女贞子糖苷富集物及其用途的制作方法

本发明涉及一种女贞子糖苷富集物，此外，本发明还涉及前述女贞子糖苷富集物的医药用途。

背景技术：

甲状旁腺功能减退症(甲旁减)是由于甲状旁腺激素(pth)分泌减少和(或)功能障碍而引起的钙磷代谢异常，一旦发生，将对患者的生活质量造成严重影响。颈部手术致甲状旁腺损伤或者误切是继发性甲旁减最常见的原因。甲状腺切除的范围越大，甲旁减的发生率就越高。甲旁减低血钙时，神经肌肉兴奋性增加，可出现肌肉痉挛、手足抽搐与惊厥，重者威胁生命；骨质缺钙表现为骨质软化和疏松；对离子内流的膜屏障作用减少，心肌兴奋性和传导性升高。

中国专利cn104800564a于2015-07-29公开了一种治疗血虚不荣型甲状旁腺功能减退症的中药组合物，由下列重量配比的药材制成：滇南鸟足兰20份、山毛藓22份、首乌藤12份、龙眼肉12份、白花油麻藤30份、川山橙根20份、二色补血草25份、阿胶8份、鸡掌七6份、玉溪天仙藤8份、毛大丁草12份、缬草6份、崖棕根10份、叶底红24份、夏至草10份、通天蜡烛12份、千针万线草20份。

目前，临床上常见的治疗方法有以补钙为主的内科治疗和细胞、组织移植为主的外科治疗。钙剂、维生素d治疗甲旁减，虽能纠正低钙血症，但较难获得稳定的钙磷平衡，存在尿钙增多引起肾钙质沉积、甚至肾功能损害的危险；pth代替治疗法能够减少患者对钙剂和维生素d类似物的依赖，减少尿钙和降低肾钙化的风险，更好的提高患者的生活质量，但是价格昂贵，患者难以接受，同时，有诱发骨肉瘤的风险。外科治疗如细胞移植、组织移植以及基因治疗的临床应用也都存在局限性。中国专利cn104800564a公开的中药组合物组方复杂。因此，寻找安全、稳定的为机体提供pth的治疗方法，是当前研究的重点。

技术实现要素：

针对现有技术的上述不足，根据本发明的实施例，希望提供一种安全、稳定的为机体提供pth、对甲状旁腺功能减退症具有明显疗效的女贞子糖苷富集物。

根据实施例，本发明提供的一种女贞子糖苷富集物，其制备方法包括如下步骤：女贞子加10-14倍量体积浓度为50-80％的乙醇，回流提取1-3h，滤过，药渣再加6-10倍量体积浓度为50-80％的乙醇，回流提取1-3h，滤过，合并两次滤液，回收溶剂，加适量乙酸乙酯萃取，舍弃乙酸乙酯层，水层加水饱和正丁醇萃取，合并水饱和正丁醇层，浓缩，真空干燥，即制得女贞子糖苷富集物。

根据一个实施例，本发明前述女贞子糖苷富集物，其制备方法包括如下步骤：3kg女贞子加12倍量体积浓度为70％的乙醇，回流提取1.5h，滤过，药渣再加8倍量体积浓度为70％的乙醇，回流提取1.5h，滤过，合并两次滤液，回收溶剂至3l，加乙酸乙酯萃取2次，每次3l，乙酸乙酯层舍弃，水层加水饱和正丁醇萃取3次，每次3l，合并水饱和正丁醇层，浓缩，真空干燥，即制得女贞子糖苷富集物。

随后的试验例将证明，本发明女贞子糖苷富集物能显著提高甲状旁腺细胞培养液pth分泌量，研究结果发现，工具药nps-2143迅速提高ovx小鼠血清pth水平，给药1小时后达到峰值，此后，开始降低；女贞子糖苷富集物较nps-2143，缓慢提升血清pth含量，给药2小时后达到峰值，此后，缓慢降低，并略高于nps-2143处理组。由于血清pth的含量变化直接受甲状旁腺casr的表达调控。糖尿病组大鼠甲状旁腺casr的基因、蛋白表达都显著上调，而经女贞子糖苷富集物处理后，甲状旁腺casr的基因、蛋白(如图7所示，p<0.01)的表达基本恢复至正常水平(非糖尿病组)。本发明女贞子糖苷富集物对甲状旁腺功能减退症具有明显疗效。

附图说明

图1是本发明女贞子糖苷富集物的制备流程图。

图2是女贞子糖苷富集物与正常(溶剂)对照组提高甲状旁腺细胞培养液pth分泌量的变化趋势图。

图3是女贞子糖苷富集物促进去卵巢小鼠pth分泌示意图。

图4是糖尿病大鼠经女贞子糖苷富集物处理4周后，血清pth含量变化图。

图5是各实验组甲状旁腺的大小变化示意图。

图6是糖尿病组大鼠甲状旁腺casr的基因表达图。

图7是糖尿病组大鼠甲状旁腺casr的蛋白表达图。

图8是女贞子糖苷富集物(a-h)对甲状旁腺细胞分泌pth的影响变化趋势图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。

