本发明涉及一种用于检测牙齿脱矿质的组合物。更具体地，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含能够对游离离子的存在产生光学信号特征的复合物，这种组合物的药物用途，以及用于使用这种组合物检测在牙齿表面的活性脱矿质的方法和试剂盒。
牙齿釉质含有大量磷灰石晶体，其形成紧固的组合结构；然而，用水和有机材料装满的极小的晶粒间的空间或孔隙分开所述晶体。在齿中发现的磷灰石形式是羟基磷灰石，其最小的重复单元是ca10(po4)6·2(oh)。所述晶体的组分可被取代。已知的取代物包括：关于钙的锶，钡，铅，钠，钾和镁；关于氢氧化物和碳酸盐的卤素(f，cl，i，br)；以及关于磷酸盐的磷酸氢盐。这些取代中，据报道氟化物和碳酸盐是最重要的，并且氟化物防止/修复龋齿且碳酸盐增加对龋齿的易感性。也报道在表面釉质中发现了许多其它离子，诸如锌，锡和铁。在完全成形的釉质中发现的有机材料(1重量％，2体积％)主要由釉蛋白(enamelins)(质量50-70kda)组成，但是也含有低分子量类脂物，以及一些糖类和有机酸诸如柠檬酸盐和乳酸盐。可通过免疫印记分析来检测釉蛋白。
许多牙齿问题由脱矿质导致。脱矿质是一个涉及龋齿，牙齿磨蚀以及牙质过敏发展的潜在过程。一个或多个牙齿硬组织的脱矿质引起牙齿完整性的损失。矿物质一般存在于矿化状态的牙齿硬组织中，并且脱矿质涉及游离离子的释放。
龋齿损害损伤齿的结构。龋齿疾病可导致疼痛，感染，难闻的气味，难闻的味道以及牙齿损失。在严重的情况下，感染可蔓延到周围的软组织，其可导致死亡。诱导龋齿的因素包括在齿周围以称为蚀斑的粘稠性物质方式集中的细菌，以及摄取的食物和饮料。与早期脱矿质有关的细菌是变异链球菌,而乳杆菌看来像是与损害发展有关。这些细菌在食物/饮料中通过发酵将糖转化为酸，诸如乳酸，并且如果保持与齿接触，这些酸导致脱矿质。从齿的晶体表面除去矿物质使结构更多孔且对侵蚀更敏感。随着孔隙尺寸增加，酸可以更深地穿透到组织中并溶解表面下的矿物质。最终在脱矿质以后的是有机材料的崩解。如果让其发展，矿物质的含量损失到这样的程度，即留下的柔软的有机材料分裂形成空腔或破坏牙齿的表面完整性。如果龋齿要发展，则在表面的蚀斑生物膜的存在是必需的。
存在确定龋齿损害的位置和程度(深度和/或矿物质损失体积)的技术。目前临床医生使用识别脱矿质的区域来检测龋齿及其它牙齿问题。这可以包括通过临床医生的视觉检查，放射照相术或诸如diagnodent(专利号us4290433)的现有技术。采用视觉检查以检出龋齿依靠鉴定者的技术，且更重要的是脱矿质/磨蚀的程度。经常地，以这样的方式检测到龋齿时，将已经存在显著的损伤。x-射线分析可显示眼看不见的龋齿的存在，然而需要继续评估以确定龋齿活性。可帮助龋齿诊断的本领域技术包括用光或激光的光纤照射。diagnodent(us4290433)和定量光-诱导荧光(qlf)(us4290433)涉及分别用红色激光(633nm)或高强度蓝色光照射牙表面，然后分析发射的荧光。发射的荧光的特性与牙中的脱矿质的程度有关。其它方法例如为：超声龋齿检测器(ucd)采用超声波(us2007238996)产生牙的图像，其中反射度的水平与组织的密度成正比例；或拉曼光谱(us2005283058)，其对矿物质和晶体取向敏感，从而表征釉质表面。
牙齿磨蚀是逐渐从牙表面开始的硬组织厚度的渐进性损失，且经常由酸性饮料/食物(其可能或可能不是含糖的)所引起，其导致脱矿质且可引起牙质的暴露。通过酸-软化釉质(或牙质)的牙-清洁还可以加速磨蚀，从而导致釉质的完全除去和随之发生的牙质暴露。具体地说，磨蚀是指引起硬的牙齿组织渐进性损失的非-细菌过程。当你的牙齿上的釉质被酸磨损时，就发生牙磨蚀。通常，包含在唾液中的钙将在你消费少量酸后帮助再矿化(或增强)你的牙齿，但是在你口中的许多的酸的存在不允许再矿化。酸可来自许多来源，包括碳酸饮料。所有的“嘶嘶发泡的(fizzy)”饮料都含有酸且可很快溶解釉质。增加的消费数量导致随着增加的损伤，如保持饮料在口中较长时间。纯果汁含有酸，且因此以与碳酸饮料类似的方式作用。贪食症和酸反流会由于牙齿暴露于胃酸而促进牙磨蚀。
有许多牙磨蚀迹象，从它的初始阶段(敏感性，变色，圆齿)到后面的更多严重的阶段(裂纹，严重敏感性，杯状陷凹)。保护性釉质的磨损导致增加牙髓中的神经末梢的暴露，从而导致当你消费热的，冷的，或甜的食物和饮料时疼痛。患者可能因此经常出现敏感性。严重的敏感性可能发展为更多釉质被磨损且牙齿愈加变得敏感。患者可能也出现变色的牙齿，因为当牙质外露时他们会变得微黄。磨蚀的结果为牙齿可能成圆形或“砂磨”外观。前牙在咬合边缘附近可能看起来稍微透明。后期的变色可导致-牙齿可能变得更黄，因为由于牙釉质损失而使更多牙质外露。小的裂纹和粗糙可能出现在牙齿的边缘，且因为在牙齿的咀嚼表面可能出现小的凹穴，所以可能出现杯状陷凹。如果鉴定为早期的牙磨蚀，则可适用治疗而保护牙齿。例如，可密封问题区域以防止进一步的脱矿质。因此早期检测和诊断极为重要。
牙质过敏是由暴露的牙质引起的疼痛，典型响应于外部刺激(且其不能通过任何其它的牙齿疾病形式解释)。暴露的张开的牙本质小管直接通向在其内部包括神经的髓组织。当在牙龈后退以后不再存在覆盖根牙质的牙骨质(由于磨蚀或磨损)时，小管暴露且可出现敏感性和疼痛。在过敏的情况下，相比不出现疼痛时，牙质在牙质表面有多达8倍以上的小管张开且小管直径加宽。这为诸如通过酸性饮料的脱矿质提供了较大的可用表面积，且也导致应用这种产品后释放更多的钙。
如上所述，通过一个或多个牙齿硬组织的脱矿质的牙完整性的损失，引起龋齿，磨蚀或过敏的发展。羟基磷灰石，即釉质的主要组分，在暴露于酸性环境时变得可溶。牙齿处于来自它们的外界环境的不断侵蚀之下。牙表面的蚀斑细菌产生酸且在含糖的饮食或零食以后，蚀斑的酸度可以显著增强。在暴露于任何酸性环境过程中，在牙齿表面的无机物质内容物的部分溶解，且可保持溶解超过2小时。酸可渗透通过此表面脱矿质产生的微孔，且因为随着蚀斑酸度回到较低水平，表面层部分再矿化，可产生牙内的表面下脱矿质层。因此，在蚀斑存在下，牙齿表面的脱矿质和再矿化的振荡周期是“正常”特征。
相比釉质，牙质和牙骨质对酸脱矿质更敏感，因为他们有更低的矿物质含量。龋齿过程是一个在牙表面开始的动态过程，但是由于与牙和蚀斑内的流体中的矿物质浓度梯度有关系的复杂的脱矿质-再矿化过程，表面比表面下区域变得更高度矿化。取代容易发生在釉质的无机结构中，且因此脱矿质也导致许多不同离子的释放。该因素对于早期检测尤其重要，因为釉质表面是初始摄取的位置，且也恰好是酸侵蚀的优先点。
通常的取代物包括钠，镁，氟化物和碳酸盐。镁和碳酸盐可穿透到釉质中，且已知改变磷灰石的晶体结构以致它变得更加可溶；因此，当酸侵蚀时从表面下部优选损失这些离子。与较深的层相比，表面釉质中还发现较高浓度的锌，铅，锡和铁。对釉质中的龋蚀损害分析通常显示高水平的氟化物以及可感知水平的镁，其被认为是由于新暴露的磷灰石层对这些离子的迅速摄取。
尽管存在一些用于确定龋齿损害的位置和程度(深度和/或矿物质损失体积)的技术，但这些方法的主要缺点在于他们不确定龋齿过程的特性，即在任何一个具体的时间点，它们是活性的还是非活性的。非活性龋齿损害可能不需要治疗，然而活性龋齿损害将(通过定义)指示正在进行的脱矿质。它也将有益于尽可能早地得到关于脱矿质的信息。活性龋齿经常到其过程的晚期才能发现，且对于牙的完整性已产生显著损伤。有时只有患者开始感到疼痛时才使用x-射线证实龋齿的存在。目前，仅可通过典型地，在放射照相(x-射线)情况下，在多于一年的时期内评价龋齿损害随时间的进程，确定龋齿的活性特征。如果龋齿，牙磨蚀或过敏性牙齿及早鉴定，则可施用治疗而保护牙齿。例如，可密封问题区域以防止进一步的脱矿质。因此及早检测和诊断是极为重要的。此外，在检查中最好捕获关于活性的信息。
初始的龋齿诊断涉及所有可见的牙表面的检验，经常使用牙探测器，或金属镐和反射镜，通过明亮的光源照射。在一些情况下，龋蚀损害或釉质脱矿质的迹象是在牙的表面上出现白垩色白色斑点。然而，这种斑点不总是可见的。
