山茶皂苷A（CamelliosideA）的应用的制作方法

本发明涉及一种山茶皂苷a(camelliosidea)的应用，属功效性化妆品技术领域。

背景技术：

皮肤内黑色素含量直接决定肤色深浅，黑色素由黑素细胞合成与分泌。受遗传、紫外线等因素的影响，可导致黑色素代谢异常，黑素细胞分泌的黑色素增加，造成局部皮肤变黑，引起黄褐斑、雀斑、老年斑和炎症后色素沉着等。

黑素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶、多巴色素互变酶、二羟基吲哚酸氧化酶等酶和蛋白作用下经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化成为黑色素。酪氨酸酶(tyr)及酪氨酸酶相关蛋白1(trp-1)影响黑素细胞合成黑素的关键酶。抑制酪氨酸酶活性，降低酪氨酸酶相关蛋白1的表达均能减少黑色素的合成。

紫外线辐射是皮肤物理性损伤的主要因素，尤其是中波紫外线(uvb)，可导致皮肤炎症、色素沉着、老化、皮肤癌。uvb主要作用于表皮角质形成细胞，增加其活性氧族(ros)的产生，引起一系列氧化性损伤，导致sod)含量下降，非酶自由基清除剂耗竭，过氧化最终产物丙二醛(mda)大量积累，而损伤的皮肤抗氧化防御体系会导致更多ros的产生，以正反馈形式加剧皮肤组织和细胞的损伤。超氧化物歧化酶对机体的氧化和抗氧化平衡起到了非常重要的作用，能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤，sod的活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力；mda的量常反应机体脂质过氧化的程度，mda的高低间接反映了细胞受自由基攻击的严重程度。

山茶(camelliajaponica)属于山茶科(theaceae)山茶属(camellia)植物，其分布于云南、四川、台湾、山东、江西等省区。灌木或小乔木，高9米，嫩枝无毛。除了作为著名的观赏植物外，还有一定的药用价值。其性偏凉，味辛、苦，无毒；具有散瘀消肿，止血凉血之功效；可用于治疗血崩，吐血等出血症，及烫伤和跌打损伤等症。目前未见有抑制黑素细胞酪氨酸酶活性、降低trp-1表达及对紫外线照射细胞的抗氧化作用的公开报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种山茶皂苷a(camelliosidea)的应用。

本发明是这样实现的：

1、制备山茶植物活性化合物

本发明的山茶植物活性化合物为山茶皂苷a(camelliosidea)，经由如下步骤得到：

a.选用山茶(camelliajaponical.)，将5kg干燥的山茶枝叶粉碎，分别用75％乙醇热回流提取3次，时间依次分别为：3h、2h、2h，合并提取液，减压回收乙醇，得到粗提物。粗提物溶解于水中，经d-101大孔树脂柱层析，分别用水、80％乙醇和95％乙醇洗脱。回收溶剂得到80％乙醇洗脱部分和95％乙醇洗脱部分。

b.将80％乙醇洗脱部分用乙醇溶解后，用400g硅胶(80-100目)拌样，2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，tlc检测后合并后得到三部分(fr.1-3)。经过薄层层析tlc检测，发现fr.3富含三萜皂苷类成分，因此主要对fr.3(90g)进行分离纯化。用mcigelchp20p树脂柱对fr.3脱色，乙醇-水梯度洗脱(30％→40％→50％→60％→70％→100)，皂苷集中在50-70％洗脱部位；再通过硅胶柱层析进行湿法装柱上样，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，得到山茶皂苷a(camelliosidea)粗品。粗品溶解于乙醇-水(2:1)中，得到结晶，再次重结晶后，过滤结晶，得到98％的山茶皂苷a(得率：0.06％)。

2、黑素细胞酪氨酸酶抑制率的测定

取对数生长期的小鼠黑素瘤b16细胞，消化，计数，将细胞接种于96孔板，接种密度为10⁴个/孔，过夜后弃去培养液，分别加入100μl/孔的药液，阴性对照组为含溶剂dmso的培养液，空白对照组为无细胞含相应溶剂dmso的培养液，分别在37℃、5％co2细胞培养箱中培养72小时后，弃上清液，pbs洗涤2次，每孔加入50μl含1％tritonx-100的pbs，低速震荡30min，放置于-80℃冰箱中1h，取出后37℃水浴40min，黑素细胞完全裂解。每孔加入100μl浓度为0.1％l-dopa(pbs液配制)溶液，继续置于37℃孵育2h，用酶标仪测定在490nm处的吸光度。每组6孔，重复3次。

