长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，特别涉及一种长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。

背景技术：

肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，也是引起大多数恶性肿瘤患者死亡的首要原因。因此，抑制肿瘤转移对挽救恶性肿瘤患者的生命具有至关重要的临床意义，已成为抗肿瘤药物研发的策略之一。

肿瘤细胞从原发病灶向远端组织的转移包括以下几种方式：(1)直接蔓延到邻近部位，侵蚀原发器官；(2)癌细胞随淋巴结引流，由近及远转移至各级淋巴结，发生远端转移；(3)癌细胞直接进入血管，随血流转移至远端组织，如肺、骨和脑等组织，形成继发性肿瘤病灶。一方面，肿瘤细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)在肿瘤转移中扮演着重要的角色，可增强肿瘤细胞的运动、迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的转移(prieto-garcia.e,etal.medoncol.2017,34(7):122.)。另一方面，肿瘤血管也为肿瘤细胞的转移提供必要的运输通道。因此，靶向肿瘤细胞抑制癌细胞emt和靶向肿瘤血管是两个重要的抑制肿瘤转移的治疗策略。

目前，靶向肿瘤细胞emt的抑制剂主要集中在tgf-β通路，如竞争性结合tgf-βri激酶atp位点的抑制剂sd-093和ly-580276(subramanian.g,etal.cancerres.2004,64(15):5200-11.)；tgf-β/alk5特异性抑制剂ew-7203(parkcy,etal.cancersci.2011,102(10):1889-96.)，ew-719(parkcy,etal.eurjcancer.2011,47(17):2642-53.)和ew-7197(jinch,etal.jmedchem.2014,57(10):4213-38.)等。然而，这些抑制剂仅停留在临床试验阶段，临床上尚缺乏有效的emt抑制剂类药物上市。

靶向肿瘤血管的治疗药物主要包括两大类(mckeagemj,etal.cancer2010,116(8):1859-71.)。一类是血管新生抑制剂(angiogenicinhibitors,ais)，主要为vegf单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab)和vegfr2酪氨酸激酶抑制剂apatinib，vandetanib等。ais主要抑制肿瘤血管的新生过程，虽然可促进肿瘤血管正常化，减少肿瘤转移，但它们对肿瘤已形成的血管无显著影响，因而仅能减缓肿瘤的进展，不能有效杀伤已形成的肿瘤，且对中晚期肿瘤的疗效较差。因此，ais的临床应用范围受到明显的限制，患者的受益程度较小。另一类是肿瘤血管破坏剂(vasculardisruptingagents,vdas)，可选择性损伤肿瘤中心区域已形成的血管，诱导肿瘤中心大面积坏死，从而发挥良好的抗肿瘤效果。然而，肿瘤边缘区域的血管成熟度较高(周细胞覆盖率相对较高)，该部分血管对vdas不敏感，因此，vdas治疗后在肿瘤边缘区域残留明显的生存圈(tozergm,etal.natrevcancer.2005,5(6):423-35.；tozergm,etal.cancerres.2008,68(7):2301-11.；nguyenl,etal.bmccancer2012,12:522.)。残留的肿瘤生存圈，一方面由于缺氧等因素导致肿瘤细胞emt增强(fifist,etal.cancermed.2013,2(5):595-610.)，增加了治疗后肿瘤发生转移的风险；另一方面，生存圈也是vdas治疗停药后迅速复发的重要原因。综上所述，寻找可同时抑制肿瘤细胞emt和破坏肿瘤血管，克服肿瘤生存圈的药物具有十分重要的治疗意义。

从夹竹桃科植物长春花中分离得到的长春碱类化合物如长春碱、长春新碱及其衍生物长春瑞滨和长春氟宁等，它们都属于双吲哚生物碱。药理作用研究表明，长春碱及其衍生物属于细胞毒性药物，主要抑制微管蛋白的聚合，妨碍纺锤体微管的形成，使细胞核分裂被阻滞于中期。长春碱及其衍生物具有广谱的抗肿瘤活性，临床上主要用于治疗何杰金氏病、绒毛膜上皮癌，对急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌、口咽部癌、单核细胞白血病均有一定疗效(wilsonl,etal.annnyacadsci.1975,253:213-31.)。近年来，angelovacca等人研究发现，非毒剂量下长春碱可在细胞水平显著抑制血管的新生(vaccaa,etal.blood1999,94(12):4143-55.)；giannoulaklement等人研究表明，持续给予低剂量的长春碱可抑制肿瘤血管的新生(klementg,etal.jclininvest.2000,105(8):r15-24.)；jamesmoore等人证实长春新碱能够抑制肿瘤新生血管的生长(moorej,etal.jpediatrsurg.2001,36(8):1273-6.)；另一方面，annakruczynskia等人研究发现，长春氟宁可抑制肿瘤血管生成，同时破坏已生成的肿瘤血管，对实验性恶性肿瘤转移也有显著的抑制作用(kruczynskia,etal.eurjcancer.2006,42(16):2821-32.)。与许多临床使用的化疗药物一样，长春碱类药物在疾病治疗过程中也出现许多严重的副作用，例如骨髓抑制、肌痛、恶性呕吐等不良反应(bonneterrej,etal.annoncol.2001,12(12):1683-91.18.；spillerm,etal.pediatrbloodcancer.2005,45(3):344-6.)，极大限制了其在临床上的应用。降低该类药物毒副作用的有效途径之一是对药物进行结构修饰，使之成为前体药物，利用病灶组织与正常组织之间分子生物学上的差异，选择性作用于病灶靶细胞的基因、酶、信号传导因子等，从而达到靶向治疗的目的。近年来大量研究表明，成纤维细胞激活蛋白酶(fibroblast-activationproteinalpha,fapα)特异性表达于伤愈组织和90％以上的肿瘤组织激活的成纤维细胞与周细胞表面(ramirez-montagutt,etal.oncogene2004,23(32):5435-46.)。

