷氏菌和液化沙雷氏菌；爱德华氏菌；变形杆菌，包括奇异变形杆菌和普通变形杆菌；链杆菌；立克次体，包括r.fickettsfi，衣原体，包括鹦鹉热衣原体和砂眼衣原体；分枝杆菌，包括结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌及鼠麻疯分枝杆菌；以及诺卡氏菌。

所述原生动物包括但不限利氏曼原虫(leishmania)、kokzidioa以及锥形虫(trypanosoma)

在本研究中，发明人发现，黄芪甲苷ⅲ能够通过免疫途径恢复nk损伤小鼠的nk细胞。同时，黄芪甲苷ⅲ还显著增强了对nk细胞增殖有作用的th1型细胞因子产物，包括γ-干扰素，白细胞介素-2和白细胞介素-12等。综上，本发明人通过一系列研究表明：黄芪甲苷ⅲ可以促使nk细胞扩增，同时能够恢复nk细胞缺失的小鼠体内的nk细胞群。而nk可选择性地杀伤被感染的靶细胞。由辅佐细胞或nk细胞所产生的ifn可协同nk作用，而对正常细胞有保护作用。另一方面，病毒感染细胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其对nk的杀伤细胞作用变得更加敏感。在体外，nk可溶解疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。此外，nk细胞在体外还可杀伤细菌、真菌、原虫等，可能与nk细胞释放某些杀伤介质有关因此，本发明的黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐可以预防和/或治疗感染性疾病。

另一方面，本发明提供了黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗免疫性疾病的药物中的用途以及一种预防和/或治疗免疫性疾病的药物，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐；优选地，其包含黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐作为唯一的活性成分。

优选地，所述免疫性疾病对nk细胞敏感。

在上述用途中，免疫性疾病可以选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能元进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、皮肤病、慢性肝病。

在本研究中，发明人发现，黄芪甲苷ⅲ能够通过免疫途径恢复nk损伤小鼠的nk细胞。同时，黄芪甲苷ⅲ还显著增强了对nk细胞增殖有作用的th1型细胞因子产物，包括γ-干扰素，白细胞介素-2和白细胞介素-12等。综上，本发明人通过一系列研究表明：黄芪甲苷ⅲ可以促使nk细胞扩增，同时能够恢复nk细胞缺失的小鼠体内的nk细胞群。因此，本发明的黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐可以预防和/或治疗免疫性疾病。

在上述用途中，进一步优选地，黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐与其它药物联合使用。

因此，本发明还提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

其中，该药物组合物可以为固体制剂、液体制剂或肠溶制剂。

鉴于黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐能够促进nk细胞的扩增，将其应用于癌症、感染性疾病或免疫性疾病的预防和治疗将具有以下优点，黄芪甲苷ⅲ或其药学上可接受的盐作为能够有效促进nk细胞的扩增的化合物，具有潜在的毒副作用小、显著抑制癌细胞增殖、广谱抗癌、制备容易以及成本低廉等优点，在临床上具有广泛的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的实施例1中，流式细胞仪nk1.1+细胞散点图；

图2为本发明的实施例1中，黄芪甲苷ⅲ对nk1.1+表达的作用曲线；

图3为本发明的实施例2中，流式细胞仪nk1.1+细胞散点图；

图4为本发明的实施例2中，流式细胞仪nk细胞分裂图；

图5为本发明的实施例3中，以mtt分析u20s的细胞活性图；

图6为本发明的实施例3中，以mtt分析b16的细胞活性图；

图7为本发明的实施例3中，以cfse染色b16细胞，利用流式细胞仪分析b16的细胞活性图；

图8为本发明的实施例4中，乳酸脱氢酶试剂盒分析llc细胞凋亡实验图；

图9为本发明的实施例4中，以fese染色llc细胞，流式细胞仪分析llc的细胞活性图；

图10为本发明的实施例5中，cd+t细胞作用下γ-干扰素阳性细胞流式细胞仪散点图；

图11为本发明的实施例5中，为黄芪甲苷ⅲ对γ-干扰素表达的作用曲线；

图12为本发明的实施例5中，以实时pcr定量白细胞介素-2和白细胞介素-12。mrna提取于经100nm黄芪甲苷ⅲ预处理48小时的th1培养的脾细胞实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1黄芪甲苷ⅲ提高nk1.1+的百分比

为了研究黄芪甲苷ⅲ对nk细胞产物的影响，发明人将野生型小鼠的淋巴细胞以黄芪甲苷ⅲ活化48小时，利用流式细胞仪分析nk1.1+细胞的百分比。我们观察到黄芪甲苷ⅲ以显著的剂量依赖的方式增加nk1.1+细胞的比例。

来自c57型小鼠的脾细胞在黄芪甲苷ⅲ浓缩液中体外培养48小时。至少三分之一的独立实验显示，黄芪甲苷ⅲ提高了nk细胞的体外扩增。实验结果为图1：代表流式细胞仪nk1.1+细胞散点图。图2：为黄芪甲苷ⅲ对nk1.1+表达的作用曲线。

