本发明属于生物医药领域，涉及一种雄黄微生物浸出液(rts)的新用途，具体涉及一种雄黄微生物浸出液的在制备降解癌蛋白bcr-abl的药物中的应用。
背景技术：
癌蛋白bcr-abl的形成，被认为是造成骨髓干细胞无限增殖，进而演变为慢性髓性白血病的主要原因[1][2]。因此，研究者可通过直接降低癌蛋白bcr-abl含量，将癌蛋白bcr-abl作为治疗慢性髓性白血病的靶标。近年来有研究报道砷制剂三氧化二砷(ato)能通过自噬降解慢性随性白血病细胞bcr-abl蛋白治疗慢性髓性白血病[3][4]，进一步的研究表明另一种砷制剂-传统中药雄黄(realgar)在体内外有与三氧化二砷相同机理的抗白血病效应[5-7]，甚至强于三氧化二砷。然而，雄黄是一种含砷矿物药，在临床应用方面会受到难溶解性和生物利用度低等缺陷的制约[8]。
本发明中的雄黄微生物浸出液是按照中国发明专利2006102000675已经公开了的微生物处理方法由雄黄制备而成,克服了传统中药雄黄的难溶解性和生物利用度低等缺陷。本发明发现雄黄微生物浸出液可以高效降低癌蛋白bcr-abl的含量进而激活慢性髓性白血病细胞及其耐药细胞的凋亡途径，达到抑制肿瘤的目的。同时发现rts降低慢性髓性白血病细胞中bcr-abl蛋白含量的能力明显强于三氧化二砷和雄黄，其高效降低bcr-abl蛋白含量的能力和激活自噬途径有关。从而证明雄黄微生物浸出液可以通过降低bcr-abl蛋白含量治疗慢性髓性白血病，还可以逆转其耐药性，而且比现有砷制剂效果更好。
参考文献
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2.reckel,s.,etal.,differentialsignalingnetworksofbcr-ablp210andp190kinasesinleukemiacellsdefinedbyfunctionalproteomics.leukemia,2017.31(7):p.1502-1512.
3.张日,etal.,亚砷酸钠治疗加速期慢性粒细胞性白血病的疗效观察.临床肿瘤学杂志,2000(04):p.263-265.
4goussetis,d.j.,etal.,autophagicdegradationofthebcr-abloncoproteinandgenerationofantileukemicresponsesbyarsenictrioxide.blood,2012.120(17):p.3555-62.
5.lu,d.-p.andq.wang,currentstudyofapltreatmentinchina.internationaljournalofhematology,2002.76(1):p.316-318.
6.wang,n.,etal.,realgar-induceddifferentiationisassociatedwithmapkpathwaysinhl-60cells.cellbiologyinternational,2008.32(12):p.1497-1505.
7.wang,l.,etal.,dissectionofmechanismsofchinesemedicinalformularealgar-indigonaturalisasaneffectivetreatmentforpromyelocyticleukemia.proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2008.105(12):p.4826-31.
8.wu,j.,etal.,themedicinaluseofrealgar(as4s4)anditsrecentdevelopmentasananticanceragent.journalofethnopharmacology,2011.135(3):p.595-602.
技术实现要素：
本发明的目的在于发现一种雄黄微生物浸出液的新用途。具体是雄黄微生物浸出液在制备降解癌蛋白bcr-abl的药物中的应用。本发明的另一个目的是雄黄微生物浸出液的在制备降解多药耐药慢性髓性白血病细胞中癌蛋白bcr-abl的药物中的应用。具体涉及雄黄微生物浸出液用于高效降解慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞中癌蛋白bcr-abl，从而抑制慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞的增殖和激活凋亡通路致使癌细胞死亡。
所述的多药耐药慢性髓性白血病细胞是耐青霉素链霉素的细胞。
本发明所公开的雄黄微生物浸出液是雄黄经过氧化亚铁硫杆菌处理，使不溶性的雄黄在水溶液中溶解，用物理或化学方法除去有害重金属离子和菌体而制得。
本发明的有益效果是：雄黄微生物浸出液可以明显降低慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞中癌蛋白bcr-abl的含量，从而抑制慢性性白血病细胞以及它的多药耐药细胞的增值和激活凋亡通路致使癌细胞死亡，且雄黄微生物浸出液降低慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞中癌蛋白bcr-abl含量的能力明显强于其它砷制剂，
