本发明涉及含无机和有机有效成分的医药配制品，具体涉及含有纳米银和丹参酮iia的医用配制品。
背景技术：
中耳炎是指中耳组织结构的感染性或炎性疾病，影响着大量人群尤其是少年儿童的健康，是儿童仅次于上呼吸道感染的第二大常见疾病，欧美国家相关研究显示，6岁以下儿童约90％曾患中耳炎，也是美国抗生素使用的最常见原因。据估计，全世界范围内每年有7亿多的急性中耳炎病例和6500万至33000万的慢性分泌性中耳炎的急性发作。现今仍认为咽鼓管功能障碍、感染和免疫不健全是中耳炎的三大主要发病病因。其中感染是化脓性中耳炎的关键性发病病因，咽鼓管功能障碍以及免疫的不健全是属于机体的内源性病因，致病菌感染成为化脓性中耳炎最重要的外源性发病病因，如果没有感染这一因素，很少单独引起化脓性中耳炎。常见的中耳炎致病菌有金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等。
而且近来有越来越多的研究者发现细菌等病原菌在中耳炎中发挥重要作用，这也是中耳炎患者使用抗生素的理论基础。目前临床上主要采取全身给药与耳内给药或二者相结合的方式治疗中耳炎，一方面可单用抗生素滴耳液(氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素等)；另一方面联用抗生素和针对炎性症状的类固醇激素类药物(氯霉素可的松液等)。一些治疗指南推荐口服二线药物阿莫西林10天用于中耳炎治疗。但是阿莫西林用药时长较长，而且嗅味不佳，在一定程度上影响了患者服药的依从性。目前关于中耳炎患儿的抗生素使用仍存在滥用的现象，耐药菌株不断产生和增加，给中耳炎的治疗带来困难。而我国的细菌耐药情况由于抗生素的不合理使用显得尤为严重。另一方面诸如像卡那霉素、庆大霉素、新霉素和多粘菌素等药物对耳蜗和前庭会产生一定毒性，使中耳炎的治疗更加棘手。因而中耳炎治疗中抗菌、抗炎药物的使用和选择是显得异常重要。
银自中国古代就作为抗菌剂，单质银、硝酸银和磺胺嘧啶银等也早已被用作烧伤、外伤以及细菌感染的治疗。纳米银作为新一代的抗菌剂，在抗菌材料领域有着广阔的应用前景。近年来随着对纳米材料抗菌作用及其机理的不断深入研究，人们发现纳米材料通过多种途径作用于细菌。在诸多无机纳米抗菌材料中，纳米银因其较强的抗菌作用被广泛研究和使用。纳米银通过多种机制抗菌，降低了其产生耐药的可能性。银的抗菌活性来源于银离子，是银溶解在水溶液中的形式。这些银离子通过以下几种方式发挥抗菌作用。首先，银离子与细菌细胞壁和质膜的含硫和磷基团的蛋白相互作用。银离子与膜上带负电荷部分结合后在膜上开了孔洞，使得胞浆从胞内流出，可能导致细胞死亡。一旦进入细胞内，银离子表现出几种更强的抗菌作用：1)抑制微生物电子转移链上的细胞色素。2)结合并损伤微生物dna和rna。3)抑制微生物dna复制，从而抑制细胞分裂。4)使30s核糖体亚单位变性，从而阻碍蛋白质翻译过程。5)诱导产生活性氧，对微生物造成损害。6)抑制革兰氏阳性菌的细胞壁合成。
随着环境友好要求的构建，作为“绿色化学”方法生物合成纳米技术得到快速发展。采用此方法合成的纳米材料具有原料来源广，反应条件温和，产物不易团聚，以及安全无毒等优势。而通过微生物介导还原制备纳米银，作为新兴的纳米技术和生物技术的交叉应用，已受到越来越多的关注。目前，报道最多的用于合成的纳米银的微生物主要有细菌和真菌。
丹参酮iia是中药丹参中主要脂溶性有效成分之一，是发挥其药理活性的基础。它不仅对心血管系统、神经系统等均具有较强的药理活性，同时还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎以及抗菌抑菌作用，而丹参酮局部应用于中耳炎的治疗也有报道。丹参酮iia对多种细菌有抑制作用，其抑菌作用可能由其化学结构上存在氧化还原活性基团邻萘醌，通过形成超氧负离子而产生。
但是，单独使纳米银和丹参酮iia治疗中耳炎的效果不理想。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗中耳炎的药物组合物，该药物组合物可显著提高治疗中耳炎的效果。
本发明解决上述问题的技术方案为：
一种治疗中耳炎的药物组合物，该药物组合物由有效成分和医学上可接受的辅料组成，其特征在于，所述的有效成分由以下重量百分比的原料制成：纳米银30％-60％；丹参酮iia40％-70％；其中，所述的药物组合物是由以下方法制备得到：
