延续
本申请要求2012年5月15日提交的美国临时专利申请号为61/647,373和2013年3月5日提交的美国临时专利申请号为61/773,067的优先权，且还要求2013年3月13日提交的美国申请号为13/799,244的优先权，为所有目的它们中的每个全部合并入本文。
发明背景
随着fda批准brentuximabvedotin用于治疗选出的一组患者以及在临床上许多其它adc的进步，抗体-药物偶联物(adc)领域已经取得显著进步。adc的接头组分是开发在良好耐受剂量下高活性的优化治疗剂的重要特征。因与硫醇基反应高特异性和在温和条件下非常快的硫醇加成动力学特性，亲电马来酰亚胺官能团已被证明在adc制备中是非常有用的。
如多个生物偶联物领域的研究者已经注意到的，亲电马来酰亚胺官能团和抗体的游离硫醇基间反应的硫代产物经历缓慢消除，从而逆转上述反应：
当纯化制备adc时发生这种可逆反应，反应很大程度上不可检测，因为通过消除过程再生的马来酰亚胺和硫醇简单地再反应，从而重整完整的偶联物。但是，当其他硫醇存在时，净效应可以是马来酰亚胺从adc的抗体转移到任何其他可用硫醇。该过程已经证实发生在血浆中，其中adc的马来酰亚胺转移到血清白蛋白的半胱氨酸34(alley等,bioconjugatechem.2008,19,759-765)。在过量半胱氨酸或谷胱甘肽存在下孵育adc时也报道有该过程发生(shen等,naturebiotech,30(2):184-9,2012)。本发明特别提供不经历该转移反应的生物偶联物。
发明概要
本发明特别提供接头、药物-接头、配体-药物偶联物、配体-接头偶联物、配体-功能剂偶联物和功能剂-接头，以及制备和使用它们的方法。配体-药物偶联物在循环系统中是稳定的，但一旦在肿瘤细胞附近或其内释放能够造成细胞死亡。
附图简述
图1提供反应示意图，示出人igg1的链间二硫键的还原，接着得到的硫醇与自稳定接头偶联，随后琥珀酰亚胺环水解(顶部)；以及使用质谱监测水解导致的抗体偶联物的分子量变化情况(底部)。
图2示出由电喷雾质谱检测自稳定抗体偶联物的琥珀酰亚胺环水解的时间进程。在ph7.2和22℃进行完全还原的cac10和马来酰亚胺-dpr-val-cit-pab-mmae的偶联，然后在指定时间采用lc-ms分析样本(顶部)。得到的％水解数据对时间作图，并拟合指数方程从而确定动力学参数(底部)。
图3提供采用igg1抗体和自稳定接头制备的生物偶联物的水解动力学曲线，其中马来酰亚胺和碱性基团(伯胺)之间的间隔有所不同。在ph8和37℃进行偶联，然后采用质谱立即监控igg1轻链偶联物的水解，绘制成时间的函数图并拟合指数方程。
图4提供采用igg1抗体和自稳定接头制备的生物偶联物的水解动力学曲线，其中马来酰亚胺和碱性基团(伯胺)之间的间隔有所不同。在ph8和37℃进行偶联，然后采用质谱立即监控igg1轻链偶联物的水解，绘制成时间函数图并拟合指数方程。
图5提供采用igg1抗体和各种不同的n-取代马来酰亚胺制备的生物偶联物的水解动力学曲线。在ph4和22℃进行偶联，然后采用质谱立即监控igg1轻链偶联物的水解，绘制成时间函数图并拟合指数方程。马来酰亚胺-己酰基偶联物(底部结构)的水解太慢，从而在这些条件下不能在24小时内发生任何可检测的水解。羧酰胺吸电子基(ewg)或伯胺(base)的存在加速水解，且两者(顶部结构)的组合得到偶联物，在这些温和条件下其水解半衰期小于20分钟。
图6提供采用α-二氨基丙酸(α-dpr,空心环)和采用β-二氨基丙酸(β-dpr,实心环)制备的自稳定马来酰亚胺药物-接头的水解动力学曲线。尽管它们彼此为同分异构体，碱性氨基和吸电羧酰胺相对于琥珀酰亚胺的定位导致琥珀酰亚胺水解速率有17倍的差异。
图7示出相对于马来酰亚胺-己酰基药物接头制备的adc，自稳定马来酰亚胺-dpr药物-接头制备的adc在包含过量硫醇的缓冲液中孵育时载药量相对于时间的变化图。在时间0和孵育后时间14天两adc的反相色谱在上面示出。色谱峰标记l0、l1、h0、h1、h2和h3分别对应未偶联轻链，具有一药物的轻链，未偶联重链和具有1、2或3个药物的重链。自稳定马来酰亚胺-dpr药物-接头以空心环表示，而采用马来酰亚胺-己酰基药物-接头制备的以空心四边形表示。自稳定药物-接头(空心环)的载药量保持恒定为每抗体8个，但对于马来酰亚胺-己酰基药物接头(空心四边形)降到每抗体4个，反映出马来酰亚胺消除导致的药物损失。
图8示出当在37℃孵育于大鼠血浆时，采用自稳定马来酰亚胺-dpr药物-接头和马来酰亚胺-己酰基药物接头制备的adc的载药量相对于时间的变化图(r＝val-cit-pab-mmae)。通过ig选择性亲和树脂纯化各时间点的adc样本，并通过adc的反相hplc分析评价它们的载药量。
图9提供经过马来酰亚胺-己酰基药物-接头(四边形)或自稳定马来酰亚胺接头(圆环)偶联到抗体的药物在大鼠(空心标志)或人(实心标志)血浆孵育期间的稳定性曲线图(r＝val-cit-pab-mmae)。在各时间点adc被捕获在a蛋白亲和树脂上，且通过其蛋白酶可切割接头酶促释放药物。然后通过lc-ms/ms定量释放的药物并根据初始值作标准化。各时间点反映出在t0观察到的偶联药物的百分比。
图10示出采用自稳定马来酰亚胺-dpr药物-接头和马来酰亚胺-己酰基药物-接头制备的adc的体内(大鼠)载药量的下降图(r＝val-cit-pab-mmae)。通过静脉注射给adc，通过ig选择性亲和树脂纯化各时间点的血浆样本并通过adc的反相hplc分析评价它们的载药量。
图11示出鼠科alcl(karpas-299细胞系)异体移植模型内adc的抗肿瘤活性。采用抗-cd30抗体cac10和包含或通过马来酰亚胺-己基(实心环)或通过自稳定马来酰亚胺-dpr基(空心环)连接到抗体的val-cit-pab-mmae细胞毒性有效负载的药物接头制备adc。在对三组剂量(每剂量组六只小鼠)给以每周1mg/kg剂量之前，允许肿瘤达到约250立方毫米体积。自稳定adc剂量组全部六只动物有完全的反应(无可检测的肿瘤)，五只动物经历可持续的消退，而马来酰亚胺-己酰基adc没有完全反应。
详细描述
缩写和定义
除非另有说明，本文使用的以下术语和句子是指具有以下含义。当商品名用于本文时，除非文内另有说明，商品名包括产品制剂、通用药物和商品名产品的一种或多种活性药物组分。
术语“吸电子基”是指将电子从反应中心拉开的官能团。示例性的吸电子基包括，但不限于，-c(＝o)、-cn、-no2、-cx3、-x、-coor、-conr2、-cor、-cox、-so2r、-so2or、-so2nhr、-so2nr2、-po3r2、-p(o)(ch3)nhr、no、-nr3+、-cr＝cr2和-c≡cr，其中x为f、br、cl或i，且各r独立地选自由氢和c1-6烷基构成的组。示例性的吸电子基也可以包括芳基(如苯基)和某些杂芳基(如吡啶)。术语“吸电子基”包括被吸电子基进一步取代的芳基或杂芳基。优选的吸电子基为-c(＝o)、-cn、-no2、-cx3和-x。
术语“碱”是指使水去质子化从而产生氢氧离子的官能团。示例性的碱是胺类和含氮杂环。代表性的碱包括–n(r3)(r4)，其中r3和r4独立地选自h或c1-6烃基，优选h或甲基，
其中，各r5、r6、r7和r8独立地选自氢或c1-6烷基，优选为h或甲基，且e为0-4。在一些方面，碱是含氮的碱。
术语“抗体”以广义用于本文，且特别包含完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异抗体、多特异抗体(如双特异抗体)，以及表现期望生物活性的抗体片段。完整的抗体主要具有两个区：可变区和恒定区。可变区结合于靶抗原并与之相互作用。可变区包括识别和结合到特定抗原上特定结合位点的互补决定区(cdr)。恒定区可以通过免疫系统识别并与免疫系统相互作用(参考，例如janeway等,2001,免疫生物学,第五版,加兰出版社,纽约(janewayetal.,2001,immuno.biology,5thed.,garlandpublishing,newyork))。抗体可以是任何型(如igg、ige、igm、igd和iga)、类(igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。抗体可以源自任何合适的物种。在一些实施方式中，抗体是人或鼠源的。抗体可以是，例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
术语“单克隆抗体”用于本文是指从实质上均质的抗体群获得的抗体，即，构成该群的各抗体是相同的，除了可能有小量存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。修饰词“单克隆”是指抗体的特性为获自实质上均质的抗体群，并不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
“完整的抗体”是这样一种抗体，其包括抗原结合可变区以及轻链恒定区(cl)和重链恒定区ch1、ch2、ch3和ch4，根据适合的抗体种类。恒定区可以是天然序列恒定区(如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，其包括抗原结合或其可变区。抗体片段的实例包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子、scfv、scfv-fc、由一种或多种抗体片段形成的多特异性抗体片段、由fab表达文库产生的一种或多种抗体片段、或免疫特异性结合靶抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的以上任何的表位结合片段。
“抗原”是抗体特异性结合的实体。
术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指抗体或抗体衍生物以高度选择的方式与其相应的靶抗原结合，而不与众多其他抗原结合。典型地，抗体或抗体衍生物以至少约1x10-7m，优选10-8m到10-9m、10-10m、10-11m或10-12m的亲合力进行结合，并且与预定抗原的结合亲和力比与非预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(如bsa、酪蛋白)的亲合力大至少两倍。
术语“抑制”是指降低可检测的量，或指完全阻止。
术语“治疗有效量的”是指有效治疗哺乳动物的疾病或紊乱的药物用量。在癌症情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即放慢到某种程度，优选停止)癌细胞浸润外围器官；抑制(即放慢到某种程度，优选停止)肿瘤转移；一定程度上抑制肿瘤生长；和/或一定程度上缓解一种或多种癌症相关症状。如果药物可以达到抑制已有癌细胞生长和/或杀死已有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的或细胞毒性的。对于癌症治疗，例如，通过评估疾病进展时间(ttp)和/或测定反应率(rr)可以检测疗效。
术语“实质性”或“实质上”是指某群体、混合物或样本中的多数，即>50％，优选某群体中大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
术语“胞内切割的”和“胞内切割”是指细胞内配体药物偶联物(如抗体药物偶联物(adc)或类似物)的代谢过程或反应，从而打断药物部分(d)和配体单元(如抗体(ab))间的共价连接，例如接头，从而在细胞内获得游离药物，或与抗体解离的偶联物的其他代谢物。因此药物-接头-配体偶联物的切割部分是胞内代谢物。
术语“细胞毒性活性”是指药物-接头-配体偶联化合物或药物-接头-配体偶联物的胞内代谢物的细胞杀伤、细胞抑制或抗增殖作用。细胞毒性活性可以ic50值表示，这是半数细胞存活时每单位体积的浓度(摩尔浓度或质量浓度)。
术语“细胞毒剂”用于本文是指抑制或抑制细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语应包括放射性同位素(如211at、131i、125i、90y、186re、188re、153sm、212bi、32p、60c和镥的放射性同位素)，化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活毒素，包括它们的合成类似物和衍生物。
术语“癌症”或“癌的”是指或描述哺乳动物的生理疾病或紊乱，典型特征为不受调节的细胞生长。“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。
本文中“自身免疫疾病”是由个体自身组织或蛋白产生且针对它们的疾病或紊乱。
“患者”的实例包括，但不限于，人、大鼠、小鼠、豚鼠、猴、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和家禽。在示范性实施方式中，患者是人。
除非文内另有说明，否则术语“治疗”或“疗法”是指治疗性处置和预防性措施，以防止复发，其目的是为抑制或减缓(减轻)不期望的生理学变化或紊乱，如癌症的产生或扩散。为本发明的目的，有利的或所需的临床结果包括，但不限于，症状的减轻，疾病程度的减轻，疾病的稳定(即没有恶化)状态，疾病进展的延缓或放慢，疾病状态的改善或缓和，以及消退(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测。“治疗”也可以指与不接受治疗的预期存活相比，存活延长。需要治疗的那些包括已经有疾病或紊乱的那些，以及易于具有疾病或紊乱的那些。
在癌症情况下，术语“治疗”包括以下的任何或全部：抑制肿瘤细胞、癌细胞或肿瘤的生长；抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制，减轻全部肿瘤负担或减少癌细胞数量，并改善与疾病相关的一种或多种症状。
在自身免疫疾病的情况中，术语“治疗”包括以下的任何或全部：抑制与自身免疫疾病状态相关的细胞(包括但不限于，产生自身免疫抗体的细胞)的复制，减轻自身免疫-抗体负担和改善自身免疫疾病的一种或多种症状。
如本文所用，术语“检测单元”是指任何产生，或者可被诱导以产生可检测信号的分子。具有可以由成像设备检测的报告分子的检测单元包括，但不限于，放射性的、顺磁性的、荧光的或不透射线的化学实体。在一些实施方式中，检测单元是放射性化合物、化学发光剂、荧光剂，或发色体。在一些实施方式中，检测单元是荧光分子，如荧光团。
如本文所用，术语“稳定单元”是指当施用于患者时，例如通过提高配体的全身性保留而提升偶联物稳定性的化合物。稳定单元也可以增加偶联物的水溶性。典型的稳定单元是聚乙二醇。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指化合物(如药物、药物-接头、或配体-药物偶联物)的药学上可接受的有机或无机盐。化合物可含有至少一个氨基，且因此可与氨基形成酸加成盐。示例性的盐包括，但不限于，硫酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(即1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可涉及将另一分子(如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子)包含在内。抗衡离子可以是稳定母化合物上电荷的任何无机或有机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个带电原子。多个带电原子是部分药学上可接受的盐的实例可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
除非另有说明，否则术语“烃基(alkyl)”单独或作为另一术语的部分是指具有指定碳原子数的取代或未取代的直链或支链、饱和或不饱和烃(例如，“-c1-c8烃基”或“-c1-c10”烃基是指分别具有1至8个，或1至10个碳原子的烃基)。当未指明碳原子数时，烃基具有1至8个碳原子。代表性的直链“-c1-c8烃基”包括，但不限于，-甲基，-乙基，-正丙基，-正丁基，-正戊基，-正己基，-正庚基和-正辛基；而支链-c1-c8烃基包括，但不限于，-异丙基，-仲丁基，-异丁基，-叔丁基，-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和的-c2-c8烃基包括，但不限于，-乙烯基，-烯丙基，-1-丁烯基，-2-丁烯基，-异丁烯基，-1-戊烯基，-2-戊烯基，-3-甲基-1-丁烯基，-2-甲基-2-丁烯基，-2,3-二甲基-2-丁烯基，-1-己基，2-己基，-3-己基，-乙炔基，-丙炔基，-1-丁炔基，-2-丁炔基，-1-戊炔基，-2-戊炔基和-3-甲基-1-丁炔基。在一些实施方式中，烃基是未取代的。烃基可被一个或多个基团取代。在一些方面，烃基是饱和的。
除非另有说明，否则“亚烷基(alkylene)”本身或作为另一术语的部分，是指具有指定碳原子数，通常为1-10个碳原子的取代或未取代的饱和的、支链或直链或环状烃基，且具有通过从母烷烃同一或两不同碳原子去除两氢原子得到的两单价基中心。典型的亚烷基包括，但不限于：亚甲基(-ch2-)，1,2-乙基(-ch2ch2-)，1,3-丙基(-ch2ch2ch2-)，1,4-丁基(-ch2ch2ch2ch2-)等。在优选的方面，亚烷基是支链或直链烃(即，它不是环烃)。
除非另有说明，否则“芳基”本身或作为另一术语的部分，是指具有6-20个碳原子的、通过从母芳香环系统的一个碳原子去除一个氢原子获得的、取代或未取代的单价碳环芳烃。在示例性结构中一些芳基表示为“ar”。典型的芳基包括，但不限于，衍生自苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等的基团。示例性的芳基为苯基，如下所示：
除非另有说明，否则“亚芳基”单独或作为另一术语的部分，是指具有两个共价键的如上所定义的芳基(即，它是二价的)，并且可以在邻位，间位，或对位配置，如以下结构所示，以苯基作为示例性基团：
除非另有说明，否则“c3-c8杂环基”本身或作为另一术语的部分，是指单价取代或未取代的芳香或非芳香单环或双环，具有3-8个碳原子(也称为环成员)和独立地选自n，o，p或s的1-4个杂原子环成员，并通过从母环系统的环原子除去一个氢原子而得。杂环上一个或多个n，c或s的原子可以被氧化。包含杂原子的环可以是芳香或非芳香环。除非另有说明，杂环在任何杂原子或碳原子位连接到其侧基，得到稳定结构。c3-c8杂环代表性的实例包括，但不限于，吡咯烷基、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、哌啶基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、苯硫基(噻吩基)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、嘧啶基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基和异噁唑基。“c3-c8杂芳基”是芳香c3-c8杂环。