具体实施方式：
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例一雄黄微生物浸出液的制备
按照中国发明专利2006102000675中公开的矿物药细菌处理方法处理雄黄，实施方案如下：称取0.5g雄黄过200目的粉末于灭菌后的250ml锥形瓶中，加入灭菌后的9k无铁液体培养基90ml，用硫酸调ph至1.75，待ph稳定后，接种体积分数为20％氧化亚铁硫杆菌和终浓度为1.0g/lfe2+。称取质量后，在30℃、振荡速度为135r/min时摇瓶浸出30d。实验过程中采用1：1(体积比)的硫酸调节ph值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液ph至7左右，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄微生物浸出液。
实施例二雄黄微生物浸出液对白血病细胞株k562和k562/adm的生长抑制作用
1.细胞培养：用rpmi1640培养基，加10％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml，置37℃、5％co2条件下培养。每1天换一次培养液。
2.mtt试验：将细胞以约105个/ml的密度接种于96孔板上，每孔100微升。分别于24小时、48小时按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液rts、ato、realgar，每一梯度至少3个重复。继续培养24、48小时后，每孔加入5μg/ml的mtt15μl，继续置于37℃温育4小时，加入三联液100μl，37℃孵育过夜，用酶标仪检测，根据测得od值绘制抑制曲线，计算半数抑制浓度ic50。
3.表1结果显示:rts、ato、realgar能抑制白血病细胞k562和k562/adm的生长，且rts抑制k562和k562/adm细胞生长的能力明显强于ato和realgar。
表1：rts、ato、realgar对白血病细胞株k562和k562/adm的半数抑制率ic50
实施例三雄黄微生物浸出液对白血病细胞株k562和k562/adm细胞癌蛋白bcr-abl蛋白含量的影响
1.细胞培养：用rpmi1640培养基，加10％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml，置37℃、5％co2条件下培养。每1天换一次培养液。
2.免疫印迹实验：
(1)蛋白样品的制备。
k562和k562/adm细胞培养在10％胎牛血清、青霉素链霉素各含100u/ml的rpmi1640培养液中，培养至对数生长期后将细胞铺于六孔板，孵育4h，等砷浓度(0.256μg/ml)的rts、ato、realgar以及联合5μm自噬抑制剂cq给药处理，培养48h之后收取细胞，各组细胞加ripa裂解液，于冰上裂解30rnin，13000rpm离心后弃沉淀，收集上清用蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，其余样品分装-20℃冻存。
(2)sds-page分离蛋白。
蛋白上样量设为每孔30μg。上样前将每组样品与loadingbuffer混匀，100℃热变性10min。sds-page采用5％浓缩胶，10％分离胶，以浓缩胶80v，分离胶120v进行蛋白电泳实验。
(3)转膜。
根据sds-page凝胶的大小剪取合适大小的pvdf膜和4张滤纸，将滤纸和纤维垫浸泡至转印缓冲液进行活化。按照说明书，将pvdf膜先放入甲醇中15s至膜变为半透明状，然后放入已备好的转印缓冲液中。按照2层纤维垫、2层滤纸、pvdf膜、凝胶、2层滤纸、2层纤维垫的顺序，制作好转印“三明治”结构，此过程中注意不要产生气泡，然后装入转印电泳槽进行转印。转印条件采用恒压100v2h。
(4)免疫结合。
用tbst配制5％的脱脂奶粉作为封闭液，将膜浸入封闭液，室温封闭2h。以封闭液为稀释剂，按1:1000的比例稀释bcr-abl、β-actin抗体，据marker标示的位置，将膜剪开，分别孵育bcr-abl、β-actin抗体，4℃孵育过夜，用tbst洗膜三次，每次10min。用封闭液按1:5000的比例稀释羊抗兔和羊抗鼠hrp-igg抗体，放入膜，室温孵育2h，用tbst洗膜，洗三次，每次10min。
(5)可视化检测。
取ecl发光液，按照说明书将a、b液按1:1混合，在膜上加适量发光液，使用tanon5500全自动化学发光成像分析系统进行曝光。
表2实验结果显示:rts能明显使慢性髓性白血病细胞和多药耐药细胞的bcr-abl蛋白含量降低，而其它砷制剂作用不明显，并且加入自噬抑制剂cq后部分阻碍了rts降低bcr-abl癌蛋白的含量。
表2:等砷浓度下rts、ato、realgar以及联合自噬抑制剂cq对白血病细胞株k562和k562/adm细胞癌蛋白bcr-abl蛋白含量的影响