将纳米银与壳聚糖制成复合物，再将丹参酮iia用羟丙基-β-环糊精包合成包合物，然后将所得到复合物与包合物混合制成常规的剂型。
上述药物组合物，其中所述原料的最佳配比为：纳米银50％，丹参酮iia50％。
上述方案中，所述复合物的制备方法如下：
取纳米银溶于蒸馏水制成质量浓度为0.0625％的纳米银胶体溶液，再取壳聚糖溶于体积浓度为1％的乙酸溶液中，制成质量浓度为0.3％的壳聚糖溶液；将所制得的纳米银胶体溶液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀，用气浴振荡器孵育2小时后即得。
上述方案中，所述包合物的制备方法如下：
取羟丙基-β-环糊精加入蒸馏水溶解，50℃条件恒温搅拌15～30分钟，制得β-环糊精水溶；取丹参酮iia加入乙醇溶解，然后按羟丙基-β-环糊精︰丹参酮iia＝250︰1的质量比缓慢注入β-环糊精中水溶，继续恒温搅拌包合4小时，再室温搅拌包合2小时后转移至旋转蒸发仪中，蒸干溶剂，残渣用蒸馏水溶解并使得丹参酮iia的质量浓度为0.04％-0.0875％，滤过即得。
上述纳米银可选用市售的也可按以下方法自行制备：
1、挑取保存于4℃保存的马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面菌种菌丝适量，于28℃恒温培养后进行菌种活化。将活化好的菌株挑取适量菌丝接入pyg液体培养基中，置于28℃恒温摇床120rpm振荡培养3天。过滤分离菌体和发酵液，菌体用水洗涤，取25g(湿重)菌体加入到100ml，再次于相同条件下振荡培养。24小时后，过滤除去菌体，获得菌体水浸液；
2、将硝酸银溶于适量蒸馏水中，配制浓度为10mm的硝酸银溶液；
3、将菌体水浸液和浓度为10mm的硝酸银溶液以10:1的体积比进行混合，室温下避光反应24小时，即可获得粒径为20～70nm的纳米银胶体溶液；或加入冻干保护剂，制成冻干制剂，即得。
本发明所述的药物组合物中的丹参酮iia与纳米银具有协同增效作用，治疗中耳炎的效果显著。此外，本发明所述的药物组合物药味少、质量稳定、疗效确切。
以下通过药效实验来充分证明本发明所述方案所具有的有益效果。
附图说明
图1为本发明所述药物组合物治疗中耳炎中耳黏膜he染色切片。
具体实施方式
实施例1(滴耳液)
1、处方
(1)有效成分：取纳米银1.5mg，丹参酮iia3.5mg。
(2)辅料：壳聚糖2.25mg，羟丙基-β-环糊精875mg。
2、制备方法
(1)制备复合物
取纳米银溶于蒸馏水制成质量浓度为0.0625％的纳米银胶体溶液，再取壳聚糖溶于体积浓度为1％的乙酸溶液中，制成质量浓度为0.3％的壳聚糖溶液；将所制得的纳米银胶体溶液和壳聚糖溶液混合，搅拌均匀，用气浴振荡器孵育2小时后即得。
(2)制备包合物
取羟丙基-β-环糊精加入蒸馏水溶解，50℃条件恒温搅拌15～30分钟，制得β-环糊精水溶液；取丹参酮iia加入乙醇溶解，然后将按羟丙基-β-环糊精︰丹参酮iia＝250︰1的质量比缓慢注入β-环糊精水溶液中，继续恒温搅拌包合4小时，再室温搅拌包合2小时后转移至旋转蒸发仪中，蒸干溶剂，残渣用蒸馏水溶解并使得丹参酮iia的质量浓度为0.04％-0.0875％，滤过即得。
(3)制备滴耳液
将所制得的包合物与复合物混匀，于室温下振荡6h后，4000r/min离心分层，取上层得到混悬液，微孔滤膜过滤，分装，即得。
实施例2(滴耳液)
1、处方
(1)有效成分：取纳米银2.25mg，丹参酮iia2.75mg。
(2)辅料：壳聚糖3.375mg，羟丙基-β-环糊精687.5mg。
2、制备方法
制备方法与实施例1相同。
实施例3(凝胶剂)
1、处方
(1)有效成分：取纳米银2.5mg，丹参酮iia2.5mg。
(2)辅料：壳聚糖3.75mg，羟丙基-β-环糊精625mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)(la/ga＝50:50)1325mg，氮甲基吡咯烷酮(nmp)3180mg。
2、制备方法
(1)制备复合物
与例1相同。
(2)制备包合物
与例1相同。
(3)制备冻干粉