实施例2黄芪甲苷ⅲ在细胞分裂中的作用

基于黄芪甲苷ⅲ可提高体外培养的nk细胞的百分比，发明人试着实验证明该化合物是否能够在剔除nk基因小鼠体内产生nk细胞。对野生c57型小鼠注射抗小鼠nk1.1+48小时以除去其体内的nk细胞。将来自nk缺失小鼠的脾细胞以黄芪甲苷ⅲ活化48小时，以流式细胞仪分析nk细胞与nkt细胞的百分比。观察到黄芪甲苷ⅲ极大地促进了nk细胞的增殖。富集nk细胞并以cfse染色。以黄芪甲苷ⅲ处理nk细胞48小时，然后以流式细胞仪分析nk细胞的分裂。我们观察到黄芪甲苷ⅲ可促进nk细胞分裂。

来自nk细胞缺失小鼠的脾细胞以100nm的黄芪甲苷ⅲ活化48小时。黄芪甲苷ⅲ能够促进nk细胞在nk细胞缺失的小鼠体内的增殖。实验结果为图3：代表流式细胞仪nk1.1+细胞散点图。图4：代表流式细胞仪nk细胞分裂。

实施例3黄芪甲苷ⅲ的抗癌作用

nk细胞对肿瘤的治疗因肿瘤细胞而异。为了证实黄芪甲苷ⅲ治疗作用，比较了其分别对骨肉瘤u20s细胞和b16黑色素瘤细胞的疗效。nk细胞共培养的骨肉瘤u20s细胞和b16黑色素瘤细胞，分别以黄芪甲苷ⅲ活化过夜6小时。以mtt分析肿瘤细胞。观察到黄芪甲苷ⅲ对b16黑色素瘤细胞的抑制作用强于骨肉瘤u20s细胞。将b16黑色素瘤细胞以cfse染色后与nk细胞共培养，以黄芪甲苷ⅲ处理过夜6小时，观察到黄芪甲苷ⅲ可以抑制nk细胞培养的b16黑色素瘤的增殖。

黄芪甲苷ⅲ对不同癌细胞的体外治疗作用。nk细胞缺失的c57小鼠以黄芪甲苷ⅲ培养过夜。以nk细胞培养的不同肿瘤细胞以黄芪甲苷ⅲ处理6小时。实验结果为图5：表示以mtt分析u20s的细胞活性图。图6：表示以mtt分析b16的细胞活性图。图7：以cfse染色b16细胞，利用流式细胞仪分析b16的细胞活性。至少三分之一的独立实验显示。数据含义±s.d.(n＝3).*p,0.05；**p,0.01；***p,0.001.

实施例4黄芪甲苷ⅲ的抗llc作用

我们进一步实验是否黄芪甲苷ⅲ对lewis鼠源性肺腺癌细胞具有同样的作用。将与nk细胞共培养的lewis鼠源性肺腺癌细胞以cfse染色，黄芪甲苷ⅲ活化过夜6小时。利用乳酸脱氢酶试剂盒分析细胞上清液中的乳酸脱氢酶。我们发现黄芪甲苷ⅲ活化过的nk细胞加快lewis鼠源性肺腺癌细胞的凋亡速度。以流式细胞仪分析cfse染色的lewis鼠源性肺腺癌细胞。我们观察到黄芪甲苷ⅲ可以抑制nk细胞共培养的lewis鼠源性肺腺癌细胞的增殖。

黄芪甲苷ⅲ在体外通过nk细胞抑制llc细胞生长。nk细胞缺失的c57小鼠以黄芪甲苷ⅲ培养过夜。以nk细胞培养的不同肿瘤细胞以黄芪甲苷ⅲ处理6小时。实验结果为图8：乳酸脱氢酶试剂盒分析llc细胞凋亡。图9：以fese染色llc细胞，流式细胞仪分析llc的细胞活性。至少三分之一的独立实验显示。数据含义±s.d.(n＝3).*p,0.05；**p,0.01；***p,0.001.

实施例5黄芪甲苷ⅲ促进th1细胞分化

为了探索以黄芪甲苷ⅲ处理的nk细胞抗肿瘤作用的内在机制，进一步研究了黄芪甲苷ⅲ对th1分化影响。将来自野生型小鼠的脾细胞以经白细胞介素-12预处理的抗小鼠cd3与抗小鼠cd28处理48小时，然后重处理4小时。以流式细胞仪分析γ+-干扰素细胞的百分比。我们观察到黄芪甲苷ⅲ以显著的剂量依赖的方式增加nk1.1+细胞的比例。这反映了γ+-干扰素表达的增加，正如定量聚合酶链反应分析的那样。同样，黄芪甲苷ⅲ增加了白细胞介素-2和白细胞介素-12的mrna的表达。结果证明了黄芪甲苷ⅲ增加th1细胞因子表达的作用机制。

黄芪甲苷ⅲ在体外促进th1细胞分化。来自c57型小鼠脾细胞以经黄芪甲苷ⅲ预处理的th1共培养78小时。至少三分之一的独立实验显示。实验结果为图10：代表cd+t细胞作用下γ-干扰素阳性细胞流式细胞仪散点图。图11：为黄芪甲苷ⅲ对γ-干扰素表达的作用曲线。图12：为以实时pcr定量白细胞介素-2和白细胞介素-12。mrna提取于经100nm黄芪甲苷ⅲ预处理48小时的th1培养的脾细胞。数据含义±s.d.(n＝3).*p,0.05；**p,0.01；***p,0.001。