用于诊断早期龋齿的通常技术是跨越可疑表面吹空气。所导致的从表面的湿气损失改变脱矿质的釉质的光学性质，从而使得指示早期龋齿的白色斑点损害可见。随着持续脱矿质，龋齿可转为黑色且最终发展为空腔。大的龋齿损害经常是肉眼可见的。然而，较小的损害可能很难识别。一旦空腔形成，损失的牙结构就不能再生。在该点以前的过程是潜在可逆的，因此必需尽快识别龋齿。
可帮助龋齿诊断的现有技术包括用光或激光的光纤照射。diagnodent是专利us6,769,911涉及的技术，其中，含探针元件和集成的红色光源的工具在牙的被细菌感染的龋蚀区域中诱导荧光，所述荧光在通过适当的过滤器后被装置测量。然而，该方法没有提供关于龋齿是活性还是非活性的指示。
作为检出牙腐蚀的方法，包括荧光染料的染料也已经用于识别牙齿上细菌的位置和酸的存在。然而，这些染料趋向于是有毒性的且因此不适于口内分析。此外，釉质是自-荧光的(auto-fluorescent)，因此背景荧光可超限制地高。
就龋齿检测而论，磨蚀是通过视觉检查检测的。指示磨蚀的迹象和症状包括，门齿增加的透明度，上升超过周围牙齿的填充物，和在非-咀嚼表面上的磨损。所有这些从容发展至可见程度，且损伤将已经完成。由于许多原因，期望获得用于测试由于磨蚀而脱矿质的方法。例如，可施用某些食物或饮料到牙齿，接着是所公开的组合物。如果由于食物或饮料与牙接触而发出离子，所述公开组合物将发射出可检测信号。或者为了测量标准食物或饮料产品，或者在牙-友好产品(低的导致磨蚀可能性)或磨蚀预防产品如牙膏和密封剂的开发中，为了确定可食用的产品可能对于牙齿造成的潜在破坏性如何的制造商可以使用该测试。牙科临床医生也可使用所述公开的组合物确定患者对磨蚀的易感性，并且通过牙组成和唾液确定。
牙质过敏将由患者报告且由牙科医师研究。有用的诊断工具是空气/水注射器，牙齿探测器，叩诊测试，咬合应力测试，以及其它热测试诸如冰块以及阻塞评估。然而，这些方法，基于患者的报告，是主观的并且缺乏准确度。
本发明的目的是以减轻诸如上面描述的那些问题。
根据本发明的第一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含能对游离离子的存在产生光学信号特征的复合物。
根据本发明的第二方面，提供一种用于检测活性龋齿和/或由于磨蚀导致的活性牙脱矿质的组合物，所述组合物包含能对游离离子的存在产生光学信号特征的复合物。
用于检测的复合物可以是染料，合成离子螯合剂如edta-报道分子复合物或大环如冠醚报道分子复合物，蛋白或蛋白-报道分子复合物，分子印迹聚合物-报道分子复合物或分子探针如霍利迪连接体。例如如果要检测不同的离子，则可使用这些复合物的一种或组合。
要检测的离子可以包含钙离子，镁离子，磷酸根离子，碳酸根离子，钾离子，锶离子，氟离子，铜离子，氯离子，锌离子，铅离子，锡离子，铁离子或有机材料如釉蛋白。不同离子的检测可能有助于确定脱矿质的位置及其进入到牙齿硬组织中的深度，因为，如这里所描述的，不同的离子可能存在于不同的牙齿硬组织中。
所述组合物还可以包含药用添加剂，并且所述添加剂优选为杀菌或抑菌试剂。
所述组合物可以包含药用赋形剂，并且所述赋形剂优选为调味或着色添加剂。
优选的是，所述组合物处于药用剂型，并且所述组合物优选为液体，粉末或凝胶。所述组合物可以包含1ng/ml至10mg/ml的复合物，或提供显著高的信噪比的任何浓度。
所述组合物可以包含蛋白或蛋白复合物。这种复合物在结合游离离子时可能经历构象的变化，这导致产生光学信号。
优选的是，所述蛋白或蛋白复合物包括水母发光蛋白，螅蛋白，钙调发光蛋白(clytin)，mitrocomin，halistaurin，瓶梗蛋白(phialidin)，mnemiopsin，symplectin，gr-bolinopsin，酪蛋白，集钙蛋白，calexcitin，钙结合半胱氨酸蛋白酶，钙调蛋白以及其它的ef手型蛋白瓜水母光蛋白(efhandproteinsorberovin)。本领域技术人员将知晓功能类似并且可以无需过度努力地选择的其它蛋白或蛋白复合物。
优选地是，所述蛋白或蛋白复合物包含荧光蛋白和离子结合蛋白如钙调蛋白，钙调蛋白-结合肽(m13)，以及增强的绿色-或黄色-发射荧光蛋白的衔接融合物。
备选地，所述复合物可在指示离子存在的特征波长发荧光。
所述组合物可以包含在结合游离离子时产生光学信号的蛋白或蛋白复合物，以及在指示离子存在的特征波长发荧光的蛋白或蛋白复合物。
这些可以被修饰，例如通过改变基因的dna序列，通过乙酰化，乙氧基羰基化，荧光胺-修饰或荧光素标记或通过形成嵌合蛋白如gfp-水母发光蛋白(us2003175807)，从而增强信号，延长信号持续时间或改变它的发射光谱。也可使用具有类似功能的蛋白和蛋白复合物，诸如结合离子时经历导致光学信号的构象变化的那些。
蛋白或蛋白复合物优选包含重组蛋白(以高纯度表达)。可将蛋白或蛋白-蛋白复合物在无特定离子的溶液中施用，以减少背景信号。这可使用离子螯合剂实现。
优选地，所述组合物将是光学透明的。这将容许组合物传送当离子-敏感性报道分子与游离离子接触时发射的光。也可加入添加剂以改变信号，例如，用于延长可检测信号保持可检测出的时间长度的凝胶，为优化反应或被修饰物质以防止立即闪光的缓冲液，但是所述闪光可随后被触发，诸如用于腔肠动物的荧光素酶的enduren体系。
组合物在暴露于游离离子时产生的光学信号可通过以下检测：分光光度计，电荷耦合装置(ccd)，互补金属-氧化物半导体cmos，数字照相机，增强照相机，口内照相机，视频示波器，照相软片，光纤装置，光度检测器，光电倍增器，微机电系统(mems)或在视觉上通过眼。
根据本发明的第三方面，提供如上所述药物组合物用于制备用于检测龋齿的制剂的用途。根据脱矿质的存在，可从活性龋齿区分非活性龋齿，因此所述组合物可用于制备用于区分活性和非活性龋齿的制剂。
根据本发明的第四方面，提供如上所述药物组合物用于制备制剂的用途，所述制剂用于检测由于磨蚀导致的活性牙脱矿质。
根据本发明的第五方面，提供如上所述药物组合物用于制备制剂的用途，所述制剂用于检测与牙质过敏有关的牙质脱矿质的部位。
根据本发明的第六方面，提供用于检测活性牙脱矿质的方法，所述方法包含以下步骤：将牙暴露于如在上文描述的组合物；和检测产生的光学信号。
所述方法还可以包括另外的标记牙或牙模型区域的步骤，以容许对牙或牙模型的特别区域的识别。可能难以保证牙或牙模型的相同区域可以被监控，并且可以帮助将来的分析，诸如当比较来自不同技术的数据或用于监控疾病或治疗随时间的发展时。这种标记可用染料、铅笔形成，或通过将例如具有指甲油的由铜丝制成的格栅附着到牙齿上形成。
所述方法还可以包括在暴露组合物之前，将牙暴露于敏化溶液的步骤。敏化溶液可为酸性或含糖(其中出现蚀斑)的溶液。这可以容许确定牙对磨蚀的易感性。为了估计对于牙磨蚀的个体的易感性，可使用该方法。该方法还可以用于估计食物或饮料产品对牙齿侵蚀性质。
所述方法还可以包含在施用敏化溶液和施用检测组合物之间允许过去一段时期的步骤。这是为了容许口中的唾液增强，并且容许使用者估计唾液的保护效果。这段时期可以是，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30秒钟，但是可以是任何其它认为必需的时间，以便容许唾液返回到它在口中的正常体积和组成，例如，可能需要一分钟，两分钟或直到五分钟。需要的时间长度将取决于个体患者中唾液体积和流动，且可容易地通过本领域技术人员确定。
可以通过分光光度计，电荷耦合装置(ccd)，互补金属-氧化物半导体cmos，数字照相机，增强照相机，口内照相机，视频示波器，照相软片，光纤装置，光度检测器，光电倍增器，雪崩光电二极管，光敏阵列，微机电系统(mems)或通过眼在视觉上检测光学信号。
