本发明涉及八味沉香丸的新用途，具体涉及八味沉香丸在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，属于生物医药领域。
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：阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease,ad)是慢性退行性中枢神经系统变性病导致的痴呆，是痴呆最常见的病因和最常见的老年期痴呆。ad以渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变以及语言障碍等神经精神症状为特征。alzheimer病是最常见和最重要的脑变性疾病，随着全球人口老龄化，ad的发病率呈逐年显著上升趋势。多数资料显示65岁以上患病率约为5％，85岁以上为20％，妇女患病率约3倍于男性。目前在世界范围内约有1500万人罹患ad，65岁以上老年人中ad发病率以每年0.5％的速度稳定增加，85岁以上老年人则以每年8％的速度增长。严重危害老年人的身心健康并影响生存质量，给病人造成深重的痛苦，给家庭及社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注。作为老年痴呆的主要类型，阿尔茨海默症的病理特征包括大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变，细胞内神经元纤维缠结和细胞外老年斑沉淀[1,2]。现代医学对ad的发病机制进行了多年的研究，但是由于其病因复杂，该病的发病机制至今仍不明确，在对ad的病因研究中，很多证据表明aβ(β-淀粉样蛋白，老年斑的主要成分)是诱导ad发生的主要病理环节。首先，aβ自身的清除和降解代谢障碍导致aβ沉积形成淀粉样斑块，几乎在所有ad病人的脑中都发现了大量的淀粉样斑块沉积[3]。其次，aβ能促进神经细胞凋亡[4]。再次，aβ还可以激活神经胶质细胞，释放细胞因子和炎症反应介质，产生炎症反应，aβ作为刺激物通过激活周围小胶质细胞产生细胞因子和神经系统免疫炎症应答，加速神经细胞死亡，导致记忆减退和认知障碍[5]。因此，β淀粉样蛋白已成为公认的筛选抗ad药物靶标。ad病因复杂、病程漫长、且发病环节较多，需要长期服药，目前主要的抗阿尔茨海默病药物乙酰胆碱酯酶抑制剂(如加兰他敏)和n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmda受体)拮抗剂(如美金刚)，但上述药物价格昂贵，服药后幻觉、意识混沌、头晕、头痛和疲倦等副作用显著，且只能控制却不能逆转患者病情。到目前为止，治疗ad还没有特效药，绝大部分药物尚处于基础研究及临床试验阶段。经过长期的应用实践证实天然药物对ad的治疗有一定优势。且ad的发病机理非常复杂，中药对ad的治疗是多靶点、多途径的，因此引起了多方面的重视。本发明公开的八味沉香丸，包括沉香100份，肉豆蔻100份，广枣100份，诃子100份，乳香50份，木香175份，木棉花75份，石灰华50份组成，最早收载于医圣宇妥·元丹贡布经典医著《四部医典》，至今已有1300余年的临床应用史，是宇妥·元丹贡布行医过程中总结民间医药经验研制而成的千百古验方之一，疗效奇特。《四部医典》记载：当心脏被箭等精锐器击伤时就服此药。具有清心热，宁心，神，开窍的作用，用于热病攻心，神昏谵语，心前区疼及心脏外伤。八味沉香丸是历代藏医用于治疗心肌缺血，外伤性心脏病的代表性药物，现在八味沉香丸是各地藏医院常用验方之一。由于效果良好，经临床验证，疗效显著，在临床上备受患者青睐。秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)是一个非常有用的多功能药物筛选和药物作用机制的研究平台。它廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；与高等生物在基因和分子通路方面高度保守[6]。它作为一个从细胞体外水平药物初筛到小鼠体内水平药物复筛的一个桥梁，越来越受到药学家的青睐。美国devgen公司利用人源化线虫筛选的抗心律不齐药物已被fda批准进入临床研究。人源化秀丽隐杆线虫ad病理模型的建立是将人源aβ1-42基因转入肌球蛋白启动子下游并受温度控制表达，该线虫株系可在15℃正常生长，当转移至25℃条件下aβ1-42表达并在其肌肉内累积，导致线虫失去运动能力而麻痹。加入受试药物可延缓肌肉麻痹表型，其结果以肌肉麻痹线虫数量占受试线虫群体数量的百分比表示。未麻痹线虫比率越高，药物抗ad效果越显著。这一模型早已被用于抗ad疾病发生机制和抗ad药物及候选物的筛选及其作用机制研究[7]。发明人经采用秀丽隐杆线虫ad病理模型对大量中药组合物进行筛选后，发现本发明公开的八味沉香丸有抗ad的作用。因此，本发明现提供的八味沉香丸具有治疗阿尔茨海默症的潜力，可在制备治疗阿尔茨海默症的药物中应用。发明专利cn95197353“乳香用于治疗阿尔茨海默症的用途”中公开了乳香在预防或治疗阿尔茨海默症的用途；发明专利cn201010300450“一种治疗老年痴呆的中药组合物及其制备方法”中公开了沉香和木香在治疗老年痴呆药物中的应用。实施例中通过实验对比证明本发明公开的八味沉香丸在治疗阿尔茨海默症的疗效明显优于乳香、木香沉香的组合物。