H4激动剂分子用于治疗特发性肺纤维化的用途的制作方法

本发明涉及化学物质1-(7-氨基-4,5,6-三乙氧基-1-氧代-1,3-二氢-3-异苯并呋喃基)-8-甲氧基-2-甲基-6,7-亚甲二氧基-,2,3,4-四氢异喹啉或三乙氧喹的左旋对映异构体和右旋对映异构体用于治疗特发性肺纤维化的用途。

背景技术

特发性肺纤维化(ipf)是间质性肺病家族中的200种肺部疾病中的一种，其影响肺间质，即位于肺的肺泡间隔之间的组织。

特发性肺纤维化是特发性间质性肺病，其又是间质性肺病，也被称为弥漫性实质性肺病。

特发性肺纤维化是罕见疾病(约13例至20例/100,000个居民的患病率)，其属于慢性演变的特发性弥漫性间质性肺病组中最常见的形式(60％的病例)并且是最严重的。

与已知医学原因的间质性弥漫性肺病(例如，由药物引起的间质性肺病或尘肺病)相反，在不存在确定的特定原因或背景的情况下发生特发性弥漫性间质性肺病。

特发性肺纤维化最近被定义在国际共识分类的框架内。术语特发性肺纤维化之前包括若干现在非常不同的实体，并且特别是已经被认为是特发性弥漫性间质性肺病组中的解剖临床实体的非特异性间质性肺病。

特发性肺纤维化的定义现在限于其中肺活组织检查示出常见间质性肺病(通常为间质性肺炎)的组织病理学方面的特发性弥漫性间质性肺病的病例。

还需要特征性计算机断层扫描异常和呼吸功能效应，以便保持特发性肺纤维化的诊断。诊断基于解剖学-放射学-临床总结。

特发性肺纤维化开始于60岁至70岁之间，其中男性略占优势。它在50岁的年龄之前是罕见的。

疾病逐渐演变成慢性呼吸衰竭和死亡，其中中位生存时间为约3年，并且10年生存率仅为约10％。

疾病通过具有逐渐发展的劳力性呼吸困难、无痰干咳以及更罕见的一般病征揭示。在检查期间，基部的两侧干噼啪声(再现“维可牢(velcro)”的声音)是恒定的。

近一半的病例中存在杵状指甲。仅在疾病的晚期才观察到发绀和右心室衰竭的病征。

在已经标志功能和计算机断层扫描异常的阶段，诊断通常太晚。胸部x线照片清楚地示出基部中明显突出的外周网状影以及肺容量的减小。

毫米切片胸部计算机断层扫描是诊断的必要检查：特征性方面示出基部的网状影，从而产生假囊性胸膜下蜂窝状外观、牵拉性支气管扩张和肺实质变形病征，几乎没有磨玻璃影；肺功能检验示出限制性通气障碍(肺活量和总肺容量降低)。通过降低一氧化碳(co)转移因子和系数证明还存在肺泡-毛细血管膜的功能性障碍。低氧血症通常在休息时不存在，但在运动期间会出现；运动性低氧血症有时是最初唯一的呼吸功能异常。

患有特发性肺纤维化的患者患有支气管癌的风险也增加。

如果疾病的总体预后不良，那么存在实质性的个体间差异。最近的若干研究使得识别预后因素成为可能：

-在诊断后的几个月期间，呼吸功能恶化是不利因素。由此，6个月内用力肺活量降低10％或更多，或12个月内co扩散量降低15％或更多，是高死亡风险的独立预测因素。

-在6分钟的平板试验期间存在饱和度小于88％是不良预后的预测因素。

-在演变期间肺动脉高血压的发生也是不良预后。

-co转移因子的实质性变化。

-胸部计算机断层扫描的蜂窝状病变的程度，以及肺活组织检查中成纤维细胞爆发的数量。

特发性肺纤维化的治疗旨在增加预期寿命、呼吸功能、生活质量以及预防疾病急性加重的风险。

迄今为止，没有治疗证明其在改善此疾病的生存率的疗效。迄今为止，不存在治愈性治疗。根据法国国家卫生管理局(frenchnationalauthorityforhealth)(has)，在疾病加重并达到严重阶段的患者中，氧疗和肺移植是推荐治疗方法。