根据本发明的第七实施方案，提供了一种用于检测脱矿质的试剂盒，所述试剂盒包括含有离子-敏感性复合物的组合物，用于施用所述组合物的工具以及检测器单元。所述试剂盒还可以包括酸性或含糖的敏化溶液。所述试剂盒还可包括标记物，诸如用于在牙或牙模型上标记所关心区域的格栅。由于许多原因可以购买试剂盒。牙科医师可能希望得到方便的市场上可买到的测试试剂盒，以用于评价患者对磨蚀的易感性。消费者可以使用磨蚀易感性的家-用测试，其然后可以决定采取什么预防性措施。食品或饮料产品的制造商如果关心他们产品的牙-侵蚀性能，则可以购买测试。
因而，本发明设法提供一种用于在牙齿应用中检测游离离子的组合物以及一种使用这种组合物的方法。
本发明还将仅经由实施例描述并且参考附图来描述，在所述附图中：
图1是在嘉美露(cameleon)指示剂中的fret的示意性表示；
图2显示具有标记在其表面上的掩蔽‘窗口’的提取的前磨牙。图2显示具有如通过指甲油划界的“窗”并且对其施用凝胶的牙齿的实例图像。在光中取得图像；
图3显示施用酸性凝胶和公开的凝胶后的提取的牙齿的图像。图3描述显示在凝胶(ph4.7或6.4)中温育、漂洗并加入公开的凝胶以后，来自窗的光输出的图像。较亮区域指示较多的光并且相应于其中存在游离钙的区域；
图4和5表明了图像分析程序imagej的使用，其用于确定用酸性凝胶和公开的凝胶处理的区域的亮度。图4显示描述来自酸性或中性凝胶处理的牙齿的光输出的图。酸性ph4.67；对照ph6.4。使用imagej的“绘图”功能确定“亮度”。图5显示描述来自酸性或中性凝胶处理的牙齿的光输出的图。首先将牙齿在凝胶(酸性ph4.67，或中性ph6.4)中温育14天，之后评价亮度，并且将牙齿转移到ph为4.67或6.4的新凝胶。使用imagej的“绘图”功能确定“亮度”；
图6表明螅蛋白作为公开组合物的使用；
图7a至7b显示在具有龋齿的牙的根上进行实验的结果；
图8a和8b显示在牙的牙质上进行实验的结果；
图9a至9b显示进行的与空腔识别有关的实验的结果；
图10a至10b显示进行的与空腔识别有关的进一步的实验的结果；
图11a至11b显示进行的与龋齿识别有关的进一步的实验的结果；
图12显示具有成穴损害(a)的脱落磨牙的图像。图12(a)和(c)显示光中的牙齿的图像，而图12(b)和12(d)显示在施用公开的凝胶以后的单色图像。图12显示具有成穴损害(a)的脱落磨牙。((a)和(c))光中的牙齿的图像，((b)和(d))在施用公开的凝胶以后的单色图像；
图13a显示具有大的龋齿损害的门齿(脱落的)(已知为奶瓶综合征)，所述牙的图像在光中取得；
图13b在施用公开的凝胶以后的门齿(脱落的)单色图像，所述门齿具有大的龋齿损害(已知为奶瓶综合征)。预期的活性区域在其中很可能脱矿质的损害的边缘的周围。这是通过来自损害的边缘的最大光区域确认的。还在牙科医生在拔除期间引起牙齿表面破坏的a点观察到高光。也观察到了来自安装材料的一些背景(b)；
图14a是显示磨牙(脱落的)的平滑表面的图像，光中的牙齿的图像；
图14b是显示在施用公开的凝胶以后的磨牙(脱落的)的平滑表面的单色图像。像残余的牙龈组织(b)一样，白点损害(a)是可见的。该测定显示了类似于白色斑点损害的不同的图案；
图15a和15b显示磨牙(永久的)的咬合表面。图15a显示牙在光中的图像，图15b显示在施用公开的凝胶以后的单色图像。(a)光中的牙齿的图像，(b)在施用公开的凝胶以后的单色图像。在位置a，树脂填充物是明显的。在添加公开的凝胶以前，牙科医生预测在位置b的活性龋齿，并且建议活性龋齿损害也可能存在于牙齿的裂纹中。本发明人的测定显示了来自位置b的大量的光以及因此的活性脱矿质以及从裂纹捕获的光。注意，图像9a和9b的尺寸差异表明公开的凝胶不覆盖全部咬合表面；
图16a是在光中取得的磨牙(脱落的)的图像。
图16显示磨牙(脱落的)。(a)光中的牙齿的图像，(b)在施用公开的凝胶以后的单色图像，(c)穿过损害产生的光的图示性表示(→)。白点损害(a)是可见的。在添加公开的凝胶之前，牙科医生预测表明，白点穿过表面刻面，并且下部区域中再矿化。本发明人从刻面的损害观察到不同的图案，其具有来自白点损害的上部区域的强信号，以及来自牙齿的下部再矿化区域的较少的光。这提供的证据是，所述测定可以用于评价龋齿损害的活性，并且可以区别活性和非活性损害；
图16b显示在施用公开的凝胶以后的单色图像；
图16c是穿过损害产生的光的图解表述；
图17a显示永久磨牙的x-射线；
图17b显示永久磨牙，其中央表面也用x-射线然后用公开的凝胶研究。牙齿的中央表面在x-射线左边，清楚的是，尽管使用公开的凝胶观察到活性脱矿质的区域，但是在永久磨牙的任一个中存在作为深色阴影可见的无脱矿质(17b，左边的图像是在光中取的，右边的单色图像是在添加公开的组合物以后)。因此，所述方法能够在x-射线能够在这些部位检测到脱矿质很早以前识别活性损害；
图18，(a)显示已经在去离子水中漂洗并且在评价以前移去的牙齿的图像；
图18，(b)显示已经在唾液中漂洗并评价的牙齿；图18，(c)显示已经在唾液中漂洗但是在评价以前移去的牙齿；
图18，(d)显示已经在唾液中温育、移去、在评价以前在去离子水中漂洗的牙齿；
图19，(a)显示添加公开的溶液以后成像的上-牙龈结石；
图19，(b)显示添加公开的溶液以后成像的下-牙龈结石；
图20，(a)显示施用公开凝胶后牙在光中的图像；方框表示结石区域；
图20，(b)显示施用公开凝胶后的单色图像；方框表示结石区域；
图21.图像显示磨牙(永久的)的咬合表面。(a)显示施用公开凝胶前，磨牙(永久的)在光中的咬合表面的图像；
图21.(b)施用公开凝胶后，磨牙(永久的)的咬合表面的单色图像。在位置a，树脂填充物是明显的。从树脂(a)呈现有限量的光，表明来自类似的树脂填充物的干扰预期是最小的。注意，图像21(a)和21(b)的尺寸差异表明公开的凝胶不覆盖全部咬合表面；
图22a至22c显示进行的与牙齿磨蚀和过敏有关的实验的结果；
图23a至23c显示进行的与牙齿磨蚀和过敏有关的进一步实验的结果；
图24a至24c显示进行的与牙齿磨蚀和过敏有关的进一步实验的结果；
图25a至25c显示用酸侵蚀的牙齿进行的实验的结果；
图26a至26d显示用酸侵蚀的牙齿进行的进一步实验的结果；
图27a和27b是显示与去离子水对比，唾液对酸处理的釉质的保护效果的图；
图28是显示如通过亮度变化测量的，不同ph溶液对不同脱矿质水平的影响的图，并且较低ph的溶液产生更多脱矿质(更多亮度)；和
图29是指示食品对牙齿脱矿质的影响的图，所述影响可用本发明的公开的组合物和测定方法确定。
在本发明的上下文中，“离子-敏感性复合物”指的是，能对由于脱矿质释放的游离离子的存在产生光学信号特征的复合物。所述复合物可以是染料，合成离子螯合剂如edta-报道分子复合物或大环如冠醚报道分子复合物，蛋白或蛋白-报道分子复合物，分子印迹聚合物-报道分子复合物或霍利迪连接体。可以将其修饰以增强对于离子的敏感性，以改善信号强度，以延长信号，以改善信噪比，以改善光谱响应。也可使用重组或修饰的蛋白。
本发明涉及下列复合物中的一种或组合作为在牙齿脱矿质检测中的报道分子的新的药物用途，所述复合物为离子-敏感性染料，合成离子螯合剂如edta-报道分子复合物或大环如冠醚报道分子复合物，蛋白或蛋白-报道分子复合物，分子印迹聚合物-报道分子复合物或分子探针如霍利迪连接体。如上所述，在牙表面的游离离子的存在指示脱矿质的存在。这些报道分子可用于检出牙齿上游离离子的存在，因而帮助检出特定的牙齿问题。
在游离离子的存在下，从离子-敏感性报道分子发射光学信号。信号的光谱，强度或持续时间与游离离子的量成正比例。不同组织具有可获得的不同量和不同类型的离子，并且因此对离子-敏感性报道分子的响应将在组织之间改变。牙齿磨蚀过程中，最终可能将牙质暴露。在牙质过敏过程中，牙骨质被除去且暴露根牙质。与釉质相比，牙质和牙骨质较少被矿化，并且因而直接响应于离子-敏感性报道分子。可以由具有更强的光学信号的区域鉴定牙齿的这些脱矿质特征。
在活性龋齿的存在下，随着牙被酸性环境和细菌脱矿质，游离离子将被连续释放。所述信号的位置和强度容许确定活性龋齿的定位。