参考文献[1]mattsonmp.pathwaystowardsandawayfromalzheimer’sdisease.nature,2004,430；631-639.[2]hardyj,selkoedj.theamyloidhypothesisofalzheimer’sdisease:progressandproblemsontheroadtotherapeutics.science,2002,297:353-356.[3]fuhj,liub,frostjl,etal.amyloid-betaimmunotherapyforalzheimer’sdisease[j].cnsneuroldisorddrudtargets,2010,9(2):197-206.[4]nelsontj,alkondl.oxidationofcholesterolbyamyloidprecursorproteinandbeta-amyloidpeptide[j].jbiolchem,2005,280(8):7377-7387.[5]韦美丹，林继宗，朱宁，等。aβ(1-42)作用的小胶质细胞对体外培养的神经干细胞生存的影响[j]。中国病理生理杂志，2012(4)：683-688。[6]kalettat,hengartnermo.findingfunctioninnoveltargets:c.elegansasamodelorganism.natrevdrugdiscov2006,5:387e398.[7]linkcd.transgenicinvertebratemodelsofage-associatedneurodegenerativediseases.mechageingdev2001,122:1639e1649.技术实现要素：本发明的目的是提供八味沉香丸的新用途，具体涉及八味沉香丸在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。八味沉香丸中组合物的配比如下：沉香100份，肉豆蔻100份，广枣100份，诃子100份，乳香50份，木香175份，木棉花75份，石灰华50份。本发明以秀丽隐杆线虫作为阿尔茨海默症病理模型进行实验，结果显示，本发明公开的八味沉香丸能显著延缓阿尔茨海默症秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹表型，表明八味沉香丸对于罹患阿尔茨海默症的秀丽隐杆线虫具有显著的治疗作用，提示本发明提供的八味沉香丸具有治疗阿尔茨海默症的潜力，可用于制备治疗阿尔茨海默症的药物。具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例一八味沉香丸水煎液显著延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹1.生物材料(1)秀丽隐杆线虫cl4176购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)；为转基因品系，在25℃温度诱导下肌肉特异性表达人类aβ1-42，aβ1-42在肌肉组织聚集，最终导致线虫麻痹，本实施例采用秀丽线虫cl4176株系作为筛选抗ad药物的病理模型。(2)大肠杆菌op50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)，作为秀丽隐杆线虫的食物。2.试剂(1)八味沉香丸产自西藏自治区藏药厂,生产批号13016a(2)固体ngm(nematodegrowthmedium)培养基成分与制作(以1升为例)：固体ngm培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/ml胆固醇1ml，1mmgso41ml,1mcacl21ml摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。(3)m9液配方成分含量na2hpo46.00gkh2po43.00gnacl5.00g1mmgso41.00ml补充h2o至1000ml(4)裂解液的配制：6.4％naclo溶液和1mnaoh溶液按体积比1:1混合。3.配制八味沉香丸水煎液的ngm平板(1)八味沉香丸水煎液的制备：取中药八味沉香丸，用研钵研碎，称取10g，加水100ml，浸泡30min，加热煮沸并保持30min，自然冷却至室温后进行离心(12000rpm，10min)，分离上清液，沉淀再用80ml去离子水浸泡10min，再用大火加热至沸腾后，再加热25min，自然冷却至室温后离心(12000rpm，10min)，取上清液，合并两次上清液，定容至50ml，即得到200mg/ml八味沉香水煎液(按生药量计)。(2)配制含有药物水煎液的ngm按ngm配方配制ngm培养基(不含琼脂、硫酸镁、氯化钙、胆固醇)，将培养基分装成每个小瓶中含13.5ml的ngm培养基液体，然后每个小瓶中加入0.257g琼脂，用封口膜封口，121℃，20min灭菌。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，1.5ml灭过菌凉至室温的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml的培养基，共四个，记作对照组。