研究表明，长春碱类化合物经肼解及加二肽衍生化形成fapα酶激活式前药后，在体内外均有良好的抗肿瘤、血管新生抑制和血管破坏活性，如申请中国发明专利(cn201310138241.8；cn201310738860.0)和pct专利(pct/cn2014/000192)。但是长春碱类衍生物在抑制肿瘤转移方面的应用和研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述的长春碱类衍生物包括长春碱类二肽及其生理上可接受的盐。

所述的长春碱类二肽为肼解长春碱类化合物与n-苄氧羰基二肽缩合得到的化合物(即长春碱类二肽为长春碱类化合物与水合肼反应形成的肼解长春碱类化合物，再与n-苄氧羰基二肽缩合所得的化合物)；优选为长春碱加二肽(bx-ccj)、长春瑞滨加二肽(bx-ccrb)、长春氟宁加二肽(bx-ccfn)和长春新碱加二肽(bx-ccxj)中的一种或以上，其结构式如式ii～v所示：

其中，z-gp表示苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基。

所述的长春碱类衍生物的合成路线如下：

所述的肼解长春碱类化合物为长春碱类化合物与水合肼反应得到的化合物；优选为肼解长春碱(jj-ccj)、肼解长春瑞滨(jj-ccrb)、肼解长春氟宁(jj-ccfn)或肼解长春新碱(jj-ccxj)。

所述的长春碱类化合物优选为长春碱(ccj)、长春瑞滨(ccrb)、长春氟宁(ccfn)或长春新碱(ccxj)。

所述的n-苄氧羰基二肽优选为n-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(z-gp-oh)；所述的n-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸的结构式如式i所示：

所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、食管癌、大肠癌、肝癌、鼻咽癌、脑癌、骨癌等恶性肿瘤；优选为乳腺癌。

所述的肿瘤转移包括肿瘤转移的各个阶段，包括肿瘤转移早期、中期和晚期。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明肼解长春碱类化合物、长春碱类二肽及其生理上可接受的盐，在体外可显著抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移和水平运动能力，在体内显著抑制肿瘤的远端转移，其药效优于长春碱类化合物，可应用于中晚期恶性肿瘤病人伴随远端转移病人的治疗。

附图说明

图1是长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231侵袭能力的抑制作用对比图(***p<0.001vs空白对照组，^###p<0.001vstgf-β1组，^#p<0.01vstgf-β1组)。

图2是长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231迁移能力的抑制作用对比图(***p<0.001vs空白对照组,^###p<0.001vstgf-β1组，^#p<0.01vstgf-β1组)。

图3是长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231水平运动能力的抑制作用对比图(***p<0.001vs空白对照组，^###p<0.001vstgf-β1组，^#p<0.01vstgf-β1组)。

图4是长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231上皮间质转化相关蛋白表达的影响结果图(***p<0.001vs空白对照组,^###p<0.001vstgf-β1组，^#p<0.01vstgf-β1组)；其中，图a为上皮细胞钙粘蛋白、图b为n-钙粘蛋白，图c为波形蛋白。

图5是长春碱类衍生物对mda-mb-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤肺转移的抑制作用对比图(n＝8,mean±sem,^###p<0.001vs空白对照组；^#p<0.01vs空白对照组)；其中，图a为h&e染色检测裸鼠肺组织转移灶数目，图b为h&e染色检测裸鼠肺组织转移灶面积，图c为利用免疫组化的方法对给药前后小鼠肺组织上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(n-钙粘蛋白、纤粘蛋白)的检测结果，图d为采用免疫印迹的方法检测长春碱类衍生物作用前后小鼠肿瘤组织中上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(n-钙粘蛋白、波形蛋白)的变化。