除非另有说明，否则“c3-c8杂亚环基(heterocyclo)”本身或作为另一术语的部分，是指如上定义c3-c8杂环基，其中杂环基氢原子之一被键取代(即，它是二价的)。“c3-c8杂亚芳基”本身或作为另一术语的部分，是指如上定义的c3-c8杂芳基，其中杂芳基的氢原子之一被键取代(即，它是二价的)。
除非另有说明，否则“c3-c8碳环基”本身或作为另一术语的部分，是3-、4-、5-、6-、7-或8-元单价的，取代或未取代的，饱和或不饱和的非芳香单环或双环碳环，通过从母环体系的环原子去除一个氢原子获得。代表c3-c8碳环包括，但不限于，环丙基，环丁基，环戊基，环戊二烯基，环己基，环己烯基，1,3-环己二烯基，1,4-环己二烯基，环庚基，1,3-环庚二烯基，1,3,5-环庚三烯基，环辛基和环辛二烯基。
除非另有说明，否则“c3-c8亚碳环基(carbocyclo)”，本身或作为另一术语的一部分，是指以上定义的c3-c8碳环，其中碳环基的氢原子的另一个被键取代(即，它是二价的)。
除非另有说明，否则术语“杂烃基(heteroalkyl)”本身或与另一术语组合，是指稳定的直链或支链烃，或它们的组合，完全饱和的或包含1-3度不饱和，由指定数量的碳原子和1-10，优选1-3个选自o，n，si和s构成组的杂原子构成，且其中氮和硫原子可任选被氧化，且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子o、n和s可置于杂烃基的任何内部位置，或置于烃基连接到分子其余部分的位置。杂原子si可位于杂烃基的任何位置，包括烃基连接到分子其余部分的位置。实例包括–ch2-ch2-o-ch3、-ch2-ch2-nh-ch3、-ch2-ch2-n(ch3)-ch3、-ch2-s-ch2-ch3、-ch2-ch2-s(o)-ch3、-nh-ch2-ch2-nh-c(o)-ch2-ch3、-ch2-ch2-s(o)2-ch3、-ch＝ch-o-ch3、-si(ch3)3、-ch2-ch＝n-o-ch3和-ch＝ch-n(ch3)-ch3。至多两个杂原子可以是连续的，诸如，例如，-ch2-nh-och3和-ch2-o-si(ch3)3。在优选的实施方式中，c1到c4杂烃基或杂亚烃基具有1-4个碳原子和1或2个杂原子，且c1到c3杂烃基或杂亚烃基具有1-3个碳原子和1或2个杂原子。在一些方面，杂烃基或杂亚烃基是饱和的。
除非另有说明，术语“杂亚烃基”本身或作为另一取代基的部分是指从杂烃基(如上所讨论的)衍生的二价基团，例如为-ch2-ch2-s-ch2-ch2-和-ch2-s-ch2-ch2-nh-ch2-。对于杂亚烃基，杂原子也可以占据链末端的任一或两者。再有，对于亚烃基和杂亚烃基连接基团，未暗示连接基团的取向。
“取代的烃基”和“取代的芳基”分别指其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基取代的烃基和芳基。典型的取代基包括，但不限于，-x、-r、-o-、-or、-sr、-s-、-nr2、-nr3、＝nr、-cx3、-cn、-ocn、-scn、-n＝c＝o、-ncs、-no、-no2、＝n2、-n3、-nrc(＝o)r、-c(＝o)r、-c(＝o)nr2、-so3-、-so3h、-s(＝o)2r、-os(＝o)2or、-s(＝o)2nr、-s(＝o)r、-op(＝o)(or)2、-p(＝o)(or)2、-po-3、-po3h2、-aso2h2、-c(＝o)r、-c(＝o)x、-c(＝s)r、-co2r、-co2-、-c(＝s)or、-c(＝o)sr、-c(＝s)sr、-c(＝o)nr2、-c(＝s)nr2或c(＝nr)nr2，其中各x独立地为h、-f、-cl、-br或-i；各r独立地为-h、-c1-c20烃基、-c6-c20芳基、-c3-c14杂环、保护基或前药部分。以上描述的亚烃基、碳环基、亚碳环基、亚芳基、杂烃基、杂亚烃基、杂环基、杂亚环基、杂芳基和杂亚芳基也可以类似地被取代。
rg是包含能够与接头单元(即，a、w、y)的组分或者药物单元d形成键的反应位点(rs)的反应基团。rs是反应基团(rg)内的反应位点。反应基团包括巯基(以形成二硫键或硫醚键)，醛，酮，或肼基(以形成腙键)，羧基或氨基(以形成肽键)，羧基或羟基(以形成酯键)，磺酸(以形成磺酰胺键)，醇(以形成氨基甲酸酯键)和胺(以形成磺酰胺键或氨基甲酸酯键)。下表是示例性的反应基团、反应位点和可以在反应位点反应后形成的示例性官能团。该表不是限制性的。本领域技术人员将理解，表中标记的r'和r”部分是有效的任何有机基团(如烃基，芳基，杂芳基，或取代的烃基、芳基或杂芳基)，其与rg向示例性官能团之一的转换中提供的键形成相容。还应理解，与用于本发明的实施方式中一样，r'可表示自稳定接头或任选第二接头的一个或多个组分，视情况而定；r”可表示任选第二接头、药物单元、稳定单元或检测单元的一个或多个组分，视情况而定。
将理解，一旦反应，反应位点rs可以与接头单元或药物单元的组分形成新键，视情况而定。反应位点，rs，一旦连接到接头单元的剩余部分，通常失去其反应活性。
如本文所用术语“双内酰胺”是指由硫代琥珀酰亚胺和自稳定接头装配体上存在的碱性基团的大环化反应形成的环酰胺。
概述
马来酰亚胺(或硫代琥珀酰亚胺)水解表示亲核加成反应，其中水，作为亲核试剂，攻击马来酰亚胺环(或琥珀酰亚胺环)的亲电羰基碳原子。羰基的亲电性可以随亚酰胺基的氮上存在的供电子和吸电子基的取代而变化，从而影响该反应的速率。水性溶剂的ph也影响水解反应的速率，随ph的提高有效增加水的亲电性。本发明人已经发现n-取代马来酰亚胺上的碱性部分也提高水解速率。通过仔细工程改造马来酰亚胺上n-取代基，可以联用它对马来酰亚胺环(从而增加它的亲电性)和局部碱度(增加附近水的有效亲核性)的吸电影响来调节母体马来酰亚胺或它的硫代琥珀酰亚胺衍生物的水解速率。本发明特别提供水解速率落在有用范围的n-取代马来酰亚胺，它们与硫醇的反应比它们水解为马来酸衍生物更快速发生，但是产生硫代琥珀酰亚胺，其在温和条件下的水解速率足够快从而非常适合生产蛋白基生物偶联物。
本发明部分基于以下发现：临近马来酰亚胺的碱性官能团会催化马来酰亚胺和蛋白硫醇偶联形成的硫代琥珀酰亚胺水解，导致稳定的生物偶联物。通过进一步组合吸电子基与临近的碱性基团，硫代琥珀酰亚胺环水解速率可以调节到所需水平。影响水解速率的设计参数包括碱性基团的pka，吸电子基(如果存在)的强度，两基团与马来酰亚胺羰基碳的接近程度。影响水解百分比的设计参数包括碱性基团的性质和到马来酰亚胺羰基碳的接近程度。
从概念上讲，不限制本发明，包括自稳定接头装配体的接头单元在本文称为自稳定接头或自稳定接头单元。在与接头单元偶联之前，自稳定接头包括马来酰亚胺基团。自稳定接头凭借接头单元内马来酰亚胺基团与碱性基团的接近程度而得以自稳定，在偶联到接头单元之后其催化它自身的硫代琥珀酰亚胺的水解。图示如下：
将理解术语自稳定接头是指稳定前和稳定后的接头单元。
鉴于上述情况，本发明在一组实施方式中提供配体-官能试剂偶联物，包括配体单元以及选自药物单元、检测单元或稳定单元中至少一种的官能试剂，其中配体单元和各官能试剂通过包括经硫醚键直接偶联到配体单元的琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺环的自稳定接头装配体连接，还包括碱性部分和吸电子基(通过琥珀酰亚胺环偶联到配体单元)，可操作地连接从而与缺乏自稳定接头装配体的配体药物偶联物相比，稳定血浆内的偶联物(即通过提高琥珀酰亚胺环水解速率)。在一些方面，定位吸电子基从而增加琥珀酰亚胺的亲电性使它更易与水反应，和定位碱性部分从而促进琥珀酰亚胺环水解(如通过分子内碱性部分催化机理)。在一些方面，代替琥珀酰亚胺环的是碱性部分与琥珀酰亚胺环反应时形成的双内酰胺。在另一组实施方式中，提供官能试剂-接头单元，其中接头部分包括自稳定接头集。在另一组实施方式中，提供配体-接头偶联物，其中接头部分包括自稳定接头装配体。在一些实施方式中，接头部分还包括任选的第二接头装配体(lo)。
在一些方面，配体-官能试剂偶联物是配体-药物偶联物。因此，本发明在一组实施方式中提供包括配体单元和至少一个药物单元的配体-药物偶联物，其中配体单元和各药物单元通过包括经硫醚键直接偶联到配体单元的琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺环的自稳定接头装配体连接，还包括碱性部分和吸电子基(通过琥珀酰亚胺环偶联到配体单元)，可操作地连接从而与缺乏自稳定接头装配体的配体药物偶联物相比，稳定血浆内的偶联物(即通过提高琥珀酰亚胺环水解速率)。在一些方面，定位吸电子基从而增加琥珀酰亚胺的亲电性使它更易与水反应，和定位碱性部分从而促进琥珀酰亚胺环水解(如通过分子内碱性部分催化机理)。在一些方面，代替琥珀酰亚胺环的是碱性部分与琥珀酰亚胺环反应时形成的双内酰胺。在另一组实施方式中，提供药物-接头单元，其中接头部分包括自稳定接头装配体。在另一组实施方式中，提供配体-接头偶联物，其中接头部分包括自稳定接头装配体。在一些实施方式中，接头部分还包括任选的第二接头装配体(lo)。在一些实施方式中，第二接头装配体是可释放的接头装配体(lr)，其包括可切割单元和任选的一个或多个延伸和间隔单元。在一些其他实施方式中，第二接头装配体是不可释放的接头装配体(ln)，其包括一个或多个延伸单元和间隔单元。在还有的其他实施方式中，本发明提供使用包括自稳定接头装配体的配体-药物偶联物治疗癌症、免疫疾病、感染性疾病以及其他疾病和紊乱的方法。
除了自稳定接头装配体外，配体-官能试剂偶联物(或配体-药物偶联物)的接头单元还可包括任选的第二接头装配体(lo)，其将各官能试剂(或药物单元)连接到自稳定接头装配体。第二接头装配体可以是可释放的接头装配体或不可释放的接头装配体。
术语接头单元可以用于本文以指包括自稳定接头装配体和任选的第二接头装配体的配体-官能试剂偶联物(或配体-药物偶联物)的接头部分。
自稳定接头装配体
设计自稳定接头以使琥珀酰亚胺环的偶联后水解速率可控并落在所需范围内。该范围的上下限通常取决于配体-药物偶联物生产中产生的问题。在一方面，太慢的水解致使生产过程不能接受的延误，或者需要激进的ph和温度条件，从而导致蛋白骨架损坏。相反，与水太易反应的马来酰亚胺可以在其与可用蛋白硫醇反应之前就水解为相应的马来酸衍生物(见不需要的路径)：
这种马来酸衍生物不与硫醇反应，因此该反应路径不能获得生物偶联物。因此，在适用条件下比硫醇加成更快经历水解的马来酰亚胺是无用的试剂。总之，提高硫代琥珀酰亚胺水解速率的结构特征也会提高母体马来酰亚胺的水解速率。
设计本发明的自稳定接头时，应理解碱性部分的pka、吸电子基的强度和两基团与马来酰亚胺的接近程度是互相关联的变量，并将影响马来酰亚胺和相应的硫代琥珀酰亚胺产物的水解速率。因此，该吸电子基团和碱性部分的定位将取决于碱性部分的pka值和吸电子基的强度。本领域技术人员将理解，对于特别强的吸电子基如氟、三氟甲基和硝基，该基团还可来自马来酰亚胺。在某些实施方式中，水解反应可以与大环化反应竞争，使得得到的偶联物包括水解的硫代琥珀酰亚胺偶联物和环化的硫代双内酰胺偶联物的异质混合物。在优选的实施方式中，不会形成双内酰胺。
选择的本发明实施方式
在一些实施方式中，配体-官能试剂偶联物由式i表示：
或是其盐(如其药学上可接受的盐)；
其中，
l是配体单元；
d'是药物单元、检测单元或稳定单元；
lo是任选的第二接头装配体；和
lss是自稳定接头装配体，其中，
m1是琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺或与bu一起形成双内酰胺；
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适合用于连接到任选的第二接头装配体或d'的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；
下标a和b各自为0或1，且a+b的总和为1；和
下标p为1至20。
在一些方面，当r为1时，he不包括羰基(即c(＝o))。
在一些方面，r是0。在一些方面，a是1且b是0。在其它方面，a是0且b是1。
在一些方面，m+q+r为0。在此方面，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，且作为吸电子基。示例性的芳基和杂芳基包括苯基和吡啶基。
在一些方面，m+q+r为1或2。
在一些方面，偶联物由式i表示，或是其盐，其中a是1，r是0。
在一些方面，偶联物由式i表示，或是其盐，其中lo存在且是可释放接头装配体，圆圈代表支架，是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，a是1，r是0，并且m+q的总和为1。在一些这样的方面，支架是c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的。
在一些方面，偶联物由式i表示或是其盐，其中lo存在且是可释放接头装配体，圆圈代表支架，是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，a是1，m和r是0。在一些这样的方面，支架是c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的。
在一些方面，偶联物由式i表示或是其盐，其中lo存在且是可释放接头装配体，圆圈代表支架，是c1、c2、c3或c4直链或支链亚烃基，a是1，r是0，且m+q之和为1。
在一些方面，偶联物由式i表示或是其盐，其中lo存在且是可释放接头装配体，圆圈代表支架，是c1、c2、c3或c4直链或支链亚烃基，a是1，且m和r是0。
在一些方面，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个并且不大于6个居间原子，和在吸电子基和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间具有不超过5个原子、不超过4个子、不超过3个原子或不超过2个居间原子。
在这些实施方式中的每个中，亚烃基或杂亚烃基链可以是直或支链的。在一些方面，亚烃基或杂亚烃基链将是直链。在其它方面中，它将是支链的。
在这些实施方式中的每个中，p可以为1到20，优选1到12，甚至更优选为1到10，或1到8。
在这些实施方式中的每个中，m1优选为琥珀酰亚胺环(即非水解的)或水解的琥珀酰亚胺环(在此也称为水解的琥珀酰亚胺)。
在这些实施方式中的每个中，d'可以是药物单元，配体-官能剂偶联物可以是配体-药物偶联物。
在一些方面，其中支架本身直接连接到任选的第二接头装配体或d'，(例如，在选定的实施方式中，当q是0或者当q是0和r是0时)，支架将包括适合用于连接到任选的第二接头装配体或d'的反应位点。
在一些实施方式中，自稳定接头装配体(lss)由式ii表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中波浪线表示任选的第二接头装配体到d'或d的连接点，并且其中//表示到配体单元的连接点。在自稳定接头装配体中，m1表示琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺环或碱性部分与琥珀酰亚胺环反应时形成的双内酰胺，bu是碱性单元，he是包括吸电子基的水解强化剂，且圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，以及任选地包括适用于连接到任选的第二接头装配体，d'或d的反应位点；且下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2个，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基。
在一些方面，当r为1时，he不包括羰基(即c(＝o))。
在一些方面，自稳定接头装配体由式ii表示，其中r是0。
在一些方面，m+q+r为0。在这些方面，c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基作为吸电子基。示例性的芳基和杂芳基包括苯基和吡啶基。
在一些方面，m+q+r为1或2。
在一些方面，自稳定接头装配体由式ii表示或是其盐，其中圆圈代表支架，是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或杂亚烃基)，r是0，且m+q为0。在一些这样的方面，支架是c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的亚烃基。
在一些方面，自稳定接头装配体由式ii表示或是其盐，其中圆圈代表支架，是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或杂亚烃基)，且m和r为0。在一些这样的方面，支架是c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的亚烃基。
在一些方面，自稳定接头装配体由式ii表示或是其盐，其中圆圈代表支架，是c1、c2、c3或c4直链或支链亚烃基，r是0，且m+q之和为1。
在一些方面，自稳定接头装配体由式ii表示或是其盐，其中圆圈代表支架，是c1、c2、c3或c4直链或支链亚烃基，且m和r是0。
在一些方面，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2并且不大于6个居间原子，在吸电子基和琥珀酰亚胺环(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间具有不超过5个原子、不超过4个子、不超过3个原子或不超过2个居间原子。
在这些实施方式中的每个中，亚烃基或杂亚烃基链优选是直或支链的。在一些方面，亚烃基或杂亚烃基链将是直链。在其它方面中，它将是支链的。
在这些实施方式中的每个中，m1优选为琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺环。
在这些实施方式中的每个中，d'优选为d，药物单元。
回到本发明的实施方式，其中配体-官能试剂偶联物具有式(i)：