酪氨酸酶抑制率＝1-[(药物组平均吸光值-空白组平均吸光值)/(阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值)]×100％

3、酪氨酸酶相关蛋白(trp-1)表达的检测

取对数生长期的小鼠黑素瘤b16细胞，接种于培养瓶中，密度为5000个/cm²，过夜培养后弃去培养液，分别加入药液培养72h。消化离心，用pbs液洗涤3次，加入60ul/瓶细胞裂解液(含1％pmsf、1％磷酸酶抑制剂)，震荡30min，使细胞充分裂解。匀浆离心，根据bca法测定蛋白质浓度。根据测定的蛋白浓度，计算蛋白上样量上样，进行sds-聚丙烯酰氨凝胶电泳，120v，电泳90min后将蛋白质转移到pvdf膜上，2.5a，13min。取膜，封闭液室温封闭2h，分别加入(1:200)多克隆兔抗鼠酪氨酸酶相关蛋白1(trp-1)抗体和(1:2000)内参gapdh，4℃过夜。洗膜后，加入(1:5000)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，室温轻摇1h。充分洗膜后，做化学发光(ecl)，显影，采用凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行分析。计算所测目标蛋白/gapdh比值，得到目标蛋白的相对含量。

4、黑素细胞中黑素合成的检测

取对数生长期的小鼠黑素瘤b16细胞接种于24孔板，过夜培养，弃去培养液，分别加入1ml/孔的药液，阴性对照组为含溶剂dmso的培养液，空白对照组为无细胞含相应溶剂dmso的培养液，分别在37℃、5％co2细胞培养箱中培养72小时后，弃上清，pbs洗涤2次，加入含1mnaoh溶液120ul/孔，80℃，水浴2h。将溶解液体吹匀转移至96孔板中(100ul/孔)，用酶标仪测定在405nm处的吸光度。每组3孔，重复3次。

黑素合成抑制率＝1-[(药物组平均吸光值-空白组平均吸光值)/(阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值)]×100％

5、细胞中的抗氧化能力评价

对数生长期的角质形成细胞hacat，以浓度为2×10⁵个/ml，接种于6孔培养板，每孔2ml，分组加药处理12h,撤去药液后加入pbs,以60mj/cm²的剂量照射uvb,24h后收集各组细胞，用4℃pbs洗2遍，反复冻融破碎细胞，将各管细胞悬液置于液氮中4s后，37℃水浴5min，按此操作反复冻融细胞4次，以充分破坏细胞并使其释放出细胞成分，4000r/min离心10min，收集上清液严格参照试剂盒说明分别测细胞内sod和mda水平。并用bca法测定各组细胞内的蛋白浓度。

本发明的山茶皂苷a(camelliosidea)在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。

本发明的有益效果在于：山茶植物活性化合物是生态化合物，成本低，具有抑制黑素合成和提高对uvb照射细胞的抗氧化能力，能够在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。

附图说明

图1为westernblot检测酪氨酸酶相关蛋白(trp-1)的表达。

图2显示与空白对照组相比，uvb照射的模型组中sod的活力。

图3显示与uvb模型组相比，加入山茶皂苷a的紫外照射组细胞中sod的活力。

具体实施方式：

下面结合附图，对本发明实施例来进一步说明本发明的实质内容。

实施例一：用常规方法制备山茶皂苷a(camelliosidea)

将5kg干燥的山茶枝叶粉碎，分别用75％乙醇热回流提取3次(3h,2h,2h)，合并提取液，减压回收乙醇，得到粗提物。粗提物溶解于水中，经d-101大孔树脂柱层析，分别用水、80％乙醇和95％乙醇洗脱。回收溶剂得到水洗脱部分、80％乙醇洗脱部分和95％乙醇洗脱部分。

80％乙醇洗脱部分，用乙醇溶解后，400g硅胶(80-100目)拌样，2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，tlc检测后合并后得到三部分(fr.1-3)。经过薄层层析tlc检测，发现fr.3富含三萜皂苷类成分，因此主要对fr.3(90g)进行分离纯化。用mcigelchp20p树脂柱对fr.3脱色，乙醇-水梯度洗脱(30％→40％→50％→60％→70％→100)，皂苷集中在50-70％洗脱部位；再通过硅胶柱层析进行湿法装柱上样，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，得到山茶皂苷a(camelliosidea)粗品。粗品溶解于乙醇-水(2:1)中，得到结晶，再次重结晶后，过滤结晶，得到纯的山茶皂苷a(得率：0.06％)。