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，187.5μl上述200mg/ml八味沉香水煎液(按生药量计)，1.3125ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，记作组合物一组，此时培养基所含药物为2.5mg/ml八味沉香(按生药量计)。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，0.375ml上述200mg/ml八味沉香水煎液(按生药量计)，1.125ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，记作组合物二组，此时培养基所含药物为5mg/ml八味沉香(按生药量计)。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，0.75ml上述200mg/ml八味沉香水煎液(按生药量计)，0.75ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，记作组合物三组，此时培养基所含药物为10mg/ml八味沉香(按生药量计)。静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌op50作为线虫的食物。4.实施步骤(1)线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌op50的固体ngm板上，然后置于16℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。(2)线虫同步化：挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的ngm培养基，用m9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩涡搅拌器上振荡5-7min待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5ml离心管中，用m9溶液洗线虫卵三次。(3)八味沉香丸水煎液对阿尔茨海默症秀丽隐杆线虫cl4176的作用将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到之前制备好的不同组的培养基上，每个培养皿60条线虫，每个药物浓度四个培养皿作为平行，16℃培养3天至l3期。为了使线虫表达aβ，将l3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激线虫身体时，线虫不能运动或者只有头部运动)。结果见表1。表中所示为不同温度诱导时间下，没有麻痹的秀丽隐杆线虫占的百分比，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中没有麻痹的秀丽隐杆线虫比例越大，即药物延缓麻痹的作用越强。实验结果表明，八味沉香丸水煎液可延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹，并且在一定浓度范围内随着浓度增加，延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹的效果越好。通过以上实施例证明，本发明提供的八味沉香丸水煎液对ad秀丽隐杆线虫发挥治疗作用，提示本发明提供的八味沉香丸具有抗阿尔茨海默症潜力，可在制备防治阿尔茨海默症的药物中应用。表1八味沉香丸水煎液延缓ad线虫麻痹的作用实施例二乳香水煎液与八味沉香丸水煎液延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹的效果相比较1.乳香水煎液的制备：取中药乳香，用研钵研碎，称取0.67g，加水100ml，浸泡30min，加热煮沸并保持30min，自然冷却至室温后进行离心(12000rpm，10min)，分离上清液，沉淀再用80ml去离子水浸泡10min，再用大火加热至沸腾后，再加热25min，自然冷却至室温后离心(12000rpm，10min)，取上清液，合并两次上清液，定容至50ml，即得到13.33mg/ml乳香水煎液(按生药量计，与200mg/ml的八味沉香水煎液中含的乳香量相同)。2.配制含药物水煎液的ngm按ngm配方配制ngm培养基(不含琼脂、硫酸镁、氯化钙、胆固醇)，将培养基分装成每个小瓶中含13.5ml的ngm培养基液体，然后每个小瓶中加入0.257g琼脂，用封口膜封口，121℃，20min灭菌。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，0.75ml上述13.33mg/ml乳香水煎液(按生药量计)，0.75ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，记作乳香水煎液组,此时培养基所含药物为0.67mg/ml。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，0.75ml上述200mg/ml八味沉香水煎液(按生药量计)，0.75ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，八味沉香丸水煎液，此时培养基所含药物为10mg/ml八味沉香(按生药量计)。