本发明以下实施例中，未特别标示的实验方法，为本领域通用的实验方法。

本发明以下实施例中，未特别标示的实验动物和试剂，均为市售的或按照本领域通用方法培养获得的。

女贞子是天然药物。

实施例1--女贞子糖苷富集物的制备方法

如图1所示，3kg女贞子加12倍量体积浓度为70％的乙醇，回流提取1.5h，滤过，药渣再加8倍量体积浓度为70％的乙醇，回流提取1.5h，滤过，合并两次滤液，回收溶剂至3l，加乙酸乙酯萃取2次，每次3l，乙酸乙酯层舍弃，水层加水饱和正丁醇萃取3次，每次3l，合并水饱和正丁醇层，浓缩，真空干燥，即得女贞子糖苷富集物，备用，用于随后的试验例。

实施例2--女贞子糖苷富集物的其它制备

将实施例1中的乙醇浓度、体积量、回流时间三个因素的量值进行调整、组合(如下表1所示)，其它制备方法不变，制得女贞子糖苷富集物a-h。

表1

试验例1--女贞子糖苷富集物促进甲状旁腺细胞分泌pth

无菌手术切取wistar大鼠双侧甲状旁腺。将组织置入rpmi1640培养液中漂洗，吸除培养液，剪成lmmxlmmxlmm的碎块。加入2.5％的胶原酶在37℃恒温水浴中振荡消化10min。然后用hank’s液洗2遍。再以0.25％的胰蛋白酶消化5min，rpmi1640(含15％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100g/ml)培养液终止消化。离心去上清后，移入含rpmi1640培养液的培养瓶中。培养瓶置于37℃内的培养箱中(95％空气，5％co2)恒温培养。

加入女贞子糖苷富集物处理甲状旁腺细胞，分别于处理后第1、3、5、7天，收集细胞培养液，测定其中pth含量。如图2所示，药物处理组与正常(溶剂)对照组具有类似的变化趋势。与溶剂对照组相比，随着处理时间延长，女贞子糖苷富集物显著提高甲状旁腺细胞培养液pth分泌量，且在第5天达到最高值。

试验例2--女贞子糖苷富集物促进去卵巢小鼠pth分泌

去除c57bl/6雌性小鼠双侧卵巢，恢复7天后，分别给予去卵巢(ovx)小鼠阳性药nps-2143(i.p)、女贞子糖苷富集物(i.g)，并在以下时间点0、0.5、1、2、3、4小时，收集动物血清，采用小鼠特异性elisa试剂盒(immutopics,inc.,sanclemente,ca,usa)测定pth含量。研究结果发现(如图3所示)，工具药nps-2143迅速提高ovx小鼠血清pth水平，给药1小时后达到峰值，此后，开始降低；女贞子糖苷富集物较nps-2143，缓慢提升血清pth含量，给药2小时后达到峰值，此后，缓慢降低，并略高于nps-2143处理组。

试验例3--女贞子糖苷富集物提高1型糖尿病大鼠pth分泌

3月龄雄性sd大鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)单次腹腔注射链脲菌素(stz,60mg/kg)，非糖尿病组大鼠注射溶解stz的柠檬酸钠缓冲液。一周后，使用罗氏血糖仪，尾静脉取血测定空腹血糖，大于13mmol/l列为糖尿病组。实验期间，一组糖尿病大鼠灌胃溶剂对照(双蒸水)，一组糖尿病大鼠灌胃女贞子糖苷富集物(500mg/kg)。4周后，腹主动脉取血，分离血清。取甲状旁腺，分别进行he染色以及钙敏受体(casr)的基因、蛋白检测。

如图4所示，糖尿病组大鼠血清甲状旁腺激素(pth)水平显著降低(p<0.05)。糖尿病大鼠经女贞子糖苷富集物处理4周后，血清pth含量显著提高(p<0.05)。如图5所示，各实验组甲状旁腺的大小没有发生明显变化，即女贞子糖苷富集物并没有引起甲状旁腺增殖效应，在该实验剂量下安全。

由于血清pth的含量变化直接受甲状旁腺casr的表达调控。糖尿病组大鼠甲状旁腺casr的基因(如图6所示，p<0.01)、蛋白(如图7所示，p<0.01)表达都显著上调，而经女贞子糖苷富集物处理后，甲状旁腺casr的基因(如图6所示，p<0.01)、蛋白(如图7所示，p<0.01)的表达基本恢复至正常水平(非糖尿病组)。

试验例4--女贞子糖苷富集物(a-h)对甲状旁腺细胞分泌pth的影响

甲状旁腺细胞的取材、体外培养同试验例1。分别加入女贞子糖苷富集物(a-h),处理甲状旁腺细胞，分别于处理后第1、3、5、7天，收集细胞培养液，测定其中pth含量。如图8所示，药物处理组与正常(溶剂)对照组具有类似的变化趋势。与溶剂对照组相比，随着处理时间延长，女贞子糖苷富集物(a、f除外)都能够一定程度上提高甲状旁腺细胞培养液pth分泌量，且在第5天达到最高值。相比于实施例1制备的女贞子糖苷富集物，a-h提高甲状旁腺细胞分泌pth的作用都相对较弱。