本发明属于中药制剂领域，尤其涉及一种治疗特发性肺纤维化缓解期疾病的中药制剂及其制备方法。
背景技术：
特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，ipf)是一种病因不明的慢性炎症性间质性肺疾病，该病以特发性的肺泡间质炎性反应和肺泡结构紊乱为主要病理特征。由于肺有效换气面积减少，多数特发性肺纤维化患者最终死于肺损伤和低氧性呼吸衰竭。近年来，由于hrct等检查设备的普及，特发性肺纤维化的发病率与阳性诊断率逐渐上升。患者一旦确诊特发性肺纤维化，其生存时间仅3-5年。流行病学研究显示，ipf的发病率约为16.3/10万，且3年内急性恶化发生率为20.7%。关于ipf的发病机制不明，存在多种学说，目前，最为主要的几种学说如下：细胞因子网络失衡，上皮间充质细胞转化，基质生成与降解失衡，氧化与抗氧化失衡，细胞凋亡，th1细胞（ⅰ型辅助t细胞）因子和th2细胞（ⅱ型辅助t细胞）因子反应失衡学说等等。因其发病机制不明，该病目前临床有效治疗手段少，除肺移植以外，尼达尼布和吡非尼酮是2015年指南推荐的用药，但因价格昂贵、国内尚未上市而临床应用较少，其他药物或治疗方法缺乏强有力的循证医学证据支持。
目前，激素是国内治疗特发性肺纤维化后期减轻症状的常用药物，但长期应用，具有激素依赖、骨质疏松等副作用，患者的依从性差。中医药治疗特发性肺纤维化具有减轻患者的症状、提高生活质量、副作用小的优势，与激素合用具有协同增效减毒的作用。
因此，研制一种治疗特发性肺纤维化缓解期疾病的中药制剂成为目前亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种治疗特发性肺纤维化缓解期的中药制剂，该制剂以络病理论为指导，基于“肺虚络瘀”的特发性肺纤维化缓解期病机认识，配制方药以益气养阴、活血化瘀、祛痰通络，最终达到延缓特发性肺纤维化疾病进展，缓解疾病症状，改善患者生活质量的治疗目的。
为实现本发明的治疗目的，本发明是这样实现的：一种治疗特发性肺纤维化缓解期疾病的中药制剂，该中药制剂是由如下重量的原料组成的：炙黄芪130-140份，广地龙60-70份，北沙参82-88份，当归60-70份，川芎60-70份，熟地黄60-70份，炙甘草60-70份，鸡血藤60-70份，麦冬60-70份，浙贝母60-70份。
优选的，该中药制剂是由如下重量的原料组成的：炙黄芪132g，广地龙66g，北沙参88g，当归66g，川芎66g熟地黄66g，炙甘草66g，鸡血藤66g，麦冬66g，浙贝母66g。
该中药制剂中君药为炙黄芪和广地龙的组合物。
所述中药制剂的剂型为合剂或颗粒剂。
所述中药制剂与激素联用作为制备治疗特发性肺纤维化缓解期疾病药物中的应用。
一种治疗特发性肺纤维化缓解期疾病的中药制剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
称取权利要求1中的十味中药，浙贝母酌予碎断，与其余九味药混合，熬药前先予饮用冷水浸泡30-45分钟，水没过1中指，2—4厘米，后加8倍量水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，浓缩至1000ml，并进行分装。
按配方服用2天，每天两次，早饭前30分钟服用（50-75ml），晚饭后半小时服用（50-75ml），服用前将该中药制剂加温；与其它中成药、西药隔开半小时以上；服药期间，禁止服用辛辣、鱼腥、发物、生冷、油腻、酸涩的食物和饮料。
一种治疗特发性肺纤维化的中药制剂的质量检测方法，经高效液相色谱法测定，确定炙黄芪中的黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷为其指标性成分，采用黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为本品含量测定成分，用于控制本品质量，炙黄芪以黄芪甲苷计，不得少于10mg，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷计，不得少于4mg。
本发明药物组成及方解如下：
本发明提供的中药制剂以络病理论为学术思想，基于对特发性肺纤维化缓解期“肺虚络瘀”的中医病机认识，以“补虚通络”为治疗大法，以清代王清任之《医林改错》之补阳还五汤组成为基本方剂进行加减而成。
方中炙黄芪、广地龙为君药。炙黄芪，味甘，性温。归肺、脾经，功能补气升阳，蜜炙可增强其补中益气的作用。此外，黄芪还有滋补肾气、补血活血之功。《汤液本草》曰:黄芪“柔脾胃，是为中州药也，……，又补肾脏元气，为里药”。《日华子本草》记载:黄芪“助气，壮筋骨，长肉，补血”，又有张元素言黄芪能治疗“血脉不行”。地龙性味咸寒，《本草纲目》称之为具有通经活络、活血化瘀，同时能够平喘。二者一补一通，起到补虚通络之用。臣药为北沙参、当归、川芎共为臣药。北沙参性微寒，味甘、微苦，归肺脾经，有养阴清肺、祛痰止咳的作用。一般认为，北沙参较南沙参而言，长于养肺阴，《本草从新》记载:“北沙参，甘苦微寒，味淡体轻。专补肺阴，清肺火”，《本草正义》曰：“清肺胃之热，养肺胃之阴”。炙黄芪、北沙参二者同归肺、脾、肾三脏，与黄芪共奏补气滋阴、养血活血之功。当归甘、辛、温，归肝、心、脾经。《本草正》记载：“当归，其味甘而重，故专能补血，其气轻而辛，故又能行血，补中有动，行中有补，诚血中之气药，亦血中之圣药也。大约佐之以补则补，故能养营养血，补气生精，安五脏，强形体，益神志，凡有形虚损之病，无所不宜。”