所述组合物可能含有一种或多种下列物质：染料，合成离子螯合剂如edta-报道分子复合物或大环如冠醚报道分子复合物，蛋白或蛋白-报道分子复合物，分子印迹聚合物-报道分子复合物或分子探针如霍利迪连接体。所述蛋白或蛋白复合物可以包括离子敏感性光蛋白(photoproteins)，离子敏感性荧光蛋白，或可通过荧光，生物发光，化学发光或荧光共振能量转移(bret，cret或fret))检测的蛋白复合物，识别有机材料如釉蛋白的标记抗体。所述合成离子螯合剂或蛋白复合物可结合在离子结合时猝灭的荧光部分，或结合有荧光部分和猝灭剂的蛋白复合物，所述猝灭剂在引起光释放的离子结合时被除去。
用不同复合物可以检测不同离子。镁通过荧光染料如mag-fura-2和mag-fura-5检测。它们可以用于原位测量镁(激发340-380nm，发射500-510nm)。优选地，染料没有毒性。
许多染料是钙敏感性的，但是可能对于口中使用毒性太大。fura-2，钙绿-1(calciumgreen-1)，fluo-3，indo-1和csnarf-1全部是结合游离的细胞内钙的荧光染料。indo-1和csnarf-1是双重发射染料。作为对发光光蛋白的备选，用于检测和测量游离钙的荧光的钙结合染料可能有用。此外，如果与halistaurin联合使用，这些的染料可用于同时测量唾液中的钙和锶的新方法。fura-2，钙绿-1，indo-1和它们的acteto甲基酯(actetomethylester)衍生物已经用于小鼠(体内)以监控神经元的活性。rhod-2也是钙敏感性染料，虽然它比fluo-3较少敏感。rhod-2的较长的激发和发射波长(～556/576nm)使得所述报道分子可用于具有高水平的自荧光的细胞和组织中的实验，以及用于其中同时使用另一种较短波长的荧光染料的实验。因为釉质已知发荧光，因此这种长发射波长将成为显著的优点。
通过荧光染料可实现氟化物的检测。高水平的氟化物一般存在于龋齿损害中，被认为归因于在脱矿质部位的离子高度摄取。对于工业和医疗应用，已经存在且继续着大量对氟化物敏感性荧光体系的研究。一种这样的复合物是zr(iv)-edta-喔星，其显示与氟化物结合时荧光降低。显示在氟化物存在下荧光增加的氟化物传感器也已报道；这些包括硼酸化合物和硫脲基萘衍生物。硼酸化合物目前相对不灵敏(检测水平50-70mm)，然而，相信通过适当的修饰，氟化物选择性可以良好地调节至期望的浓度范围。新的硫脲基萘衍生物显示氟化物存在时荧光增加40倍，且对氟化物具有超过其他卤素的很高的选择性。备选地，(tae-hyunkim和timothym.swager(2003，德国应用化学国际版(chem.int.ed.angewandte)42，4803-4806)描述了一种其中通过氟化物所致的si-o键的开裂导致高荧光香豆素分子形成的体系。
钾的检测可用荧光染料如sbfi，其是钾和钠都敏感的(激发340-380nm，发射510nm)。钾与牙齿过敏有关系且可能与龋齿有关。备选地，由鸢乌贼(symplectoteuthisoualaniensis)获得的光蛋白对钾敏感且可以使用(us2004191884)。
在所述组合物包括蛋白或蛋白复合物的情况下，它可以在结合游离离子时产生光学信号。可将这种蛋白或蛋白复合物修饰，例如通过改变基因的dna序列，通过乙酰化，乙氧基羰基化，荧光胺-修饰或荧光素标记或通过形成诸如gfp-水母发光蛋白(us2003175807)的嵌合蛋白，从而增强信号，延长信号持续时间或改变它的发射光谱。也可使用具有类似功能的蛋白和蛋白复合物，诸如结合离子或有机材料时经历导致光学信号的构象变化的那些。
这种蛋白或蛋白复合物的实例是光蛋白。光蛋白是由一个或多个多肽链和氧-预活化底物组成的稳定的酶-底物复合物，所述氧-预活化底物例如为2-氢过氧化腔肠素(hydroperoxycoelenterazine)，其与蛋白紧密但是非共价结合。生物发光可通过例如ca2+和与蛋白结合的底物的脱羧的产物触发。根据本发明，另一种可能有用的光蛋白是halistaurin。halistaurin可用于检测锶，锶被认为在矿化过程中取代羟基磷灰石晶体中的一小部分钙。锶的缺陷与龋齿有关系(“锶和龋齿(strontiumanddentalcaries)”.营养学综述(nutrrev)1983；41：342-344)。锶的检测可使用光蛋白如halistaurin。在us的不同区域中已经报道了牙齿中的宽范围的锶的值(例如，66-564ppm)。
光蛋白的另一个实例是水母发光蛋白，其天然地产生于生物发光水母维多利亚多管水母(aequoreavictoria)中，或可以重组表达。水母发光蛋白是能储藏大量在钙存在下释放的能量的蛋白。脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)与它的底物腔肠素互相作用，以形成相对稳定的通过钙活化的复合物。两个钙离子对水母发光蛋白的结合引起所述蛋白的构象改变，导致蛋白开放和腔肠素过氧化物分解为腔肠酰胺(coelenteramide)和co2，伴有光学信号或光的发射。进一步的关于水母发光蛋白的描述可以在下列文献中发现：shimomura等(1978)美国科学院院刊(proc.natlacad.sci.u.s.a.)75，2611-2615；head等(2000)自然(nature)405，372-376；和shimomura(2005)显微镜学杂志(journalofmicroscopy)217，3-15。
光蛋白的其它实例包括螅蛋白,钙调发光蛋白(clytin),mitrocomin,halistaurin,瓶梗蛋白(phialidin),mnemiopsin,symplectin,gr-bolinopsin和瓜水母光蛋白。这些光蛋白显示高的序列同源性，且包含三个“ef-手型”钙结合部位。这些光蛋白的进一步描述可在以下文献中发现：prasher等,生物化学与生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)126(1985)；inouye等,美国科学院院刊(proc.natlacad.sci.u.s.a.)82(1985),3154-3158页；prasher等,生物化学(biochemistry)26(1987),1326-1332页；inouye等,febs通讯(febslett.)315(1993),343-346页；t.f.fagan等,febs通讯(febslett.)333(1993),301-305页；illarionov等,dokl.akad.nauk326(1992),911-913页；illarionov等,基因(gene)153(1995),273-274页；shimomura等(1985),生物化学杂志(biochemj.)6月15日；228(3):745-9；ward等(1974)生物化学(biochemistry).3月26日；13(7):1500-10。这些蛋白的作用模式的进一步描述可在以下文献中发现：markova等,生物化学(biochemistry)41(2002),2227-2236页；charbonneau等,生物化学(biochemistry)24(1985),6762-6771页；tsuji等,光化学光生物学(photochem.photobiol.)62(1995),657-661页。
所述组合物可以包含合成离子螯合剂如edta-报道分子复合物或大环如冠醚报道分子复合物。有许多关于这些的实例，其与离子结合且具有报道分子的复合物已经制成。例如，对于钙，使用bapta，用光诱导的电子传递连接荧光团和选择性受体，所述bapta如在johnf.callan，a.prasannadesilvaa和nathand.mcclenaghanv(2004)化学通讯(chem.commun.)2048-2049中所描述。美国专利5409835也描述了用于确定样品中钙离子浓度的荧光钙-结合杂环探针化合物。
所述组合物可以包含在指示离子存在的特征波长发荧光的复合物。通过改变光的强度或颜色，这种发荧光复合物响应于离子。这些复合物可以是蛋白或蛋白复合物。