然而，两种药物已经获得营销授权：

-一方面，其中吡非尼酮(pirfenidone)(esbriet)的生存率结果的意义很小或没有。吡非尼酮的作用方式尚不清楚。吡非尼酮用于治疗轻度至中度ipf。此产品以大约2.4克/天的非常高的剂量使用。

根据法国国家卫生管理局(has)，根据评估肺功能和疾病进展标志的中间标准，了解吡非尼酮的疗效。相对于安慰剂，在此标准上观察到的差异有利于吡非尼酮，但此差异很小，临床意义尚不十分清楚，并且从一项研究到另一项研究是不同的。

用esbriet观察到的对具有精确功能标准(fvc≥50％并且dlco≥35％)的患者的肺功能下降的效果低。由于临床相关标准(生活质量、总生存率等)经历探索性和非稳健性分析，所以难以了解带给患有特发性肺纤维化的患者的临床益处。然而，患者的合并研究使得有可能在某些患者概况上揭示生存率的显著改善。

观察到的吡非尼酮的主要不良反应是胃肠道病症(恶心、腹泻、消化不良)、皮肤病症(光敏和皮疹)以及代谢和营养失调(厌食和食欲不振)。

-另一方面，以ofev的商业名称已知的尼达尼布(nintedanib)最近在美国被批准用于治疗特发性肺纤维化。它还收到欧洲药品管理局(europeanmedicinesagency)(ema)的chmp的赞同意见，并且等待欧洲一级的营销授权。尼达尼布的作用方式在于酪氨酸激酶抑制剂。此产品的使用剂量为200毫克/天至400毫克/天。已经观察到许多副作用，特别是胃肠道副作用。

法国国家卫生管理局认为不推荐以下内容(不存在可接受的研究方法、不存在功能判断的标准的证明)：作为单一疗法的类皮质激素、秋水仙碱、环胞素a、干扰素γ1b、波生坦(bosentan)、依那西普(etanercept)、类皮质激素/免疫调节剂联合和乙酰半胱氨酸/泼尼松/硫唑嘌呤三联疗法。

在特发性肺纤维化期间揭示氧化剂-抗氧化剂失衡。n-乙酰半胱氨酸(谷胱甘肽的前体，肺中的主要抗氧化剂中的一个)被评估为治疗特发性肺纤维化。

最近用n-乙酰半胱氨酸(1,800mg/d，持续一年)[除用类皮质激素和硫唑嘌呤治疗之外]的随机对照试验示出适度的呼吸功能性益处，其中用力肺活量下降平均降低0.18l(0.03-0.32)，即9％的相对差异，co扩散的相对差异为24％，但两组之间的死亡率不存在差异。

法国国家卫生管理局认为，对某些患者可给予乙酰半胱氨酸，其已经用低水平证据示出肺活量恶化的速度减慢。迄今为止，此产品不具有营销授权。

目前正在研究许多产品，以用于治疗特发性肺纤维化：

单克隆抗体(处于第ii阶段的lebrikizumab和处于第iii阶段的tralokinumab)在2015年的状况不确定。

由百时美施贵宝公司(bristol-myers-squibb)开发的bms-986202(溶血磷脂酸受体拮抗剂)目前处于第ii阶段。

超过154项研究正在进行中，但目前很少有产品通过第ii阶段，因为结果特别平庸。

由此，目前特发性肺纤维化是病理，几乎没有真实有效的商业上可用的治疗方法(迄今为止，只有用于轻度ipf和中度ipf的esbriet)。

技术实现要素：

三乙氧喹是现在已知多年的化学物质，并且被用作抗组胺药。其制造在法国专利1.295.309中描述。

三乙氧喹是7-氨基-4,5,6-三乙氧基-3-(5,6,7,8-四氢-4-甲氧基-6-甲基-1,3-间二氧杂环戊烯并[4,5-g]-5-异喹啉基)苯酞。在其上市的药物形式中，其具有对映异构体的混合物的形式。

已知三乙氧喹由于其对组氨酸脱羧酶的抑制作用而具有抗过敏活性。然而，此活性非常低，并且不能解释它对各种临床症状、鼻炎、荨麻疹、湿疹、肥大细胞增多症的许多特性。

发明人中的一个与其它发明人一起已经证明，三乙氧喹对新受体(组胺h4受体)具有非常实质性的作用。

三乙氧喹对h4受体的此活性在terrasse和coll的专利us2010144718a“由h4受体激动剂调节的疾病的治疗(treatmentofdiseasesmodulatedbyah4receptoragonist)”中证明。

