一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用。

背景技术：

刺激隐核虫(cryptocaryonirritans)是一种寄生于海水鱼类的纤毛虫，引起海水养殖鱼类严重致死性疾病——白点病。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成了非常严重的危害。由于海水养殖的开放性特征，很难杜绝刺激隐核虫对鱼体的感染，加之尚无有效的治疗药物和处理方法，使得该病的防治异常困难。目前生产上主要采用药物防治和物理防治(colorniandburgess，1997；蔡泽平等，2001；noritakaetal.，2001；noritakaetal.，2003；黄玮等，2004)，然而这些方法由于存诸多缺陷，如效果不稳定、破坏养殖环境、危害食品安全、实施不便等，很难达到理想的效果。

大量的研究证实，海水鱼类对刺激隐核虫感染会产生获得性免疫保护，疫苗接种可能成为防治刺激隐核虫病的有效方法(yoshinagaetal，1997；yambotetal，2006；luoetal，2007；hatanakaandhirazawa，2008)。本课题组展开了刺激隐核虫免疫防治的基础研究和应用研究，研发出了刺激隐核虫幼虫灭活疫苗，该疫苗对海水鱼的免疫保护率可以达到80％以上(luoetal，2007；jian-shanbaietal，2008；但学明等，2008；danetal，2013)。但是该全虫疫苗的批文申请和产业化遇到了巨大的挑战，主要因为该寄生虫无法进行离体培养，必须在鱼体上才能进行繁殖，因此难以获得足够的虫体用以生产疫苗，更为重要的是难以制订规范的生产流程和质量标准，这迫使我们向更深层次进行研究，开发基因工程疫苗。

本研究从刺激隐核虫转录组数据库中筛选出表面蛋白c1候选基因，并在四膜虫上表达出重组蛋白制备疫苗用以免疫海水鱼，通过检测疫苗的免疫原性和保护性，筛选到刺激隐核虫有效的保护性抗原基因。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用，具体步骤如下：

1、刺激隐核虫传代：

采用的刺激隐核虫分离于广东省惠州市大亚湾某卵形鲳鲹养殖网箱，对体表及鳃出现明显症状的卵形鲳鲹进行镜检，确认体表及鳃上的滋养体形态与刺激隐核虫报道一致。将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500l海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊。包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。

2、斜带石斑鱼的暂养：

所用斜带石斑鱼均购自广东省大亚湾水产试验中心，整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录。实验鱼暂养2周，水温为25度，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖饲料。试验前，随机抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。

3、刺激隐核虫总rna的提取：

提取刺激隐核虫的总rna，具体操作步骤如下：

1)从-80℃冰箱中取出样品，置于冰上，每个样品不超过30mg，快速加入1mlmagzolreagent，用组织匀浆机快速匀浆。

2)室温放置5min让组织充分裂解。

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。

4)4℃，12,000×g离心15min。

5)小心转移上清液至新的离心管中，加入1.5倍体积无水乙醇后混匀。

6)把hipurernaminicolumn装在2ml收集管中，转移混合液至柱子中，8,000×g离心30s。

7)倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入用乙醇稀释的650μlbufferrw2至柱子中，8,000×g离心30s。

8)重复上步骤一次。

9)倒弃滤液把柱子装回收集管中10,000×g离心空柱2min甩干柱子的基质。

10)将柱子转移至1.5ml离心管中，加入45μlrnasefreewater至柱子的膜中央，室温静置2min，10,000×g离心1min。

11)丢弃rna柱子，电泳检测rna的完整性，oda260/280测定rna浓度。剩余样品保存-80℃。

4、一链cdna的合成：

1)按以下体系添加试剂：totalrna，1μg；dnaseibuffer，1μl；dnasei，1μl；最后加rnasefreewater至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组dna污染；

2)反应结束后向上述体系中加入1μledta(25mm)，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活dnasei；