《本草新编》：“当归，味甘辛，气温，可升可降，阳中之阴，无毒。虽有上下之分，而补血则一。入心、脾、肝三脏。但其性甚动，入之补气药中则补气，入之补血药中则补血，无定功也。”川芎性味辛温香燥。其性走而不守，既能行散，又入血分，活血祛瘀作用力强。当归、川芎其性动窜，补中有行，行中得补，为治血之纲领，亦主气之用也，且其质性略润，非燥烈之比。佐药为鸡血藤、熟地、浙贝。鸡血藤性味苦、甘，温。主入肝、肾二经，具有补血活血，调经通络的功效,与归、芎共治气血之亏损。熟地黄味甘、微苦、微温，归心、肝、肾经，功用补血调经，滋阴补肾。熟地入肝肾而功专养血滋阴，填精益髓，真阴不足者，皆可用之。《本草纲目》记载，“地黄……熟则微温，而补肾，血衰者需用之”，《医学起源》曰，“熟地黄……补血虚不足，虚损血衰之人须用”。麦冬性微寒，味甘微苦，归心、肺、胃经，功可养阴津、润肺燥。《药鉴》曰，麦冬“阳中微阴也。阴乃肺药，微阴去肺中之伏火，火去则肺金生”。熟地黄与麦冬相须为用,共为补血养阴之品。浙贝母色白归肺经，有化痰散结之功，引药入肺络，扫荡痰浊，佐助前药进一步恢复肺络的正常生理功能。方中炙甘草缓急止痛、调和诸药，乃为使药。
诸药合用，标本同治，攻补兼施，益气养阴、活血祛瘀、化痰通络合用，达补虚通络之效。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
本发明系由纯中药制成的治疗特发性肺纤维化的中药内服制剂，是在传统中医理论指导下，根据络病理论对特发性肺纤维化“肺虚络瘀”的中医病机认识，基于补虚通络的治疗原则，调配益气养阴、活血化瘀、祛痰通络之中药，用于治疗特发性肺肺纤维化。
本发明配伍切当、疗效确切、服药简单、安全性高、依从性好、医疗成本较低等优点。相比现有药物，本发明在延缓疾病进展、改善患者生存质量及避免药物毒副作用等方面亦具有一定的优势，为治疗特发性肺纤维疗效较好的中药复方制剂。
本发明可与激素联用，联用的治疗效果优于单纯使用激素激素，从而降低激素对于人体的副作用，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中各组he染色图片（×200倍）。
图2为实施例1中各组masson染色图片（×200倍）。
图3为实施例1中各组大鼠肺组织中inf-γmrna表达水平电泳图，其中，1.空白对照组；2.模型对照组；3.西药组；4.炙黄芪+三七组；5.炙黄芪+广地龙组；6.丹参+川芎组；7.炙黄芪+丹参组。
图4为实施例1中各组大鼠肺组织中il-4mrna表达水平电泳图，其中，1.空白对照组；2.模型对照组；3.西药组；4.炙黄芪+三七组；5.炙黄芪+广地龙组；6.丹参+川芎组；7.炙黄芪+丹参组。
图5为本发明制备流程示意图。
具体实施方式
实施例1本发明君药筛选实验。
实验依据：本复方制剂发明人以中国生物医学文献数据库（cbm）、中国知网（cnki）数据库为范围，采用多种数据挖掘方法,确定中药复方防治特发性肺纤维化方中药物使用的频次前五位的是黄芪、丹参、甘草、麦冬、川芎，核心组合前五位丹参-黄芪、丹参-当归、丹参-川芎、黄芪-三七、丹参-党参，证素主要是气虚、血瘀、阴虚最为常见，且其证型常以多证素相互组合为主。基于以上数据挖掘结果，确定本申请专利方君药炙黄芪+广地龙与炙黄芪+丹参、丹参+当归、黄芪+三七、模型组、强的松六组进行比较，并以最常用的气管切开注入博来霉素造模方式进行观察。
实验目的：探讨不同组合中药复方制剂君药干预特发性肺纤维化模型大鼠作用效应，证实炙黄芪+广地龙组合效应最优。
材料与方法
1.材料
1.1实验动物
选用wistar大鼠210只、雌雄各半、体重200±20g、清洁级、购于辽宁长生生物技术有限公司（动物许可证号：scxk(辽)2010-0001）
1.2实验药品及试剂
实验药品：注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社，生产批准文号x30362，进口药品注册证号：h20090885，15mg/支）；中药各组（由辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心制剂室提供。浓度:1.13g/ml；提供日期：2016.9.04。规格：500ml/瓶；保存条件：4℃冰箱保存）；醋酸泼尼松片(天津天药药业股份有限公司生产，国准：h12020698产品批号：130302，5mg/片)。
试剂：il-4ellisa试剂盒（货号：ek0406）、inf-γellisa试剂盒（货号：ek0374）、proteinladder(11条带)（货号：00150801）:美国thermo公司；westernbrightecl发光液（货号：d-26012-407）：美国advansta公司；总rna提取试剂盒（离心柱型）：tiangenbiotech（beijing）；biort逆转录扩增（rt-pcr）试剂盒（两步法）：北京全式金生物技术有限公司；dnamarker(货号：bm101)北京全式金生物技术有限公司；trizol：invitrogen公司；引物，由北京三博远志生物技术有限公司代为合成。
仪器