图6是长春碱类衍生物对裸鼠乳腺癌mda-mb-231肺转移的抑制作用对比图(n＝8,mean±sem,^###p<0.001vs空白对照组；^#p<0.01vs空白对照组)；其中，图a为h&e染色检测裸鼠肺组织转移灶数目；图b为h&e染色检测裸鼠肺组织转移灶面积；图c为利用免疫组化的方法对给药前后小鼠肺组织上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(n-钙粘蛋白、纤粘蛋白)的检测结果，图d为采用免疫印迹的方法检测长春碱类衍生物对小鼠肺组织中上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(n-钙粘蛋白、波形蛋白)的作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中涉及的长春碱类化合物依次为长春碱(ccj)、长春瑞滨(ccrb)、长春氟宁(ccfn)和长春新碱(ccxj)，它们经肼解后所得的肼解长春碱类化合物；肼解长春碱类化合物为：肼解长春碱(jj-ccj)、肼解长春瑞滨(jj-ccrb)、肼解长春氟宁(jj-ccfn)和肼解长春新碱(jj-ccxj)；

本发明实施例中涉及的长春碱类二肽为为长春碱类化合物与水合肼反应形成的肼解长春碱类化合物，再与n-苄氧羰基二肽(n-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(z-gp-oh))缩合所得的化合物；长春碱类二肽为长春碱二肽(bx-ccj)、长春瑞滨二肽(bx-ccrb)、长春氟宁二肽(bx-ccfn)及长春新碱二肽(bx-ccxj)；

所述化合物的结构及命名如下所示：

实施例1长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231侵袭能力的抑制作用

实验方法：将处于对数生长期的人乳腺癌细胞mda-mb-231细胞(购买于americantypeculturecollection，atcc)消化，离心，计数，以2×10⁴/ml分别接种于铺有matrigel基质胶(bd公司)的transwell小室，重悬细胞于无血清培养基中。每孔100μl，设置空白对照组、tgf-β1组(tgf-β12ng/ml)组和加药组，加药组为bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)与tgf-β1(2ng/ml)共同处理，下室加入700μl含10％新生牛血清的1640培养液。培养48小时后，吸去培养液，用pbs缓冲液清洗一次，4％多聚甲醛室温固定30分钟，用吉姆萨染料着色30分钟，用棉棒将小室上层膜上的细胞擦去，pbs清洗一次，显微镜观察并计算细胞数目。

实验结果：与空白对照组相比，tgf-β1组显著增加了人乳腺癌细胞mda-mb-231的侵袭作用；与因子组对比，长春碱类衍生物明显抑制了人乳腺癌细胞mda-mb-231的侵袭作用，其药效优于长春碱类化合物(见图1)。

实施例2长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231迁移能力的抑制作用

实验方法：取对数生长期的mda-mb-231细胞，pbs清洗离心，重悬细胞于无血清培养基中。将2×10⁴个/ml的细胞接种于transwell小室，每孔100μl，设置空白对照组、tgf-β1(tgf-β12ng/ml)组和加药组，加药组为bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)与tgf-β1(2ng/ml)共同处理，下室加入700μl含10％新生牛血清的1640培养液。置37℃、含5％co2的细胞培养箱中，培养48h后，弃去培养液，用pbs清洗一次，4％多聚甲醛室温固定30分钟，用吉姆萨染料着色30分钟，用棉棒将小室上层膜上的细胞擦去，pbs清洗一次，显微镜观察并计算细胞数目。

实验结果：与空白对照组相比，tgf-β1组显著增加了人乳腺癌细胞mda-mb-231的迁移作用；与因子组对比，长春碱类衍生物明显抑制了人乳腺癌细胞mda-mb-231的迁移作用，其药效优于长春碱类化合物(见图2)。

实施例3长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231水平运动能力的抑制作用

实验方法：取对数生长期的mda-mb-231细胞，pbs清洗，消化。将5×10⁵个/ml的细胞接种于六孔板，待细胞密度达90％时，用无血清培养基饥饿8h，10μl移液器划十字交叉痕，pbs冲洗，拍照，设置空白对照组、tgf-β1(tgf-β12ng/ml)组和加药组，加药组为bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)与tgf-β1(2ng/ml)共同处理，8h后相同视野拍照。结果使用imageplus5软件统计，求平均值，并计算迁移的细胞数目。

实验结果：与空白对照组相比，tgf-β1组显著增加了人乳腺癌细胞mda-mb-231的水平运动能力；与tgf-β1组对比，长春碱类衍生物明显抑制了人乳腺癌细胞mda-mb-231的水平运动能力，其药效优于长春碱类化合物(见图3)。

