本发明涉及家禽医药技术领域，尤其是一种家禽活疫苗稀释液佐剂及其制备方法与应用。
背景技术：
佐剂(adjuvant)又称免疫调节剂(immunomodulator)或免疫增强剂(immunoenhancement)，是指先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的一类物质。佐剂的英文名adjuvant来源于拉丁文“adjuvare”，意思为“帮助”。佐剂作为疫苗的主要成分其作用主要有：(1)使抗原缓慢释放；(2)延长抗原在体内停留时间；(3)扩大抗原的表面积；(4)促进局部的炎症反应；(5)增强吞噬细胞的吞噬与抗原提呈。
自从1925年法国免疫学家ranmon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异性地增强机体的免疫反应以来，至今免疫佐剂的发展已近90年。佐剂种类很多，按其性质可分为：矿物盐类佐剂、皂苷类佐剂、微生物衍生物类佐剂、油乳剂佐剂、微粒抗原递呈系统佐剂、细胞因子佐剂、多糖类佐剂等，其中目前最常用的是铝盐佐剂和油乳剂佐剂，但它们也有一些不可避免的缺点，如油佐剂存在粘滞性大、稳定性不佳及注射局部反应明显，在机体内降解吸收慢、残留时间长、影响肉品的外观及食用安全，不能有效刺激t细胞免疫，引起免疫抑制；铝盐佐剂则是不足以诱导较弱抗原的免疫反应且不能诱导细胞介导的免疫应答，皮下注射时常有持续性肉芽肿，不能很好的吸收。目前国内市场上活疫苗基本采用生理盐水或者磷酸盐缓冲液来进行稀释，稀释后的疫苗溶液不含免疫调节剂物质，病毒抗原不能良好的诱导机体产生非特异性与特异性免疫应答，因此新型的活疫苗免疫佐剂在市场上极具应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供一种家禽活疫苗稀释液佐剂及其制备方法与应用，将它应用在家禽活疫苗中能增强原有冻干疫苗免疫抗体水平，其制备方法简单易行。
本发明是这样实现的：家禽活疫苗稀释液佐剂，每1ml该稀释液佐剂中含有1mg左旋咪唑、0.3～1mg活性多糖、5mg转移因子、3mg新鱼腥草素钠，其余为磷酸盐缓冲液。
所述的活性多糖为壳聚糖和菊粉多糖。
家禽活疫苗稀释液佐剂的制备方法，包括如下步骤：
a)配制高浓度母液：
1)左旋咪唑母液：将盐酸左旋咪唑干粉溶解于灭菌注射用水中，配制成浓度为100mg/ml的盐酸左旋咪唑液，将盐酸左旋咪唑液于116℃湿热灭菌30min后，获得左旋咪唑母液，在4℃保存备用；
2)活性多糖母液：将壳聚糖与菊粉多糖粉末溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制得到含壳聚糖、菊粉多糖浓度分别为100mg/ml、30mg/ml的活性多糖母液，4℃保存备用；
3)转移因子母液：将转移因子干粉溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为500mg/ml的转移因子母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用；
4)新鱼腥草素钠母液：将新鱼腥草素钠晶体粉末溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为300mg/ml的新鱼腥草素钠母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用；
b)配制工作浓度稀释液佐剂：
按上述质量浓度比例分别取左旋咪唑母液，活性多糖母液，转移因子母液、新鱼腥草素钠母液及灭菌的磷酸盐缓冲液，将上述各组分混合均匀后，过0.22μm滤膜除菌，获得每1ml含左旋咪唑1mg、活性多糖0.3～1mg、转移因子5mg及新鱼腥草素钠3mg的疫苗稀释液佐剂。
家禽疫苗稀释液佐剂在家禽活疫苗中的应用，将家禽活疫苗与所述的疫苗稀释液佐剂按体积比为1:15～1:20混合溶解后，获得含佐剂的家禽活疫苗，以提高家禽活疫苗的免疫效果。
所述的家禽活疫苗为家禽传染性法氏囊病活疫苗，家禽新城疫活疫苗或家禽传染性支气管炎活疫苗。