cx41-12c02光学显微镜(日本olympus公司)，dycp-40e电泳槽（北京六一仪器厂），tanongis凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司），bi-2000型图像分析系统（成都泰盟科技有限公司），anthos2010型全自动酶标仪（奥地利anthoslabtecinstruments），wd-9413b型凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂），16c14型721分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造），uv-2800型紫外可见分光光度计（尤尼卡（上海）仪有限公司）；eps300型电泳仪（上海天能科技有限公司），梯度pcr仪（美国伯乐公司），转膜仪（上海天能科技有限公司）。
方法
2.1动物分组及给药210只wistar大鼠常规饲养3天后，按雌雄、体重随机分为七组，分别为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松片对照组(简称西药组)、炙黄芪+广地龙、炙黄芪+丹参、丹参+当归、黄芪+三七六组，每组30只。造模次日，日一次灌胃给药，其中西药组予以醋酸泼尼松龙片0.625mg，用蒸馏水溶解成混悬液，按照1ml/100g体积灌胃。中药剂量组分别予以0.5g剂量，用蒸馏水溶解颗粒剂后，亦按1ml/100g体积灌胃。空白对照组和模型对照组分别予以等体积的生理盐水，各组每周复查体质量，根据体质量变化调整给药剂量，共28天。
造模方法参照szapiel等[1]方法，用3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,模型组、泼尼松组、参龙合剂颗粒剂组分别气管内注入博来霉素溶液0.2-0.3ml(按体质量5mg/kg给药)，正常对照组在同等条件下气管内注射等容生理盐水。
标本采集方法分别于造模后第7、14、28d三个时间点取材，每个时间点各组分别腹主动脉放血处死10只大鼠。各组大鼠以腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，将其仰卧固定，经腹主动脉取血4-5ml，室温下静止2h后，离心（3600r/min，10min），分离血清，密封保存于-80℃冰箱，待测；随后打开胸腔分离肺组织。于4℃生理盐水漂洗干净后，剔除结缔组织，以滤纸吸干，称湿重。再分离左右肺组织，取左肺组织置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，常规脱水，以石蜡包埋。然后将取右肺组织放入预先消毒和depc处理过的冻存管中，-80℃条件下保存备用。
法检测及判定按elisa试剂盒说明操作。用酶标仪选择在450nm波长下测定各孔的吸光度（od）值。
2.5westernblot法检测及判定
各组大鼠肺组织进行组织匀浆后,用组织裂解液提取总蛋白,并进行bca法测定蛋白浓度。各组蛋白样品以40μg蛋白上样量进行sdspage电泳后,通过电转移将蛋白转移至pvdf膜上。pvdf膜经5%bsa/pbs溶液封闭过夜后,以inf-γ、il-4进行一抗孵育(1∶500),再进一步与hrp标记的二抗孵育后,采用dab显色法检测蛋白信号。应用生物凝胶电泳图像分析系统进行扫描定量，计算各目的条带与内参β-actin的光密度比值作为各蛋白的相对含量。
检测及判定按trizol液说明书操作提取肺组织总rna，并用紫外分光光度计测量rna浓度并定量,模板量均取2μl。引物：ifn-γ：上游：5’-tggatatctggaggaactgg-3’下游：5’-cgactccttttccgcttcct-3’扩增片段310bp；il-4引物：上游5′-caccttgctgtcaccctgt-3’下游5′-ctttcagtgttgtgagctt-3’扩增片段360bp；β-actin引物：上游5′-gagaccttcaacaccccagcc-3′下游5′-aatgtcacgcacgatttccc-3′扩增片段263bp。反应条件：预变性2min，循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，72℃终延伸30s，30个循环。pcr扩增仪热盖设定温度为105℃。rt-pcr产物判定分析：rt-pcr产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,加样量均为5μl,采用tanongis凝胶图像分析系统测定电泳条带积分吸光度,(ia)测定，分析各目的rna条带与内参β-actin的rna条带的ia比值，作为各目的rna的相对含量。
统计分析方法统计分析采用spss15.0处理软件，计量资料数据以均数加减标准差（±s）表示，两组比较用t检验；多组比较用方差分析，p<0.05或p<0.01被认为统计学上具有显著性意义。
结果
1.一般情况
实验期间,共有10只大鼠死亡,死亡率为4.7%。其中在造模当天，空白对照组有1只大鼠死亡，剖腹探查无异常，考虑麻醉过量死亡。第3d模型对照组、炙黄芪+广地龙组、西药组均有1只大鼠死亡，第5d炙黄芪+三七组、西药组亦有1只大鼠死亡，上诉5只大鼠均形体消瘦，最瘦者体重不足130g，且口鼻部有少量红褐色分泌物，查阅文献，考虑与博来霉素的细胞毒性有关，或早期炎症较重，免疫力差不能耐受。第15d模型对照组、中药炙黄芪+三七组有1只大鼠死亡、第17d、24d中药丹参+川芎组各有一只大鼠死亡，鉴于大鼠均在夜间死亡，解剖后探查，未发现明显异常，分析死因可能与乏氧或呼吸衰竭有关。
大鼠肺系数变化情况