或是其盐，其中l、m1、he、bu、lo、d'和下标p、a、b、m、q和r中的每个具有以上提供的含义，选择的实施方式包括那些，其中：
1)m为1，q和r为0；
2)q为1，m和r为0；
3)r为1，m和q为0；
4)m为1，q和r为0，和a为1；
5)q为1，m和r为0，和a为1；
6)r为1，m和q为0，和a为1；
7)m为1，q和r为0，和d'为药物单元，d；
8)q为1，m和r为0，和d'为药物单元，d；
9)r为1，m和q为0，和d'为药物单元，d；
10)m为1，q和r为0，a为1，和d'为药物单元，d；
11)q为1，m和r为0，a为1，和d'为药物单元，d；或
12)r为1，m和q为0，a为1，和d'为药物单元，d。
在其它选择的实施方式(包括基于以上选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个的那些)中，碱性单元(bu)包括伯、仲胺或叔胺。在还有的其他选择实施方式(包括基于以上选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个的那些)中，碱性单元选自下组：-(c(r9)(r10))xnh2、-(c(r9)(r10))xnhra和-(c(r9)(r10))xnra2，其中，x为0-4(或1-4)的整数，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，前提是如果x为0，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个居间原子，且各r9和r10独立地选自h或c1-3烃基。在还有的其他选择实施方式(包括基于以上选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个的那些)中，碱性单元选自下组：-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2，其中，x为0-6(优选0-4或1-4)的整数，前提是如果x为0，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个居间原子，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基。在还有的其他选择的实施方式中，x为1-4的整数。在还有的其他选择的实施方式(包括基于以上选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个的那些)中，碱性单元是-nh2、-ch2nh2、-ch2ch2nh2、-ch2ch2ch2nh2或-ch2ch2ch2ch2nh2，前提是如果碱性单元是-nh2，在碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个居间原子。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于以上选择的实施方式2)，5)，8)和11)的那些和包括基于在前段段落的实施方式的那些)中，he优选包含羰基、磺酰基或磷酰基部分。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式(例如选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个)的那些，和包括基于在前段落的实施方式的那些)中，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个、不多于6个居间原子，和在吸电子基和琥珀酰亚胺环(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间具有不超过5个原子、不超过4个子、不超过3个原子或不超过2个居间原子。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式(例如选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个)的那些，和包括基于在前段落的实施方式的那些)中，m1是琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式(例如选择的实施方式1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)和12)中各个)的那些，和包括基于在前段落的实施方式的那些)中，圆圈表示支架，为c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或杂亚烃基)。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的亚烃基。
在还有的其它选择的实施方式中，配体-官能试剂偶联物具有结构式：
或其药学上可接受的盐，其中，支架、l、m1、he、bu、lo、d'和下标p中的各个具有以上提供的含义，选择的实施方式包括那些，其中：
1)碱性单元(bu)，包括伯、仲胺或叔胺，和d'优选为药物单元d。
2)碱性单元选自下组：-(c(r9)(r10))xnh2、-(c(r9)(r10))xnhra和-(c(r9)(r10))xnra2，其中，x为0-4(或1-4)的整数，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，前提是如果x为0，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个居间原子，且各r9和r10独立地选自h或c1-3烃基，以及d'优选为药物单元d。
3)碱性单元选自由-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中，x为0-6(优选0-4或1-4)的整数，前提是如果x为0，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个居间原子，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，和d'优选为药物单元d。在还有的其他选择的实施方式中，x为1-4的整数。
4)碱性单元是-nh2、-ch2nh2、-ch2ch2nh2,、-ch2ch2ch2nh2或-ch2ch2ch2ch2nh2，前提是如果碱性单元是-nh2，在碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个居间原子；和d'优选为药物单元d。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，he包含羰基、磺酰基或磷酰基部分，和d'优选为药物单元d。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间有不小于2个、不多于6个居间原子，和在吸电子基和琥珀酰亚胺环(水解的或者非水解的)或双内酰胺的氮原子之间具有不超过5个原子、不超过4个子、不超过3个原子或不超过2个居间原子，和d'优选为药物单元d。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，m1是琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺，和d'优选为药物单元(d)。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，圆圈代表支架，是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，和d'优选为药物单元(d)。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的亚烃基。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，he是羰基，和d'优选为药物单元(d)。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，he是羰基，圆圈代表支架，是直链c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，和d'优选为药物单元(d)。
在还有的其它选择的实施方式(包括基于每个以上选择的实施方式的那些)中，he是羰基，圆圈代表支架，是支链c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选为c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，和d'优选为药物单元(d)。
在还有的其它选择的实施方式中，配体-药物偶联物具有结构式：
或其药学上可接受的盐，其中，配体部分是抗体(ab)，下标p为1-20(优选为1-12)，m1、bu和lo如本文提供的任何实施方式中所描述的，和d为药物单元。例如，在一些方面，lo是可释放的接头装配体，和bu是-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2，其中x是1-4的整数，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基。在还有的其他方面，lo是可释放接头装配体，和bu是-ch2nh2、-ch2ch2nh2、-ch2ch2ch2nh2或-ch2ch2ch2ch2nh2。在一些方面，ab可以被非抗体蛋白替代。m1优选为琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺环。
在还有的其它选择的实施方式中，配体-药物偶联物具有结构式：
或其药学上可接受的盐，其中配体部分是抗体(ab)，下标p为1-20(优选为1-12)，m1、bu和lo如本文提供的任何实施方式中所描述的，和d为药物单元。例如，在一些方面，lo是可释放接头装配体，和bu是-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2，其中x是1-4的整数，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基。在还有的其他方面，lo是可释放接头装配体，和bu是-ch2nh2、-ch2ch2nh2、-ch2ch2ch2nh2或-ch2ch2ch2ch2nh2。在一些方面，ab可以被非抗体蛋白替代。m1优选为琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺环。
在还有的其它选择的实施方式中，配体-药物偶联物具有结构式：
或其药学上可接受的盐，其中配体部分是抗体(ab)，下标p为1-20(优选为1-12)，m1、bu和lo如本文提供的任何实施方式中所描述的，和d为药物单元。例如，在一些方面，lo是可释放接头装配体，和bu是-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2，其中x是0-4的整数，各ra独立地选自由c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基。在还有的其他方面，lo是可释放接头装配体，和bu是-nh2、-ch2nh2、-ch2ch2nh2、-ch2ch2ch2nh2或-ch2ch2ch2ch2nh2。在一些方面，ab可以被非抗体蛋白替代。m1优选为琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺环。
已经描述本发明提供的各种不同的配体-官能试剂偶联物和配体-药物偶联物，本领域技术人员将理解各个组分装配体也是有用的。因此，本发明提供官能试剂-接头偶联物(如药物-接头偶联物)、接头和配体-接头装配体。
官能试剂-接头偶联物
在其他实施方式中，本发明提供具有以下结构的官能试剂-接头偶联物(如药物-接头偶联物)，
或其盐(如药学上可接受的盐)，其中，
d'是药物单元、检测单元或稳定单元；
lo为任选的第二接头装配体；和
lss是自稳定接头装配体，其中，
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适合用于连接到任选的第二接头装配体或d'的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；和
下标a和b各自为0或1，且a+b的总和为1。
在某些选择的实施方式中，官能试剂-接头偶联物由下式表示：
或为其盐，而在其他选择的实施方式中，药物-接头偶合物由下式表示：
或为其盐，其中圆圈、he、bu、lo和d'具有本文为式i提供的含义，和d为药物单元。此外，为圆圈、he、bu、lo和d'(对于式i或本文提供的任何偶联物)特别例举的各选择的实施方式同样适用于这些药物-接头偶联物。在优选的方面，d'是药物单元d。
接头
本文还提供具有下式的接头：
或其盐(如药学上可接受的盐)，其中，
rg为lo末端的反应基团(包括反应位点)，适合用于连接药物单元；
lo为任选的存在的第二接头装配体；和
lss是自稳定接头装配体，其中，
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，以及任选地包括适合用于连接到任选的第二接头装配体或药物单元的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；和
下标a和b各自为0或1，且a+b的总和为1。
在其中接头连接到检测单元或稳定单元的一些方面，rg是反应基团，含有能与检测单元或稳定单元而非药物单元成键的反应位点。
在某些选择的实施方式中，接头由下式表示：
或是其盐，而在其他选择的实施方式中，接头由下式表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中圆圈、he、bu、lo和rg具有以上提供的含义。此外，为bu、lo和rg(对于本文提供的任何偶联物)特别例举的各选择的实施方式同样适用于这些接头。
配体-接头偶联物
本文还提供具有下式的配体-接头偶联物：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中，
l是配体单元；
下标p为1-20；
rg是lo末端的反应基团(包括反应位点)，它适合用于连接药物单元；
lo为任选的存在的第二接头装配体；和
lss是自稳定接头装配体，其中，
m1为琥珀酰亚胺环或水解的琥珀酰亚胺；
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，任选地包括适合用于连接到任选的第二接头装配体或药物单元的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；和
下标a和b各自为0或1，且a+b的总和为1。
在一些方面，其中配体-接头偶联物连接到检测单元或稳定单元而非药物单元，rg是反应基团，包含能与检测单元或稳定单元而非药物单元成键的反应位点。
在某些选择的实施方式中，配体-接头偶联物由下式表示：
或为其盐，而在其他选择的实施方式中，配体-接头偶联物由下式表示：
或为其盐(如药学上可接受的盐)，其中l是抗体(ab)，圆圈、he、m1、bu、lo和rg具有以上提供的含义。此外，为ab、m1、bu、lo和rg(对于本文提供的任何偶联物)特别例举的各选择的实施方式同样适用于这些配体-接头偶联物。
在本发明的一些实施方式中，自稳定接头装配体由ltt表示，而非lss结构所表示的，且具有式(iii)：
或其药学上可接受的盐，其中波浪线表示任选的第二接头装配体或药物单元的连接点，并且其中//表示到配体单元的连接点；
其中，m1为非水解的或水解的琥珀酰亚胺，或m1与b形成双内酰胺(如当b与琥珀酰亚胺环反应时形成双内酰胺)，其中琥珀酰亚胺或双内酰胺通过硫醚键偶联到配体单元；
v、q、t和g独立地选自-(c(r9)(r10))-；
r1为h或c1-3烃基；
r9和r10，在各出现处，独立地选自h或c1-3烃基；
f为c(e1)(e2)，其中e1和e2独立地选自氢、吸电子基，或e1和e2一起为(＝o)；
rs为用于偶联到任选的第二接头装配体或药物单元的组分的反应位点；
g为0-5；
m为0-5；
n为0-5；
d为0或1；
x为0-4，条件是当m为0时，x为1-4；
和b为碱性部分。
在一些方面，各配体单元连接有1-20个药物-接头。
在选择的实施方式中，配体-药物偶联物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
在选择的实施方式中，药物-接头具有下式：
或其药学上可接受的盐。
在选择的实施方式中，接头具有下式：
或其药学上可接受的盐。
在选择的实施方式中，配体-接头偶联物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
在式iiia、iiib、iiic和iiid或它们的药学上可接受的盐中，
l，如果存在，为配体单元；
lo是任选的第二接头装配体；
rg，如果存在，是lo末端的反应基团(包括反应位点)，它适合用于连接药物单元；
m1，如果存在，为非水解的或水解的琥珀酰亚胺环，或m1与b形成双内酰胺(如当碱与琥珀酰亚胺环反应时形成双内酰胺)，其中琥珀酰亚胺或双内酰胺通过硫醚键偶联到配体单元；
v、q、t和g独立地选自-(c(r9)(r10))-；
r1为h或c1-3烃基；
r9和r10，在各出现处，独立地选自h或c1-3烃基；
f为c(e1)(e2)，其中e1和e2独立地选自氢、吸电子基，或e1和e2一起为(＝o)；
rs为用于偶联到任选的第二接头装配体或药物单元的组分的反应位点；
g为0-5；
m为0-5；
n为0-5；
d为0或1；
x为0-4，条件是当m为0时，x为1-4；
p，如果存在，为1-20，优选为1-12；
和b为碱性部分。
将理解，对于式iii(包括iiia、iiib、iiic和iiid)和它们的药学上可接受的盐，吸电子基用f(如e1、e2，或e1和e2)或用反应位点rs表示。例如，当d为0，或当e1和e2是氢，反应位点将作为吸电子基。在一些方面，当d为0，rs为-c(＝o)-。在一些方面，n、d和g是0，或m、n、d和g是0，且rs为-c(＝o)-。
示例性的实施方式，其中配体-药物偶联物、药物-接头、接头或配体-接头偶联物由式iii(或式iiia、iiib、iiic或iiid，根据具体情况)表示或它们的药学上可接受的盐，包括其中m是0；m是0和n是0、1、2或3；x是1；x是0和n是0、1、2或3；以及m是0，n是0和x是1的那些。示例性的实施方式包括本文描述的其中r9和r10为氢的那些。示例性的实施方式包括e1和e2独立地选自h、-cn、-no2、-cx3，其中x为卤素；或e1和e2一起为(＝o)的那些。取代基的剩余部分如所定义的。
