一种治疗退行性骨关节病的注射剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种治疗退行性骨关节病的注射剂及其制备的方法。

背景技术：

退行性骨关节病，即退行性变关节炎、增生性关节炎、老年性关节炎等，是一种由于关节软骨退行性变，引起关节软骨完整性破坏及关节边缘软骨下骨板病变，继而导致关节症状和体征的一组慢性退行性关节疾病。包括骨刺、骨质增生、罗圈腿、颈椎病、髌骨软化、腰椎病等。据who统计，50岁以上的人群中，骨关节炎的发病率为50％，55岁以上人群中发病率为80％。我国65岁以上人群中发病率高达60％-70％。根据who预测，到2015年中国骨病患者将达到1.5亿。骨关节炎已成为导致人类残疾的第一大疾病，称为“不死的癌症”。退行性骨关节病可分为原发性和继发性两类：原发性退行性骨关节病多发生于中老年，无明确的全身或局部诱因，与遗传和体质因素有一定的关系，继发性退行性骨关节病可发生于青壮年，继发于创伤、炎症、关节不稳、慢性反复的积累性劳损或先天性疾病等。主要症状为关节疼痛及压痛，负重关节及双手最易受累。目前治疗主要包括物理治疗：按摩、推拿、针灸、红外线、离子导入等；手术治疗：适于关节严重畸形者；对症治疗：非甾体类药物；氨糖疗法：修复损伤软骨，减轻疼痛等。以上治疗方法疗效均不理想，有些疗法副作用很大。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点而备受关注：(1)多向分化，在体内/外特定条件下诱导可分化成脂肪、骨、软骨、肌腱、肌肉、韧带、神经、肝脏、心肌、内皮等多种组织细胞，可连续传代和冷冻后仍具有多向分化能力；(2)免疫调控，mscs表达mhc-i类分子，不表达cd80，cd86，hla-dr等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，可用于器官移植后的排异反应及造血干细胞移植后的移植物抗宿主病；(3)自我复制，mscs作为干细胞可进行自我复制，体外扩增，可以用作基因治疗的干细胞平台。

目前mscs多来源于成人骨髓，但成人来源的mscs细胞数量、分化能力会随着年龄的增长而下降，且有诸多不可控风险，且临床取材复杂，损伤性大，研究发现，mscs在人胎儿和生后多组织广泛存在，但脐带来源最广泛，取材方便，对供体无影响，人脐带间充质干细胞是组织工程理想的种子细胞。因为其除具有取材方便，来源广，数量充足，增殖能力强，长期传代不改变，分泌具有合适构成的细胞外基质等特点。此外还具有以下优点：1、采集脐带对产妇和新生儿没有任何危害及损伤；2、干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力；3、免疫细胞较为幼稚，功能活性低，免疫功能不够成熟，处于一种缄默状态，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；4、不会有肿瘤细胞，病毒和病原微生物的感染及传播几率也相对较低；5、不涉及社会、伦理及法律方面的更多争议。近年来，国内外学者对人脐带间充质干细胞进行研究并取得了一定成果。脐带间充质干细胞有望取代骨髓间充质干细胞成为组织工程更好的研究对象。足量有分化潜能的细胞是组织工程的先决条件，随着新型生物材料和生物反应器的出现及发展，种子细胞在体外的大量扩增成为可能。这可以从根本上解决组织工程中种子细胞数量少的难题。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种治疗退行性骨关节病的注射剂及其制备方法，以克服现有治疗方法的不足，本发明的目的在于提供一种立即见效、疗效持久、患者满意度更高的治疗退行性骨关节病的注射剂。本发明的另一个目的是提供这种注射剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤一，注射用人脐带间充质干细胞的制备

a、取足月妊娠，经检查无传染病的健康产妇的新生儿脐带，将其用pbs清洗干净，剪碎，加入胶原酶消化，所述胶原酶的加入量为1-4g/l，消化温度为37℃，消化时间为30分钟-90分钟，优选地为60分钟；

b、加入10-30g/l胰酶再次消化，消化温度为37℃，消化时间为30分钟-90分钟，优选地为30分钟；

c、用200目筛网过滤步骤b未消化脐带组织后，加入pbs中和，消化液与pbs比为1：10-1：15，优选地为1：12；

d、将步骤c中经过中和后的液体进行离心获得细胞，离心转速为1000转/分钟至3000转/分钟，离心时间为10分钟至20分钟；将经过离心获得的细胞接种于培养皿进行细胞培养，4天后全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每周半量换液2次；