3.乳香水煎液与八味沉香丸水煎液对阿尔茨海默症秀丽隐杆线虫cl4176的作用将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到之前制备好的不同组的培养基上，每个培养皿60条线虫，每个药物浓度四个培养皿作为平行，16℃培养3天至l3期。为了使线虫表达aβ，将l3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激线虫身体时，线虫不能运动或者只有头部运动)。结果见表2。表中所示为不同温度诱导时间下，没有麻痹的秀丽隐杆线虫占的百分比，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中没有麻痹的秀丽隐杆线虫比例越大，即药物延缓麻痹的作用越强。表2乳香水煎液与八味沉香丸水煎液延缓ad线虫麻痹的作用实验结果表明，八味沉香丸水煎液可延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹，而乳香水煎液不能延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹。通过以上实施例证明，本发明提供的八味沉香丸水煎液对ad秀丽隐杆线虫发挥治疗作用，乳香在其中不起主要作用，提示本发明提供的八味沉香丸具有抗阿尔茨海默症潜力，而其药效不是通过乳香单独的作用。其它操作同实施例一实施例三沉香和木香组合物水煎液与八味沉香丸水煎液延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹的效果相比较1.沉香与木香组合物水煎液的制备：取中药沉香，木香，分别打粉机打碎，称取沉香1.33g，木香2.33g，混匀后加水100ml，浸泡30min，加热煮沸并保持30min，自然冷却至室温后进行离心(12000rpm，10min)，分离上清液，沉淀再用80ml去离子水浸泡10min，再用大火加热至沸腾后，再加热25min，自然冷却至室温后离心(12000rpm，10min)，取上清液，合并两次上清液，定容至50ml，即得到73.33mg/ml沉香和木香组合物水煎液(按生药量计，与200mg/ml的八味沉香水煎液中含的沉香和木香的量相同)。2.配制含药物水煎液的ngm按ngm配方配制ngm培养基(不含琼脂、硫酸镁、氯化钙、胆固醇)，将培养基分装成每个小瓶中含13.5ml的ngm培养基液体，然后每个小瓶中加入0.257g琼脂，用封口膜封口，121℃，20min灭菌。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，0.75ml上述73.33mg/ml沉香和木香组合物水煎液(按生药量计)，0.75ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，记作沉香和木香水煎液组，此时含药培养基所含药物为3.67mg/ml。待培养基温度降至80℃时，在小瓶中加入15μl的1m硫酸镁，15μl的1m氯化钙，15μl的5mg/ml胆固醇，0.75ml上述200mg/ml八味沉香水煎液(按生药量计)，0.75ml灭过菌的去离子水，充分混匀后，均分至直径为3cm的培养皿中，每个培养皿中约3.5ml含药的培养基，共四个，记作组合物三组，此时培养基所含药物为10mg/ml八味沉香(按生药量计)。3.沉香与木香组合物水煎液与八味沉香丸水煎液对阿尔茨海默症秀丽隐杆线虫cl4176的作用将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到之前制备好的不同组的培养基上，每个培养皿60条线虫，每个药物浓度四个培养皿作为平行，16℃培养3天至l3期。为了使线虫表达aβ，将l3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激线虫身体时，线虫不能运动或者只有头部运动)。结果见表3。表中所示为不同温度诱导时间下，没有麻痹的秀丽隐杆线虫占的百分比，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中没有麻痹的秀丽隐杆线虫比例越大，即药物延缓麻痹的作用越强。其它操作同实施例一表3沉香和木香组合物水煎液与八味沉香丸水煎液延缓ad线虫麻痹的作用实验结果表明，八味沉香丸水煎液可延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹，而沉香与木香组合物的水煎液不能延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹。通过以上实施例证明，本发明提供的八味沉香丸水煎液对ad秀丽隐杆线虫发挥治疗作用，沉香与木香组合物在其中不起主要作用，提示本发明提供的八味沉香丸具有抗阿尔茨海默症潜力，而其中沉香与木香组合物不起主要作用。综上所述：本发明公开的八味沉香丸能显著延缓阿尔茨海默症秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹表型，表明该八味沉香丸对于罹患阿尔茨海默症的秀丽隐杆线虫具有显著的治疗作用，提示本发明提供的八味沉香丸具有治疗阿尔茨海默症的潜力，可用于制备治疗阿尔茨海默症的药物。当前第1页12