siRNA-GOLPH3在制备预防或治疗心肌细胞肥大药物中的应用的制作方法

本发明涉及golph3介导的高尔基体自噬，本身能参与apelin诱导的心肌细胞肥大。golph3抑制剂sirna-golph3，本身能通过抑制高尔基体自噬发挥抑制apelin诱导的心肌细胞肥大以及心肌肥厚的作用。

背景技术：

apj是1993年首次被o'dowd等人发现的一种g蛋白偶联受体，并在1998年，tatemoto等人在牛胃中首次提取出apj的内源性配体apelin。前体apelin有77个氨基酸，可以被肽链内切酶水解成一些不同长度的氨基酸片段，包括apelin-12,apelin-13,apelin-17,apelin-36。在apelin的这些活性片段中，apelin-13的生物学活性最强。apelin/apj系统在心血管系统中具有十分丰富的生物学功能。apelin/apj系统能够促进血管生成，保持流体稳态，诱导外周以及冠脉血管的舒张，降低动脉血压，减轻心脏的前后负荷，增加心肌输出量和促进心肌细胞肥大，因此apelin/apj系统在动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、心肌肥厚以及心肌梗死等心血管疾病中均发挥着重要的作用。

高尔基体(golgiapparatus，ga)主要是由扁平膜囊以及囊泡(vesicles)组成的，其中膜囊又分为顺式膜囊、中间膜囊、反式膜囊。高尔基体是一种具有极性的细胞器，它一般位于内质网和细胞膜之间。高尔基体凸出的一面对着内质网被称为形成面或顺面，凹进的一面对着细胞膜则被称为成熟面或反面。顺面和反面都有一些大小不一的囊泡，糙面内质网中合成的蛋白质，经出芽形成的囊泡转运到高尔基体的顺式膜囊，在中间膜囊进行加工，经反式膜囊形成的囊泡分泌到细胞膜，经胞吐的方式排到膜外。高尔基体结构和功能的紊乱与多种疾病相关，例如心肌肥厚。高尔基体是个动态变化的细胞器，它的结构不断的经历着解离和重组，但其解离和重组的具体机制尚不明确，并且是否能影响高尔基的的结构和功能以及影响相关疾病的发生发展。

高尔基体自噬(golgiphagy)是当高尔基体应激超出了机体负荷和适应能力是，高尔基体的结构会遭到破坏及其功能发生紊乱，造成其损伤，当损伤的高尔基体积累到一定程度时，机体会启动自噬反应，损伤高尔基体被选择性的包裹进自噬体，与溶酶体进行融合形成自噬溶酶体，最终完成损伤高尔基体的降解和清除。golph3是高尔基体外膜蛋白，是定位在高尔基体上的功能蛋白，它能够参与囊泡运输、高尔基体结构的稳定、受体蛋白的分选、蛋白糖基化修饰以及反面高尔基体到胞膜的信号传递。已有研究报道si-golph3(forward:5’-agggcgactccaaggaaa-3’(seqidno.3)；reverse:5’-tgatgtgtaaccctcgcg-3’(seqidno.4))能抑制结肠癌细胞增殖。golph3的表达水平与氧化应激的程度呈正相关。在氧化应激的过程中，golph3也从胞核周围紧凑的带状结构弥散到整个胞浆呈点状结构，因此golph3在胞内荧光定位的改变与高尔基体发生应激时的破碎形态是相同的。另外，golph3的上调还能诱导自噬标志蛋白lc3i向lc3ii的转换和ros的产生。这些结果提示golph3可以作为介导高尔基体自噬发生的标志蛋白。

apelin可定位在高尔基体以及分泌小泡上，并有研究发现当apj敲除后，在人主动脉内皮细胞发现高尔基体定位缺陷以及消除了高尔基体的极化现象在层流状态下。但是，apelin是否能通过golph3依赖高尔基体自噬调节高尔基体的功能左后诱导心肌细胞肥大并没有被报道过。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供高尔基体外膜蛋白golph3作为生物标志物在预测心肌细胞肥大中的应用。所述高尔基体外膜蛋白golph3通过促进高尔基体自噬来介导apelin-13促进心肌细胞肥大。