与空白对照组比较：余下经博来霉素造模的六组大鼠肺系数在3个检测时间点均明显增加（p<0.01）；与模型对照组比较：西药组、炙黄芪+三七组、炙黄芪+广地龙组大鼠肺系数在3个检测时间均明显降低（p<0.01)，丹参+川芎、炙黄芪+丹参组则在14d、28天有所降低；与西药组比较：炙黄芪+广地龙组大鼠肺系数有明显下降（p<0.05或p<0.01）(见表1)
3.模型评价
3.1he染色
空白对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔无增厚，未见充血、水肿、炎症及纤维化，各时间点均未出现明显病理改变。
模型对照组符合肺纤维化病理改变，表现为肺泡炎与肺纤维化。第7d以肺泡炎为主，染色可见肺毛细血管充血，肺泡间隔水肿，肺泡壁有所增厚，肺泡腔内出现大量巨噬细胞为主的炎症细胞浸润，并可见少量成纤维细胞增生聚集；第14天，肺泡炎较前有所减轻，肺泡间隔较前明显增宽,炎症细胞有所减少,而成纤维细胞则较前明显增多，间质胶原纤维开始增生，开始有纤维化改变；第28天，病理表现以纤维化为主。肺泡炎基本消失，仅见少量的炎症细胞，肺泡萎缩、消失、结构改变，肺泡间隔进一步增厚、断裂，大量成纤维细胞聚集，胶原沉积、肺纤维化改变为主，形成纤维化瘢痕。与模型对照组比较，余下五组给药组的肺组织病理相似，但均有不同程度的改善，病理改变相似，病变程度由轻到重顺序分别为：第7d时，西药组、炙黄芪+广地龙、炙黄芪+三七、当归+川芎、炙黄芪+丹参；第14d时：西药组、炙黄芪+广地龙、炙黄芪+三七、当归+川芎、炙黄芪+丹参；第28d时：炙黄芪+广地龙、西药组、炙黄芪+三七、当归+川芎、炙黄芪+丹参（见图1）。
3.2masson染色
经染色后，细胞核呈蓝绿色，细胞质和胶质纤维呈红色，而胶原纤维呈绿色。
空白对照组大鼠支气管壁胶原层较薄，肺泡间隔部有少量染成蓝色纤细胶原分布，而小血管、小支气管未见。模型对照组大鼠符合肺纤维化病理改变，与其他各组比较胶原纤维沉积最重。大鼠第7d肺泡间增宽，可见支气管壁、血管壁以及肺泡间隔均有染成蓝色的胶原纤维分布；第14d可见各级支气管及血管外壁、增厚的肺泡隔内均有胶原纤维，提示胶原纤维增加，细胞外基质增多；第28d在部分细支气管、低血管外膜和纤维化实变区内可见大片蓝色胶原纤维增生，提示弥漫性肺纤维形成。与同期模型对照组比较，余下五组给药组各个时间点病理变化相似，但均纤维化程度均有不同程度的改善，病变程度由轻到重顺序：第7d时西药组、炙黄芪+广地龙、炙黄芪+三七、当归+川芎、炙黄芪+丹参；第14d时，西药组、炙黄芪+广地龙、炙黄芪+三七、当归+川芎、炙黄芪+丹参；第28d时炙黄芪+广地龙、西药组、炙黄芪+三七、当归+川芎、炙黄芪+丹参（见图2）。
各组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量测定结果
与空白对照组比较：模型对照组、西药组、炙黄芪+三七组、炙黄芪+丹参组大鼠在3个检测时间点肺组织中羟脯氨酸均明显增多（p<0.01），炙黄芪+广地龙组也有增加，但无统计学差异（p>0.05）；与同期模型组比较，西药组、炙黄芪+三、炙黄芪+广地龙组大鼠在3个检测时间点肺组织中羟脯氨酸均明显减少（p<0.01或p<0.05），丹参+川芎、炙黄芪+丹参组虽也有所减少，但差异不明显（p>0.05）；与西药组比较：炙黄芪+广地龙组大鼠在第7天肺组织中羟脯氨酸减少明显（p<0.05）（见表2）。
法各组大鼠血清inf-γ、il-4的含量测定结果
3.1各组大鼠血清inf-γ的含量
与空白对照组相比，其他各组大鼠血清的inf-γ在3个时间段均明显降低（p＜0.01）；与模型对照组相比，西药组、炙黄芪+三七组及炙黄芪+广地龙组大鼠血清的inf-γ在3个时间段均明显升高（p＜0.01或p＜0.05），丹参+川芎、炙黄芪+丹参组大鼠血清中inf-γ在14天、28天均有所升高（p＜0.05）；与西药组比较：炙黄芪+广地龙、炙黄芪+三七组均差异无统计学意义（p＞0.05），炙黄芪+三七组、炙黄芪+丹参组大鼠血清的inf-γ在28天明显降低（p＜0.01），于7天、14天均差异无统计学意义（p＞0.05）。（见表3）
3.2各组大鼠血清il-4的含量测定结果
与空白对照组相比，模型对照组、炙黄芪+三七组和丹参+川芎、炙黄芪+丹参组大鼠血清的il-4在3个时间段均明显升高（p＜0.01或p＜0.05）；与模型对照组相比，西药组、炙黄芪+三七组、炙黄芪+广地龙组、丹参+川芎、炙黄芪+丹参组大鼠血清的il-4在3个时间段均明显降低（p＜0.01）；与西药组比较：炙黄芪+三七组、炙黄芪+广地龙组大鼠血清的il-4在3个时间段差异无统计学意义（p＞0.05）。（见表4）
4.各组大鼠肺组织inf-γ/il-4mrna表达水平
4.1rt-pcr法检测各组大鼠肺组织inf-γmrna表达水平结果显示：与空白对照组比较，其余各组大鼠肺组织inf-γmrna在3个时间段表达水平显著下调（p<0.01）；与模型对照组比较，西药组、中药各组大鼠肺组织inf-γmrna在3个时间段表达水平显著上调（p<0.01）。与西药组比较，炙黄芪+广地龙组大鼠肺组织inf-γmrna在3个时间段表达水平显著下调（p<0.01）（见表5，图3）
4.2各组大鼠肺组织il-4mrna表达水平