3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；

4)cdna合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的rna溶液，11μl；oligo(dt)20(10pmol/μl)，1μl；5×rtbuffer，4μl；dntpmixture(各10mm)，2μl；rnaseinhibitor(10u/μl)，1μl；revertraace，1μl；totalvolume20μl。反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min。反应产物转到-20℃保存备用。

5、表面蛋白c1基因开放阅读框(orf)的克隆：

结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白c1基因orf的引物(5’到3’)：c1f，atgtaaaagattttagctattttatt；c1r，tcatttgaataaaagagcaaag。

模板使用刺激隐核虫一链cdna，引物使用c1f/r，pcr反应体系如下：一链cdna，2μl；c1f(10μm)，2μl；c1r(10μm)，2μl；primestarmaxmix，25μl；加h2o至50μl。pcr反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

回收目的条带，产物与克隆载体peasy-bluntcloningvector进行连接，连接反应体系如下：pcr回收产物，4μl；peasy-bluntcloningvector，1μl。

混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞。从-80℃取出trans1-t1感受态细胞50μl置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mllb液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μl菌液涂布于含有x-gal、iptg和卡那霉素的lb平板上，37℃倒置过夜培养。

次日挑取白色单菌落于10μl无菌水中，漩涡混匀。取1μl混合液为模板，进行阳性克隆鉴定。反应体系如下：菌液，1μl；primerm13f(10μm)，1μl；primerm13r(10μm)，1μl；premixtaq，25μl；加h2o至50μl。pcr反应条件为：95℃预变性10min，(94℃，30s；55℃，30s；72℃，3min)×35个循环，最后72℃延伸10min。电泳鉴定阳性克隆，随机挑取3个阳性克隆保种并送到公司测序。

6、四膜虫rdna表达载体的构建：

1)候选基因的结构特征分析

利用软件对表面蛋白c1基因进行以下分析：预测蛋白序列、限制性酶切位点分析、与四膜虫密码子使用偏好性差异分析、信号肽序列分析和gpi锚定位点分析。

2)表面蛋白c1基因的改造

以目的基因cdna为模板通过pcr对候选基因进行如下改造：在两端设计特异性酶切位点(bamh和xhoi)、去除gpi-anchor结构、增加标签、设计tev位点等。

3)候选基因与穿梭载体的连接

把改造后的候选基因和分泌型穿梭载体(ptiev4)进行双酶切(酶切位点为bamh和xhoi)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定。

4)表达载体的构建

把上述穿梭载体和pd5h8载体进行单酶切(酶切位点为noti)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定，成功构建四膜虫rdna表达载体。

7、四膜虫rdna表达载体的转化和阳性虫株筛选：

1)四膜虫的准备

用neff培养基分别培养两种交配型的四膜虫(ii型和vii型)，当细胞浓度达到10⁵个/ml以上时转入饥饿液中震荡培养7-14小时，然后静置培养9.5h，如果镜检发现细胞配对比率达到80％以上，且在荧光显微镜下观察发现新的大核原基已经形成，就可以进行转化；

2)转化

将浓缩的表达载体(浓度＞1ug/ul)包被金颗粒，利用bio-radpds-1000台式基因枪把表达载体转入四膜虫的大核原基中；

3)筛选

将转化后的细胞培养在neff培养基中，依次加入1000×～100×的巴龙霉素进行梯度筛选，最终获得带有9000-10000个外源基因的工程四膜虫。

8、工程四膜虫的诱导表达和重组蛋白的分离纯化：

1)当细胞浓度达到10⁵个/ml以上时800×g离心2分钟弃上清，加入1mmcdcl2，诱导四膜虫表达；

2)对于分泌型表达的工程四膜虫，诱导3小时后，收集虫液800×g离心2分钟，取上清经硫酸铵沉淀、透析和ni-nta树脂纯化后即可得到纯的重组蛋白。

重组蛋白大量诱导后，收集上清，重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带，详见附图1，其中m泳道表示蛋白marker，1、2、3泳道分别表示50mm、100mm、250mm咪唑洗脱得到的纯化样品。