左旋咪唑是(levamisolum)是一种广谱驱肠虫药，同时也是第一个被发现具有免疫调节作用的人工合成化合物，具有广泛的免疫调节活性，可促进细胞和体液免疫促进淋巴细胞增殖。壳聚糖(chitosan)是由几丁质经过脱乙酰作用得到的多糖。研究发现，壳聚糖作为疫苗佐剂能提高局部粘膜的吸收性、介导药物传递，此外还能提高机的局部性抗体反应，促进抗体产生。菊粉(inulin)属于线型菊糖型果聚糖，可以改善动物肠道环境，促进机体免疫器官发育，提高血液中免疫球蛋白含量，调节机体免疫能力。转移因子(transferfactor,tf)，又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生。转移因子能够活化巨噬细胞、提高体内白介素ii、干扰素等人多种细胞因子在体内的生成，具有触发和调节细胞免疫功能，是一种新型的免疫激发剂。新鱼腥草素钠(sodiumnewhouttuyfonate,snh)是人工合成物与亚硫酸氢钠的加成复合物，它既有一定的抑菌作用，又能提高机体免疫力，增强白细胞的吞噬活性，提高机体非特异性免疫功能。
由于采用了以上技术方案，本发明经过特定的筛选及组合，制备获得家禽活疫苗稀释液佐剂，将该获得的佐剂应用在家禽活疫苗中，能增强原有冻干疫苗免疫抗体水平，提高家禽活疫苗的免疫效果，且该佐剂的制备方法简单易行，成本低廉，使用效果好。
附图说明
图1是ndvhi抗体效价动态监测结果图；
图2是γ干扰素动态检测结果图；
图3是白细胞介素4动态检测结果图；
图4是白细胞介素10动态检测结果图；
图5是t淋巴细胞亚群(cd3，cd4，cd8)动态检测结果图；
图6是本发明免疫调节剂对ibdv抗体的影响结果图；
图7是本发明免疫调节剂对新支二联活疫苗ndv抗体的影响结果图；
图8是本发明免疫调节剂对新支二联活疫苗ibv抗体的影响结果图。
具体实施方式
本发明的实施例1：家禽活疫苗稀释液佐剂，每1ml该稀释液佐剂中含有1mg左旋咪唑、0.3～1mg活性多糖、5mg转移因子、3mg新鱼腥草素钠，其余为磷酸盐缓冲液。
所述的活性多糖为壳聚糖和菊粉多糖。
家禽活疫苗稀释液佐剂的制备方法，包括如下步骤：
a)配制高浓度母液：
1)左旋咪唑母液：将盐酸左旋咪唑干粉溶解于灭菌注射用水中，配制成浓度为100mg/ml的盐酸左旋咪唑液，将盐酸左旋咪唑液于116℃湿热灭菌30min后，获得左旋咪唑母液，在4℃保存备用；
2)活性多糖母液：将适量的壳聚糖、菊粉多糖粉末溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制得到含壳聚糖、菊粉多糖浓度分别为100mg/ml、30mg/ml的活性多糖母液，4℃保存备用；
3)转移因子母液：将转移因子干粉溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为500mg/ml的转移因子母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用；
4)新鱼腥草素钠母液：将新鱼腥草素钠晶体粉末溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为300mg/ml的新鱼腥草素钠母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用；
b)配制工作浓度稀释液佐剂：
以100ml佐剂为例进行配制时，分别取100mg/ml的左旋咪唑母液1ml，0.3～1mg/ml的活性多糖母液1ml，500mg/ml的转移因子母液1ml，300mg/ml的新鱼腥草素钠母液1ml，与其余为灭菌的磷酸盐缓冲液稀释混合均匀后0.22μm滤膜除菌，即为每1ml含左旋咪唑1mg、活性多糖0.3～1mg、转移因子5mg、新鱼腥草素钠3mg的疫苗稀释液免疫调节剂。
本发明的实施例2：家禽疫苗稀释液佐剂在鸡新城疫活疫苗中的应用
一、实验材料
1.试验动物：spf种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，孵化后置贵州福斯特生物科技有限公司动物房负压隔离区进行饲养。
2.疫苗：鸡新城疫活疫苗(lasota株)由贵州福斯特生物科技有限公司生产。
3.佐剂成分：配制所用左旋咪唑购自桂林南药股份有限公司；壳聚糖购自sigma公司、菊粉多糖购自比利时beneo-orafit公司；转移因子购自杭州善牧生物工程有限公司；新鱼腥草素钠购自武汉大华伟业医药化工有限公司。
二、实验方法
1.佐剂溶液配制
按实施例1所述方法制备得到家禽疫苗稀释液佐剂。
2.分组情况
选取体重基本一致的spf雏鸡120羽，随机分为2组，每组60羽于负压隔离区中分别饲养，于7日龄通过滴鼻接种疫苗，一组接种0.03ml用灭菌磷酸盐缓冲液稀释的鸡新城疫活疫苗，另一组接种0.03ml含免疫佐剂的鸡新城疫活疫苗。