步骤二，注射剂的制备

将步骤一所得到的经过培养好的细胞进行收集，添加细胞溶液制得治疗退行性骨关节病的注射剂；

2、如权利要求1所述的一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于所述注射剂的间充质干细胞含量为4000万个。

3、如权利要求1所述的一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于步骤一a中所述剪碎的尺寸为组织块大小为0.05mm-2mm，优选地为1.5mm；所述胶原酶的加入量为2g/l。

4、如权利要求1所述的一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于步骤一b中胰酶的加入量为25g/l。

5、如权利要求1所述的一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于步骤一d中离心转速优选地为2000转/分钟，离心10分钟。

6、如权利要求1所述的一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于步骤一d中所用培养皿的培养基为无血清培养基，该无血清培养基中的皮生长因子和成纤维生长因子的含量各为2纳克/毫升至5纳克/毫升，优选为4纳克/毫升，无血清培养基中的氢化可的松含量为0.2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升，肝素的含量为5至20微克/毫升，优选为15微克/毫升。

7、如权利要求1所述的一种治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，其特征在于步骤二中所用的细胞溶液为生理盐水、林格氏液、复方电解质注射液或者基液。

8、一种治疗退行性骨关节病的注射剂，其特征在于采用该注射剂采用如权利要求1-4所述的方法制备得到。

有益效果：

该注射剂是一种立即见效、疗效持久、患者满意度更高的治疗退行性骨关节病的注射剂。

附图说明

图1是培养成功的脐带间充质干细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；

图2是本发明的一个具体实施例的治疗退行性骨关节病的脐带间充质干细胞注射剂的包装照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下面进一步详细说明本发明所提供的治疗退行性骨关节病的注射剂的制备方法，但本发明并不因此而受到任何限制。(1)取足月妊娠，经检查无传染病的健康产妇的新生儿脐带，放入含有双抗的组织保存液中，在采集后24小时内进行处理；(2)剪除脐带两侧受损伤的脐带组织，及含双抗的pbs反复清洗脐带外周及脐静脉内腔；(3)将处理后的脐带组织用手术剪剪碎，组织块大小为0.05mm-2mm，优选地为1.5mm；(4)加入2g/l胶原酶进行消化,消化温度为37℃，消化时间为30分钟-90分钟，优选地为60分钟；(5)加入25g/l胰酶消化，消化温度为37℃，消化时间为30分钟-90分钟，优选地为30分钟；(6)用200目筛网过滤未消化脐带组织后，加入pbs中和，消化液与pbs比为1：10-1：15，优选地为1：12；(7)离心获得细胞，离心转速为1000转/分钟至3000转/分钟，离心时间为10分钟至20分钟，优选地为2000转/分钟，离心10分钟；(8)接种于培养皿进行细胞培养，4天后全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每周半量换液2次，所用培养基为无血清培养基，加入上皮生长因子、成纤维生长因子，含量各为2纳克/毫升至5纳克/毫升，优选为4纳克/毫升，加入氢化可的松和肝素，所述氢化可的松在培养液中的含量可以为0.2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量可以为5至20微克/毫升，优选为15微克/毫升。上述的培养液和生长因子及活性材料可以是选自一个公司或者多个公司(如美国的cascade公司、sigma公司、hyclne公司等)的市售产品；(9)将培养好的足量的细胞进行收集，检测，制备成注射用人间充质干细胞注射液，所用细胞溶液为生理盐水、林格氏液、复方电解质注射液或者基液，优选地为复方电解质注射液。每100ml复方电解质注射液的细胞含量为2000万个至8000万个，优选地为4000万个；(10)将制备好的脐带间充质干细胞注射液在8小时至24小时内输注给需要治疗的退行性骨关节病患者，优选地为12小时内进行输注；(11)进行治疗后的观察与评估，包括进行疗效评估(结合临床)，副反应观察。

所述细胞溶液选用的基液的制备方法包括以下步骤：

(1)、将透明质酸钠溶于去离子水中制成浓度为1-2wt％透明质酸钠水溶液，胶原蛋白溶于去离子水中制成浓度为3-5wt％胶原蛋白水溶液，几丁糖溶于去离子水中制成浓度为0.1-2wt％几丁糖水溶液；