实施例四雄黄微生物浸出液对白血病细胞株k562和k562/adm细胞凋亡蛋白cleavedcaspase3和bcl-2的影响
1.细胞培养：用rpmi1640培养基，加10％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml，置37℃、5％co2条件下培养。每1天换一次培养液。
2.免疫印迹实验：
(1)蛋白样品的制备。
k562和k562/adm细胞培养在10％胎牛血清、青霉素链霉素各含100u/ml的rpmi1640培养液中，培养至对数生长期后将细胞铺于六孔板，孵育4h，等砷浓度(0.256μg/ml)的rts、ato、realgar以及联合5μm自噬抑制剂cq给药处理，培养48h之后收取细胞，各组细胞加ripa裂解液，于冰上裂解30min，13000rpm离心后弃沉淀，收集上清用蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，其余样品分装-20℃冻存。
(2)sds-page分离蛋白。
蛋白上样量设为每孔30μg。上样前将每组样品与loadingbuffer混匀，100℃热变性10min。sds-page采用5％浓缩胶，10％分离胶，以浓缩胶80v，分离胶120v进行蛋白电泳实验。
(3)转膜。
根据sds-page凝胶的大小剪取合适大小的pvdf膜和4张滤纸，将滤纸和纤维垫浸泡至转印缓冲液进行活化。按照说明书，将pvdf膜先放入甲醇中15s至膜变为半透明状，然后放入已备好的转印缓冲液中。按照2层纤维垫、2层滤纸、pvdf膜、凝胶、2层滤纸、2层纤维垫的顺序，制作好转印“三明治”结构，此过程中注意不要产生气泡，然后装入转印电泳槽进行转印。转印条件采用恒压100v2h。
(4)免疫结合。
用tbst配制5％的脱脂奶粉作为封闭液，将膜浸入封闭液，室温封闭2h。以封闭液为稀释剂，按1:1000的比例稀释caspase3抗体，按1:800的比例稀释caspase3抗体，按1:1000的比例稀释caspase3抗体，据marker标示的位置，将膜剪开，分别孵育bcr-abl、β-actin抗体，4℃孵育过夜，用tbst洗膜三次，每次10min。用封闭液按1:5000的比例稀释羊抗兔hrp-igg抗体，放入膜，室温孵育2h，用tbst洗膜，洗三次，每次10min。
(5)可视化检测。取ecl发光液，按照说明书将a、b液按1:1混合，在膜上加适量发光液，使用tanon5500全自动化学发光成像分析系统进行曝光。
表3、表4结果显示：rts能使抗凋亡蛋白bcl-2减低和凋亡蛋白剪切化caspase3蛋白增多，且这种作用也能被自噬抑制剂cq部分逆转，而等砷浓度下rts使凋亡蛋白剪切化caspase3蛋白增多的程度明显高于其它砷剂。
表3：等砷浓度下rts、ato、realgar以及联合自噬抑制剂cq对白血病细胞株k562和k562/adm细胞cleavedcaspase3蛋白含量的影响
表4：等砷浓度下rts、ato、realgar以及联合自噬抑制剂cq对白血病细胞株k562和k562/adm细胞bcl-2蛋白含量的影响
实施例五雄黄微生物浸出液对白血病细胞株k562和k562/adm细胞凋亡的影响
1.细胞培养：用rpmi1640培养基，加10％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml，置37℃、5％co2条件下培养。每1天换一次培养液。
2.annexinv-fitc/pi双染实验检测细胞凋亡：
k562和k562/adm细胞培养在10％胎牛血清、青霉素链霉素各含100u/ml的rpmi1640培养液中，培养至对数生长期后将细胞铺于六孔板，孵育4h，不同砷浓度(0.128μg/ml、0.256μg/ml、0.512μg/ml)的rts给药处理，培养48h之后收取细胞，使用bd双染试剂盒染色，pbs洗3遍细胞，进行流式细胞仪分析。
表5实验结果显示：rts诱导慢性髓性白血病细胞以及多药耐药细胞发生凋亡，而在等砷浓度下，其它砷制剂诱导细胞凋亡的能力明显低于rts。
表5rts、ato、realgar对白血病细胞株k562和k562/adm细胞凋亡的影响
结论：rts可以明显降低慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞中癌蛋白bcr-abl的含量，且rts降低慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞中癌蛋白bcr-ab含量的能力明显强于其它砷制剂，从而抑制慢性髓性白血病细胞以及它的多药耐药细胞的增值，表明雄黄微生物浸出液可以在制备高效降解癌蛋白bcr-abl药物中应用。
加入自噬抑制剂cq之后部分逆转了rts降低癌蛋白bcr-abl含量的作用，也部分逆转了rts增加凋亡蛋白剪切化caspase3表达的作用，说明降低癌蛋白bcr-abl能激活凋亡通路致使癌细胞死亡，也说明rts高效降低bcr-abl蛋白含量的能力和激活自噬途径有关。