将所制得的包合物溶液与复合物混均，于室温下振荡6h后，4000r/min离心分层，取上层得到混悬液，装至西林瓶中，加丁基橡胶塞，冻干，压盖，即得。
(4)制备凝胶剂
先将plga溶于nmp中，搅拌均匀，制成聚合物溶液，然后所制得的冻干粉加入聚合物溶液，搅拌，涡旋混匀，微孔滤膜过滤，分装，即得凝胶剂。
实施例4(凝胶剂)
1、处方
(1)有效成分：取纳米银3mg，丹参酮iia2mg。
(2)辅料：壳聚糖4.5mg，羟丙基-β-环糊精500mg，plga(la/ga＝50:50)1325mg，nmp3180mg。
2、制备方法
制备方法与实施例3相同。
实施例5
实验1丹参酮iia/纳米银组合物抗菌作用的测定
1.1实验方法
1.1.1纳米银最小抑菌浓度(mic)的测定
采用微量肉汤稀释法进行，将纳米银分别制备浓度为220μg/ml，110μg/ml，55μg/ml，27.5μg/ml，13.75μg/ml，6.88μg/ml，3.44μg/ml，1.72μg/ml的纳米银胶体溶液。用微量加样器加样到96孔板中，每孔中纳米银胶体溶液加样体积为100μl。然后每孔加入100μl浓度为2×106cfu/ml的菌悬液，混匀。置37℃恒温恒湿培养箱中培养18h-24h，观察结果。
1.1.2丹参酮iia最小抑菌浓度(mic)的测定
采用微量肉汤稀释法进行，将丹参酮iia包合物分别制备含丹参酮iia浓度为800μg/ml，400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml的丹参酮iia包合物溶液。用微量加样器加样到96孔板中，每孔中丹参酮iia包合物溶液加样体积为100μl。然后每孔加入100μl浓度为2×106cfu/ml的菌悬液，混匀。置37℃恒温恒湿培养箱中培养18h-24h，观察结果。
1.1.3丹参酮iia/纳米银组合物混悬液部分抗菌浓度指数(fic)的测定
按照棋盘法设置药物浓度，使得丹参酮iia/纳米银组合物混悬液中纳米银在96孔板的横列方向上的浓度依次为110μg/ml，55μg/ml，27.5μg/ml，13.75μg/ml，6.88μg/ml，3.44μg/ml；丹参酮iia在纵列方向上的浓度依次为400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml。每孔中丹参酮iia/纳米银组合物混悬液加样体积为100μl。然后每孔加入100μl浓度为2×106cfu/ml的菌悬液，混匀。置37℃恒温恒湿培养箱中培养18h-24h，观察结果。
1.1.4mic终点判读
以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的mic。试验重复3次，取平均值。
1.1.5计算部分抗菌浓度指数fic
fic＝mic甲药联用/mic甲药单用+mic乙药联用/mic乙药单用结果判定标准：fic≤0.5为协同作用；0.5＜fic≤1为相加作用；1＜fic≤2为无作用；fic＞2为拮抗作用。
1.2实验结果
表1丹参酮iia/纳米银组合物的抗菌作用
丹参酮iia/纳米银组合物对这三种致病菌均表现出明显的协同抗菌作用，使用组合物混悬液抗菌时明显降低纳米银和丹参酮iia的mic。
实验2本发明所述药物组合物用于中耳炎的治疗研究
2.1实验动物：
动物来源及饲养：模型中耳炎豚鼠模型，fmmu豚鼠，购自南方医科大学实验动物中心，雌雄不限，250～300g，自由饮食、光/暗周期为12hr/12hr(光照时间为6am-6pm)，温度为25±3℃。
2.2中耳炎模型建立
采用鼓室注射菌液法制备中耳炎模型豚鼠。腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)将豚鼠麻醉后，清理双侧外耳道，用聚维酮碘溶液消毒，采用1ml无菌注射器抽取1×108cfu/ml金黄色葡萄球菌液0.1ml，经鼓膜穿刺接种入鼓室。造模前后的观察及检测指标：豚鼠耳腔内有脓液，中耳腔分泌物细菌培养为原接种菌者定为成功的中耳炎模型。
2.3动物分组及受试药物：
(1)动物分组
豚鼠经过造模成功后分组给药，随机分为模型组、抗生素组、实验组a、b、c、d，以及对照组1和2，共计8组，每组做6个平行。
(2)受试药物：