荧光蛋白的优选实例包括嘉美露蛋白或指示剂。嘉美露是一类新的用于活细胞中钙离子浓度的指示剂，其在钙离子的存在下，通过导致“
荧光蛋白的另一个实例是pericam，其是gfp的修饰形式。cam和pericam的结合肽m13之间的ca2+-诱导的相互作用导致循环改变(cp)yfp的荧光特征的改变，如nagai等，pnas98(6)：3197(2001)描述的。
荧光方法的另一个实例是camgaroo探针，其中钙的结合与钙调蛋白互相作用，所述钙调蛋白引起蛋白构象的变化以及来自黄色荧光蛋白的荧光增加，并且诱导荧光增加(如在rüdigerrudolf，marcomongillo，rosariorizzuto和tulliopozzan的自然综述分子细胞生物学(naturereviewsmolecularcellbiology)4，579-586中评论的)。
荧光方法的另一个实例是嵌合荧光-光蛋白，例如gfp-水母发光蛋白(诸如us2003175807)，其中荧光分子与光蛋白共价连接，并且存在通过化学发光共振能量转移(cret)的能量转移。
这些实例用于说明蛋白-报道分子复合物在离子检测中的用途。涉及的蛋白可以是在结合特定离子时结合或改变构象的任意数量。对于钙，这些可以是酪蛋白,集钙蛋白,calexcitin,钙结合半胱氨酸蛋白酶，钙调蛋白和其它ef手型蛋白。报道分子可以是染料或荧光蛋白或发光蛋白。
所述组合物可以包含结合分子探针的复合物，所述分子探针诸如scorpion探针，taqman探针，霍利迪连接体或线性探针。离子结合探针时可出现荧光或发光。分子探针的优选实例是霍利迪连接体。这些是在四股dna之间形成的活动连接体。通常用它们来检测特定的dna序列，然而，已知金属离子通过结合到特定部位而在确定连接体的构象中起重要的作用(thorpej.h.，galeb.c.，teixerias.c.和cardinc.j.(2003)分子生物学杂志(jmolbiol.)20033月14日；327(1)：97-109)。因此这些连接体可以用于检测离子如钠，钙和锶的存在。
许多方法可以一起使用。例如，可用螯合剂来隔绝一种离子，留下另一种以结合光蛋白。因而光蛋白halistaurin结合钙和锶两者。锶可能是疾病的好的量度，并且可以在将光蛋白加入到牙中以前，将会另外掩蔽存在的锶的量的钙隔绝，从而使光蛋白仅响应于锶。钙隔绝试剂可以是基于蛋白(钙调蛋白，钙周期蛋白)的或基于化学品(bapta，egta)的。bapta(1，2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸)是钙-特定的螯合剂，且bapta基化合物对于测量游离的细胞内ca2+是最通用的。
用生物发光共振能量转移(bret)可以一起使用光蛋白和荧光蛋白，其中从光蛋白产生的光学信号传递至紧密接近的荧光蛋白，然后测量来自荧光蛋白的荧光。用这样的方式，可改变信号的颜色或增加信号的持续时间以改善成像。与牙齿上的成像荧光染料有关的问题之一在于经常存在下列情况，其中使用高强度光源不实际，原因在于内在的牙齿的高的自-荧光。使用bret的一个可能的好处在于，它可以用于在钙存在的特定区域共-定位(co-localised)的荧光探针的激发。
所述组合物可以用于口中分析，例如以检测活性龋齿的存在；和口外分析，诸如在实验室中用于人工诱导的龋齿的研究，新式牙-友好食物和制剂的开发以及食品腐蚀性的研究。使用所述组合物的口外分析也可用牙模型如羟基磷灰石模型或釉质切片进行。
例如通过牙科医师和牙齿卫生学家，所述组合物可以用于活性脱矿质的早期检测，最佳治疗的确定，用于随着时间的过去监控问题或治疗，以及识别可能对某种牙齿问题敏感(例如磨蚀或过敏)的个体；由实验室研究者用于新产品(例如牙膏，饮料)的开发；或为了家庭护理市场而用于活性牙齿疾病的检测和评估(例如以嗽口水或公开片剂的形式)。
当前没有用于活性龋齿检测的单一步骤方法。活性龋齿趋向于产生游离离子，原因在于持续的脱矿质；无活性龋齿将产生很少的，若有的话，游离离子，原因在于没有脱矿质。通过在施用离子-敏感性报道分子以后测量光学信号输出可检测脱矿质，这可以与其中存在很少或没有脱矿质的非-活性龋齿对比。
因此，离子-敏感性报道分子可以提供对龋齿的活性特性的一次测量，并消除对到牙科医师多次就诊的需要。离子-敏感性报道分子也可用于确定个体对牙齿疾病如牙齿磨蚀的敏感性。在该情况下，可将温和侵蚀溶液如弱酸加入到牙齿，并且牙齿的响应将指示脱矿质的程度和将来遇到与磨蚀有关的问题的可能性，所述响应通过由检测组合物发射的信号测量。
用于检测活性牙脱矿质的方法可任选地包括以下步骤，从牙表面去除唾液，并且其中适当的去除蚀斑(如果存在)，然后将待研究的牙表面暴露于如上所述的组合物并检测得到的光学信号。
所述方法还可以包含下列步骤：在用蛋白组合物暴露之前，将牙暴露于敏化溶液，诸如含糖的或酸性溶液。敏化溶液模仿脱矿质的作用，以便检测过敏和磨蚀，并可用来估计具体问题的程度。例如，酸性溶液可用来识别牙质(例如来自牙磨蚀)或根暴露(例如来自后退的牙龈)的区域。这是因为牙的特别部分对酸性溶液比对其它部分将响应更强烈，且因此可被识别。例如，原因在于质和牙骨质内较低的矿化程度，因此和釉质对比，敏化溶液的添加将导致从牙质和牙骨质比从釉质释放更多的钙。在施用离子-敏感性报道分子时，牙质区域(相当于牙质磨蚀或过敏的区域)将比釉质区域更明亮，即具有更强的光学信号，如此指示问题的程度。这可以改善结果的准确度。
敏化溶液也可以用于估计个体对于特别状态的敏感性。那些对牙磨蚀更敏感的个体将显示更多脱矿质且因此显示更大的响应。在评价对牙齿磨蚀敏感性中，釉质结构和构成相比于唾液不重要。在确定个体的磨蚀敏感性中，唾液组合物，体积，组成和流动给予重要的作用。本发明的技术可能能够确定牙釉质对酸挑战的耐受性，包括通过个体唾液(特别是唾液表膜)提供的保护。这种定量测试可能有益于牙科医师和牙齿卫生学家确定患者敏感性并且监控治疗，且有益于牙膏开发商和食品科学家，他们要了解对于制剂在脱矿质水平上有什么效果改变。另外，所述测试将在促进新的磨蚀预防涂层中有用。因此，用于归因于磨蚀的脱矿质测试的备选方案可包括等待一段时间以后，例如暴露于侵蚀溶液小于1，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30秒钟后，以致唾液在口中增强，然后用检测组成测试脱矿质的程度。为了唾液再次增强，可将所述的时期根据需要延长高达1，2或5分钟。
可用分光光度计，电荷耦合装置(ccd)，互补金属-氧化物半导体(cmos)，数字照相机，增强照相机，照相软片，光纤装置，光度检测器，光电倍增器，微机电系统(mems)或在视觉上通过眼检测得到的光学信号。对于实验室测试，例如在牙-友好饮料的开发过程中，为了样品的自动化和高检测量，所述方法可以使用照相机，发光计或荧光计。
可使用软件来分析光的强度，光的位置和产生的光的持续时间。它可用于增强信号并在牙齿图像上提供“叠加的”覆盖(overlay)，以使牙科医师能够精确地定位部位，并且帮助监控实时的或在治疗后的改变。
因而，本发明通过确定游离钙的量，还容许评价进一步磨蚀的可能性，以及牙质过敏(通过脱矿质引起暴露的牙本质小管进一步的张开)。因而，所述方法容许对牙磨蚀更敏感的患者以及过敏性牙的鉴定。这将容许易于磨蚀的那些个体采取预防性措施，并且也可以容许实验室-基试验研究新的用于过敏的牙膏，或分析关于其牙-腐蚀性质的食品或饮料产品。
使用基于图像的发光技术和离子-敏感性蛋白即水母发光蛋白进行下列实验。使用提取的人齿进行全部工作。在口中，可以使用多种应用的方法。例如，可以存在用于所述公开的组合物的载体装置。这可以是口模如牙盘。使用载体装置的优点是，它保持唾液远离牙和所述公开组合物。所述盘可以是非-定制的，即仅具有与人口近似的形状和尺寸，或定制的，即使用人齿作为模板来制造所述盘。所述盘将作为所述公开组合物和所述检测器之间的界面。优选地，所述载体装置是光学清晰的。可以将所述公开组合物在放入患者口中以前加入到载体装置，或当载体装置在口中时将所述公开组合物注入载体装置中。备选地，可以使用所述公开组合物的条(strip)。这将与现有技术中已知的牙漂白条类似，可将其用于所关心的区域。常规漂白条包含涂有中等粘度的牙齿漂白凝胶的柔性塑料条，且在面对使用者牙齿的所述条的一侧具有相对低的粘合性。备选地，可以将所述组合物喷在牙齿上或施用在嗽口水中。