示例性的实施方式，其中配体-药物偶联物、药物-接头、接头或配体-接头偶联物由式iii(或式iiia、iiib、iiic或iiid，根据具体情况)表示或它们的药学上可接受的盐的包括以下那些，其中：
(i)e1和e2独立地选自氢、-cn、-no2、-cx3和-x，其中x为卤素；或e1和e2一起为(＝o)；
(ii)m为0，和n为0、1、2或3；
(iii)x为1；
(iv)x为4；
(v)x为0，和n为0、1、2或3；
(vi)m为0，n为0和x为1；
(vii)d为1和g为1-5；
(viii)d为1和g为2-5；
(ix)n、d和g为0；
(x)m、n、d和g为0；
(xi)rs为-c(＝o)-；
(xii)e1和e2一起为(＝o)；
(xiii)b为：
(xiv)b为-n(r3)(r4)，其中r3和r4独立地选自h或c1-6烃基；
(xv)b为(xiii)或(xiv)中所示，r3、r4、r5、r6、r7和r8独立地选自h或c1-3烃基；
(xvi)b为(xiii)或(xiv)中所示，r3、r4、r5、r6、r7和r8独立地选自h或甲基；
(xvii)b为(xiii)或(xiv)或(xvi)中所示，r3和r4为氢；
(xviii)b为(xiii)或(xiv)或(xvi)中所示，r3和r4中至少一个为氢；
(xix)b为(xiii)或(xiv)或(xvi)中所示，r3和r4中至少一个不为氢；
(xx)r1、r9和r10独立地选自h或甲基；
(xxi)r1、r9和r10为h；
(xxii)r1、r9和r10独立地选自h或甲基；
(xxiii)存在可切割单元；
(xxiv)存在可切割单元，其结构是为
(xxv)存在可切割单元，直接偶联到药物单元；
(xxvi)存在可切割单元，通过可切割肽、二硫键或腙键直接偶联到药物单元；
(xxvii)存在可切割单元，不存在间隔单元和延伸单元；
(xxviii)药物是澳瑞他汀(auristatin)；
(xxix)m1为水解的或非水解的琥珀酰亚胺；
(xxx)p为约4；
(xxxi)p为约8；
(xxxii)在ph7.4和22℃下，自稳定接头单元的硫代琥珀酰亚胺的水解t1/2为约10分钟到约2.5小时；
(xxxiii)在ph7.4和22℃下，自稳定接头单元的硫代琥珀酰亚胺的水解t1/2为约10分钟到约1小时；
(xxxiv)在ph7.4和22℃下，自稳定接头单元的硫代琥珀酰亚胺的水解t1/2为约10分钟到约30分钟；
(xxxv)配体单元是抗体；
(xxxvi)配体单元是抗体并通过链间二硫键的半胱氨酸残基连接到接头单元；
(xxxvii)配体单元是单克隆抗体；
和(i)-(xxxvii)的组合或亚组合，条件是这些组合或亚组合不互相冲突(如xxx和xxxi冲突，因为p不可能既是约4又是约8)。例如，在选择的实施方式中，m是0，和n是0、1、2或3。在其他选择的实施方式中，m是0，n是0，和x是1。在任何这些选择的实施方式中，d可以是1和g可以是1-5，或d可以是1和g可以是2-5。在任何这些选择的实施方式中，可以应用(i)，(iii)或(xi)-(xxxvi)中的一个或多个。
在各选择的实施方式中，其中配体-药物偶联物、药物-接头、接头或配体-接头偶联物由式iii(或式iiia、iiib、iiic或iiid，根据具体情况)表示或其药学上可接受的盐，任选的第二接头装配体可以由下式表示：
还包括的选择实施方式中，接头具有下式：
或其药学上可接受的盐，其中v、t、b、r1、q、f、g、m、x、n、d和g如式iii中定义的，rg是包括反应位点，rs的反应基团，以便在不存在第二接头装配体时用于偶联到药物单元d，或者用于偶联到第二接头装配体的某组分，其中第二接头装配体第二接头具有下式：
本发明的其他实施方式
在与配体偶联之前以及在偶联和偶联形成的硫代琥珀酰亚胺水解之后，示例性的自稳定接头装配体如下所示：
或为其药学上可接受的盐，其中v、q、m、n、x和b如式iii或任何其他选择的实施方式所定义，c为1-4，r11和r12在各出现处，独立地选自h或c1-c6烃基。在示例性的实施方式中，c为1或4。水解的硫代琥珀酰亚胺的“s”表示配体(如抗体)的硫原子。波浪线表示连接到第二接头装配体或药物单元。在示例性的实施方式中，波浪线表示连接到以下第二接头装配体
在本发明的一些方面，自稳定接头装配体经历大环化从而形成如下的双内酰胺，其中r表示偶联物的剩余部分：
第二接头装配体
任选的第二接头可以包括各种不同的连接基团。在本发明提供的各实施方式中，包括特定例举的实施方式，lo可以存在并具有下式：
其中，
-a-为任选的延伸单元，下标a'为0或1；
-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；和
-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1。
任选的第二接头装配体可以是可释放的接头装配体，lr。在那些实施方式中，w为1。在一些其他方面，任选的第二接头装配体是不可释放的接头装配体。在那些实施方式中，w为0，药物的释放是通过全蛋白降解途径(即非可切割途径)。
配体单元
在本发明的一些实施方式中，存在配体单元。配体单元(l-)是特异性结合到靶部分的靶向试剂。配体可以特异性结合到细胞组分(细胞结合试剂)或到其他感兴趣的靶分子。在一些方面，配体单元将药物单元传递到特定的靶细胞群体，其与配体单元相互作用。配体包括，但不限于，蛋白质、多肽和肽。合适的配体单元包括，例如，抗体，如全长抗体和其抗原结合片段、干扰素、淋巴因子、激素、生长因子和集落刺激因子、维生素、营养运输分子(如，但不限于，转铁蛋白)或任何其他细胞结合分子或物质。在一些方面，配体是非抗体蛋白靶向试剂。在一些方面，提供配体-官能试剂，其中d’为检测单元或稳定单元，配体单元是蛋白质(如非抗体蛋白质)。
在一些方面，配体单元通过配体的巯基与自稳定碱性单元的马来酰亚胺成键从而形成硫代琥珀酰亚胺。巯基可以在配体的自然状态存在于配体上，例如，天然形成的残基，或可以通过化学修饰导入配体。
已观察到生物偶联物的药物偶联的位点可以影响许多参数，包括偶联的易操作性、药物-接头稳定性、对获得的生物偶联物的生物物理性能的影响和体外细胞毒性。对于药物-接头稳定性，药物-接头到配体的偶联位点可以影响偶联药物-接头经历消除反应的能力，以及对于药物接头而言，从生物偶联物的配体转移到生物偶联物周围存在的其它反应活性硫醇的能力，所述硫醇是例如，白蛋白中的反应硫醇、游离半胱氨酸或谷胱甘肽，当在血浆中。若使用非自稳定烃基马来酰亚胺(如马来酰亚胺-己酰基药物接头)，在偶联于易进行消除反应及随后药物-接头转移的位点的硫醇残基时，使用本发明自稳定接头是特别有利的。该位点包括，例如，链间二硫键和选择半胱氨酸工程改造位点。使用本发明的自稳定接头提供稳定的连接键且能够连接多种药物到各配体单元。
在一些方面，配体单元具有一个或多个赖氨酸残基，可以被化学修饰从而引入一个或多个巯基。可以用来修饰赖氨酸的试剂包括，但不限于，n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰硫基乙酸酯(sata)和2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(特劳特试剂(traut'sreagent))。
在另一实施方式中，配体单元可以具有一个或多个碳水化合物基团(carbohydrategroup)，可以被化学修饰以具有一个或多个巯基。
在另一实施方式中，配体是抗体，通过链间二硫键的还原生成巯基。因此，在一些实施方式中，接头单元偶联到还原的链间二硫键的半胱氨酸残基。
在另一实施方式中，通过化学方法将巯基引入抗体，例如，通过引入半胱氨酸残基。因此，在一些实施方式中，接头单元偶联到引入的半胱氨酸残基。
有用的非免疫反应蛋白质，多肽或肽配体包括，但不限于，转铁蛋白、表皮生长因子(egf)、铃蟾肽、胃泌激素、胃泌激素释放肽、血小板衍生生长因子、il-2、il-6、转移生长因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β、牛痘病毒生长因子(vgf)、胰岛素和类胰岛素生长因子i和ii、生长激素抑制素、凝集素和源自低密度脂蛋白的脱辅基蛋白。
特别优选的配体是抗体。有用的多克隆抗体是源自免疫动物的血清的抗体分子异质群体。有用的单克隆抗体是针对特定抗原决定簇(如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其片段)的抗体均质群体。针对感兴趣抗原的单克隆抗体(mab)可以通过培养传代细胞系产生抗体分子的任何本领域已知的技术制备。
有用的单克隆抗体包括，但不限于，人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合人-鼠(或其他物种)单克隆抗体。抗体包括全长抗体和其抗原结合片段。可以通过本领域已知的任何众多技术制备人单克隆抗体(如teng等,1983,proc.natl.acad.sci.usa.80:7308-7312:kozbor等,1983,immunologytoday4:72-79；和olsson等,1982,meth,enzymol92:3-16)。
抗体可以是免疫特异性结合到靶细胞(如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的抗体的官能活性片段、衍生物或类似物；或是结合到肿瘤细胞或基质的其它抗体。在这方面，“官能活性”指所述片段、衍生物或类似物能引发识别与获得所述片段、衍生物或类似物的抗体相同抗原的抗-抗-同种型抗体。特别地，在示例性的实施方式中，可以通过删除框架区和cdr序列来增强免疫球蛋白分子的同种型的抗原性，所述cdr序列是特异性识别抗原的cdr序列的c-末端。为检测哪个cdr序列结合抗原，可以通过本领域已知的任何结合测定方法(如biacore试验)将包含cdr序列的合成肽用于与抗原的结合试验(参见，如kabat等，1991，供免疫学研究的蛋白序列，第五版，国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(kabatetal.,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,nationalinstituteofhealth,bethesda,md)；kabate等,1980,j.immunology125(3):961-969)。
其他有用的抗体包括抗体片段，如，但不限于，f(ab’)2片段、fab片段、fvs、单链抗体、双抗、三抗、四抗、scfv、scfv-fv、或任何其他分子，具有与抗体相同的特异性。
此外，重组抗体，如包含人和非人部分的嵌合的和人源化的单克隆抗体是有用的抗体，它们可以使用标准重组dna技术制成。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物种的分子，例如，具有衍生自鼠单克隆的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些(参见,如,美国专利号4,816,567；和美国专利号4,816,397,通过引用全部并入本文)。人源化抗体是具有一个或多个非人物种的互补决定区(cdr)和源自人免疫球蛋白分子的框架区的非人种的抗体分子(参见，如，u.s.专利号5,585,089,通过引用全部并入本文)。这种嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域中已知的重组dna技术生产，例如，使用以下文献中描述的方法：国际公开号wo87/02671；欧洲专利公开号0184187；欧洲专利公开号0171496；欧洲专利公开号0173494；国际公开号wo86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利公开号012023；berter等,1988,science240:1041-1043；liu等,1987,proc.natl.acad.sci.usa84:3439-3443；liu等,1987,j.immunol.139:3521-3526；sun等,1987,proc.natl.acad.sci.usa84:214-218；nishimura等,1987,cancer.res.47:999-1005；wood等,1985,nature314:446-449和shaw等,1988,j.natl.cancerinst.80:1553-1559；morrison,1985,science229:1202-1207；oi等,1986,biotechniques4:214；美国专利号5,225,539、jones等,1986,nature321:552-525；verhoeyan等,1988,science239:1534和beidler等,1988,j.immunol.141:4053-4060，各文献通过引用全部并入本文。
完全人抗体是特别理想的，并且可以使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠制备。
抗体包括经修饰的类似物和衍生物，例如，通过共价连接任何类型的分子，只要这种共价连接允许抗体保留其抗原结合免疫特异性。例如，但不作为限制，抗体的衍生物和类似物包括进一步修饰的那些，例如通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团衍生化，蛋白水解切割，连接到细胞抗体单元或其他蛋白质等。任意的多种化学修饰可以通过已知的技术进行，包括但不限于，特异性化学切割，乙酰化，甲酰化，衣霉素存在下代谢合成等。此外，类似物或衍生物可以含有一个或多个非天然氨基酸。
抗体可以在与fc受体相互作用的氨基酸残基内具有修饰(例如，取代，缺失或添加)。特别地，抗体可以在鉴定为参与抗fc结构域与fcrn受体间相互作用的氨基酸残基内具有修饰(参见，例如，国际公开号wo97/34631，通过引用全部并入本文)。
癌细胞抗原的免疫特异性抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法制备，例如，化学合成或重组表达技术。编码癌细胞抗原的免疫特异性抗体的核苷酸序列可以从，例如，genbank数据库或者类似的数据库，文献出版物，或者通过常规克隆和测序获得。
在特定实施方式中，可以使用用于治疗癌症的已知抗体。癌细胞抗原的免疫特异性抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法制备，例如，重组表达技术。编码癌细胞抗原的免疫特异性抗体的核苷酸序列可以从，例如，genbank数据库或者类似的数据库，文献出版物，或者通过常规克隆和测序获得。
在另一特定实施方式中，治疗自身免疫疾病的抗体可用于本发明组合物和方法。负责产生自身免疫抗体的细胞的抗原的免疫特异性抗体可以从任何组织(例如大学的科学家或公司)获得或由本领域技术人员已知的任何方法制备，例如，化学合成或重组表达技术，在另一实施方式中，有用的抗体是对于治疗自身免疫疾病免疫特异性的，包括，但不限于，抗核抗体；抗双链dna；抗单链dna；抗心磷脂抗体igm、igg；抗磷脂抗体igm、igg；抗sm抗体；抗线粒体抗体；甲状腺抗体；微粒体抗体；甲状腺球蛋白抗体；抗scl-70抗体；抗jo抗体；抗u1rnp抗体；抗la/ssb抗体；抗ssa；抗ssb抗体；抗perital细胞抗体；抗组蛋白抗体；抗rnp抗体；c-anca抗体；p-anca抗体；抗着丝点抗体；抗纤维蛋白抗体和抗gbm抗体。
在某些实施方式中，有用的抗体可以结合到表达于活化淋巴细胞上的受体或受体复合物。受体或受体复合物可以包括免疫球蛋白基因超家族成员，tnf受体超家族成员，整联蛋白，细胞因子受体，趋化因子受体，主要组织相容性蛋白，外源凝集素，或补体控制蛋白。合适的免疫球蛋白超家族成员的非限制性实例是cd2，cd3，cd4，cd8，cd19，cd20，cd22，cd28，cd30，cd70，cd79，cd90，cd152/ctla-4，pd-1和icos。合适的tnf受体超家族成员的非限制性实例是cd27，cd40，cd95/fas和cd134/ox40，cd137/4-1bb，tnf-r1，tnf-2，rank，taci，bcma，骨保护素，apo2/trail-r1，trail-r2，trail-r3，trail-r4和apo-3。合适的整联蛋白的非限制性的实例是cd11a、cd11b、cd11c、cd18、cd29、cd41、cd49a、cd49b、cd49c、cd49d、cd49e、cd49f、cd103和cd104。合适的外源凝集素的非限制性实例是c型、s型和i型外源凝集素。
药物单元，d
药物单元(d)可以是任何细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制药物，本文也称为细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制剂。药物单元具有能够与接头单元成键的原子。在一些实施方式中，药物单元d具有可以与接头单元成键的氮原子。在其他实施方式中，药物单元d具有可以与接头单元成键的羧酸。在其他实施方式中，药物单元d具有可以与接头单元成键的巯基。在其他实施方式中，药物单元d具有可以与接头单元成键的羟基或酮。
有用类型的细胞毒性或免疫抑制剂包括，例如，抗微管蛋白剂，澳瑞他汀，dna小沟结合剂，dna复制抑制剂，烷化剂(例如，铂复合物，如顺铂，单(铂)，双(铂)和三-核铂复合物和卡铂)，蒽环类，抗生素，叶酸拮抗剂，抗代谢物，化疗致敏剂，多卡米星(duocarmycin)，依托泊苷，氟化嘧啶，离子载体，莱托星(lexitropsin)，亚硝基脲，顺铂(platinol)，预成形化合物，嘌呤抗代谢物，嘌呤霉素，放射致敏剂，类固醇，紫杉烷，拓扑异构酶抑制剂，长春花生物碱等。有用类型的细胞毒性试剂的特别实例包括，dna小沟结合剂，dna烷化剂，和微管蛋白抑制剂。示例性的细胞毒性剂包括，例如，澳瑞他汀类，喜树碱，多卡米星，依托泊苷，美登素和美登木素生物碱(maytansinoid)(例如，dm1和dm4)，紫杉烷，苯并二氮杂卓(如吡咯并[1,4]苯并二氮杂卓(pbd)，二氢吲哚并苯并二氮杂卓和氧杂二氢吲哚并苯并二氮杂卓)和长春花生物碱。包含苯并二氮杂卓的药物的选择在wo2010/091150、wo2012/112708、wo2007/085930和wo2011/023883中描述。