试验中，¹h-nmr和¹³c-nmr的1d、2dnmr谱在avanceiii600mhz超导核磁共振仪上测定(tms为内标，化学位移δ用ppm表示，耦合常数j用hz表示)；ms在xevotq-s超高压液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪上测定；红外光谱(ir)在brukertensor-27红外光谱仪上测定(kbr压片)；柱层析用硅胶g(200-300目)或硅胶h(10-40μ)及薄层层析均为青岛海洋华工工厂产品。反相材料分离材料(rp-8及rp-18)和反相薄层板为merck公司产品。分析和半制备用agilent1260型高效液相色谱仪，半制备色谱柱为agilent公司的zorbax-sb-c18column(5μm；25×9.4mm)。薄层层析通过5％硫酸-乙醇溶液加热观察其斑点。

山茶植物活性化合物山茶皂苷a(camelliosidea)的化学结构式为：

山茶皂苷a(camelliosidea):无色方晶；c53h84o24；ir(kbr)νmax3423,2944,1712,1625,1077cm^-1；positiveesi-msm/z1127[m+na]⁺；¹h-nmr(c5d5n,600mhz)：δh3.27(1h,dd,j＝13.4,4.5hz,h-3),5.46(1h,brs,h-12),1.25(3h,s,me-23),1.12(3h,s,me-24),0.83(3h,s,me-25),1.22(3h,s,me-26),1.34(3h,s,me-27),0.91(3h,s,me-29),1.00(3h,s,me-30),4.94(1h,d,j＝7.0hz,h-1'),5.84(1h,d,j＝8.1hz,h-1”),5.79(1h,d,j＝7.9hz,h-1”'),5.19(1h,,d,j＝7.9hz,h-1””)；¹³cnmrdate(c5d5n,150mhz)见表1。结构解析表明该化合物为山茶皂苷a(camelliosidea)。

山茶皂苷a(camelliosidea)的碳谱数据(c5d5n,150mhz)

实施例二：活性成分山茶皂苷a抑制黑素细胞酪氨酸酶活性的能力

取对数生长期的小鼠黑素瘤b16细胞，消化，计数，将细胞接种于96孔板，接种密度为10⁴个/孔，过夜后弃去培养液，分别加入100μl/孔15μg/ml山茶皂苷a药液，阳性对照组为相同浓度的熊果苷溶液，阴性对照组为含溶剂dmso的培养液，空白对照组为无细胞含相应溶剂dmso的培养液，分别在37℃、5％co2细胞培养箱中培养72小时后，弃上清液，pbs洗涤2次，每孔加入50μl含1％tritonx-100的pbs，低速震荡30min，放置于-80℃冰箱中1h，取出后37℃水浴40min，黑素细胞完全裂解。每孔加入100μl浓度为0.1％l-dopa(pbs液配制)溶液，继续置于37℃孵育2h，用酶标仪测定在490nm处的吸光度。每组6孔，重复3次。

酪氨酸酶抑制率＝1-[(药物组平均吸光值-空白组平均吸光值)/(阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值)]×100％

表1提取物对b16细胞内酪氨酸酶活性的抑制率(n＝3，％)

注：*：与阴性对照组相比，p<0.05。

结果如表1所示：与阴性对照组相比，提取物山茶皂苷a及阳性对照物熊果苷在15ug/ml时可显著抑制b16细胞的酪氨酸酶活性，差异有统计学意义(p<0.05)；且山茶皂苷a的抑制率6.97％±3.15高于阳性对照熊果苷组4.96％±1.57。