水母发光蛋白溶液制备如下。用原始来自维多利亚多管水母(aequoreavictoria)的基因序列在大肠杆菌中表达重组水母发光蛋白，与底物腔肠素复合，并且冻干。所述干备料包含在甘露糖醇(prolume(rtm))中约1重量％的水母发光蛋白。为了制造用于施用到牙齿的工作水母发光蛋白溶液，将干原料水母发光蛋白制剂在无钙净化水中以1mg/mlw/v的浓度溶解。备选地，在具有1mmedta的1％akucell3625凝胶中制备1mg/mlw/v的水母发光蛋白。当将钙离子加入到此水母发光蛋白溶液或凝胶中，发射蓝光的闪光(flash)。
将样品放置在高度-可调台上的暗箱中，且使用低光电荷耦合装置或ccd(装有tamron(rtm)超近摄镜头的starlightxpresshx-9(rtm)热电冷却ccd照相机)记录图像。大多数情况下，2x2的硬件像素融合(binning)用于增强检测的灵敏性且减少暴露时间。将图像保存为tif文件。当暗箱门打开从而允许环境的光照射样品时，捕获日光图像，且用10/100th秒曝光并2x2贮存。随着所述暗箱的门关闭，取得黑色图像，并用1或2分钟曝光时间，用2x2像素融合。
在imagej中将灰度(256水平)图像打开，并且(如果必要)在将所述图像插入至microsoftword(rtm)文件以前，调整对比度以增强图像的清晰度。对于相同实验产生的图像，对每个图像进行相同的调整。得到的图像可用于绘制相应于样品上的钙的存在的发光。所述最黑的区域(黑的)指示最低的光的区域而较亮的区域(白的)指示增加了光的区域。
实验a：使用酸性凝胶的牙齿脱矿质
将工业中为了模仿实验室中的活性龋齿的产生而使用的标准方法用于使用酸性溶液或凝胶产生脱矿质的区域(例如参考文献amaechi等：口腔生物学文集(archoralbiol)1998；43：619-628)。本发明人已经进行了类似的实验，以确定本发明人公开的材料是否可用于识别脱矿质的区域。
在ph4.7或ph6.4(用0.1m乳酸，用5m氢氧化钾中和)制备羧甲基纤维素(3％w/vakucell1985)凝胶。因为釉质在大约5.4的临界ph溶解，因而选择所述ph范围。使用指甲油在提取的前磨牙的平滑表面上产生大约4x4mm的‘窗口’，图2。窗口具有类似的大小(因为已知尺寸影响矿物质的损失程度)。将凝胶(ph4.7或6.4)施用于窗口且将所述牙在水合环境且37℃中温育5，10，14或21天。在每个时间点和ph，使用5颗复制牙齿。另外，在ph4.7的任一凝胶中将15颗牙齿温育14天，评价，然后在再评价之前，用ph4.7或ph6.4的凝胶再温育5天。这容许确定是否可以通过中和凝胶停止脱矿质。
温育后，将所述凝胶从具有组织的所述牙表面轻轻地擦去，且用去离子水将表面清洗。用sonyhx9照相机用2x2融合将所述牙成像，且在光中图像捕获时间为10ms。使用自动移液器，将0.2cm3用1mmedta制备的在1％akucell3625凝胶(公开凝胶)中的1mg/cm3水母发光蛋白转移至牙齿。在黑暗中立即取2x2融合的1分钟图像。
图3中显示了实例图像。将图像的对比度改变以改善外观，且对所有图像施用完全相同的调整。将imagej用于确定所述窗口内区域的亮度，图4和5。
所述结果清楚地显示，相比于用ph6.4的凝胶温育的那些，用ph4.7的凝胶温育的那些牙齿显示较高水平的光，即游离钙的释放和脱矿质。此外，与从酸性凝胶转移至酸性凝胶的牙齿相比，当牙齿首先在酸性凝胶中温育然后转移至中性凝胶时，光输出减少。
这些结果提供了稳固的证据，即钙敏感性光蛋白如水母发光蛋白可以检测脱矿质的区域。显著地，仅5天后就可以检测脱矿质。这早于发表的文献中所描述的其它技术，从而提供该方法将提供非常早的脱矿质的数据的证据。
实验b：备选公开材料的使用
存在许多可用于通过确定离子释放来识别脱矿质区域的材料。实施例a使用光蛋白水母发光蛋白。其它材料也可使用。
图6显示也可以使用螅蛋白(钙敏感性光蛋白)。将提取的牙在1％柠檬酸中温育2分钟。已知酸导致釉质的脱矿质。将牙移去，在去离子水中清洗然后测定。用sonyhx9照相机用2x2融合将所述牙成像，且在光中图像捕获时间为10ms。使用自动移液器，将0.2cm3用1mmedta制备的在1％akucell3625凝胶(公开凝胶)中的1mg/cm3的水母发光蛋白或50ug/ml的螅蛋白转移至牙齿。在黑暗中立即取2x2融合的1分钟图像。为了改善外观，用imagej调整图像对比度；对两个图像都进行相同的调整。图6a显示从水母发光蛋白凝胶产生的光，且6b显示从螅蛋白凝胶产生的光。结果显示许多不同的报道分子可也用于指示游离离子的存在和脱矿质。
实验c.根的暴露
将提取的牙浸于水母发光蛋白中，以测试是否所述牙的所有区域以同样方式对水母发光蛋白溶液响应。用无钙净化水将所述牙轻轻地刷拭，且将牙放在暗箱中的3cm直径的皮氏培养皿中。用所述的ccd照相机获得日光图像。
将5ml的1mg/ml水母发光蛋白溶液直接吸移到所述牙表面上。直接获得图像，用2分钟曝光，用2x2融合。然后用液体乳液(copydex(rtm))将所述相同牙的根‘掩蔽’，然后再添加水母发光蛋白溶液，并且像以前一样取得图像。结果显示于图7a和7b中。
图7a和7b分别是暴露于水母发光蛋白后的牙的图像，以及在暴露于水母发光蛋白以前用copydex(rtm)掩蔽的牙的根的图像。图7中，较亮区域(最大的发光)对应于根，且在图7b中，没有来自已经被掩蔽的根区域的光。光输出稍有不同，原因在于掩蔽后的牙的再-定向(re-orientation)。箭头显示所述牙冠中龋齿的存在，如明显的为白色斑点，且通过牙科临床医生证实。
结果显示，所述牙的根与冠相比对所述水母发光蛋白反应更强烈，指示所述根中游离钙的量更高。认为这是由于所述根组织(牙质和牙骨质)比所述冠的釉质的更低的矿化。诸如这里所描述的方法，使用水母发光蛋白的钙-敏感性测定可用来识别暴露的根组织，例如作为过敏性机构研究的一部分。备选地，在添加所述水母发光蛋白以前，可将根例如用copydex(rtm)掩蔽，从而允许在没有来自根干扰的情况下的对冠的研究。
实验d：牙质的暴露
也可将公开的凝胶或溶液用于检测和估计脱矿质的程度和定位，所述的公开的凝胶或溶液识别由于离子释放的脱矿质，所述脱矿质由磨蚀(并且间接地，过敏)产生。
当牙的冠变得碎裂-即失去一些釉质时，牙的牙质会暴露。类似地，当牙齿例如通过酸腐蚀时，可能暴露牙质。在此实验中，将碎裂的牙用于研究用离子-敏感性报道分子测定是否可鉴定暴露的牙质。用无钙净化水轻轻地刷拭提取的牙。在所述过程中一部分釉质碎裂掉，从而暴露出下面的牙质。用液体乳液(copydex(rtm))将所述牙的根‘掩蔽’。将所述牙放置在暗箱中的3cm的皮氏培养皿中。获得日光图像。将4ml的1mg/ml水母发光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中立即获得图像，用2分钟曝光，用2x2像素融合。图8a和8b中显示了结果。
图8a是牙的日光图像，并且图8b是牙在暴露于水母发光蛋白后的图像。圆形区域显示碎片区域。箭头指示未完全被copydex(rtm)覆盖的根的区域。
结果显示许多光产生于与所述牙刚刚碎裂的区域接触的水母发光蛋白。这显示暴露的牙质与水母发光蛋白反应以产生光。因此可以将离子-敏感性报道分子测定，例如使用水母发光蛋白的离子-敏感性报道分子测定，用于例如在牙磨蚀以后识别暴露牙质的区域。
实验e：空腔识别
由训练的牙科临床医生将提取的牙识别为具有空腔。用copydex(rtm)将所述牙的根掩蔽。用无钙净化水将所述牙轻轻地刷拭，且将牙放在暗箱中的3cm的皮氏培养皿中。用ccd照相机获得日光图像。