各细胞毒性或免疫抑制剂包括，例如，雄激素，安曲霉素(amc)，天冬酰胺酶，5-氮杂胞苷，咪唑硫嘌呤，博来霉素，白消安，丁硫氨酸亚砜胺，卡奇霉素(calicheamicin)，喜树碱，卡铂，卡莫司汀(bsnu)，cc-1065，苯丁酸氮芥，顺铂，秋水仙素，环磷酰胺，阿糖胞苷，胞嘧啶核苷阿拉伯糖苷，细胞松弛素b，达卡巴嗪，放线菌素d(以前称为放线菌素)，柔红霉素，氨烯咪胺(decarbazine)，多西紫杉醇，阿霉素，依托泊苷，雌激素，5-氟脱氧脲苷，5-氟尿嘧啶，吉西他滨，短杆菌肽d，羟基脲，伊达比星(idarubicin)，异环磷酰胺，伊立替康，环己亚硝脲(ccnu)，美登素，双氯乙基甲胺，美法仑，6-巯基嘌呤，氨甲蝶呤，光神霉素，丝裂霉素c，米托蒽醌，硝基咪唑，紫杉醇，水螅毒素，普卡霉素，甲苄肼(procarbizine)，根霉素，链脲霉素，替尼泊苷(tenoposide)，6-硫鸟嘌呤，三胺硫磷(thiotepa)，托泊替康(topotecan)，长春碱，长春新碱，长春瑞滨，vp-16和vm-26。
在一些典型的实施方式中，合适的细胞毒性剂包括，例如，dna小沟结合剂(如烯二炔类和莱托星(lexitropsin)，cbi化合物；还参见美国专利号6130237)，多卡米星(参见美国公开号20060024317)，紫杉烷(例如，紫杉醇和多西紫杉醇)，嘌呤霉素，长春花生物碱，cc-1065，sn-38，托泊替康，吗啉代阿霉素，根霉素，氰基吗啉代阿霉素，棘霉素，考布他汀(combretastatin)，纺锤菌素，埃坡霉素a和b，雌莫司汀(estramustine)，克托星(cryptophysins)，西马多丁(cemadotin)，美登木素生物碱，海绵内酯(discodermolide)，五加苷素(eleutherobin)和米托蒽醌。
在一些实施方式中，药物单元是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括，但不限于，紫杉烷(如
在某些实施方式中，细胞毒性剂是美登素或美登木素生物碱，另一组抗微管蛋白剂(免疫原公司；还参见chari等,1992,cancerres.52:127-131和美国专利号8,163,888)。
在一些实施方式中，药物单元是澳瑞他汀。澳瑞他汀包括，但不限于，ae、afp、aeb、aevb、mmaf和mmae。澳瑞他汀的合成和结构在美国申请公开号2003-0083263、2005-0238649、2005-0009751、2009-0111756和2011-0020343，国际专利公开号wo04/010957，国际专利公开号wo02/088172和美国专利号7659241和8343928中描述，各个通过引用全部为所有目的并入本文。本发明示例性的澳瑞他汀结合微管蛋白并对所需细胞系发挥细胞毒性或细胞抑制作用。
示例性的澳瑞他汀药物单元具有以下结构式或其药学上可接受的盐，其中波浪线表示到接头单元的连接位点：
在一些实施方式中，药物是苯并二氮杂卓(benzodiazepine)(包括含有苯并二氮杂卓的药物，例如，吡咯并[1,4]苯并二氮杂卓(pbd)，二氢吲哚苯并苯并二氮杂卓和氧杂二氢吲哚并苯并二氮杂卓)。
pbd如通式结构所示：
但在取代基的数量、类型和位置，在它们的芳香a环和吡咯c环，以及c环的饱和度上可以不同。在b-环，在n10-c11位有亚胺(n＝c)、甲醇胺(nh-ch(oh))或甲醇胺甲基醚，其为负责烷基化dna的亲电中心。全部已知天然产物在手性c11a位具有(s)-构型，从c环到a环观察时，为它们提供右旋。这给它们合适的三维形状。从而与b-形dna的小沟具有等螺旋性(isohelicity)，进而导致在结合位点处贴合。pbd在小沟内形成加合物的能力，使它们能够干扰dna加工，因此，它们用作抗肿瘤剂。这些分子的生物活性可以加强，例如，通过将两pbd单元通过它们的c8/c’-羟基官能团经由灵活的亚烃基接头连接在一起。pbd二聚体被认为形成序列选择性的dna损伤，如回文结构5’-pu-gatc-py-3’链间交联，这被认为主要负责它们的生物活性。
有许多不同的试验可用于测定配体-药物偶联物是否对细胞系发挥细胞抑制或细胞毒作用。在用于测定配体-药物偶联物是否对细胞系发挥细胞抑制或细胞毒作用的一个实施方式中，使用胸苷掺入法。例如，细胞在96孔板内以每孔5000细胞的密度培养72小时，在72小时的最后8小时期间暴露于0.5μci的3h-胸苷，在有和没有配体-药物偶联物存在下检测3h-胸苷掺入培养的细胞。与在相同条件下培养的但没有接触配体-药物偶联物的相同细胞系相比，如果培养的细胞的3h-胸苷掺入减少，配体-药物偶联物对细胞系具有细胞抑制或细胞毒作用。
在另一个实施方式中，为测定配体-药物偶联物是否对细胞系发挥细胞抑制或细胞毒作用，通过检测细胞内染料摄取，如中性红、台盼蓝或alamartm蓝(参见，例如，page等,1993,intl.j.ofoncology3:473-476)检测细胞活力。在这样的试验中，细胞培养于包含染料的培养基中，洗涤细胞，通过分光光度法检测剩余的颜料，反映染料的细胞摄取。也可以使用蛋白结合染料磺酰罗丹明b(srb)检测细胞毒性(skehan等,1990,j.nat’lcancerinst.82:1107-12)。优选的配体-药物偶联物包括对细胞系的ic50(定义为获得50％细胞杀死的mab浓度)值小于1000纳克/毫升，优选小于500纳克/毫升，更优选小于100纳克/毫升，甚至更优选小于50或甚至更优选小于10纳克/毫升的那些。
连接药物到接头的通用方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号8,163,888、7,659,241、7,498,298，美国公开号us20110256157以及国际申请号wo2011023883和wo2005112919。
m1-琥珀酰亚胺
通过硫醚键偶联于配体单元的非水解琥珀酰亚胺(本文也称为琥珀酰亚胺环)可如下表示，其中r表示接头单元的剩余部分，任选地偶联至药物单元，检测单元或稳定单元：
通过硫醚键偶联于配体单元的水解琥珀酰亚胺(本文也称为水解琥珀酰亚胺环)可如下表示为它的两个位置异构体之一，其中r表示接头单元的剩余部分，任选地偶联至药物单元，检测单元或稳定单元：
将理解，对于非水解琥珀酰亚胺和水解琥珀酰亚胺的图示，可以有1-20，优选为1-12、1-10或1-8自稳定接头偶联到各配体。在一些方面，有1-20，优选为1-12、1-10或1-8药物-接头偶联到各配体。此外，对于本文描述的没有连接配体的偶联物，琥珀酰亚胺是不饱和形式为马来酰亚胺(能与硫醇或配体反应)
碱性单元
在式i，以及包括自稳定接头(lss)的其他结构式中，碱性单元(bu)基本上可以是能够促进氢氧根离子(或水)攻击以水解附近琥珀酰亚胺基的任何碱性部分。因此，bu代表任何“碱性部分”，但通常是包含系留胺(tetheredamine)或含氮杂环的基团；所述胺或含氮杂环作为碱性单元的碱性部分。代表性的胺包括-n(r3)(r4)，其中r3和r4r独立地选自h或c1-6烃基，优选h或甲基，
其中r5、r6、r7和r8，在每次出现时，独立地选自氢或c1-6烃基，优选h或甲基，以及e是0-4。在以上结构式中，波浪线表示到连接基团(tetheringgroup)(通常亚烃基接头-(c(r9)(r10))x-，其中下标x为0-6或1-6的整数，条件是如果x为0，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)或双内酰胺的氮原子之间具有不少于2个居间原子，以及r9和r10独立地选自h或c1-3烃基)的连接点。在一些方面，亚烃基接头是-(ch2)x-，其中下标x为0-6或1-6的整数，条件是如果x为0，在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)或双内酰胺的氮原子之间具有不少于2个居间原子。下标x优选为0-4、1-4或1-3，或2-3、或2-4，但也可以是0、1、2、3或4。因此，在一些实施方式中，碱性单元选自-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中x为0-4、1-4、或1-3、或2-3、或2-4的整数，但也可以是0、1、2、3或4，和各ra独立选自c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基。在优选的方面，碱性单元的碱性部分为含氮碱。
水解强化剂(he)和吸电子基
式i，以及包括自稳定接头(lss)的其他结构式的水解强化剂可以基本上是能促进附近琥珀酰亚胺基团水解的任何吸电子基。而协助氢氧根离子(或水)攻击以水解附近琥珀酰亚胺基，或使附近琥珀酰亚胺基更易水解的碱性单元(bu)进一步促进水解。因此，he可以包括从反应中心吸走电子的官能团。典型的吸电子基包括，但不限于，-c(＝o)、(＝o)、-cn、-no2、-cx3、-x、-coor、-conr2、-cor、-cox、-so2r、-so2or、-so2nhr、-so2nr2、-po3r2、-p(o)(ch3)nhr、no、-nr3+、-cr＝cr2、和-c≡cr，其中x为f、br、cl或i，或r在各出现处，独立地选择由氢和c1-6烃基构成的组。典型的吸电子基还包括芳基(如苯基)和某些杂芳基(如吡啶)。术语“吸电子基”包括进一步被吸电子基取代的芳基或杂芳基。
在一些实施方式中，he包括羰基、磺酰基或磷酰基部分。在一些实施方式中，水解强化剂(he)为-ch2c(o)-、-c(o)-、-c(o)ch2-、-ch2ch2c(o)-或-ch2c(o)nh。
在一些实施方式中，其中he直接连接到第二接头装配体或药物单体或稳定单元或检测单元，he包括适合连接到任选的第二接头装配体或药物单元的反应位点。在一些方面，吸电子基团本身将起到吸电子基团和连接于任选的第二接头装配体或药物单元的反应位点(例如，c(＝o)-)的作用。
任选的第二接头装配体
如上所述，任选的第二接头装配体可以由下式表示：
其中-a-为任选的延伸单元，下标a'为0或1；-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；和-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1。临近任选的延伸单元的波浪线表示到自稳定接头装配体的连接位点，和临近任选的间隔单元的波浪线表示到药物单元的连接位点。
连接药物单元、检测单元或稳定单元到配体单元的一般方法是本领域公知的。可采用本文描述的教导改造本领域已知的接头以便与自稳定接头装配体使用，或进行修饰以包括碱性组分和/或吸电子基。例如，澳瑞他汀和美登素adc目前在临床开发用于治疗癌症。单甲基澳瑞他汀e通过蛋白酶可切割肽接头偶联到抗体，单甲基澳瑞他汀f通过马来酰亚胺己酸直接偶联到抗体，dm1通过二硫键或直接通过异双官能smcc接头偶联，和dm4通过二硫键偶联。可采用本文描述的教导改造这些接头系统以便与自稳定接头装配体使用，或进行修饰以包括碱性组分和/或吸电子基，和根据所用的接头系统通过可切割或不可切割的系统释放药物。二硫，硫醚，肽，肼，酯，或氨基甲酸酯键是可以用来连接药物单元到接头单元的键的全部实例。延伸单元、可切割单元和间隔单元在下文中更详细地描述。
本发明也考虑支链接头。因此，在一个方面中，将延伸单元设计成允许在接头单元内分支，如将多于一个药物单元或检测单元或稳定单元连接到各自稳定接头装配体，如下式表示：
其中，波浪线表示到自稳定接头装配体的连接位点，-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1，u为2-20(优选2-10)；a为延伸单元，a'为在a末端的任选的延伸单元组分；和a'为0或1。各a'、w、y和d'可以相同或不同。各可切割单元可以通过延伸单元上相同或不同官能团连接到延伸单元(a或a')。在一些方面，d'是药物单元d。
具有分支或无分支接头的示例性配体-官能试剂偶联物或配体-药物偶联物具有以下结构：
或其盐(如药学上可接受的盐)，其中l、m1、he、bu和d'，以及下标p、a、b、m、q和r各自具有为式i和为式i任何选择的实施方式提供的含义，d为药物单元，圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到a、w、y或d'(或d，根据具体情况)的反应位点；-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1，a为延伸单元，a'为在a末端的任选的延伸单元组分；a'为0或1；和u为1-20(优选1-10)，其中当u为2-20，存在a，和当u为1，a可以存在或不存在。各a'、w、y和d'(或d，根据具体情况)可以相同或不同。各可切割单元可以通过延伸单元上相同或不同官能团连接到延伸单元(a或a')。在一些方面，w'为1。在一些方面，w'为1且a'为0。在接头不是分支的方面，u为1且a'为0。在其他方面，其中接头是分支的，u为2-20(优选2-10)。在这些选择的各实施方式中，圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)或c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链。
具有分支或非分支接头的配体-官能试剂偶联物可以由下式表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中l、m1、he、bu和d'，以及下标p中各个具有为式i和为式i任何选择的实施方式提供的含义；圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到a、w、y或d'的反应位点；-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1，a为延伸单元，a'为在a末端的任选的延伸单元组分；a'为0或1；和u为1-20(优选1-10)，其中当u为2-20，存在a，和当u为1，a可以存在或不存在。各a'、w、y和d'可以相同或不同。各可切割单元可以通过延伸单元上相同或不同官能团连接到延伸单元(a或a')。在一些方面，w'为1。在一些方面，w'为1且a'为0。在接头不是分支的方面，u为1，a'为0，a可以存在或不存在。在其他方面，其中接头是分支的，u为2-20(优选2-10)。在一些优选实施方式中，bu选自-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中，x为0-4的整数，各ra独立选自c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，条件是在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)的氮原子之间具有不少于2个居间原子。在一些这样的方面，x为0-4，和各ra为c1-6烃基。
具有分支或非分支接头的配体-药物偶联物可以由下式表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中l、m1、he、bu和下标p中各个具有为式i和为式i任何选择的实施方式提供的含义，d是药物单元；圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到a、w、y或d的反应位点；-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1，a为延伸单元，a'为在a末端的任选的延伸单元组分；a'为0或1；和u为1-20(优选1-10)，其中当u为2-20，存在a，和当u为1，a可以存在或不存在。各a'、w、y和d'可以相同或不同。各可切割单元可以通过延伸单元上相同或不同官能团连接到延伸单元(a或a')。在一些方面，w'为1。在一些方面，w'为1且a'为0。在接头不是分支的方面，u为1，a'为0，a可以存在或不存在。在其他方面，其中接头是分支的，u为2-20(优选2-10)。在一些优选实施方式中，bu选自-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中，x为0-4的整数，各ra独立选自c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，条件是在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)的氮原子之间具有不少于2个居间原子。在一些这样的方面，x为0-4，和各ra为c1-6烃基。
具有分支或非分支接头的官能试剂-接头偶联物可以由下式表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中he、bu、d'和下标p、a、b、m、q和r中各个具有为式i和为式i任何选择的实施方式提供的含义；圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到a、w、y或d'的反应位点；w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1，a为延伸单元，a'为在a末端的任选的延伸单元组分；a'为0或1；和u为1-20(优选1-10)，其中当u为2-20，存在a，和当u为1，a可以存在或不存在。各a'、w、y和d'可以相同或不同。各可切割单元可以通过延伸单元上相同或不同官能团连接到延伸单元(a或a')。在一些方面，w'为1。在一些方面，w'为1且a'为0。在接头不是分支的方面，u为1，a'为0，a可以存在或不存在。在其他方面，其中接头是分支的，u为2-20(优选2-10)。在这些选择的各实施方式中，圆圈可以表示支架，是c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)或c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链。在这些选择的各实施方式中，d'可以为d。
在一些方面，
在一些这样的方面，d'为d。在一些优选的实施方式中，bu选自-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中，x为0-4的整数，各ra独立选自c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，条件是在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)的氮原子之间具有不少于2个居间原子。在一些这样的方面，x为0-4，和各ra为c1-6烃基。