本发明具有强的酪氨酸酶活性抑制作用。

实施例三：活性成分山茶皂苷a能降低酪氨酸酶相关蛋白(trp-1)的表达取对数生长期的小鼠黑素瘤b16细胞，接种于培养瓶中，密度为5000个/cm²，过夜培养后弃去培养液，分别加入15ug/ml山茶皂苷a、15ug/ml熊果苷或细胞培养基培养72h。消化离心，pbs液洗涤3次，加入60ul/瓶细胞裂解液(含1％pmsf、1％磷酸酶抑制剂)，震荡30min，使细胞充分裂解。匀浆离心，根据bca法测定蛋白质浓度。根据测定的蛋白浓度，计算蛋白上样量上样，进行sds-聚丙烯酰氨凝胶电泳，120v，电泳90min后将蛋白质转移到pvdf膜上，2.5a，13min。取膜，封闭液室温封闭2h，分别加入(1:200)多克隆兔抗鼠酪氨酸酶相关蛋白1(trp-1)抗体和(1:2000)内参gapdh，4℃过夜。洗膜后，加入(1:5000)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，室温轻摇1h。充分洗膜后，做化学发光(ecl)，显影，采用凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行分析。计算所测目标蛋白/gapdh比值，得到目标蛋白的相对含量。

结果如图1所示，与对照组(100％)相比，15ug/ml的山茶皂苷a处理组的酪氨酸相关蛋白1相对表达量降低至16.2％，显著低于同等浓度熊果苷处理组(52.3％)的表达，表明山茶皂苷a能够显著降低trp-1蛋白的表达。

本发明具有强的酪氨酸酶相关蛋白表达抑制作用。

实施例四：活性成分山茶皂苷a对黑素合成的抑制能力

取对数生长期的小鼠黑素瘤b16细胞接种于24孔板，过夜培养，弃去培养液，分别加入1ml/孔的含15ug/ml的山茶皂苷a药液，阳性对照组为相同浓度的熊果苷溶液，阴性对照组为含溶剂dmso的培养液，空白对照组为无细胞含相应溶剂dmso的培养液，分别在37℃、5％co2细胞培养箱中培养72小时后，弃上清，pbs洗涤2次，加入含1mnaoh溶液120ul/孔，80℃，水浴2h。将溶解液体吹匀转移至96孔板中(100ul/孔)，用酶标仪测定在405nm处的吸光度。每组3孔，重复3次。

黑素合成抑制率＝1-[(药物组平均吸光值-空白组平均吸光值)/(阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值)]×100％

表2提取物对b16细胞黑素合成的抑制率(n＝3，)

注：*：与阴性对照组相比，p<0.05；#：与阳性对照组相比，p<0.05。

结果发现：与阴性对照组相比，提取物山茶皂苷a及阳性对照物熊果苷可显著抑制b16细胞的黑素合成，差异有统计学意义(p<0.05)；并且，山茶皂苷a的抑制率显著高于阳性对照熊果苷组，差异有统计学意义(p<0.05)，见表2。

本发明具有强的黑素合成抑制能力。

实施例五：活性化合物茶皂苷a对uvb照射细胞的抗氧化能力

实验设置为空白对照组、uvb模型组、uvb+山茶皂苷a组。uvb+山茶皂苷a组角质形成细胞hacat于紫外线照射前12h加入15ug/ml山茶皂苷a，空白对照组和uvb模型组只加入相同量的dmem培养基。各组于紫外线照射前吸取培养基，再加入pbs覆盖。以uvb(波长280-320nm)照射，照射剂量为60mj/cm²。空白对照组用锡箔纸遮住，辐照结束后弃去pbs液，再分别加入dmem培养基，继续培养。

对数生长期的hacat细胞，以细胞浓度为2×10⁵个/ml，接种于6孔培养板，每孔2ml，分组与处理如上所述。uvb照射24h后收集各组细胞，用4℃pbs洗2遍，反复冻融破碎细胞，将各管细胞悬液置于液氮中4s后，37℃水浴5min，按此操作反复冻融细胞4次，以充分破坏细胞并使其释放出细胞成分，4000r/min离心10min，收集上清液严格参照试剂盒说明分别测细胞内sod和mda水平。并用bca法测定各组细胞内的蛋白浓度。

图2结果显示：与空白对照组相比，uvb照射的模型组中sod活力显著降低(p<0.01),mda活力显著升高(p<0.01)，表明uvb辐射对hacat造成明显损伤，uvb组造模成功。

图3结果显示：与uvb模型组相比，加入山茶皂苷a的紫外照射组细胞中sod活力明显提高(p<0.05)，差异具有统计学意义；而反应细胞受损程度的mda含量在加入山茶皂苷后却降低(p<0.01)。

本发明具有抗氧化能力，能够减轻细胞受损程度。