rt-pcr法检测各组大鼠肺组织il-4mrna表达水平结果显示：与空白对照组比较，其余各组大鼠肺组织il-4mrna在3个时间段表达水平显著上调（p<0.01）；与模型对照组比较，西药组、中药各组大鼠肺组织il-4mrna在3个时间段表达水平显著下调（p<0.01）。与西药组比较，炙黄芪+广地龙组大鼠肺组织il-4mrna在3个时间段表达水平与西药相当（见表6，图4）。
本实验研究结果表明，空白对照组大鼠血清中的inf-γ、il-4在实验期间无明显变化。与其相比较，模型对照组大鼠血清中inf-γ含量明显降低，而il-4含量明显增加且在纤维化过程中，两者含量增加与下降的趋势刚好相反。说明两则具有明显的拮抗作用，与文献报道结果一致。经药物干预的各组中，与模型对照组比较，西药与中药各剂量组中大鼠血清inf-γ水平均明显上调，il-4水平则明显降低，提示药物具有促进inf-γ、抑制il-4的作用。尤其值得关注的是，西药组与炙黄芪+广地龙组血清中il-4的含量与空白对照组比较，虽有升高，但不具备统计学意义，提示两者具有明显的抑制血清中il-4的作用。并且炙黄芪+广地龙对inf-γ、il-4的表达调控效果略优于西药组。通过比较免疫组化、rt-pcr法测得的大鼠肺组织内il-4、inf-γ的蛋白和mrna检测结果，炙黄芪+广地龙效果略优于西药组，其余各组均差于西药组。
实施例2本发明制备方法提取工艺条件的实验研究
1、因素水平表
为了选择最佳的水提取工艺，采用正交试验法对影响水提取的主要因素提取时间、提取次数、加水量进行考察，每个因素选择三个水平，具体数值见表1。
、试验方法及数据
取药材（炙黄芪30g，北沙参20g，当归15g，川芎15g，熟地黄15g，地龙15g，炙甘草15g，鸡血藤15g，麦冬15g，浙贝母15g）每份170g，共九份，按照因素水平表和l9（34）正交表进行试验。将每份提取液浓缩，转移至250ml量瓶中，加水定容，摇匀，精密吸取15ml，70℃干燥，得干膏，以黄芪甲苷与毛蕊异黄酮苷含量及干膏率作为考察指标，进行综合评价(干膏率、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、黄芪甲苷含量的权重系数分别为0.2、0.4、0.4)优选最佳提取工艺，具体结果见2。
、方差分析
将正交试验结果进行方差分析，结果见表3。
由表2、3结果可知，b因素是显著性因素，各因素对结果影响主次为b＞c＞a，最佳提取工艺为a3b3c3，结合大生产实际，节约成本，以a1b3c1作为最佳提取工艺，即加水6倍量，提取3次，每次提取1小时。
、验证实验：
取药材170g，共三份，按以上工艺操作，测定黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、出膏率。验证试验结果见表4。
结果表明，水提取工艺稳定，重现性好。
实施例3本发明制备方法分离精制工艺的实验研究。
中药提取液是多种成分的混合物，既有有效成分又有无效杂质，如不除去杂质，会影响制剂的质量和稳定性。本处方采用沉降分离法除去一部分杂质。具体方法为将提取液经过一定时间的静置冷藏后，吸取上清液，弃去沉淀。对提取液浓度，静置时间，静置温度做考察。
1、提取液浓度考察
按处方比例称取药材，按上述工艺煎煮，滤过，滤液浓缩至0.5g生药/ml，1.0g生药/ml，1.5g生药/ml，各取100ml，至量筒中常温静置24小时，结果0.5g生药/ml组沉降明显，固-液分层清晰，1.0g生药/ml组沉降明显，固-液分层基本清晰，1.5g生药/ml组有沉降，但没有完全沉至量筒底部，颜色深，固-液分层不明显，不利于上清液吸出。因此将提取液浓缩至0.5g生药/ml进行沉降，比较合适。
2、静置时间考察
取浓度为0.5g生药/ml100ml两份，分别至量筒中，常温静置24小时、48小时，观察沉淀，结果静置48小时沉淀与静置24小时沉淀相比较，并无明显增多，所以提取液静置24小时即可。
3、静置温度考察
取浓度为0.5g生药/ml100ml两份，分别至量筒中，一份常温放置，一份放冰箱中冷藏（4℃）24小时，结果沉淀量并无明显差异。但是为防止药液变质，放冰箱冷藏为佳。
实施例4本发明临床试验
目的：评价本发明治疗ipf的临床疗效
1.临床资料：
1.1病例来源及分组
本研究观察病例来自辽宁中医药大学附属医院门诊及病房符合入选标准的病例，选择发病三年内早中期肺间质纤维化患者，共观察ipf病人60例；根据随机原则，采用随机数字表法，随机分为试验组与对照组各30例，并根据双盲（研究者和受试者）信封隐藏原则分为中药合剂+激素强的松治疗组与激素强的松组。
1.2试验用药
中药复方合剂（由辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心制剂室提供。浓度:1.13g/ml；提供日期：2016.9.04。规格：500ml/瓶；保存条件：4℃冰箱保存）。主要处方和制法如下：
1.2.1处方：炙黄芪132份，广地龙66份，北沙参88份，当归66份，川芎66份，熟地黄66份，炙甘草66份，鸡血藤66份，麦冬66份，浙贝母66份
1.2.2制法：以上十味，浙贝母酌予碎断，加6倍量水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，浓缩至1500ml，冷藏（4℃～10℃）放置24小时，取上清液浓缩至1000ml，分装，灭菌，即得。
1.3用药方法
试验组（a组）：按配方每付汤药服用2天，每天两次，早饭前30分钟服用50ml，晚饭后半小时服用50ml，服用前将药液加温；服用汤药期间，禁止服用辛辣、鱼腥、发物、生冷、油腻、酸涩的食物和饮料,疗程3个月，联合强的松0.5mg/kg口服一个月，后2个月强的松改为0.25mg/kg。激素组（b组）：强的松0.5mg/kg口服一个月，后2个月强的松改为0.25mg/kg。