具有分支或非分支接头的配体-接头偶联物可以由下式表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中l、m1、he、bu和下标p、a、b、m、q和r中各个具有为式i和为式i任何选择的实施方式提供的含义；圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到a、w、y或d的反应位点；rg是
在一些方面，
在一些优选的实施方式中，bu选自-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中，x为0-4的整数，各ra独立选自c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，条件是在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)的氮原子之间具有不少于2个居间原子。在一些这样的方面，x为0-4，和各ra为c1-6烃基。
分支或非分支接头可以有下式表示：
或是其盐(如药学上可接受的盐)，其中支架、he、bu和下标a、b、m、q和r中各个具有为式i和为式i任何选择的实施方式提供的含义；圆圈表示支架，可以是c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到a、w、y或d的反应位点；rg是
在一些方面，
在一些优选的实施方式中，bu选自-(ch2)xnh2、-(ch2)xnhra和-(ch2)xnra2构成的组，其中，x为0-4的整数，各ra独立选自c1-6烃基和c1-6卤代烃基构成的组，或两ra与它们连接的氮组合从而形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基，条件是在碱性单元的碱性部分和琥珀酰亚胺(水解或非水解)的氮原子之间具有不少于2个居间原子。在一些这样的方面，x为0-4，和各ra为c1-6烃基。
在一些其他方面，具有分支或非分支接头的示例性的配体-药物偶联物具有下式：
或其药学上可接受的盐，其中l、m1、v、r1、t、b、q、f、g和rs，以及下标p、m、x、n、d和g中各个具有为式iii和为式iii任何选择的实施方式提供的含义；l是配体单元，w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1，a为延伸单元，a'为在a末端的任选的延伸单元组分；a'为0或1；和u为1-20(优选1-10)，其中当u为2-20，存在a，和当u为1，a可以存在或不存在。各a'、w、y和d可以相同或不同。各可切割单元可以通过延伸单元上相同或不同官能团连接到延伸单元(a或a')。在一些方面，w'为1。在一些方面，w'为1且a'为0。在接头不是分支的方面，u为1，a'为0，a可以存在或不存在。在其他方面，其中接头是分支的，u为2-20(优选2-10)。
下文更详细描述延伸单元、可切割单元和间隔单元。
延伸单元
延伸单元(-a-)，当存在时，延伸接头单元的框架以在自稳定接头装配体和药物单元之间提供更多的距离。当可切割单元存在时，延伸单元能连接自稳定接头装配体到可切割单元；当可切割单元不存在而间隔单元存在时，连接自稳定接头装配体到间隔单元；当可切割单元和间隔单元两者都不存在时，连接自稳定接头装配体到药物单元。如所描述的，延伸单元能够连接到多于一个可切割单元、间隔单元和/或药物单元。
根据延伸单元的组分，还可利用延伸单元改变药物-接头的理化性能。在一些方面，延伸单元将被加入以提高药物-接头的溶解性，包括一种或多种溶解性增强基团，如离子基团或水溶性聚合物。水溶性(聚合物)通常包括可以在室温下溶于水的任何区段或聚合物，且包括聚乙二醇基团和其他聚合物，如聚乙烯亚胺。
延伸单元包括一个或多个延伸基团。典型的延伸基团包括，例如，-nh-c1-c10亚烃基-、-nh-c1-c10亚烃基-nh-c(o)-c1-c10亚烃基-、-nh-c1-c10亚烃基-c(o)-nh-c1-c10亚烃基-、-nh-(ch2ch2o)s-、-nh-(ch2ch2o)s-ch2-、-nh-(ch2ch2nh)s-(ch2)s、-nh-(ch2ch2nh)s-(ch2)s-nh-c(o)-(ch2)s、-nh-(c3-c8亚碳环)-、-nh-(亚芳基-)-和-nh-(c3-c8亚杂环-)-，其中，各s独立地为1-10。具有羰基以便连接到接头单元的剩余部分或药物单元的代表性延伸基团如下：
其中，r13为-c1-c10亚烃基-、-c3-c8亚碳环-、-亚芳基-、-c1-c30杂亚烃基-、-c3-c8亚杂环-、-c1-c10亚烃基-亚芳基-、-亚芳基-c1-c10亚烃基-、-c1-c10亚烃基-(c3-c8亚碳环)-、-(c3-c8亚碳环)-c1-c10亚烃基-、-c1-c10亚烃基-(c3-c8亚杂环)-、-(c3-c8亚杂环)-c1-c10亚烃基-、-(ch2ch2o)1-10(-ch2)1-3-或-(ch2ch2nh)1-10(-ch2)1-3-。在一些实施方式中，r13为-c1-c10亚烃基-或-c1-c30杂亚烃基-。在一些实施方式中，r13为-c1-c10亚烃基-、-(ch2ch2o)1-10(-ch2)1-3-或-(ch2ch2nh)1-10(-ch2)1-3-。在一些实施方式中，r13为-c1-c10亚烃基-聚乙二醇、或聚乙烯亚胺。
非可切割药物释放系统是本领域已知的，可以改造以适用于与本发明的自稳定接头装配体使用作为延伸单元和/或间隔单元。能够以总体稳定和共价方式连接药物单元到配体的非可切割接头实质上耐受酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶-或酯酶诱导的切割和二硫键切割。药物通过可选择的机理，如蛋白水解配体降解，从包含非可切割接头的配体药物偶联物释放。
在美登木素生物碱药物和配体之间形成非可切割接头的交联剂是本领域已知的且可适用于本文。在美登木素生物碱药物和配体之间形成非可切割接头的典型交联剂包括马来酰亚胺基或卤乙酰基部分。它们包括4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸n-琥珀酰亚胺酯(smcc)、作为smcc(lc-smcc)的“长链”类似物的n-琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基乙酸酯)、κ-马来酰亚胺十一酸n-琥珀酰亚胺酯(kmua)、γ-马来酰亚胺丁酸n-琥珀酰亚胺酯(gmbs)、ε-马来酰亚胺己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(emcs)、m-马来酰亚胺苯甲酰-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、n-(α-马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯[amas]、琥珀酰亚胺-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(smph)、n-琥珀酰亚胺4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酯(smpb)、和n-(p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(pmpi)、n-琥珀酰亚胺-4-(碘乙酰基)-氨基苯酸酯(siab)、n-琥珀酰亚胺碘乙酸酯(sia)、n-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(sba)和n-琥珀酰亚胺3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(sbap)。用于与本发明自稳定接头装配体组合的其他延伸单元可以在，例如美国专利号8,142,784中找到，为所有目的通过引用全部并入本文。
可切割单元
可切割单元(-w-)，当存在时，能够连接自稳定接头装配体到间隔单元，当间隔单元存在时；或连接自稳定接头装配体到药物单元，当可切割单元不存在时。当延伸单元不存在时，自稳定接头装配体与间隔单元或药物单元的连接可以直接来自自稳定接头装配体，如果延伸单元存在，可以通过延伸单元连接。
在一些实施方式中，可切割单元可以在一端直接偶联到自稳定接头装配体，在另一端偶联到药物单元。在其他实施方式中，可切割单元在一端直接偶联到延伸单元，在另一端偶联到药物单元。在还有的其他实施方式中，可切割单元在一端直接偶联到延伸单元，且在另一端偶联到间隔单元。在还有的其他实施方式中，可切割单元在一端直接偶联到自稳定接头装配体，在另一端偶联到间隔单元。本文描述的任何特别描述的自稳定接头装配体可以用于这些实施方式。
可切割单元能够与药物单元或间隔单元形成可可切割的键。用于形成可可切割的键的反应基团可以包括，例如，巯基以形成二硫键，醛，酮，或肼基团以形成腙键，羧基或氨基以形成肽键，和羧基或羟基以形成酯键。
可切割单元的性质可以广为变化。例如，可可切割的接头包括通过二硫键交换可切割的含二硫键接头，在酸性ph下可切割的酸不稳定接头，以及通过水解酶、肽酶、酯酶和葡糖醛酸酶可切割的接头。
在一些方面，可切割单元的结构和顺序是这样的，该单元通过存在于靶部位的酶的作用切割。在其它方面中，可切割单元可以通过其他机制切割。可切割单元可以包括一个或多个切割位点。
在一些实施方式中，可切割单元将包括一个氨基酸或氨基酸的一个或多个序列。可切割单元可以包括，例如，单肽，二肽，三肽，四肽，五肽，六肽，七肽，八肽，九肽，十肽，十一肽或十二肽单元。
各氨基酸可以是天然或非天然的和/或为d-或l-同分异构体，当然条件是具有可可切割的键。在某些实施方式中，可切割单元将仅包含天然氨基酸。在一些方面，可切割单元将包含1至12个氨基酸的连续序列。
在一些实施方式中，各氨基酸独立地选自下组：丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸，甘氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸，硒代半胱氨酸，鸟氨酸，青霉胺，β-丙氨酸，氨基烷酸，氨基炔酸，氨基烷二酸，氨基苯甲酸，氨基-亚杂环基-烷酸，杂环羧酸，瓜氨酸，抑胃酶氨酸，二氨基链烷酸，以及它们的衍生物。在一些实施方式中，各氨基酸独立地选自下组：丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸，甘氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方式中，各氨基酸独立地选自下组：丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸，甘氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，各氨基酸选自蛋白原或非蛋白原氨基酸。
在另一实施方式中，各氨基酸独立地选自以下l-(天然的)氨基酸构成的组：丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸，甘氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸和缬氨酸。
在另一实施方式中，各氨基酸独立地选自以下这些天然氨基酸的d-异构体构成的组：丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸，甘氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，色氨酸和缬氨酸。
在一些实施方式中，可切割单元和药物单元之间的键可以通过一种或多种酶，包括肿瘤相关的蛋白酶作酶促切割以释放出药物单元(-d)，其中，在一实施方式中，所述药物单元在释放后是体内质子化的，以提供药物(d)。
可以为特定酶，如肿瘤相关的蛋白酶的酶促切割的选择性方面对有用的可切割单元作设计和优化。在一实施方式中，可切割单元和药物单元或间隔单元之间的连接(或键)是通过组织蛋白酶b，c和d，或纤溶酶蛋白酶(plasminprotease)催化切割。
在某些实施方式中，可切割单元可以仅包括天然氨基酸。在其他实施方式中，可切割单元可以仅包括非天然氨基酸。在某些实施方式中，可切割单元可包含连接到非天然氨基酸的天然氨基酸。在某些实施方式中，可切割单元可包含连接到天然氨基酸的d-同分异构体的天然氨基酸。
示例性可切割单元是二肽、-val-cit-、-phe-lys-或-val-ala。
在一些实施方式中，可切割单元将包含肽和包含1至12个氨基酸。在一些这样的实施方式中，肽将直接偶联到药物单元，间隔单元将不存在。在一些这样的实施方式中，延伸单元和间隔单元将不存在。在一方面中，肽是二肽。
在一些实施方式中，可切割单元-ww-由-(-aa-)1-12-或(-aa-aa-)1-6表示，其中aa在各出现处独立地选自天然或非天然氨基酸。在一方面，aa在各出现处独立地选自天然氨基酸。本领域技术人员将了解，氨基酸通常通过存在于氨基酸的官能单元(如它的羧酸或氨基末端)连接于药物单元或间隔单元。
在一些这样的方面，配体药物偶联物和药物-接头是由以下结构式表示或是其盐，其中l、lss、ltta、a'、aa、y、y'、d和p如本文描述的任何实施方式中定义，和f为从1到12的整数：
应当理解的是，虽然没有反映在上式中，这样的结构式可以如本文所教示被修饰，从而包括分支的接头，即多个药物单元可以被连接到各个稳定接头装配体。
在其它方面，可切割单元将包括葡糖醛酸苷(glucoronide)单元，优选1或2个葡糖醛酸苷单元。在一些这样的实施方式中，葡糖醛酸苷(glucuronide)单元包括糖部分(su)，通过糖苷键(-o’-)连接到自分解间隔(self-immolativespacer)：
-[su-o’-y]-。
糖苷键(-o’-)通常是β-葡萄糖醛酸酶可切割位点，例如由人，溶酶体β-葡萄糖醛酸酶可切割的键。
在一些方面，-[su-o’-y]-由下式表示：
其中，su是糖部分，-o’-表示糖苷键；各r独立地是氢，卤素，-cn，或-no2；其中，临近氮原子的波浪键表示共价连接到延伸单元或配体，和临近氧的波浪键表示共价连接至间隔单元或药物单元。在偶联到抗体之前和偶联后包括葡糖醛酸苷的示例性接头单元如下，其中，波浪线表示连接到药物单元或间隔单元，和ab表示抗体，和s表示抗体的硫原子。将理解的是，多于一个自稳定装配体可连接到各抗体：
在一些实施方式中，可切割单元本身将包含硫原子，其能够与间隔单元或药物单元的硫原子成键，以形成二硫键或受阻二硫键。二硫键的两个硫原子之间发生切割。在一些这样的实施方式中，硫原子之一从药物单元切割，条件是没有进一步释放机制，另一硫原子仍然连接于药物单元。包括具有硫原子的的可切割单元的接头单元能够与间隔单元或药物单元的硫原子成键，以形成二硫键或受阻二硫键。
示例性的接头包括，例如，下面的药物-接头，其中波浪线表示到接头单元的剩余部分的连接位点，d为美登木素生物碱药物，且ra和rb独立地选自h或甲基。
各种不同的二硫键接头是本领域已知的，可经改造适用于本发明，包括，例如，可使用下组形成的那些：sata(n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰硫乙酯)、spdp(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、spdb(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)、smpt(n-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)和spp(n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯)。(参见，例如thorpe等,1987,cancerres.47:5924-5931；wawrzynczak等,刊于《免疫偶联物：辐射治疗癌症的抗体偶联物》(immunoconjugates:antibodyconjugatesinradioimageryandtherapyofcancer)(c.w.vogel编,牛津大学出版社,1987.)；还参见美国专利号4,880,935)。
一些实施方式中，可切割接头是ph敏感的，将包括，例如，在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(如腙，缩氨基脲，氨硫脲，顺式乌头酰胺(cis-aconiticamide)，原酸酯，乙缩醛或缩酮基)，可以被使用(参见,例如,美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；dubowchik和walker,1999,pharm.therapeutics83:67-123；neville等,1989,biol.chem.264:14653-14661.)。这种接头是中性ph条件下，例如在血液中那些条件下相对稳定，但在ph值低于5.5或5.0(近似溶酶体的ph)是不稳定的。
在一些实施方式中，可切割单元将直接偶联到药物单元，间隔单元不存在，可切割单元将通过可切割肽，二硫键，或腙键连接药物单元。
间隔单元
间隔单元(-y-)，如果存在的话，连接可切割单元到药物单元或连接延伸单元到药物单元或连接自稳定接头装配体到药物单元。像延伸单元，间隔单元在存在时可以延长接头单元的框架。间隔单元可以包含多个自分解或非分解基团。在一些实施方式中，间隔单元包含一个或多个自分解基团。在此上下文中，术语“自分解基团”是指能够将两个间隔的化学部分共价连接在一起形成通常稳定的三重分子的双官能化学部分。它会自发地从第二化学部分分开，如果它到第一部分的键被可切割的话。在其他实施方式中，间隔单元不是自分解的。在这些实施方式中，部分或全部间隔单元保持连接于药物单元。
在一些实施方式中，-y-是自分解基团，并通过自分解基团的亚甲基碳原子连接到可切割单元，和通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基直接连接到药物单元。
在一些实施方式中，-yy-是p-氨基苄基醇(pab)单元，其亚苯基部分任选地被-c1-c8烃基，-o-(c1-c8烃基)，-卤素，-硝基或-氰基取代。在另一实施方式中，-yy-可以是碳酸酯基。未取代的pab单元如下：