将5ml的1mg/ml水母发光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中立即获得图像，用2分钟暴露，用2x2像素融合。图9a至9b和10a至10b中显示了结果。
图9a至9b是：(a)在光中的脱落的(或‘乳’)牙的图像，且(b)是单色图像。随后处理以黑色显示的较低光的图像区域，用灰色和白色指示增加光的区域。箭头显示由牙科临床医生识别的空腔。
图10a至10b分别是在光中的恒牙的图像以及单色图像。随后处理以黑色显示的较低光的图像区域，用灰色和白色指示增强的光的区域。箭头显示由牙科临床医生识别的空腔。
根据本发明的组合物通过发射光对游离离子响应，并且所述光学信号强度是存在的游离离子的数量的量度。所述发射光的持续时间显示所述释放离子的特性，例如较长的发光可显示离子的连续释放或来自更深组织的离子释放。所述牙的不同部分对由于存在的游离离子的化学性质的离子-敏感性蛋白的响应不同，例如归因于矿化的量，牙质响应多于釉质。这可用于识别牙活性龋齿，活性的磨蚀，牙龈退回以后暴露的牙质，等等。
所述光学信号的位置将显示所述问题如所述活性龋齿的位置。光的表面积的尺寸显示问题的程度，所述问题例如为活性龋齿的表面积。所述发光的持续时间可以显示所述问题的程度，所述问题例如为酸-挑战的影响程度(即牙/患者对龋齿或磨蚀的个体敏感性)或受影响组织的类型。通过产生的光学信号的强度，持续时间或颜色，可将活性龋齿与无活性龋齿区别。在活性龋齿中，脱矿质是连续的，因此存在更多钙且产生更多信号。完全的无活性损害将仅产生‘背景’信号水平。部分活性损害将显示活性和无活性的区域，即具有信号的区域和无信号的区域。
因而，用离子-敏感性复合物，可在临床可见龋齿损害形成之前检测脱矿质的区域，从而可以应用治疗如氟化物施用，以防止衰减过程的进一步发展。
实验f：龋齿识别i
使用酸性溶液，可将实验室研究用于产生人造龋齿。优选地，将自口提取且具有龋齿的牙齿用来测试所述方法。这些将具有自然产生的龋齿，且提供较好的口中牙齿模仿。
在明亮的光下识别‘白色’区域后，由经训练的牙齿临床医生识别提取的牙具有龋齿。这指示了脱矿质的区域并且是识别龋齿的传统方法。
用copydex(rtm)将所述牙的根掩蔽。用无钙净化水将所述牙轻轻地刷拭，且将牙放在暗箱中的3cm的皮氏培养皿中。用ccd照相机获得日光图像。
将5ml的1mg/ml水母发光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中立即获得图像，用2分钟暴露，用2x2像素融合。
图11a至11b分别是牙在光中的日光图像以及灰度图像。随后处理图像，以黑色显示的较低光的区域，用灰色和白色指示增强的光的区域。箭头显示由牙科临床医生用传统方法识别的龋齿。
如图像显示，由经训练的牙科临床医生识别为是龋齿损害的‘白色’区域(当提取所述牙时，是活性的)被识别为是水母发光蛋白测定中的明亮区域。这显示所述水母发光蛋白测定可以取代传统的‘凭视觉’的方法。
实验g：刚刚提取的牙齿的龋齿识别，评估
将出于正牙学或其它的原因提取的牙齿在提取后立即获得。没有获得患者信息，虽然牙科医师预测一些牙齿由于年龄(用于未成年人的临床)和牙齿病症而具有活性龋齿。提取后立即用去离子水清洗牙齿以除去一些粘附的血液和生物物质。用公开的凝胶立即测定所述牙齿。
通过比较来自刷拭和不刷拭的具有成穴损害的牙齿的光输出，确定在去离子中刷拭提取的牙齿的影响；图12。观察到有限的影响并且因此刷拭牙齿的其余部分，因为本发明人认为该方法最好地模仿了当访问牙科医师时患者的行动。
牙科医师评价牙齿的龋齿损害且用铅笔标记看来像在牙的哪一侧。将该侧在皮氏培养皿中放置在最上，并用sonyhx9照相机用2x2融合成像，且在光中图像捕获时间为10ms。使用自动移液器，将0.2cm3用1mmedta制备的在1％akucell3625凝胶(公开凝胶)中的1mg/cm3的水母发光蛋白转移至牙齿。在黑暗中立即取2x2融合的1分钟图像。
尽管在没有图像修饰情况下的差异也是容易可见的，也将imagej用于改变图像的对比度，其处理是为了较好地呈现数据。较低的光区域呈现黑色，用灰色和白色指示增强的光的区域。图13-16中显示了结果。
然后对牙齿施加x-射线，以确定是否在所述光蛋白测定中识别的活性脱矿质区域通过传统方法是可见的。尽管x-射线用于监控损害发展，但用所述公开凝胶检测的龋齿通过x-射线不可见，图17。这显示了该方法用于龋齿损害的早期识别的有效性。
实验h：干扰的评估
研究其它产品如牙膏的潜在干扰，原因在于如果响应于这些而产生光，则该测定对于口中使用可能有问题。
唾液：将提取的牙齿在去离子水或唾液(汇聚自8个个体)中清洗。在添加公开的溶液以前，用sonyhx9照相机用2x2融合且在光中捕获时间为10ms将所述牙齿成像。然后添加5cm3的1mg/ml去离子水中的水母发光蛋白(公开溶液)且在黑暗中成像2分钟，2x2融合。将牙齿或者在唾液中、或者从唾液中移去或在去离子水中移去并且清洗的情况下成像，图18。结果显示唾液含有显著量的钙。然而，只要牙不在大量的唾液中，不会干扰分析。即使在口中，大量的唾液将最少，因此不预期唾液对于分析是个问题。
实验h2-结石
在牙齿治疗的过程中，通过从牙齿上敲击获得结石，且作为悬浮在水中的薄片提供结石。将龈下的和龈上的两者都评价。在使用以前，将样品在真空下用millipore膜过滤器和固定器将样品过滤，并且用去离子水洗涤。添加5cm3的去离子水中的1mg/ml水母发光蛋白，且将样品成像1分钟，2x2融合。图19，a和b。用imagej调整对比度以改善外观，将相同的调整应用于两个样品。
也研究原位结石的影响。添加5cm3的去离子水中的1mg/ml水母发光蛋白，且将样品成像2分钟，2x2融合，图20。
实验h3-树脂填充物
评价具有树脂填充物的牙。用sonyhx9照相机用2x2融合将所述牙成像，且在光中图像捕获时间为10ms。将0.2cm3用1mmedta制备的在1％akucell3625凝胶(公开凝胶)中的1mg/cm3的水母发光蛋白转移至牙齿。在黑暗中立即取2x2融合的1分钟图像，图21。
结果显示获得少量的光，但是可能过低而干扰所述测定。实际上，牙上光较低的区域可以提供结石存在的指示。
实验h4-牙膏。
在对牙齿用2cm3的去离子水中的1mg/cm3水母发光蛋白评价以前，用去离子水，或牙膏和去离子水刷拭牙齿。与对照相比，没有来自牙膏-处理的表面的额外的光可见，从而指示牙膏不应当干扰所述测定(数据未示出)。
实验i：牙齿磨蚀和过敏
碳酸软饮料含有高水平的酸且已知是牙磨蚀的原因并可以加重牙质过敏。将许多提取的牙齿在这些饮料中温育，且将水母发光蛋白用于估计它们的影响。进行此实验的目的在于，开发用于牙齿磨蚀(且间接地，过敏)的测定或识别可感者个体的方法。
用无钙净化水和牙刷轻轻地刷拭提取的牙齿，并将提取的牙齿放置在暗箱中的3cm的皮氏培养皿中。用ccd照相机获得日光图像。将5ml的1mg/ml水母发光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在黑暗中立即获得图像，用2分钟曝光，用2x2像素融合。
然后将所述牙齿用无钙净化水清洗，之后浸于可乐，irnbru(rtm)或1％柠檬酸中10分钟。然后用无钙净化水漂洗牙齿，之后添加5ml水母发光蛋白溶液，且将所述牙齿如前成像。也评价所述溶液的ph(用hydrus300ph计(rtm))。全部是酸性的：cola：ph2.38；irnbru(rtm)ph2.82；柠檬酸ph2.17。图22a至22c，23a至23c和24a至24c显示了结果。
图22a至22c示例了浸没在可乐中10分钟的影响。图22a是没有添加水母发光蛋白的牙的日光图像；图22b是添加水母发光蛋白后在黑暗中的牙的图像，没有任何其它处理；而图22c是添加水母发光蛋白后且接着在可乐中温育10分钟后，在黑暗中的牙的图像。