1.4诊断标准：
1.4.1病例选择标准
西医诊断标准（参照中华医学会呼吸病学分会特发性肺（间质）纤维化诊断和治疗指南（草案）；中华结核和呼吸杂志2002；（25），7：387.）患者免疫功能正常，且符合以下所有的主要诊断条件和至少3～4条次要诊断条件，可临床诊断为ipf。
主要诊断标准：①除外已知间质性肺病的病因，如某些药物的毒性作用、环境污染和结缔组织疾病所致的ild；②异常的肺功能改变，包括限制性通气功能障碍和(或)气体交换障碍；③胸部hrct表现为双侧肺底部网状阴影，少伴磨玻璃样改变，晚期出现蜂窝肺；④tblb或支气管肺泡灌洗无其他疾病的证据。
次要诊断标准：①年龄>50岁；②隐匿起病或不可解释的运动后呼吸困难；③疾病持续时间≥3个月；④双侧肺底部可闻及吸气性爆裂音。
病情分级标准
重：tlc(肺总量)或dlco(弥散功能)≤40％；或无法完成肺功能检测；
中：40％<tlc(肺总量)或dlco(弥散功能)≤60％；
轻：60％<tlc(肺总量)或dlco(弥散功能)≤80％；
无：80％<tlc(肺总量)或dlco(弥散功能)。
中医肺肾气阴两虚、血瘀阻滞证诊断标准：（参照国家技术监督局发布《中医临床诊疗术语证候部分》和《中药新药临床指导原则》制定：(1)久咳、痰白;(2)气短喘促，动则喘甚，吸气尤难;(3)胸闷、乏力(4)易患感冒;(5)腰膝酸软，耳鸣耳聋，头晕眼花(6)舌暗红或有瘀斑，脉虚弱或沉细尺弱。具备3项即可诊断(其中1、2、6项为必备症状)。
1.4.2纳入及排除标准
纳入标准：
符合特发性肺间质纤维化西医诊断标准；病程小于3年；年龄在50至70岁者；两周内未服用过对试验用药有较大影响的药物。
排除标准：合并心、脑、肺、肝、肾及造血系统严重原发性疾病，以及精神疾病患者；妊娠期或哺乳期患者，以及对试验用药过敏者；近两个月内参加其他研究者；拒绝或不能签署知情同意书者。
1.4.3疗效评定标准
根据中华医学会呼吸分会2002年制定《特发性肺(间质)纤维化诊断和治疗指南(草案)》制定
1.4.4西医疗效评价标准
在3个月的治疗后，如果连续两次的随访符合以下2项以上条件时，则认为对治疗反应良好，病情改善:①症状减轻，活动能力增强。②x线胸片或hrct异常影像减少。③肺功能表现tlc、vc、dlco、pao2较长时间保持稳定。以下数据供参考:tlc或vc增加≥10%，或至少增加≥200ml;dlco增加≥15%或至少增加3ml·min－1·mmhg－1;动脉血氧饱和度(sao2)增加＞4%;心肺运动试验中pao2增加≥4mmhg(具有2项或2项以上者认为肺生理功能改善)。
反应差或治疗失败:①症状加重，特别是呼吸困难和咳嗽。②x线胸片或hrct上异常影像增多，特别是出现了蜂窝肺或肺动脉高压迹象。③肺功能恶化。以下数据供参考:tlc或vc下降≥10%或下降≥200ml;dlco下降≥15%或至少下降≥3ml·min－1·mmhg－1;sao2下降≥4%，或运动试验中肺泡—动脉血氧分压差［p(a-a)o2］增加≥4mmhg(具有2项或2项以上者认为肺功能恶化)。
稳定：治疗3个月后，症状和x线胸片或hrct显示肺间质病变无显著改善或加重。
1.4.5中医证候疗效判定标准：
根据尼莫地平法积分法判定，计算方法：疗效指数＝（疗前积分－疗后积分）/疗前积分×100％
①临床控制症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≧95％
②显效症状、体征明显改善，证候积分减少≧70％＜95％
③有效症状、体征均有好转，证候积分减少≧30％＜70％
④无效症状、体征均无明显改善，甚或加重，证候积分减少＜30％
1.5评价指标：
1.5.1安全性指标
①一般记录项目：
试验开始日期，知情同意书签署日期，既往用药，伴随疾病等。
人口学特征：性别、年龄、身高、体重、民族。
生命体征：体温、静息脉率、呼吸、休息10分钟后的血压（收缩压、舒张压）。
影响疗效因素：过敏史、用药史、患病史、合并用药情况。
依从性观察：能否按时、按量用药；是否自行使用其它药物。
②血、尿、便常规，心电图、肝功能（alt、ast）、肾功能（bun、cr）检测、x线胸片、凝血机制试验，6分钟步行试验。
③不良反应
1.5.2临床效应指标
①临床症状：咳嗽、呼吸困难、6分钟步行试验。
②中医肺肾气阴两虚兼血瘀阻滞证的症状分级量化。
中医症状积分标准：（参考《中药新药临床研究指导原则》）
喘息：重(6分)：安静时喘息不能平卧；中(4分)：安静时喘息不著，稍事活动后即加重；轻(2分)：明显活动(如登楼、劳作等)后喘息；无(0分)：活动后不觉喘息。
憋气：重(6分)：安静时憋气不能平卧；中(4分)：安静时憋气不著，稍事活动后即加重；轻(2分)：明显活动(如登楼、劳作等)后轻度憋气；无(0分)：活动后不觉憋气。
胸闷：重(6分)：安静时胸闷严重；中(4分)：安静时胸闷不著，稍事活动后即加重；轻(2分)：明显活动(如登楼、劳作等)后轻度胸闷；无(0分)：活动后不觉胸闷。
气短：重(6分)：安静时气短不得接续，不能平卧；中(4分)：安静时气短不著，稍事活动后即加重；轻(2分)：明显活动(如登楼、劳作等)后轻度气短；无(0分)：活动后不觉气短。
咳嗽：重(6分)：昼夜咳嗽频繁，影响工作及睡眠；中(4分)：阵咳，不影响睡眠；轻(2分)：间断咳嗽；无(0分)：无咳嗽。