本发明的另一目的在于提供sirna-golph3在制备预防或治疗心肌细胞肥大药物中的应用。sirna-golph3为抑制高尔基体外膜蛋白golph3表达的干扰链。

所述sirna-golph3的碱基序列如下：

5’-gcuggcccucauuuaccuatt-3’(seqidno.1)；

5’-uagguaaaugagggccagctt-3’(seqidno.2)。

本发明通过实验表明：

apelin/apj系统具有促心肌细胞肥大的作用，在静压力作用下，apj水平增加激活pi3k-自噬途径诱导h9c2心肌细胞肥大。高尔基体外膜蛋白golph3能促进高尔基体自噬，这种新型选择性自噬能介导apelin-13促进心肌细胞肥大，干扰golph3的表达能抑制心肌细胞内的高尔基体自噬以及apelin-13对促进心肌细胞直径和体积增加作用。本发明明确sirna-golph3在心肌肥厚的基础研究和药物研究中都有重要的意义和广泛的应用前景。

本发明的有益技术效果

1、本发明的si-golph3具有理想的抗心肌肥厚的作用，因此，可用于制备药物。

附图说明

图1为apj拮抗剂f13a抑制apelin-13诱导大鼠心肌细胞中高尔基体顺式膜囊标志物gm130-rfp自噬标志蛋白lc3b-gfp发生荧光共定位；

图2为apj拮抗剂f13a抑制apelin-13诱导大鼠心肌细胞中高尔基体反式膜囊标志物tgn46-rfp与自噬标志蛋白lc3b-gfp发生荧光共定位；

图3为apelin-13能够上调h9c2心肌细胞中高尔基体应激标志蛋白golph3的表达；其中(n＝4；**p<0.01vscontrol)；

图4为apelin-13诱导大鼠心肌细胞中golph3与lc3b发生蛋白相互作用；

图5为透射电镜结果显示apelin-13能诱导大鼠心肌细胞发生高尔基体自噬(箭头代表高尔基体，圆形箭头代表自噬溶酶体)；

图6为干扰golph3表达抑制大鼠心肌细胞中高尔基体顺式膜囊标志物gm130-rfp与自噬标志蛋白lc3b-gfp的荧光共定位；

图7干扰golph3表达抑制大鼠心肌细胞中高尔基体反式膜囊的标志蛋白tgn46-rfp与自噬标志蛋白lc3b-gfp的荧光共定位；

图8透射电镜结果显示干扰golph3会抑制大鼠心肌细胞内的高尔基体自噬(箭头代表高尔基体，圆形箭头代表自噬溶酶体)；

图9干扰golph3抑制了apelin-13对h9c2心肌细胞直径的上调作用；

图10干扰golph3抑制了apelin-13对h9c2心肌细胞体积的上调作用。

具体实施方式

实施例1测定apelin-13对高尔基体自噬的影响

在apelin刺激以及使用apj受体拮抗剂阻断后，观察大鼠心肌细胞中高尔基体标志物(顺式膜囊标志物gm130-rfp和反式膜囊标志物tgn46-rfp)与自噬标志蛋白lc3b-gfp发生荧光共定位的结果。检测apelin-13对h9c2心肌细胞中高尔基体应激标志蛋白golph3的表达以及与lc3b发生蛋白相互作用的影响。利用透射电镜结果测定apelin-13能否诱导大鼠心肌细胞发生高尔基体自噬。

1.测定apelin-13对高尔基体标志物与自噬标志蛋白lc3b-gfp发生荧光共定位的影响

在培养板中选取生长密度为50％-70％的细胞进行质粒转染。首先用优化培养基稀释lipofectamine^tm3000、p3000^tm和待转染的质粒(gm130-rfp、tgn46-rfp、lc3b-gfp)。以6孔板的4个转染孔为例，转染需要8个高压过的1.5ml的ep管，取4个ep管加入200μl优化培养基，然后加入5μl的lipofectamine^tm3000，混合均匀；另外4个ep管加入200μl优化培养基，然后加入2.5μg的质粒，最后加入5μl的p3000^tm，混合均匀以后，将4个ep管里面稀释好的质粒加入到含lipofectamine^tm3000的4个ep管里面，得到质粒-脂质体的混合物，离心5s左右，然后将ep管在室温下放置10-15min，最后将质粒-脂质体的混合物分别加入到培养板的4个待转染的孔中，将培养板放到37℃、5％co2的细胞培养箱中继续培养6-8h以后换液，换成没有加青霉素-链霉素的培养基，转染24h以后，分别采用apelin-13、apelin-13+f13a处理大鼠心肌细胞，用荧光显微镜观察tgn46-rfp与lc3b-gfp的荧光共定位情况。(参见图1，图2)