9、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护性的检测：

把重组蛋白与弗氏佐剂混合制成疫苗免疫石斑鱼，首次免疫两周后加强免疫一次。首次免疫后第4周，用刺激隐核虫幼虫攻毒，检验疫苗的免疫保护性。首次免疫后第4周(攻毒前)以及攻毒后第3d，分别采集免疫组和对照组石斑鱼血清，用westernblot检测血清中抗体水平。结果表明，表面蛋白c1重组蛋白免疫后，给石斑鱼提供了27.27％的相对保护率。westernblot结果显示(见图2)：免疫前后血清中抗体含量相似，但攻毒后免疫组血清中抗体含量显著升高，而对照组未见显著变化。

10、亚单位疫苗的制备：

把表面蛋白c1重组蛋白溶于pbs后，加入等剂量的弗氏佐剂，在冰上用组织匀浆器将抗原与佐剂混合均匀，制成亚单位疫苗，4℃保存。

附图说明

图1为表面蛋白c1重组蛋白纯化结果图。

图2为westernblot检测血清中抗体水平结果。1.对照组感染前血清；2.免疫组感染前血清；3.对照组感染后血清；4.免疫组感染后血清。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用，具体步骤如下：

1、刺激隐核虫传代：

采用的刺激隐核虫分离于广东省惠州市大亚湾某卵形鲳鲹养殖网箱，对体表及鳃出现明显症状的卵形鲳鲹进行镜检，确认体表及鳃上的滋养体形态与刺激隐核虫报道一致。将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500l海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊。包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。

2、斜带石斑鱼的暂养：

所用斜带石斑鱼均购自广东省大亚湾水产试验中心，整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录。实验鱼暂养2周，水温为25度，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖饲料。试验前，随机抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。

3、刺激隐核虫总rna的提取：

提取刺激隐核虫的总rna，具体操作步骤如下：

1)从-80℃冰箱中取出样品，置于冰上，每个样品不超过30mg，快速加入1mlmagzolreagent，用组织匀浆机快速匀浆。

2)室温放置5min让组织充分裂解。

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。

4)4℃，12,000×g离心15min。

5)小心转移上清液至新的离心管中，加入1.5倍体积无水乙醇后混匀。

6)把hipurernaminicolumn装在2ml收集管中，转移混合液至柱子中，8,000×g离心30s。

7)倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入用乙醇稀释的650μlbufferrw2至柱子中，8,000×g离心30s。

8)重复上步骤一次。

9)倒弃滤液把柱子装回收集管中10,000×g离心空柱2min甩干柱子的基质。

10)将柱子转移至1.5ml离心管中，加入45μlrnasefreewater至柱子的膜中央，室温静置2min，10,000×g离心1min。

11)丢弃rna柱子，电泳检测rna的完整性，oda260/280测定rna浓度。剩余样品保存-80℃。

4、一链cdna的合成：

1)按以下体系添加试剂：totalrna，1μg；dnaseibuffer，1μl；dnasei，1μl；最后加rnasefreewater至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组dna污染；

2)反应结束后向上述体系中加入1μledta(25mm)，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活dnasei；

3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；

4)cdna合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的rna溶液，11μl；oligo(dt)20(10pmol/μl)，1μl；5×rtbuffer，4μl；dntpmixture(各10mm)，2μl；rnaseinhibitor(10u/μl)，1μl；revertraace，1μl；totalvolume20μl。反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min。反应产物转到-20℃保存备用。

5、表面蛋白c1基因开放阅读框(orf)的克隆：

结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白c1基因orf的引物(5’到3’)：c1f，atgtaaaagattttagctattttatt；c1r，tcatttgaataaaagagcaaag。

模板使用刺激隐核虫一链cdna，引物使用c1f/r，pcr反应体系如下：一链cdna，2μl；c1f(10μm)，2μl；c1r(10μm)，2μl；primestarmaxmix，25μl；加h2o至50μl。pcr反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

回收目的条带，产物与克隆载体peasy-bluntcloningvector进行连接，连接反应体系如下：pcr回收产物，4μl；peasy-bluntcloningvector，1μl。