自分解基团的其它实例包括，但不限于，芳香化合物，在电学特性上与pab基团类似，例如2-氨基咪唑基-5-甲醇衍生物(见，例如，hay等，1999，bioorg.med.chem.lett.9:2237)和其它邻或对氨基苄基缩醛。可以使用在酰胺键水解后环化的间隔物，例如取代的和未取代的4-基丁酸酰胺类(见，例如，rodrigues等，1995，chemistrybiology2：223)以及适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(参见，例如，storm等,1972,j.amer.chem.soc.94：5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(参见，例如，amsberry等人，1990,j.org.chem.55:5867)。在甘氨酸的a位被取代的含氨基药物的消除也是自分解基团的实施方式。
其它合适的间隔单元在美国专利申请号2005-0238649中描述，其公开内容通过引用并入本文。
可以与本发明组合物和方法使用的示例性的延伸单元，可切割单元和间隔单元，在wo2004010957、wo2007/038658，wo2005/12919，美国专利号6214345、7659241、7498298、7968687、8163888和美国公开号2009-0111756、2009-0018086、2009-0274713中描述，其中各个通过引用全部并入本文并用于所有目的。
在偶联物偶联到稳定单元或检测单元而非药物单元的实施方式中，任选的第二接头装配体通常不存在。在第二接头装配体存在的实施方式中，延伸单元通常是存在的，但可切割单元和间隔单元将不存在。延伸单元将扩展接头单元的框架，以在自稳定装配体和检测单元或稳定单元之间提供更远的距离。在这些方面，延伸单元能够连接自稳定接头装配体到检测单元或稳定单元。
载药量
每配体的自稳定接头的数量由p表示。在接头不是分支的实施方式中，p代表每个配体分子(如抗体)的药物-接头分子(或检测-接头或稳定-接头分子)的数量。根据上下文，p表示每个配体的自稳定接头的平均数(或在接头不是分支的实施方式中，每个配体(如抗体)的药物-接头分子(或检测-接头或稳定-接头分子)的平均数)。变量p为1-20，典型1-12，1-10和优选为1-8。在一些优选的实施方式中，当p表示每个抗体的自稳定接头的平均数时，p为约2至约5。在一些实施方式中，p为约2，约4，或约8。在一些优选的实施方式中，当p代表每个抗体的药物-接头分子的平均数时，p为约2至约5。在一些实施方式中，p为约2，约4，或约8。每个自稳定接头的d'的数量用u表示。u为从1到10。
在以偶联反应的制备中每个配体单元的药物单元平均数可以用常规方法表征，如质谱，elisa测定，hic和hplc。药物-接头-配体偶联物中p的定量分布也可以测定。在某些情况下，可以通过如反相hplc或电泳的方法实施均匀配体-药物偶联物的分离，纯化和表征，其中p是具有其他载药量的配体-药物偶联物的特定值。
自稳定接头装配体(lss或ltt)和水解率
自稳定接头装配体连接配体单元到延伸单元，如果延伸单元存在；连接配体单元到可切割单元，如果延伸单元不存在和可切割单元存在；连接配体单元到间隔单位，如果延伸单元和可切割单元不存在，和间隔单元存在；或连接配体单元到d'(例如，药物单元)，如果延伸单元、可切割单元和间隔单元不存在。在一些实施方式中，延伸单元，可切割单元，和间隔单元不存在，自稳定接头装配体将直接偶联到d'(例如，药物单元)。在其他实施方式中，一个或多个延伸单元，可切割单元，和间隔单元将存在。
可以使用水解的t1/2定量当部分配体-药物偶联物经历水解时自稳定接头的硫代琥珀酰亚胺的水解速率。t1/2水解是指在规定条件(例如，ph7.4和22℃)下，一半目标化合物水解，即经历开环的时间。在本发明的一些实施方式中，使用以下测定法和规定条件，自稳定接头单元的硫代琥珀酰亚胺的水解t1/2小于4小时，优选小于3小时，甚至更优选地，小于2小时，小于1小时，小于45分钟，小于30分钟，小于15分钟。
偶联到抗体半胱氨酸后，马来酰亚胺基药物接头的水解反应速率可以通过质谱发测定，因水解产物的分子量比未水解的偶联物大18道尔顿。人igg1的链间二硫键的还原产生轻链上单个还原半胱氨酸和重链上的三个还原半胱氨酸。然后自稳定马来酰亚胺药物-接头可以在ph7.4和22℃偶联到还原的抗体，并通过分离偶联轻和重链的反相hplc柱引入高分辨电喷雾质谱仪。因此可以检测偶联轻和重链的质量，并由标准质谱数据处理软件(如masslynx)测定峰强度。通过在一定时间范围进行一系列的注射，可以监控对应于原始未水解偶联物质量的峰的消失情况，和对应于水解偶联物质量的峰的出现情况来，检测峰强度，计算各时间点的水解偶联物的百分比。通过以时间对水解百分比绘图，生成曲线(例如，使用prism)，可以拟合为标准指数方程，其中包括用于t1/2的参数。
在一些方面中，自稳定接头将被设计成使得自稳定接头的马来酰亚胺组分在偶联到配体单元之前实质上不经历水解。
在本发明的一些实施方式中，在ph约7至约7.5(如7.4)和温度约22℃下，自稳定接头的硫代琥珀酰亚胺的水解t1/2为约5或约10分钟至约24小时，优选为约5或约10分钟至约12小时，更优选为约5或约10分钟至约5小时，更优选为约5或约10分钟至约2.5小时，甚至更优选为约5或约10分钟至约1小时，甚至更优选约5或约10分钟至约30分钟，甚至更优选为约5或约10分钟至约20分钟，甚至更优选为约10分钟至约15分钟。
在一些这样的实施方式中，其中水解t1/2如上所述，水解进行到完成。如果90％的硫代琥珀酰亚胺水解，认为实现完全水解。优选地，95％或更高，96％，97％，98％，99％或100％的水解将得以实现。在一些实施方式中，水解反应会与双内酰胺形成相竞争，也不会达到完全。在一些这样的实施方式中，至少90％的反应产物将是或者水解硫代琥珀酰亚胺配体-药物偶联物或者硫代琥珀酰亚胺配体-药物偶联物的组合物。优选至少95％或更高，96％，97％，98％，99％或100％的反应产物将是或者水解硫代配体-药物偶联物或者硫代双内酰胺配体-药物偶联物的组合物。通过检测对应原始未水解偶联物质量的峰强度、对应于水解偶联物质量的峰强度和使用峰强度的总和由终点偶合物的质谱数据计算水解百分比，以测定水解百分比和未水解百分比。
除了通过其水解t1/2和/或水解反应效率表征配体-药物偶联物，可以由配体-药物偶联物经历消除反应和药物-接头由配体单元转移到配体-药物偶联物周围存在的其它反应活性硫醇的能力来表征配体-药物偶联物的稳定性。在一些实施方式中，在以下测试和规定条件下，药物-接头将表现出没有或基本没有从配体解离。如果样本中小于40％，优选小于20％，甚至更优选小于10％，或甚至更优选小于5％或小于2％的药物-接头从配体解离，可以认为实现短语“基本没有从配体解离”。
含酶可切割接头的药物-接头从抗体的消除可以通过以下方法在离体血浆内检测。偶联物置于无菌血浆和在37℃下孵育。在孵育的开始和在从1小时至1周或更长时间不同的时间点上，取出等份样品在-80℃下冷冻。在完成时间点，样品通过a蛋白亲和树脂以捕获抗体，树脂用缓冲液洗涤，然后通过用适当的酶(如木瓜蛋白酶或蛋白酶k，对于肽基可切割接头)处理从捕获的抗体释放药物。然后可以通过标准lc-ms方法定量释放的药物，并且在各时间检测的药物量除以检测的孵育前等份样品的药物量，从而测定在各时间点偶联到抗体的药物剩余百分比。通过包括使用同位素标记的相同药物-接头制备的内标抗体-药物偶联物可以提高该检测的精度，以致从其释放的药物可以在lc-ms检测中与从测试药物-接头释放的药物因其质量差异而得以独立检测。在a蛋白捕获步骤之前立即将该同位素标记的内标抗体-药物偶联物以等量加入各样本。然后，通过常规lc-ms技术，根据内标信号成比例地定量测定从测试adc释放的药物。
用于评价马来酰亚胺药物-接头从抗体(或其他配体)消除的替代方法是在缓冲液中(如磷酸缓冲盐)，在稍微升高的ph(例如，ph值8.0)下，在大量过量的将与从母体偶联物消除的任何马来酰亚胺反应的小分子硫醇(例如，n-乙酰基-半胱氨酸，nac)存在下，孵育偶联物。可以进行lc-ms试验以检测和定量偶联到nac或母体配体-偶联物的药物-接头。在后一种情况下，配体-偶联物与非偶联配体的比例可以测定和随时间变化保持恒定，如果配体偶联物是稳定的。在实施方式部分提供其他方法。
癌症的治疗
配体-药物偶联物在抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖，引起肿瘤或癌细胞内细胞凋亡，或治疗患者癌症中是有用的。配体-药物偶联物可以相应地以多种设置用于癌症的治疗。配体-药物偶联物可以用于递送药物到肿瘤细胞或癌细胞。不被理论所束缚，在一实施方式中，配体-药物偶联物的配体单元结合癌细胞或肿瘤细胞相关抗原或与之缔合，和配体-药物偶联物可通过受体介导的内吞作用或其他内部化机制摄入(内化)肿瘤细胞或癌细胞。抗原可以附着到肿瘤细胞或癌细胞或可以是与肿瘤细胞或癌细胞相关的胞外基质蛋白。一旦进入细胞内，通过切割或非切割机制，根据接头系统的组分，药物在细胞内释放。在另一实施方式中，药物或药物单元在肿瘤细胞或癌细胞外从配位-药物偶联物切割，药物或药物单元随后进入细胞。
配体-药物偶联物可以提供偶联特异性的肿瘤或癌症药物靶向作用，从而减少药物的一般毒性。在一些实施方式中，接头单元在血液中稳定配体-药物偶联物，但是一旦进入细胞能够释放药物。
在一实施方式中，配位单元结合到肿瘤细胞或癌细胞。
在另一实施方式中，配位单元结合到肿瘤细胞或癌细胞表面上的肿瘤细胞或癌细胞抗原。
在另一实施方式中，配位单元结合到肿瘤细胞或癌细胞抗原，其是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。
配体单元对于特定肿瘤细胞或癌细胞的特异性对于检测被最有效治疗的这些肿瘤或癌症至关重要。例如，具有br96配体单元的配体-药物偶联物可以用于治疗抗原阳性癌，包括肺，乳腺，结肠，卵巢和胰腺的那些。具有抗-cd30或抗-cd70结合配体单元的配体-药物偶联物可以用于治疗血液恶性肿瘤。
可以用配体药物偶联物治疗的其他特定类型的癌症，包括，但不限于，在表1中公开的那些：
表1
实体瘤，包括但不限于：
纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，结肠直肠癌，肾癌，胰腺癌，骨癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，食管癌，胃癌，口腔癌，鼻腔癌，喉头癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆道癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，肾母细胞瘤，子宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，小细胞肺癌，膀胱癌，肺癌，上皮癌，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞癌，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，皮肤癌，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，
血液传播癌症，包括但不限于：
急性淋巴细胞白血病“all”，急性淋巴性b细胞白血病，急性淋巴细胞t-细胞白血病，急性成髓细胞性白血病“aml”，急性早幼粒细胞白血病“apl”，急性单核细胞白血病，急性红白细胞白血病(erythroleukemicleukemia)，急性巨核细胞白血病，急性髓单核细胞白血病，急性非淋巴细胞白血病，急性未分化性白血病，慢性髓细胞性白血病“cml”，慢性淋巴细胞性白血病“cll”，毛细胞白血病，多发性骨髓瘤；
急性和慢性白血病：
淋巴母细胞，骨髓性的，淋巴细胞，粒细胞，髓细胞白血病
淋巴瘤：
霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
癌症的多模式治疗
癌症，包括，但不限于，肿瘤，转移，或其它疾病或紊乱，特征是不受控制的细胞生长，可以通过配体-药物偶联物的施用治疗或抑制。
其他实施方式中，提供用于治疗癌症的方法，包括给有需要的患者施用有效量的配体-药物偶联物和化疗剂。在一实施方式中，化疗剂是采用其治疗癌症尚未发现是难治的那种。在另一实施方式中，化疗剂是采用其治疗癌症已经发现是难治的那种。配体-药物偶联物可以施用到已经接受手术治疗癌症的患者。
在一些实施方式中，患者还接受额外的治疗，如放射治疗。在特定实施方式中，配体-药物偶联物与化疗剂或放射治疗同时施用。在另一特定实施方式中，化疗剂或放射治疗在施用配位体药物偶联物之前或之后施用
化疗药物可以经一系列周期施用。化疗剂的任何一种或组合，如标准的一种或多种护理化疗剂，可以施用。
此外，提供采用配体-药物偶联物治疗癌症的方法，作为化疗或放射治疗的替代，其中已经证实或能够证实化疗或放射治疗对正治疗的患者毒性太大，例如，导致不可接受的或无法忍受的副作用。正治疗的患者可以，任选地，采用另一癌症治疗如外科手术、放射治疗或化学进行治疗，这取决于发现该治疗是可接受的，或者可以忍受的。
自身免疫疾病的治疗
配体-药物偶联物对杀伤或抑制产生自身免疫疾病的细胞的复制或对治疗自身免疫疾病是有用的。因此配体-药物偶联物可以以多种方式用于治疗患者自身免疫疾病。配体-药物偶联物可以用于递送药物至靶细胞。不被理论所束缚，在一实施方式中，配体-药物偶联物与靶细胞表面上的抗原结合，然后配体-药物偶联物通过受体介导的内吞作用纳入靶细胞内。一旦进入细胞，接头单元内的一种或多种特定肽序列被切割，导致药物或药物单元的释放。然后释放的药物或药物单元在胞液中自由移动，并诱导细胞毒性或细胞抑制活性。在另一实施方式中，在靶细胞外药物从配体-药物偶联物切割，随后药物或药物单元进入细胞。
在一实施方式中，配体单元结合至自身免疫抗原。在一个方面中，抗原在参与自身免疫病症的细胞表面上。
在另一实施方式中，配体单元结合至细胞表面上的自身免疫抗原。
在一实施方式中，配体单元结合至与该自身免疫疾病状态相关的活化淋巴细胞。
在进一步的实施方式中，配体-药物偶联物杀伤产生与特定自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞或抑制其增殖。
可用配体-药物偶联物治疗的特定类型的自身免疫性疾病包括，但不限于，th2淋巴细胞相关紊乱(如过敏性皮炎，过敏性哮喘，鼻炎，过敏性鼻炎，欧门综合征，全身性硬化症，和移植物抗宿主疾病)；th1淋巴细胞有关紊乱(如类风湿性关节炎，多发性硬化，牛皮癣，索格仑综合征，桥本氏甲状腺炎，格雷夫氏病(grave’sdisease)，原发性胆汁性肝硬化，韦格纳肉芽肿病和结核病)：活化b淋巴细胞有关的紊乱(如系统性红斑狼疮，肺出血肾炎综合征，类风湿性关节炎，和i型糖尿病)；以及表2中公开的那些。
表2
慢性活动性肝炎，阿狄森氏病，过敏性齿槽炎，过敏反应，过敏性鼻炎，alport综合征，过敏性反应(anaphlaxis)，强直性脊柱炎，抗磷脂抗体综合征，关节炎，蛔虫病，曲霉病，特应性变态反应，阿托皮炎，阿托鼻炎，白塞氏病，养鸟人肺，支气管哮喘，卡普兰综合征，心肌病，乳糜泻，南美锥虫病，慢性肾小球肾炎，科根综合征，冷凝集素病，先天性风疹感染，crest综合征，克罗恩病，冷球蛋白血症，库欣综合征，皮肌炎，盘状红斑狼疮，德雷斯勒综合症，伊顿-兰伯特综合征，埃可病毒感染，脑脊髓炎，内分泌性眼病，eb病毒感染，马肺气肿，红斑狼疮，埃文氏综合征，费尔蒂综合征，纤维肌痛，富克睫状体炎，胃萎缩，胃肠过敏症，巨细胞动脉炎，肾小球性肾炎，肺出血肾炎综合征，移植物抗宿主病，格拉夫病，格林巴利病，桥本氏甲状腺炎，溶血性贫血，过敏性紫癜，特发性肾上腺萎缩，特发性肺纤维化(fibritis)，iga肾病，炎性肠病，胰岛素依赖型糖尿病，幼年型关节炎，幼年型糖尿病(i型)，兰伯特-伊顿综合征，蹄叶炎，扁平苔藓，狼疮样肝炎，狼疮，淋巴球减少症，美尼尔氏病，混合性结缔组织病，多发性硬化，重症肌无力，恶性贫血，多腺体综合征，早老性痴呆症，原发性丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，牛皮癣，银屑病关节炎，雷诺氏现象，复发性流产，瑞特综合征，风湿热，类风湿性关节炎，萨特(sampter)综合征，血吸虫病，施密特综合征，硬皮病，舒尔曼综合征，索格仑综合征，僵人综合征，交感性眼炎，全身红斑狼疮，多发性大动脉炎，颞动脉炎，甲状腺炎，血小板减少症，甲状腺功能亢进，中毒性表皮坏死松解症，b型胰岛素抵抗，i型糖尿病，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，白癜风，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，韦格纳肉芽肿病。
自身免疫疾病的多-药物治疗
也公开用于治疗自身免疫疾病的方法，包括对需要的患者施用有效量的配体-药物偶联物和另一种已知的治疗自身免疫疾病的治疗剂。
感染性疾病的治疗
配体-药物偶联物可杀伤产生感染性疾病的细胞或抑制其增殖或用于治疗感染性疾病。因此配体-药物偶联物可以以多种方式用于治疗患者感染性疾病。配体-药物偶联物可以用于递送药物至靶细胞。在一实施方式中，配体单元结合于感染性疾病的细胞。
在一实施方式中，偶联物杀死产生特定感染性疾病的细胞或抑制其增殖。
可以采用配体-药物偶联物治疗的特定类型的感染性疾病包括，但不限于，表3中公开的那些。
表3
细菌性疾病：
白喉，百日咳，隐性菌血症，尿路感染，肠胃炎，蜂窝组织炎，会厌炎，气管炎，腺样体肥大，咽后脓肿，脓疱病，臁疮，肺炎，心内膜炎，化脓性关节炎，肺炎球菌病，腹膜炎，菌血症(bactermia)，脑膜炎，急性化脓性脑膜炎，尿道炎，宫颈炎，直肠炎，咽炎，输卵管炎，附睾炎，淋病，梅毒，李斯特菌病，炭疽，诺卡氏菌病，沙门氏菌，伤寒，痢疾，结膜炎，鼻窦炎，布氏杆菌病，兔热病(tullaremia)，霍乱，腺鼠疫，破伤风，坏死性肠炎，放线菌病，混合厌氧菌感染，梅毒，回归热，钩端螺旋体病，莱姆病，鼠咬热，肺结核，淋巴结炎，麻风病，衣原体，衣原体肺炎，沙眼，包涵体性结膜炎
全身性真菌病：
组织胞浆菌病(histoplamosis)，球孢子菌病(coccidiodomycosis)，芽生菌病，孢子丝菌病，球菌病(cryptococcsis)，全身性念珠菌病，曲霉菌病，毛霉菌病，足分支菌病(mycetoma)，产色真菌病(chromomycosis)
立克次体病：
斑疹伤寒症，落基山斑疹热，埃立克体病，东方蜱传立克次体病，立克次氏体痘(rickettsialpox)，q热，巴尔通氏体病(bartonellosis)
寄生虫病：