(2)、交联反应

将透明质酸钠水溶液、胶原蛋白水溶液、几丁糖水溶液混合，加入壳聚糖、氯化钙、硫酸氨基葡萄糖和聚氰基丙烯酸正丁酯(所述透明质酸钠、胶原蛋白、几丁糖、壳聚糖、氯化钙、硫酸氨基葡萄糖和聚氰基丙烯酸正丁酯的质量比为1-2：3-5：0.1-2：1-3：0.5-1：1-4：0.5-1)，经过超声分散15-40min得到悬浊液，分散完毕后加入0.01-0.03wt％京尼平和0.5-1wt％聚乙烯醇进行交联反应，再次搅拌3-8h得到经过交联的溶液；

(3)、步骤二中经过交联的溶液加入0.2-0.8wt％氯化钠和ph调节剂得到ph值为5-9混合液的；

(4)、纳米粉体的制备

将步骤三得到的混合液进行冷冻干燥，该冷冻干燥是在-60～-70℃，0.5～0.1pa条件下进行真空冷冻干燥，得到粒径为10-1000nm的纳米颗粒；

将得到的纳米粉体用高压均质使的粒径达到5-100nm，且10-50nm的颗粒占比为60％以上，所述高压均质过程中的均质压力为100至1500bar；高压均质过程中的均质循环为50-1000个循环；

(5)、基液的制备

将步骤四得到的纳米颗粒、抗菌活化剂和去离子水充分混合后，采用钴-60进行辐照灭菌得到基液；所述纳米颗粒、抗菌活化剂和去离子水的质量比为1-5：0.01-0.1：100-150；钴-60辐照灭菌强度为10～30kgy；照射时间为10～30分钟。

步骤(1)中所述的透明质酸钠的相对分子质量为1.0×10⁶～2.0×10⁶da。

步骤(3)中所述的ph调节剂选自氢氧化钠、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等；所得到的混合液的ph值更优为6-8，最优选为6.5-7.0。

步骤(4)中高压均质过程中的均质压力优选300-1000bar；高压均质过程中的均质循环优选为100至600个循环。

步骤(5)中所述抗菌活化剂由溴化十二烷基二甲基苄基铵和1,6-双(正-对氯苯双胍)己烷以质量比为1-2:0.5混合得到；所述钴-60辐照灭菌强度优选为20～25kgy；照射时间优选为15～20分钟。

下面结合实施例进一步详细说明本发明所提供的治疗退行性骨关节病的注射剂及其制备方法。

实施例1：

细胞的分离培养

(1)将处理后的脐带组织用手术剪剪碎，组织块大小为0.05mm；(2)加入2g/l胶原酶进行消化,消化温度为37℃，消化时间为30分钟；(3)加入25g/l胰酶消化，消化温度为37℃，消化时间为消化时间为30分钟；(4)用200目筛网过滤未消化脐带组织后，加入pbs中和，消化液与pbs为1：10；(5)离心获得细胞，离心转速为1000转/分钟，离心时间为10分钟；(6)接种于培养皿进行细胞培养，4天后全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每周半量换液2次，所用培养基为无血清培养基，加入上皮生长因子、成纤维生长因子，含量为2纳克/毫升，加入氢化可的松和肝素，氢化可的松在培养液中的含量为0.2微克/毫升；肝素在培养液中的含量为5微克/毫升；(7)将培养好的足量的细胞进行收集，检测，制备成注射用人间充质干细胞注射液，所用细胞溶液为生理盐水。每100ml生理盐水的细胞含量为2000万个；(8)将制备好的脐带间充质干细胞注射液在8小时内输注给需要治疗的退行性骨关节病患者；(9)进行治疗后的观察与评估，包括进行疗效评估(结合临床)，副反应观察。