咯痰：多(3分)：24h痰量在100ml以上；中(2分)：24h痰量50～100ml；轻(1分)：偶有痰，24h痰量20～50ml；无(0分)：无痰
velcros音：多(6分)；两肺满部；中(4分)：双肺散在velcros音；轻(2分)：一侧肺可闻及；
无(0分)：双肺未能闻及。
湿性啰音：多(6分)；两肺满部；中(4分)：双肺散在湿啰音；轻(2分)：一侧肺可闻及；无(0分)：双肺未能闻及。
干性啰音：多(6分)；两肺满部；中(4分)：双肺散在干啰音；轻(2分)：一侧肺可闻及；无(0分)：双肺未能闻及。
腰膝酸软：重(6分)：一直有；中(4分)：经常用；轻(2分)：偶尔有；无(0分)：从来没有。
痰中带血：有（2分）：痰中有血丝。无（0分）：痰中无血丝。
发热：有（2分）：体温在37.5以上。无（0分）：体温在37.4以下。
咽痛：有（2分）：有咽痛；无（0分）：无咽痛。
汗出：有（2分）：时有汗出；无（0分）：无汗出
口干：有（2分）：自觉口舌咽干燥；无（0分）：无口舌咽干燥
疲倦：有（2分）：自觉明显疲倦乏力；无（0分）：无疲倦乏力
心慌：有（2分）：自觉心慌，活动后明显；无（0分）：无心慌
口渴欲饮：有（2分）：口咽干燥明显；无（0分）：无口咽干燥
口唇紫暗：有（2分）：口唇紫暗明显；无（0分）：无口唇紫暗
爪甲紫暗：有（2分）：爪甲紫暗明显；无（0分）：无爪甲紫暗
杵状指：有（2分）：有明显杵状指；无（0分）：无杵状指
舌象：有异常（2分）暗，胖，苔白或黄等；无异常（0分）淡红舌，薄白苔。
脉象：有异常（2分）沉滑等；无异常（0分）虚数。
③理化指标：肺功能：通气功能检测，肺活量（fvc、vc）、残气量（rv）、肺总量（tlc）或肺一氧化碳弥散功能(dlco)的变化；血气分析：pco2、sao2、pao2；六分钟步行试验；tgf-β、il-4、il-13、il-12、ifn-γ测定。
1.6统计分析
计量资料样本均数间两两比较采用方差分析，分类资料的统计分析采用χ2检验，均以α=0.05为检验水准，p＜0.05认为差异有统计学意义。本试验资料均采用spss15.0软件包进行统计学处理。
2.结果及分析：
2.1.两组病例分布
本中心入组病例数共60例，其中a组30例，b组30例，a组完成26例，b组完成27例，共完成53例合格病例。
2.2治疗前人口学基线比较
治疗前两组之间性别（p＝0.678）、年龄（p＝0.241）比较差异无统计意义（p>0.05），具有可比性。
2.3临床症状总积分比较。
治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组临床症状积分组内比较均有统计学差异（治疗组p=0.000，对照组p=0.000），且治疗后均值小于治疗前，说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂治疗ipf均能改善患者的临床症状；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行症状积分的组间比较：疗程30天时，两组之间无统计学差异（p=0.330），疗程60天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），疗程90天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），（注：两组基线水平无统计学差异，p=0.727，疗程60天、90天时，治疗组症状积分均值小于对照组），说明随着疗程的增加（>60天），激素联合中药复方合剂在症状改善方面的作用优于激素。
2.4血气分析结果比较。
治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组po2、pco2组内比较均有统计学差异（治疗组p=0.000，对照组p=0.000），且治疗后均值大于治疗前，说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂治疗ipf均能改善患者的po2、pco2；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行po2的组间比较：疗程30天时，两组之间无统计学差异（p=0.511），疗程60天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），疗程90天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），（注：两组基线水平无统计学差异，p=0.238，疗程60天、90天时，治疗组po2均值大于对照组）。治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行pco2的组间比较：疗程30天时，两组之间无统计学差异（p=0.852），疗程60天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），疗程90天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），（注：两组基线水平无统计学差异，p=0.797，疗程60天、90天时，治疗组pco2均值小于对照组）。说明随着疗程的增加（>60天），激素联合中药复方合剂在po2、pco2改善方面的作用优于激素。治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组so2组内比较均无统计学差异（p>0.05），说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂对ipf患者so2指标无影响；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行so2指标的组间比较：疗程30天、60天、90天时，两组之间均无统计学差异（p>0.05），（注：两组基线水平无统计学差异，p>0.05），说明本研究中，激素联合中药复方合剂在so2改善方面的作用与激素相当。