然而，此专利没有描述三乙氧喹对特发性肺纤维化的活性。

关于h4激动剂的另一专利wo2008006974a2描述这些产品在化疗框架中保护造血前体的用途。

专利wo2008006974a2和其它科学文献没有揭示h4激动剂对组胺在特发性肺纤维化中的作用。

商业三乙氧喹具有白色粉末的形式，对光高度敏感，使其在可他宁(cotarnine)和邻苯二甲酸中降解。

商业三乙氧喹(被称为酞茂异喹)呈片剂形式，其中每片含量为100mg。

三乙氧喹具有2个不对称碳，但商业形式是2种对映异构体(r-r和s-s)的混合物。

附图说明

图4a示出不对称碳的存在，其被记为a和b。

图4b示出异构体d1的形式。

图4c示出异构体d2的形式。

图5参考h4激动剂比较三乙氧喹和氯苯丙替(clobenpropit)。此图揭示三乙氧喹能够抑制h4受体中富含的cfu的增殖。当使用抗h4时，三乙氧喹的活性像氯苯丙替的活性一样实质性降低。这很好地证明三乙氧喹是h4激动剂分子。

发明人已经揭示在特发性肺纤维化的常规动物模型，即博来霉素(bleomycin)小鼠模型中三乙氧喹的惊人特性。

图3a解释使用的治疗方案。将博来霉素吸入5天以便引起肺纤维化。从d14开始，每天口服给予三乙氧喹直至d28。

此模型中使用的剂量为20mg/kg和40mg/kg，其大约是70kg的成年男性1.4克/天至2.8克/天的剂量。

图1a示出三乙氧喹对以ng/mg组织表示的tgfβ分泌的治疗效果。

图2a示出用吡非尼酮作为对照，三乙氧喹对胶原蛋白分泌的效果。

图2b示出用吡非尼酮作为对照，三乙氧喹对解剖评分的治疗效果。

图3b示出博来霉素对肺组织的效果。

具体实施方式

治疗方案

用每组10只小鼠的所有小鼠(物种：c57/b16j，进一步称为bl6)进行博来霉素小鼠治疗方案(blm)；这些小鼠是8周龄的雌性小鼠。

分别对每组的所有动物进行纤维化分析。使用各种定量和半定量方法在生物化学、组织学和细胞学上分析纤维化的程度。

根据下文的治疗方案处理所有小鼠bl6。

-评估5组小鼠。

用博来霉素(blm)治疗根据以下治疗方案进行：

所有组的所有小鼠(组1除外)连续5天鼻内接收博来霉素(blm)(经由鼻内滴注3mg/kg)，并且将被每天监测并在blm滴注后的d+29时被杀死以便研究慢性肺部炎症和纤维化。博来霉素在8周龄时给予五次(参见图3a)。

在小鼠的整个寿命期间，以2个剂量(20毫克/千克/天和40毫克/千克/天)进行用三乙氧喹治疗。用博来霉素首次吸入治疗后第十四天开始用三乙氧喹治疗。治疗是口服进行的。所研究的组如下：

1.bl6小鼠nacl

2.bl6小鼠blm+载体

3.bl6小鼠blm+吡非尼酮(100mg/kg，po)

4.bl6小鼠blm+三乙氧喹(20mg/kg，po)

5.bl6小鼠blm+三乙氧喹(40mg/kg，po)

组织学

在支气管肺泡灌洗(bal)和肺灌注后，将大肺叶固定在4％缓冲甲醛中，以用于标准显微镜分析(leica显微镜)。通过使用标准技术用马森(masson's)三色剂(tm)使3-mm切片着色，其允许评估纤维化(tm)，因为胶原蛋白的纤维呈蓝色，并且观察炎症程度。

由两名独立的观察者随严重程度的增加通过半定量评分(0-5)(ashcroft评分)评估纤维化。

由两名独立的观察者随严重程度增加使用0-5的半定量评分评估位于肺泡壁和支气管周围区域的胶原蛋白的沉积以及炎性细胞的浸润的纤维化。

胶原蛋白(羟脯氨酸)的滴定

胶原蛋白含量在肺均质化后进行。在支气管肺泡灌洗(bal)后，用盐水溶液通过心脏的右心室灌注整个肺，以便排空血管内容物。

将肺在-70℃下冷冻直至使用它们时。然后将肺在pbs中均质化并且离心。

弃去上清液，并且将较低部分放回到含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵(htab)和5mm乙二胺四乙酸(edta)的1mlpbs中的悬浮液中。