实施例2：

(1)将处理后的脐带组织用手术剪剪碎，组织块大小为1.5mm；(2)加入2g/l胶原酶进行消化,消化温度为37℃，消化时间为60分钟；(3)加入25g/l胰酶消化，消化温度为37℃，消化时间为消化时间为30分钟；(4)用200目筛网过滤未消化脐带组织后，加入pbs中和，消化液与pbs为1：12；(5)离心获得细胞，离心转速为2000转/分钟，离心时间为15分钟；(6)接种于培养皿进行细胞培养，4天后全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每周半量换液2次，所用培养基为无血清培养基，加入上皮生长因子、成纤维生长因子，含量为4纳克/毫升，加入氢化可的松和肝素，氢化可的松在培养液中的含量为1微克/毫升；肝素在培养液中的含量为15微克/毫升；(7)将培养好的足量的细胞进行收集，检测，制备成注射用人间充质干细胞注射液，所用细胞溶液为林格氏液。每100ml林格氏液的细胞含量为3000万个；(8)将制备好的脐带间充质干细胞注射液在12小时内输注给需要治疗的退行性骨关节病患者；(9)进行治疗后的观察与评估，包括进行疗效评估(结合临床)，副反应观察。

实施例3：

(1)将处理后的脐带组织用手术剪剪碎，组织块大小为2mm；(2)加入2g/l胶原酶进行消化,消化温度为37℃，消化时间为90分钟；(3)加入25g/l胰酶消化，消化温度为37℃，消化时间为消化时间为90分钟；(4)用200目筛网过滤未消化脐带组织后，加入pbs中和，消化液与pbs为1：15；(5)离心获得细胞，离心转速为3000转/分钟，离心时间为20分钟；(6)接种于培养皿进行细胞培养，4天后全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每周半量换液2次，所用培养基为无血清培养基，加入上皮生长因子、成纤维生长因子，含量为5纳克/毫升，加入氢化可的松和肝素，氢化可的松在培养液中的含量为2微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量为20微克/毫升；(7)将培养好的足量的细胞进行收集，检测，制备成注射用人间充质干细胞注射液，所用细胞溶液为复方电解质注射液。每100ml复方电解质注射液的细胞含量为4000万个；(8)将制备好的脐带间充质干细胞注射液在24小时内输注给需要治疗的退行性骨关节病患者；(9)进行治疗后的观察与评估，包括进行疗效评估(结合临床)，副反应观察。

实施例4：

(1)将处理后的脐带组织用手术剪剪碎，组织块大小为2mm；(2)加入2g/l胶原酶进行消化,消化温度为37℃，消化时间为90分钟；(3)加入25g/l胰酶消化，消化温度为37℃，消化时间为消化时间为90分钟；(4)用200目筛网过滤未消化脐带组织后，加入pbs中和，消化液与pbs为1：15；(5)离心获得细胞，离心转速为3000转/分钟，离心时间为20分钟；(6)接种于培养皿进行细胞培养，4天后全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每周半量换液2次，所用培养基为无血清培养基，加入上皮生长因子、成纤维生长因子，含量为5纳克/毫升，加入氢化可的松和肝素，氢化可的松在培养液中的含量为2微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量为20微克/毫升；(7)将培养好的足量的细胞进行收集，检测，制备成注射用人间充质干细胞注射液，所用细胞溶液为基液。每100ml复方电解质注射液的细胞含量为4000万个；(8)将制备好的脐带间充质干细胞注射液在24小时内输注给需要治疗的退行性骨关节病患者；(9)进行治疗后的观察与评估，包括进行疗效评估(结合临床)，副反应观察。

基液的制备方法包括以下步骤：

(1)、将透明质酸钠溶于去离子水中制成浓度为1-2wt％透明质酸钠水溶液，胶原蛋白溶于去离子水中制成浓度为3-5wt％胶原蛋白水溶液，几丁糖溶于去离子水中制成浓度为0.1-2wt％几丁糖水溶液；

(2)、交联反应

将透明质酸钠水溶液、胶原蛋白水溶液、几丁糖水溶液混合，加入壳聚糖、氯化钙、硫酸氨基葡萄糖和聚氰基丙烯酸正丁酯(所述透明质酸钠、胶原蛋白、几丁糖、壳聚糖、氯化钙、硫酸氨基葡萄糖和聚氰基丙烯酸正丁酯的质量比为1-2：3-5：0.1-2：1-3：0.5-1：1-4：0.5-1)，经过超声分散15-40min得到悬浊液，分散完毕后加入0.01-0.03wt％京尼平和0.5-1wt％聚乙烯醇进行交联反应，再次搅拌3-8h得到经过交联的溶液；