2.测定apelin-13对h9c2心肌细胞中高尔基体应激标志蛋白golph3的表达以及与lc3b发生蛋白相互作用的影响

apelin-13处理后提取心肌细胞的总蛋白。根据所需要检测的蛋白分子量来制备不同比例的sds-page凝胶，并用事先提取的蛋白进行上样，然后先以电压80v，电泳30min，再调电压至120v，使蛋白跑至分离胶的底部。再用0.2μm的pvdf膜进行湿转，转膜结束以后，将pvdf膜放于含5％tbst的牛奶中封闭2h。封闭结束以后，孵育相应的一抗以及二抗。最后显影，配好发光液，均匀的在pvdf膜上涂上发光液，采用tanon6200发光成像系统进行显影成像。检测apelin-13对golph3的表达的影响(参见图3)。并通过免疫共沉淀技术观察apelin处理后golph3的表达以及与lc3b发生蛋白相互作用的影响(参见图4)。

3.测定apelin-13能否诱导大鼠心肌细胞发生高尔基体自噬

首先用apelin-13对心肌细胞进行前期处理，并在提取的细胞中加入1ml电镜专用的2.5％戊二醛固定液，将细胞沉淀物放在4℃冰箱中进行固定，将固定好的细胞样本送到中南大学湘雅医学院电子显微镜中心进行取样、拍照(参见图5)。

实施例2测量干扰golph3表达对apelin-13诱导心肌细胞肥大的影响

干扰golph3对apelin刺激后，大鼠心肌细胞中高尔基体标志物(顺式膜囊标志物gm130-rfp和反式膜囊标志物tgn46-rfp)与自噬标志蛋白lc3b-gfp发生荧光共定位的结果。利用透射电镜结果测定干扰golph3对apelin-13诱导大鼠心肌细胞发生高尔基体自噬的影响。干扰golph3对apelin-13上调h9c2心肌细胞直径和体积的上调作用的影响。

1.测定si-golph3对apelin-13诱导的高尔基体标志物与自噬标志蛋白lc3b-gfp荧光共定位的影响

在将gm130-rfp、tgn46-rfp、lc3b-gfp都转入细胞内24h后，分别采用apelin-13、apelin-13+si-golph3处理大鼠心肌细胞，用荧光显微镜观察gm130-rfp、tgn46-rfp与lc3b-gfp的荧光共定位情况(参见图6，图7)。

2.测定si-golph3对apelin-13诱导大鼠心肌细胞高尔基体自噬的影响

首先用apelin-13和si-golph3对心肌细胞进行前期处理，并在提取的细胞中加入1ml电镜专用的2.5％戊二醛固定液，将细胞沉淀物放在4℃冰箱中进行固定，将固定好的细胞样本送到中南大学湘雅医学院电子显微镜中心进行取样、拍照(参见图8)。

3.测定si-golph3对apelin-13上调h9c2心肌细胞直径和体积的影响

取生长良好的h9c2大鼠心肌细胞，将细胞接种于6孔板中培养，加入apelin-13和si-golph3处理，用pbs清洗细胞2-3次，加入胰蛋白酶消化细胞，将消化好的细胞加入15ml的ep管中，采用800r/min的转速离心5min，弃去培养基。然后用pbs重悬细胞，将细胞密度调节在5x104-1x105cells/ml的范围，采用sceptertm手持式细胞计数仪检测h9c2心肌细胞的直径和体积(参加图9，图10)。

综上所述，本发明的si-golph3具有理想的抗心肌细胞肥大的功效，能够用于制备相关的药物。

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