在离心后，如由制造商所述，通过sircol测定法(法国的法国生物化学部门(francebiochemdivision,france))确定胶原蛋白含量。

细胞因子的测量

在肺匀浆中测量干扰素γ和tgfβ水平；根据制造商的说明，使用magpix(法国的伯乐公司(biorad,france))通过luminex测定法确定这些不同细胞因子的浓度。

结果

根据通过半定量评分(0-5)(ashcroft评分)评估的方法的组织学测量给出以下结果：

对于组织学，吡非尼酮试验100mg/kg对博来霉素。

·配对t试验(学生试验)

·p值0，0449

·p值汇总：p<0.05是试验显著吗？是

试验高度显著吗？否，在显著性极限处差异低(p＝0.045)。

平均值±标准偏差(博来霉素)：4.2±0.14，n＝10

平均值±标准偏差(吡非尼酮)：3.8±0,12n＝10

两个平均值之间的差异：-0.40±0.18

结论：吡非尼酮在显著性极限处的疗效。

对于组织学，三乙氧喹试验20mg/kg对博来霉素。

·配对t试验(学生试验)

·p值<0，0002

·p值汇总：p<0.0002是试验显著吗？是

试验高度显著吗？是，差异非常高(p＝0.0002)非常高的显著性。参见图2a。

结论：具有高显著性的三乙氧喹的疗效非常高

三乙氧喹不管是以20mg/kg还是40mg/kg的剂量，都实质性降低组织学评分，并且这是高度显著的。吡非尼酮处于显著性极限(p0.045)，而对于三乙氧喹，差异高度显著(对于20mg/kg的剂量，p＝0.0001)-参见图2b。

胶原蛋白的滴定(通过羟脯氨酸剂量的方法)以μg/mg蛋白质表示。

对于胶原蛋白(羟脯氨酸)，吡非尼酮试验100mg/kg对博来霉素。

·非配对t试验(学生试验)

·p值0，0450

·p值汇总：p<0.05是试验显著吗？是

试验高度显著吗？否，在显著性极限处差异低(p＝0.045)。

平均值±标准偏差(博来霉素)：340.0±4.888，n＝10

平均值±标准偏差(吡非尼酮)：316.5±9.748，n＝10

两个平均值之间的差异：-23.50±10.90

结论：吡非尼酮在显著性极限处的疗效(p045)。

对于胶原蛋白(羟脯氨酸)，三乙氧喹试验20mg/kg对博来霉素。

·非配对t试验(学生试验)

·p值<0,0001

·p值汇总：p<0.0001是试验显著吗？是

试验高度显著吗？是，差异非常高(p＝0.0001)非常高的显著性。

平均值±标准偏差(博来霉素)：340.0±4.888，n＝10

平均值±标准偏差(三乙氧喹20mg/kg)：280.0±7.528，n＝10

两个平均值之间的差异：-60.00±8.975

结论：具有高显著性的三乙氧喹的疗效非常高。

三乙氧喹对抑制胶原蛋白形成具有远高于吡非尼酮的强作用。显著性也是实质性的(p＝0,0001)-参见图2a。

细胞因子的剂量：三乙氧喹也强烈抑制tgfβ。(p＝0.001)和吡非尼酮一样(p＝0.001)参见图1a。

三乙氧喹可以其“片剂”形式之外的不同形式(例如以程序化崩解的软胶囊、糖浆、口服凝胶、胶囊或片剂的形式)使用而不改变其疗效。

三乙氧喹已经以3mg/kg的剂量用于人类中，但从未用于特发性肺纤维化中，然而此剂量在此病理中应该对人类有活性。

实际上，用于动物中的剂量通常比用于人类中的剂量高10倍。例如，esbriet以100mg/kg的剂量用于小鼠中，而用于人类中中的剂量仅为15mg/kg。

对于三乙氧喹，此剂量比毫无疑问是相同的。那么可为有效的剂量应为3mg/kg至40mg/kg。