图23a至23c示例了在irnbru(rtm)中浸没10分钟的影响。图23a是没有添加水母发光蛋白的牙的日光图像；图23b是添加水母发光蛋白后在黑暗中的牙的图像，没有任何其它处理；且图23c是添加水母发光蛋白后且接着在irnbru(rtm)中温育10分钟后，在黑暗中的牙的图像。
图24a至24c示例了在1％柠檬酸中浸没10分钟的影响。图24a是没有添加水母发光蛋白的日光图像；图24b是添加水母发光蛋白后在黑暗中的牙的图像，没有任何其它处理；且图24c是添加水母发光蛋白后接着在1％柠檬酸中温育10分钟后，在黑暗中的牙的图像。
已知饮用碳酸饮料导致牙磨蚀。本文中的结果显示，在用含糖的碳酸饮料或酸性溶液温育后，从牙齿释放可用水母发光蛋白检测的游离钙。这些在根上是最显著的。因此，可将离子-敏感性蛋白如水母发光蛋白用于指示钙释放的区域，并且因此显示脱矿质的区域以及随后的牙损伤如磨蚀或增加的过敏可能性。
在过敏性牙齿中，牙质有更多小管在牙质表面打开(高达8倍)且所述小管直径更宽。这为如通过酸性饮料的脱矿质提供了较大的可获得的表面积，且也将引起在施用这种产品以后更多钙的释放。这将被观察为较亮区域，如图22至24所看到的。
实验j：酸侵蚀的牙齿
将牙齿蚀刻凝胶用于将牙表面变粗糙，从而例如可将裂隙密封剂稳固地附着。所述蚀刻凝胶是酸性制剂，所述酸性制剂在局部区域中蚀刻至有限深度。
用无钙净化水和牙刷轻轻地刷拭提取的牙齿。将小的(4x4mm)标签应用于牙，并且通过在标签的整个区域上并且包裹牙表面涂布指甲油，将其固定在适当位置。容许其干燥，然后将所述标记剥离，得到由指甲油包围的4x4mm的暴露区域。这限制了施用牙齿蚀刻凝胶(ultradentproductsinc)的区域。蚀刻凝胶被保留5分钟，然后用棉拭子擦去，并且用潮湿的脱脂棉拭子清洗掉。
将5ml的1mg/ml水母发光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中立即获得图像，用2分钟曝光，用2x2像素融合。然后立即获得第二个图像，用2分钟曝光。图25a至25c中显示了结果。
图25a至25c是：日光图像，没有添加水母发光蛋白；添加水母发光蛋白后的单色图像，用2分钟曝光；和添加水母发光蛋白后的单色图像，用连续的2分钟曝光。左侧箭头指示了指甲油，星号指示了施用所述蚀刻凝胶的区域。
当将水母发光蛋白加入到已经被牙齿蚀刻凝胶侵蚀的牙时，存在通过眼可见的光的明亮闪光。相比第一次曝光，第二次曝光导致较少光发射。这显示凝胶仅从限部区域释放钙，这对于对水母发光蛋白的反应直接有效，因此所述闪光具有很少的用于将光输出延长的‘表面下的’钙释放。
这不像用柠檬酸观察到的影响，其中光输出持续一些时间。如图26a至26d中所示，用第二次图像，5min曝光，并且在添加所述水母发光蛋白后15分钟获得，进行如实验e中描写的方法。看来柠檬酸引起更广泛的脱矿质。
图26a至26d示例了在1％柠檬酸中浸没10分钟的影响。图26a是日光图像，没有添加水母发光蛋白；图26b是添加水母发光蛋白后在黑暗中的牙的图像，没有任何附加处理；图26c是添加水母发光蛋白后且在1％柠檬酸中温育10分钟之后，在黑暗中牙的图像，添加水母发光蛋白后2分钟曝光直接取得；图26d是添加水母发光蛋白后且在1％柠檬酸中温育10分钟之后，在黑暗中的牙的图像，添加水母发光蛋白15分钟后5分钟曝光直接取得。
实验k：患者对磨蚀敏感性的评估
不同人对磨蚀和过敏具有不同的敏感性。已知这部分地在于诸如氟中毒的治疗和牙齿的定位，尽管一般地认为影响牙齿磨蚀预防的最重要因素是唾液(流速，组成，缓冲和再矿化能力)。
所述公开的组合物可用来识别脱矿质的水平，所述脱矿质是由患者通过在酸性溶液中首先漂洗牙齿的酸磨蚀所引起的。这将提供关于牙本身对于磨蚀的敏感性信息。进一步地，通过对所述牙齿添加唾液后再估价光输出，可以确定个体患者的唾液的作用。可在提取的牙齿上或在所述口中进行所述的测定。
为了评价脱矿质，用sonyhx9照相机用2x2融合，且在光中图像捕获时间10ms，将所述牙成像。使用自动移液器，将0.2cm3用1mmedta制备的在1％akucell3625凝胶(公开凝胶)中的1mg/cm3的水母发光蛋白转移至牙齿。用2x2融合，在黑暗中立即取1分钟图像。将imagej用于确定冠和根区域的亮度。包括glowelltm(蓝色g2，96孔格式)，以保证光测量装备的一致性。重要的是，所述水母发光蛋白对ph不敏感，且跨越大的ph范围的光输出类似。将提取牙齿如上评价(三重测定)。将牙齿在1％柠檬酸中温育2分钟，移去，在去离子水中清洗，评价，然后在去离子水或者唾液中温育30s然后再评价。
图27a和27b显示所述唾液对酸-处理的釉质如何比去离子水有更大的保护作用，从而导致光输出更大的减少。在根表面上观察到较少差异。与提供用于所述测定定量特性的证据的实验l一起，此实验提示的是，类似的测定将提供确定患者对磨蚀敏感性的方法，其中所述类似的测定用酸性溶液将患者的牙齿清洗，用脱矿质公开溶液对光输出评价，且通过接触唾液后再估价来确定唾液的保护影响。这将在临床诊断，决定适当的治疗，以及在为生活方式如何影响患者的牙齿提供证据中有用。
实验l：食品腐蚀性的评估
已知不同的食品导致不同的磨蚀水平(例如hemingway等，英国牙齿杂志(britishdentaljournal)(2006)；201，439)。这部分在于由于食品的ph并且部分在于钙浓度。例如，碳酸软饮料含有高水平的酸，且已知是牙磨蚀的原因且可以加重牙质过敏。
可将所述公开的溶液和测定法用来开发对于牙齿磨蚀的测定(且间接，过敏)。这可用来识别由食品所引起的脱矿质程度，如此证明食物的危险因素。也可将其用于确定消费者和诸如牙膏，嗽口水，密封剂，漂白试剂的临床产品的有效性。也可将其用于食品的开发和鉴定，所述食品导致较少脱矿质且因此对牙齿较好。
在过敏性牙齿中，牙质有更多小管在牙质表面打开(高达8倍)且所述小管直径更宽。这为例如通过酸性饮料的脱矿质提供了更大的可获得的表面积，且也将引起继施用这种产品后更多钙的释放。这将作为较明亮的区域被观察。
跨越提取的脱落牙齿，将管道用指甲油画好以限定冠和根表面。将提取的牙齿在不同ph的溶液中温育。这些要么是柠檬酸，碳酸氢钠，磷酸盐缓冲盐水的不同稀释物，要么是去离子水。也评价所述溶液的ph(用hydrus300ph计(rtm))。温育2分钟，温育后将所述牙齿移出在去离子水中清洗，然后测定。在光中，用sonyhx9照相机用2x2融合且图像捕获时间10ms，将所述牙成像。使用自动移液器，将0.2cm3用1mmedta制备的在1％akucell3625凝胶(公开凝胶)中的1mg/cm3的水母发光蛋白转移至牙齿。在黑暗中立即取2x2融合的1分钟图像。将imagej用于确定所述冠和根区域的亮度。包括glowelltm(蓝色g2，96孔形式)，以保证光测量装备的一致性。将实验进行三重测定；显示平均值。
图28示例如通过亮度测量，不同ph溶液如何引起不同水平的脱矿质，并且较低ph的溶液产生更多的脱矿质(更大亮度)。如所示的，根比冠更敏感，在ph4具有更多脱矿质，其与可获得的文献相当符合，其显示釉质在临界ph5.5脱矿质，然而不被釉质保护的根组织在临界ph6.2脱矿质。该实验显示所述测定是定量的且可用于评价由磨蚀导致的脱矿质。识别由于离子释放的脱矿质的公开的凝胶或溶液，可用于指示牙损伤，诸如磨蚀或增加的过敏可能性。
图29示例如何用该公开组合物和测定法确定食品对牙齿脱矿质的影响。测定法如所描述的。结果显示所述食品的ph对牙齿有大的影响。此外所述根表面看来好象对ph更敏感。所述结果不仅依赖于食物的ph并且看起来涉及其它因素。因此，饮料可口可乐(rtm)和ribenareallylight(rtm)少于可能从它们的ph预期产生的光。
公开的识别由于离子释放的脱矿质的凝胶或溶液，当将其用于如此的测定时，可将其用于确定不同食品对牙齿的危险因素，或作为新式食品以及消费者和临床产品开发中的工具，所述消费者和临床产品诸如牙膏，嗽口水，密封剂，漂白剂。其它步骤的加入，诸如如实验g所示将唾液洗涤结合，对模仿口内条件也是有用的。