2.5肺功能结果比较。
治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组tlc、vc、fev1/fvc组内比较均无统计学差异（p>0.05），说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂对ipf患者tlc、vc、fev1/fvc指标无影响；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行tlc、vc、fev1/fvc指标的组间比较：疗程30天、60天、90天时，两组之间均无统计学差异（p>0.05），（注：两组基线水平无统计学差异，p>0.05），说明本研究中，激素联合中药复方合剂在tlc、vc、fev1/fvc改善方面的作用与激素相当。
治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组dlco、fev1组内比较均有统计学差异（dlco治疗组p=0.001，对照组p=0.000；fev1治疗组p=0.000，对照组p=0.000），且治疗后均值大于治疗前，说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂治疗ipf均能改善患者的dlco、fev1；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行dlco、fev1指标的组间比较：60天、90天时，两组之间均无统计学差异（p＜0.05），（注：两组基线水平无统计学差异，p>0.05），说明本研究中，激素联合中药合剂在dlco、fev1改善方面的作用优于激素，并可能与疗程成正比。
2.6六分钟步行试验。
治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组6min步行距离组内比较均有统计学差异（治疗组p=0.000，对照组p=0.004），且治疗后均值大于治疗前，说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂治疗ipf均能改善患者的6min步行距离；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行6min步行距离的组间比较：疗程30天时，两组之间无统计学差异（p=0.554），疗程60天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），疗程90天时，两组之间有统计学差异（p=0.000），（注：两组基线水平无统计学差异，p=0.771，疗程60天、90天时，治疗组6min步行距离均值大于对照组），说明随着疗程的增加（>60天），激素联合中药复方合剂在6min步行距离改善方面的作用优于激素。
2.7炎症因子测定。
治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组tgf-β、il-4、il-13组内比较均有统计学差异（治疗组p=0.000，对照组p=0.000），且治疗后均值小于治疗前，说明本研究中，激素组与激素联合中药复方合剂治疗ipf均能改善患者的tgf-β、il-4、il-13；治疗前与治疗后（90天），治疗组与对照组il-12、ifn-γ组内比较均有统计学差异（治疗组p=0.000，对照组p=0.000），且治疗后均值大于治疗前，说明本研究中，激素与激素联合中药复方合剂治疗ipf均能改善患者的il-12、ifn-γ；治疗组与对照组在治疗后30天、60天、90天分别进行tgf-β、il-4、il-13、il-12、ifn-γ指标的组间比较：60天、90天时，两组之间均无统计学差异（p＜0.05），（注：两组基线水平无统计学差异，p>0.05），说明本研究中，激素联合中药复方合剂能够调节tgf-β、il-4、il-13、il-12、ifn-γ的表达，其作用与优于激素组，可能与疗程成正比。
2.8疾病疗效结果。
试验组总有效率为100%，激素组总有效率为85.19%，两组比较有统计学差异（p=0.041），说明激素联合中药复方合剂在总有效率改善方面的作用优于激素组。
结论。
本研究中，激素联合中药复方合剂与激素均能够改善ipf患者的临床症状，改善po2、pco2等血气分析指标，改善dlco、fev1等肺功能指标，改善6min步行距离以及改善ipf患者血清tgf-β、il-4、il-13、il-12、ifn-γ等分子指标，而在改善患者临床症状、po2、pco2、dlco、fev1、六分钟步行试验、炎症因子等关键结局指标方面，激素联合中药复方参龙合剂效果优于激素，且与治疗疗程有一定关系。