实施例4长春碱类衍生物对tgf-β1诱导的人乳腺癌细胞mda-mb-231上皮间质转化相关蛋白表达的影响

实验方法：取对数生长期的mda-mb-231细胞，设置空白对照组、tgf-β1(tgf-β12ng/ml)组和加药组，加药组用bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj(6.25nm)处理48小时后，tgf-β1组和加药组同时加入tgf-β1(2ng/ml)，作用1小时。用ripa裂解液裂解细胞蛋白；进行bca蛋白定量；取40～50μg蛋白样品进行sds-page凝胶电泳，根据分子量大小的不同对蛋白进行分离；将胶上的蛋白条带转移到pvdf膜上；将蛋白条带置于5％的牛血清白蛋白(bsa)中进行封闭；孵育一抗(购买于cellsignalingtechnology，cst)：按照体积比1:1000稀释上皮细胞钙粘蛋白，波形蛋白，n-钙粘蛋白，4℃孵育过夜；孵育二抗(购买于cellsignalingtechnology，cst)；用ecl显色液a和b显出蛋白条带，并用quantityone软件进行灰度分析。

实验结果：与空白对照组相比，tgf-β1组上皮细胞钙粘蛋白表达下降；n-钙粘蛋白和波形蛋白的表达升高。与tgf-β1组相比，给药组上皮细胞钙粘蛋白的表达增高；n-钙粘蛋白和波形蛋白的表达下降；表明长春碱类衍生物作用后，可显著抑制tgf-β1诱导的上皮标志物上皮细胞钙粘蛋白表达降低，同时抑制间质标志物n-钙粘蛋白和波形蛋白表达升高，长春碱类衍生物抑制上皮间质转化相关蛋白的作用优于长春碱类化合物(见图4)。

实施例5长春碱类衍生物对mda-mb-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤肺转移的抑制作用

实验方法：将处于对数生长期的mda-mb-231细胞消化，用预冷pbs稀释的matrigel基质胶(体积比1:1稀释)重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/ml后，按0.15ml/只接种于6周龄雌性balb/cnu/nu裸鼠(购买于广东省医学实验动物中心)左侧乳腺脂肪垫内。待瘤块长至100mm³～200mm³大小，将裸鼠随机分为9组，每组10只，分别为生理盐水，bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj组，尾静脉注射给药，给药剂量为2μmol/kg。隔天给药1次，连续给药10次后结束实验，裸鼠经心脏采血后，剥取肿瘤组织和肺组织。裸鼠肺组织采用苏木精-伊红染色，分析转移灶的大小和数目。肺组织用abc法免疫组化染色。以上皮细胞钙粘蛋白作为上皮细胞标志性蛋白，n-钙粘蛋白和纤粘蛋白作为间质细胞标志物，分析它们在空白对照组和给药组小鼠肺组织的表达情况。裸鼠肿瘤组织取一半匀浆、裂解组织蛋白，用westernblotting的方法分别检测裸鼠肿瘤组织中上皮细胞钙粘蛋白，n-钙粘蛋白和波形蛋白的表达情况。

实验结果：长春碱类衍生物显著抑制了裸鼠乳腺癌上皮间质转化作用，进而抑制了裸鼠mda-mb-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤的肺转移；其药效优于长春碱类化合物(见图5)。

实施例6长春碱类衍生物对裸鼠mda-mb-231乳腺癌转移的抑制作用

实验方法：将处于对数生长期的mda-mb-231细胞消化，重悬于无血清的dmem空白培养基内，调整细胞密度为1×10⁷个/ml后，按0.1ml/只尾静脉注射到6周龄雌性balb/cnu/nu裸鼠。两周后，将裸鼠随机分为9组，每组10只，分别为生理盐水，bx-ccj，bx-ccrb，bx-ccfn，bx-ccxj，ccj，ccrb，ccfn，ccxj组，给药剂量为2μmol/kg。隔天尾静脉给药1次，连续给药10次后结束实验，裸鼠经心脏采血后，剥取肺组织，裸鼠肺组织采用苏木精-伊红染色，分析转移灶的大小和数目。用abc法免疫组化染色。以上皮细胞钙粘蛋白作为上皮细胞标志性蛋白，n-钙粘蛋白和纤粘蛋白作为间质细胞标志物，分析它们在空白对照组和给药组小鼠肺组织的表达情况。取一半裸鼠肺组织匀浆、裂解组织蛋白，用westernblotting的方法检测裸鼠肺组织中上皮细胞钙粘蛋白，n-钙粘蛋白和波形蛋白的表达情况(见图6)。

实验结果：长春碱类衍生物显著抑制了裸鼠乳腺癌上皮间质转化作用，进而抑制了裸鼠乳腺癌mda-mb-231的肺转移，其药效优于长春碱类化合物。

上述实验结果揭示了本发明所述长春碱类衍生物在体内外可显著地抑制乳腺癌的转移，可应用于乳腺癌转移早期和晚期的治疗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。