混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞。从-80℃取出trans1-t1感受态细胞50μl置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mllb液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μl菌液涂布于含有x-gal、iptg和卡那霉素的lb平板上，37℃倒置过夜培养。

次日挑取白色单菌落于10μl无菌水中，漩涡混匀。取1μl混合液为模板，进行阳性克隆鉴定。反应体系如下：菌液，1μl；primerm13f(10μm)，1μl；primerm13r(10μm)，1μl；premixtaq，25μl；加h2o至50μl。pcr反应条件为：95℃预变性10min，(94℃，30s；55℃，30s；72℃，3min)×35个循环，最后72℃延伸10min。电泳鉴定阳性克隆，随机挑取3个阳性克隆保种并送到公司测序。

6、四膜虫rdna表达载体的构建：

1)候选基因的结构特征分析

利用软件对表面蛋白c1基因进行以下分析：预测蛋白序列、限制性酶切位点分析、与四膜虫密码子使用偏好性差异分析、信号肽序列分析和gpi锚定位点分析。

2)表面蛋白c1基因的改造

以目的基因cdna为模板通过pcr对候选基因进行如下改造：在两端设计特异性酶切位点(bamh和xhoi)、去除gpi-anchor结构、增加标签、设计tev位点等。

3)候选基因与穿梭载体的连接

把改造后的候选基因和分泌型穿梭载体(ptiev4)进行双酶切(酶切位点为bamh和xhoi)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定。

4)表达载体的构建

把上述穿梭载体和pd5h8载体进行单酶切(酶切位点为noti)，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定，成功构建四膜虫rdna表达载体。

7、四膜虫rdna表达载体的转化和阳性虫株筛选：

1)四膜虫的准备

用neff培养基分别培养两种交配型的四膜虫(ii型和vii型)，当细胞浓度达到10⁵个/ml以上时转入饥饿液中震荡培养7-14小时，然后静置培养9.5h，如果镜检发现细胞配对比率达到80％以上，且在荧光显微镜下观察发现新的大核原基已经形成，就可以进行转化；

2)转化

将浓缩的表达载体(浓度＞1ug/ul)包被金颗粒，利用bio-radpds-1000台式基因枪把表达载体转入四膜虫的大核原基中；

3)筛选

将转化后的细胞培养在neff培养基中，依次加入1000×～100×的巴龙霉素进行梯度筛选，最终获得带有9000-10000个外源基因的工程四膜虫。

8、工程四膜虫的诱导表达和重组蛋白的分离纯化：

1)当细胞浓度达到10⁵个/ml以上时800×g离心2分钟弃上清，加入1mmcdcl2，诱导四膜虫表达；

2)对于分泌型表达的工程四膜虫，诱导3小时后，收集虫液800×g离心2分钟，取上清经硫酸铵沉淀、透析和ni-nta树脂纯化后即可得到纯的重组蛋白。

重组蛋白大量诱导后，收集上清，重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带，详见附图1，其中m泳道表示蛋白marker，1、2、3泳道分别表示50mm、100mm、250mm咪唑洗脱得到的纯化样品。

9、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护性的检测：

把重组蛋白与弗氏佐剂混合制成疫苗免疫石斑鱼，首次免疫两周后加强免疫一次。首次免疫后第4周，用刺激隐核虫幼虫攻毒，检验疫苗的免疫保护性。首次免疫后第4周(攻毒前)以及攻毒后第3d，分别采集免疫组和对照组石斑鱼血清，用westernblot检测血清中抗体水平。结果表明，表面蛋白c1重组蛋白免疫后，给石斑鱼提供了27.27％的相对保护率。westernblot结果显示(见图2)：免疫前后血清中抗体含量相似，但攻毒后免疫组血清中抗体含量显著升高，而对照组未见显著变化。

10、亚单位疫苗的制备：

把表面蛋白c1重组蛋白溶于pbs后，加入等剂量的弗氏佐剂，在冰上用组织匀浆器将抗原与佐剂混合均匀，制成亚单位疫苗，4℃保存。