3.抗体检测
3.1血清制备
每组每次随机取5羽试验鸡，每周心脏或翅下静脉取血一次，3500rpm离心，转移上层透明血清(至少需要200μl)，-20℃低温保存待测。
3.2血清抗体检测
参照现行《中华人民共和国兽药典》红细胞凝集抑制试验法进行检测：测定血清中鸡新城疫抗体效价。
4.t淋巴细胞亚群检测
参照t淋巴细胞亚群(cd3，cd4，cd8)elisa检测试剂盒说明书进行测定。
5.细胞因子检测
将每周采集到的鸡血清进行相关细胞因子的检测，参照鸡血清ifn-γ细胞因子elisa检测试剂盒说明书、鸡血清il-4细胞因子elisa检测试剂盒说明书和鸡血清il-10细胞因子elisa检测试剂盒说明书进行。
三、实验结果
1.ndvhi抗体效价动态监测结果
由图1可知，免疫调节剂在疫苗免疫初期能较早的促进ndv保护抗体产生，并维持较高的抗体滴度。
2.γ干扰素动态检测结果
由图2可知，在鸡的外周血γ干扰素含量这一指标中，含免疫调节剂组的ifn-γ动态含量均高于普通疫苗组相应点的检测含量。
3.白细胞介素4动态检测结果
由图3可知，在鸡的外周血白细胞介素4含量这一指标中，免疫调节剂组的il-4动态含量高于对应普通疫苗组相应点的检测含量。
4.白细胞介素10动态检测结果
由图4可知，在鸡的外周血的白细胞介素10含量这一指标中，添加免疫调节剂组的il-10动态含量除第2和第3周外，均高于普通疫苗组相应点的检测含量。
5.t淋巴细胞亚群(cd3，cd4，cd8)动态检测结果
由图5可知，在鸡的外周血的t淋巴细胞亚群含量这一指标中，添加免疫调节剂组的动态含量高于普通疫苗组相应点的检测含量。
实施例3：家禽疫苗稀释液佐剂在家禽传染性法氏囊病活疫苗中的应用
一、实验材料
1.试验动物：同实施例2。
2.疫苗：鸡传染性法氏囊病活疫苗(b87株)由贵州福斯特生物科技有限公司生产。
3.佐剂成分：同实施例2。
二、实验方法
1.佐剂溶液配制
按实施例1所述方法制备得到免疫调节剂。
2.分组情况
选取体重基本一致的spf雏鸡120羽，随机分为2组，每组60羽于负压隔离区中分别饲养，于14日龄通过滴鼻接种疫苗，一组接种0.03ml用灭菌磷酸盐缓冲液稀释的鸡传染性法氏囊病活疫苗，另一组接种0.03ml含免疫佐剂的鸡传染性法氏囊病活疫苗。
3.抗体检测
3.1血清制备
每组每次随机取5羽试验鸡，每周心脏或翅下静脉取血一次，3500rpm离心，转移上层透明血清(至少需要200μl)，-20℃低温保存待测。
3.2血清抗体检测
参照爱德士ibdelisa抗体检测试剂盒说明书对血清中传染性法氏囊病毒抗体进行检测。
三、实验结果
由图6可知，免疫调节剂在疫苗免疫初期能较早的促进ibdv保护抗体产生，同时维持较高的抗体滴度，并能够减缓ibdv抗体的衰减。
实施例4：家禽疫苗稀释液佐剂在家禽新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中的应用。
一、实验材料
1.试验动物：同实施例3。
2.疫苗：鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(lasota株+h120株)由贵州福斯特生物科技有限公司生产。
3.佐剂成分：同实施例3。
二、实验方法
1.佐剂溶液配制
按实施例1所述方法制备得到免疫调节剂。
2.分组情况
选取体重基本一致的spf雏鸡120羽，随机分为2组，每组60羽于负压隔离区中分别饲养，于7日龄通过滴鼻接种疫苗，一组接种0.03ml用灭菌磷酸盐缓冲液稀释的新支二联活疫苗，另一组接种0.03ml含免疫佐剂的新支二联活疫苗。
3.抗体检测
3.1血清制备
每组每次随机取5羽试验鸡，每周心脏或翅下静脉取血一次，3500rpm离心，转移上层透明血清(至少需要200μl)，-20℃低温保存待测。
3.2血清抗体检测
参照现行《中华人民共和国兽药典》红细胞凝集抑制试验法进行检测：测定血清中ndv、ibv抗体效价。
三、实验结果
由图7可知，免疫调节剂在疫苗免疫初期能较早的促进新支二联活疫苗诱导ndv保护抗体产生，同时维持较高的抗体滴度，并能够减缓ndv抗体的衰减。
由图8可知，免疫调节剂在疫苗免疫初期能较早的促进新支二联活疫苗诱导ibv保护抗体产生，同时维持较高的抗体滴度，并能够减缓ibv抗体的衰减。
本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。