实验组a为实施例1的滴耳液，实验组b为实施例2的滴耳液，实验组c为实施例3的凝胶剂，实验组d为实施例4的凝胶剂，对照组1为实施例3的纳米银，对照组2为实施例3的丹参酮iia包合物，抗生素组为市售氧氟沙星滴耳液。
(3)给药方式及剂量：
实验组a、实验组b和抗生素组的滴耳液以及实验组c和实验组d凝胶剂直接鼓室注射给药，对照组1和对照组2所用药物分别加入适量的蒸馏水制成注射液后鼓室注射给药。
给药剂量：实验组a～d按纳米银和丹参酮iia重量之和计算0.3mg/kg豚鼠体重；对照组1按纳米银重量计算0.3mg/kg豚鼠体重；对照组2按丹参酮iia重量计算0.3mg/kg豚鼠体重；抗生素组按滴耳液重量计算0.72mg/kg豚鼠体重；各组每天1次，连续三天。
2.4实验方法
2.4.1细菌培养和观察
各组豚鼠分别在用药前及用药后6h、24h、48h、72h分别收集中耳灌洗液，将其调整到1ml并进行10倍倍比稀释，直到108稀释度。吸取100μl连续稀释液涂布于lb琼脂培养基内，37℃孵育24h，之后进行菌落计数。
2.4.2中耳灌洗液中炎症因子含量检测
治疗结束后豚鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，收集中耳灌洗液，4000rpm离心10min后，取上清液冻存于-20℃待测细胞因子。以elisa试剂盒检测细胞因子tnf-α和il-8浓度。
2.4.3组织学观察
治疗结束后豚鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，然后断头处死，迅速取出双侧听泡，置入10％甲醛中固定24h，后经10％稀硝酸脱钙3天。漂洗，包埋后做切片，行常规he染色。在光镜下观察中耳腔黏膜等结构的改变，特别是炎症情况。
2.5统计学处理：
全部数据采用spss19.0统计学软件进行统计分析，计量资料用平均值±标准差
2.6实验结果
2.6.1丹参酮iia/纳米银组合物对中耳炎豚鼠的中耳腔细菌数量的影响
表1显示中耳炎豚鼠给予药物治疗以后，豚鼠中耳腔细菌量与模型组相比显著降低(p＜0.01)。与对照组1和2单独使用药物组相比，药物组合物a，b，c，d组别的豚鼠中耳腔细菌量有显著性降低(p＜0.01)，说明相对于单独使用纳米银和丹参酮iia而言，丹参酮iia/纳米银组合物对豚鼠中耳炎有较好的改善作用。
表2丹参酮iia/纳米银组合物对中耳炎豚鼠的中耳腔细菌数量的影响(n＝6，单位：×104cfu/ml)
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与对照组1比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与对照组2比较，+p＜0.05，++p＜0.01
2.6.2丹参酮iia/纳米银组合物对中耳炎豚鼠的中耳腔灌洗液炎症因子含量影响
由表2可以看出，与对照组1和2单独使用药物组相比，药物组合物a，b，c，d组别的豚鼠中耳腔灌洗液中的tnf-α和il-8含量有显著性降低(p＜0.01)，说明相对于单独使用纳米银和丹参酮iia而言，丹参酮iia/纳米银组合物对豚鼠中耳炎有显著的改善作用。
表3丹参酮iia/纳米银组合物对中耳炎豚鼠的中耳腔灌洗液炎症因子含量影响(n＝6)
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与对照组1比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与对照组2比较，+p＜0.05，++p＜0.01
2.6.3he染色观察中耳组织切片
结果见图1。可见造模后，中耳黏膜上皮细胞坏死，炎症细胞浸润严重，出现间质纤维化，间质血管增生，黏膜增厚明显。经对照组和丹参酮iia/纳米银组合物治疗后，中耳黏膜开始修复，炎症细胞浸润情况较轻，在黏膜浅层有少许炎性细胞浸润，炎症细胞散在分布，偶尔呈现成群分布。模型组炎性细胞浸润严重，主要为中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞。
2.6.4结论
上述实验结果从中耳腔细菌量，炎症因子和组织学显示，对比单独使用纳米银和丹参酮iia而言，发现药物组合物具有协同增效作用。