(3)、步骤二中经过交联的溶液加入0.2-0.8wt％氯化钠和ph调节剂得到ph值为5-9混合液的；

(4)、纳米粉体的制备

将步骤三得到的混合液进行冷冻干燥，该冷冻干燥是在-60～-70℃，0.5～0.1pa条件下进行真空冷冻干燥，得到粒径为10-1000nm的纳米颗粒；

将得到的纳米粉体用高压均质使的粒径达到5-100nm，且10-50nm的颗粒占比为60％以上，所述高压均质过程中的均质压力为100至1500bar；高压均质过程中的均质循环为50-1000个循环；

(5)、基液的制备

将步骤四得到的纳米颗粒、抗菌活化剂和去离子水充分混合后，采用钴-60进行辐照灭菌得到基液；所述纳米颗粒、抗菌活化剂和去离子水的质量比为1-5：0.01-0.1：100-150；钴-60辐照灭菌强度为10～30kgy；照射时间为10～30分钟。

步骤(1)中所述的透明质酸钠的相对分子质量为1.0×10⁶～2.0×10⁶da。

步骤(3)中所述的ph调节剂选自氢氧化钠、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等；所得到的混合液的ph值更优为6-8，最优选为6.5-7.0。

步骤(4)中高压均质过程中的均质压力优选300-1000bar；高压均质过程中的均质循环优选为100至600个循环。

步骤(5)中所述抗菌活化剂由溴化十二烷基二甲基苄基铵和1,6-双(正-对氯苯双胍)己烷以质量比为1-2:0.5混合得到；所述钴-60辐照灭菌强度优选为20～25kgy；照射时间优选为15～20分钟。

采用自制的基液使得该注射剂具有如下优点：

1、基液中采用壳聚糖，一方面壳聚糖本身带有正电，通过与纳米颗粒的结合，通过两者相互作用，形成更小且更为致密的结构，便于细胞内吞形成吞噬泡，更加利于后期的骨关节病的治疗；，另外壳聚糖的结构与关节软骨中的结构氨基多糖结构上的相似性，增强了该系统在关节腔注射中的生物相容性；

2、本发明中采用了几丁糖，由于几丁糖具有一定的粘性，制备的纳米注射液结合脐带间充质干细胞可以在关节损伤处富集，富集的目的为一可以保护关节，二可以把有效的抗炎药包裹在里面，具有缓释作用，促进关节病的康复。药效相较于现有的关节治疗用的注射液作用时间更长，药效持久。

3、采用自制的基液中采用了高压均质进行进一步的减小颗粒粒径，使得在关节处富集的更加紧密；

4、该实施例所有的原料相互之间具有协同作用，经过大量实验得知相类似的原材料并不能够得到与本发明相同的技术效果，本发明所制备的注射剂具有较强的骨诱导能力，制备的注射液适用于关节腔使用，稳定性好、安全度高，可塑性强、生物相容性好。

实施例5：

细胞形态学观察与细胞生长周期采用本方法分离的原代细胞多在24小时内帖壁生长，培养一周后，倒置显微镜下可见细胞呈梭形，多角形，两周后为形态均一的梭形，平行排列或旋涡状生长，连续传代20代，细胞形态无明显变化。图1为传代一周的细胞排列照片及细胞生长曲线，图2为传代20代的细胞生长排列照片。第10-15天细胞密度达80％-90％，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状，辐射状排列，可以进行传代扩增培养。传代后细胞生长迅速，生长曲线呈s形，接种后第1-2天为潜伏适应期，从第3天起细胞开始增殖并进入对数生长期，第5、6天达到高峰。细胞在多次传代后仍具有较强的增殖能力。

实施例6：

临床治疗病例刘某某，男，50岁，于2014年11月在北京军区总医院确诊为双侧股骨头坏死，退行性骨关节病，现症状为双腿疼痛，走路时疼痛加重，需扶拐杖行走，于2015年3月来经北京军区总医院接受脐带间充质干细胞注射剂治疗，每次静脉输入此细胞注射剂100ml，20分钟内输完。使用后第二天感觉关节疼痛明显减轻，连用三次，每月一次，每次一袋(100ml胶带间充质干细胞注射剂)，疼痛症状消失，不需要扶拐杖走路。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。