疟疾，巴贝虫病，非洲昏睡病，南美锥虫病，利什曼病，黑热病(dum-dumfever)，弓形体病，脑膜脑炎，角膜炎，阿米巴病(entamebiasis)，贾第虫病，隐孢子虫病(cryptosporidiasis)，等孢子球虫病(isosporiasis)，环孢子虫病(cyclosporiasis)，微孢子虫病，蛔虫病，鞭虫感染，钩虫感染，蛲虫感染，眼幼虫移行症，旋毛虫病，几内亚线虫病，淋巴丝虫病，罗阿丝虫病，河盲症，犬心丝虫感染，血吸虫病，游泳者发痒，东方肺吸虫，东方肝吸虫，肝片吸虫病，姜片虫病，后睾吸虫病，绦虫感染，棘球蚴病，泡状棘球蚴病
病毒病：
麻疹，亚急性硬化性全脑炎，普通感冒，流行性腮腺炎，风疹，玫瑰疹，第五病，水痘，呼吸道合胞病毒感染，臀部，细支气管炎，传染性单核细胞增多症，脊髓灰质炎，疹性咽峡炎，手足口病，博恩霍尔姆疾病，生殖器疱疹，生殖器疣，无菌性脑膜炎，心肌炎，心包炎，胃肠炎，获得性免疫缺陷综合征(aids)，人类免疫缺陷病毒(hiv)，瑞氏综合征，川崎症，流行性感冒，支气管炎，病毒性“行走”肺炎，急性发热性呼吸系统疾病，急性咽结膜发热(acutepharyngoconjunctivalfever)，流行性角结膜炎，单纯疱疹病毒1(hsv-1)，单纯疱疹病毒2(hsv-2)，带状疱疹，巨细胞包涵体病，狂犬病，进行性多灶性白质脑病，库鲁病，致死性家族失眠症，克雅氏病，gss氏病(gerstmann-straussler-scheinkerdisease)，热带痉挛性截瘫，西方马脑炎，加利福尼亚脑炎，圣路易斯脑炎，黄热病，登革热，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，拉沙热，出血热，汉坦病毒肺综合症(hantviruspulmonarysyndrome)，马尔堡病毒感染，埃博拉病毒感染，天花
感染性疾病的多-药物治疗
公开用于治疗感染性疾病的方法，包括为需要它们的患者施用配体-药物偶联物和另一种作为抗感染性疾病剂的治疗剂。
组合物和给药方法
本发明提供药物组合物，包含本文描述的配体-药物偶联物和药学上可接受的载体。配体-药物偶联物可以是任何形式的，其允许将化合物施用于患者以便治疗与配体单元结合的抗原表达相关的疾病。例如，偶联物可以是液体或固体形式。优选的给药途径是肠胃外。肠胃外给药包括皮下注射，静脉注射，肌肉注射，胸骨内注射或输注技术。在一个方面，组合物是肠胃外给药。在一个方面中，化合物是静脉内给药。
本发明还提供包含本文所述的配体-官能化试剂偶联物和药学上可接受的载体的药物组合物。配体-药物偶联物可以是任何形式的，其允许该化合物为治疗紊乱或为诊断目的施用于患者。
药物组合物可以被配制，以便为患者施用组合物后允许化合物是生物可利用的。组合物可以采取一种或多种剂量单位形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位。
用于制备药物组合物的材料在用量内可以是无毒的。对于本领域普通技术人员来说这将是显而易见的，药物组合物内一种或多种活性成分的最佳剂量将取决于多种因素。相关因素包括，但不限于，动物的种类(例如，人)，化合物的具体形式，给药方式，和使用的组合物。
组合物可以是，例如，液体形式。通过注射液体可以用于输送。在通过注射施用的组合物中，也可以包括一种或多种表面活性剂，防腐剂，润湿剂，分散剂，助悬剂，缓冲液，稳定剂和等渗剂。
液体组合物，无论它们是溶液，悬浮液，或其它类似的形式，还可以包括一种或多种以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水，盐水溶液，优选生理盐水，林格氏溶液，等渗氯化钠；不挥发性油，例如可作为溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油，环糊精，丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苄醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如氨基酸，醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐；去污剂，例如非离子表面活性剂，多元醇；和用于调节渗透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。非肠道组合物可封装在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量药瓶内。生理盐水是典型的辅助剂。可注射组合物优选是无菌的。
有效治疗特定紊乱或病症的偶联物的量将取决于紊乱或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。此外，体外或体内试验可以任选用来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量也将取决于给药途径，以及疾病或紊乱的严重性，并应根据医生的判断和各病人的情况决定。
组合物包含有效量的化合物，以获得合适的剂量。通常，该量为组合物重量的至少约0.01％的化合物。
对于静脉内给药，组合物可以包括每千克动物体重约0.01到约100毫克的配体-药物偶联物。在一个方面，组合物可以包括每千克动物体重约1到约100毫克的配体-药物偶联物。在另一个方面，施用的量将在约0.1至约25毫克/千克体重的化合物的范围内。
一般地，施用给患者的化合物的剂量通常为约0.01毫克/千克至约100毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，施用给患者的剂量为约0.01毫克/千克至约15毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，施用给患者的剂量为约0.1毫克/千克至约15毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，施用给患者的剂量为约0.1毫克/千克至约20毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，施用给患者的剂量为约0.1毫克/千克至约5毫克/千克，或约0.1毫克/千克至约10毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，给药剂量为约1毫克/千克至约15毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，给药剂量为约1毫克/千克至约10毫克/千克患者体重。在一些实施方式中，治疗周期给药剂量为约0.1至约4毫克/千克，甚至更优选为0.1-3.2毫克/千克，或甚至更优选为0.1-2.7毫克/千克患者体重。
配体-功能剂偶联物，例如，配体-药物偶联物，可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注(bolusinjection)，通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜)吸收。给药可以是全身或局部。各种递送系统是已知的，例如，包封在脂质体，微粒，微胶囊，胶囊内，并且可用于施用化合物。在某些实施方式中，多于一种化合物或组合物施用于患者。
术语“载体”指与化合物一同施用的稀释剂，辅助剂或赋形剂。此类药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的那些，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油。载体可以是盐水，阿拉伯树胶，明胶，淀粉糊，滑石，角蛋白，胶体二氧化硅，尿素。另外，可以使用辅剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂和着色剂。在一实施方式中，当施用于患者时，化合物或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当化合物静脉内给药时，水是典型的载体。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，如淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇。如果需要，本发明组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。
在实施方式中，根据适用于静脉内给药至动物，特别是人类的药物组合物的常规程序配制偶联物。通常，用于静脉内给药的载体或赋形剂是无菌等渗水性缓冲液。在必要时，该组合物还可以包括增溶剂。用于静脉内给药的组合物可以任选地包含局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，或者单独或者混合一起以单位剂量形式应用组分，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，置于密封的容器，如指示活性试剂量的安瓿或容器(sachette)。偶联物通过输注给药时，它可以被分散，例如，用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶。偶联物通过注射给药时，可以提供安瓿装无菌注射用水或盐水，使得成分可以在施用前进行混合。
药物组合物一般配制成无菌，基本上等渗并完全符合美国食品和药物管理局的全部药品生产质量管理规范(gmp)规定。
本发明药物组合物包含本发明的配体药物偶联物和药学上可接受的载体。在一些优选的实施方式中，存在于药物组合物中的所有或基本上所有，或50％以上的药物偶联物包括水解的硫代琥珀酰亚胺。在一些优选的实施方式中，存在于药物组合物中的多于55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的配体药物偶联物包括水解的硫代琥珀酰亚胺。
制备配体药物偶联物的方法
在另一个方面，本发明提供了制备包括自稳定接头的配体-药物偶联物或配体-功能剂的方法。
在一些实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供如本文所述的药物-接头或接头单元，偶联所述药物-接头或接头单元到配体单元的巯基从而形成偶联物，使所得偶联物经过水解反应以形成包括硫代水解琥珀酰亚胺的配体-药物偶联物。
可以通过调节药物-接头偶联到配体后的反应条件，例如，通过调节ph值或温度来控制硫代琥珀酰亚胺水解速率。在本发明的一些实施方式中，所有的，基本上所有的，或至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或者甚至95％的硫代琥珀酰亚胺不用调控反应条件是水解的，即，水解反应在与偶联反应相同的反应条件下发生。在一些实施方式中，所有的，基本上所有的，或至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或甚至95％的硫代琥珀酰亚胺在偶联后水解20分钟-4小时，优选偶联后水解20分钟至2小时。在示例性实施方式中，偶联条件是ph值为约7.4和温度约为22℃。
在一些实施方式中，用于制备配体-药物偶联物的方法包括以下步骤：提供包括自稳定接头的药物-接头或接头单元；偶联所述药物-接头或接头单元到配体的巯基从而形成包括非水解的硫代琥珀酰亚胺的配体-药物偶联物；使非水解的硫代琥珀酰亚胺经历水解反应，其中所有的，基本上所有的，或至少50％，60％，70％，80％或甚至85％的琥珀酰亚胺在偶联后水解10分钟到4小时。在一些实施方式中，所有的，基本上所有的，或至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或者甚至95％的琥珀酰亚胺在偶联后水解10分钟，20分钟，40分钟，60分钟，90分钟或120分钟。在一些实施方式中，水解反应在与偶联反应相同的反应条件发生。在示例性实施方式中，偶联条件是ph值为约7.4和温度约为22℃。
合成自稳定接头的方法
本发明特别提供自稳定接头。制备自稳定接头单元的方法包含在本发明范围内。
通常由相应的胺经伯胺与顺丁烯二酸酐反应，最后进行马来酰胺酸环化脱水制备马来酰亚胺化合物。制备马来酰亚胺化合物的总体方案如以下图示所示：
为制备在原料胺的侧链内包含碱性基团的马来酰亚胺，如果需要，该碱性基团应该被保护。合适的保护基团应该是在马来酰亚胺制备条件下稳定的，但应该是在马来酰亚胺存在后可去除的。合适的保护基团包括，但不限于，酸不稳定的保护基团。“boc”保护基是优选的保护基之一。
马来酰亚胺制备的第一步骤，马来酰胺酸的形成是很容易的，并且通常可以通过将胺缓慢加入含有化学计量过量的马来酸酐的悬浮液中以良好的收率实现。
第二个步骤，马来酰胺酸的环化脱水，可以以多个本领域技术人员已知的方式实现。例如，化学脱水剂的使用已是用于实现这个步骤的好的既定方法。碳二亚胺结合异构醇，例如：dcc/hobt，已被用来实施酰胺酸环化脱水为马来酰亚胺。
在酸催化剂存在下用共沸蒸馏的热环化脱水是生成马来酰亚胺的另一种已知方法。使用共沸溶剂允许有效地在水副产物形成时将其除去，从而驱动反应获得马来酰亚胺。合适的共沸溶剂包括环己烷，苯，甲苯，乙基苯，均三甲苯等。甲苯被认为是最适合的，因为它在大气压下于110℃沸腾。低于200℃的沸腾温度是优选的，以最大程度降低马来酰胺酸可能的热异构化，以获得热力学更稳定的反式(富马酰胺酸)结构。
使用极性非质子共溶剂可以有利于总产率的改善，以及减少环化脱水的时间。包括二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，乙腈，n-甲基吡咯烷酮，二甲基亚砜，和磺酸酯的几种极性非质子溶剂，已宣称是有用的。最有用的极性非质子溶剂是二甲基甲酰胺。
根据美国专利us5973166，掺入某些胺盐代替非质子溶剂可以进一步利于马来酰亚胺形成。
以马来酸酐和合适的胺为原料不使用溶剂的一步微波辅助马来酰亚胺的合成也已报导(h.n.borah,等,j.chem.research(s),1998,272-272)。
使用水作为马来酰亚胺形成的溶剂的实施例已由v.ondrus等在arkivoc,2001(v)
60-67中报道。
或者，从马来酰亚胺和适当的醇，使用例如，下式示出的光延反应条件(m.a.walker,tetrahedronletters,1994,v.35,n5,第665-668页)可以生成马来酰亚胺化合物。
使用本文描述的教导结合本领域已知方法，本发明的自稳定接头装配体连接到延伸单元，可切割单元，间隔单元，或药物单元。使用本文描述的教导结合本领域已知方法，接头和药物-接头偶联到配体单元。例如，对于偶联到链间二硫键，可以用还原剂如二硫苏糖醇(dtt)处理抗体，以还原一些或全部链间二硫半胱氨酸残基从而形成高亲核半胱氨酸硫醇基团。完全还原的抗体或部分还原的抗体随后可以偶联到接头单元的马来酰亚胺。在示例性实施方式中，偶联条件是温和的，ph约7，温度约22℃。
中间体
本发明提供中间体，用于在制备自稳定接头。中间体包括以下结构，其中t，c，r11和r12如前所述：
单硫代或二硫代马来酰亚胺或琥珀酰亚胺自稳定接头
除了设计自稳定接头用于提高单硫代琥珀酰亚胺的水解速率，自稳定接头也可用于提高单硫代马来酰亚胺，二硫代马来酰亚胺或二硫代琥珀酰亚胺的水解速率。
鉴于上述情况，本发明在一组实施方式中提供配体-官能试剂偶联物，包含配体单元和选自药物单元、检测单元或稳定单元的至少一种官能试剂，其中，配体单元和各官能试剂通过自稳定接头装配体连接，所述自稳定接头装配体包括琥珀酰亚胺环、马来酰亚胺环、水解琥珀酰亚胺环或水解马来酰亚胺环，其中，所述琥珀酰亚胺环、马来酰亚胺环、水解琥珀酰亚胺环或水解马来酰亚胺环通过一个或两个硫醚键直接偶联到所述配体单元；和碱性部分和吸电子基，可操作地连接从而与缺乏自稳定接头装配体的配体-官能试剂偶联物相比，稳定血浆内的所述偶联物(即通过提高琥珀酰亚胺或马来酰亚胺环水解速率)。在一些方面，定位吸电子基以增加琥珀酰亚胺或马来酰亚胺的亲电性使它与水更具反应性，和定位碱性部分以协助琥珀酰亚胺或马来酰亚胺环的水解(例如，通过分子内碱性部分催化机理)。
在一些实施方式中，配体-官能试剂由式iv或iva表示：
或其盐(如药学上可接受的盐)；
其中，
l是配体单元，
ll是配体单元，可以存在或不存在，其中l和ll可以是相同或不同的配体单元；
d'是药物单元、检测单元或稳定单位；
lo是任选的第二接头装配体；
m2是马来酰亚胺环、水解马来酰亚胺、琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺，通过硫醚键偶联到l或ll中的至少一个；和
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以为c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地包括适用于连接到lo、a、w、y或d'的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；
下标p为1至20；
-w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；
-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1；
-a-为任选的延伸单元，
-a'-为a末端的任选延伸单元组分；
a'为0或1；和
u为1-20，条件是当u为2-20，a存在；当u为1时，a可以存在或不存在。
l、he和bu、lo、a、w和y具有为配体-药物偶联物提供的含义。此外，对于圆圈、l、he、bu、lo、a、w和y各特别例举的选择的实施方式同样适用于这些偶联物。l和ll可以是不同或相同的配体单元。在实施方式中，l和ll是相同的配体单元，琥珀酰亚胺或马来酰亚胺可以在配体单元的相同或不同的多肽链上偶联到配体单元。
在一些方面，当r是1时，he不包括羰基(即，c(＝o))。
在一些方面，m+q+r是0、1或2。
在一些方面，r是0。
在一些方面，配体-官能试剂偶联物由式iv或iva或其盐表示，其中r和m为0，q是1。
在一些方面，配体官能试剂偶联物由式iv或iva或其盐表示，其中圆圈表示支架，为c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，r为0，m+q的总和为1。在一些这样的方面，支架为c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的。
在一些方面，配体官能试剂偶联物由式iv或iva或其盐表示，其中圆圈表示支架，为c1-8亚烃基或c1-8杂亚烃基(优选c1-4亚烃基或c1-4杂亚烃基)，m和r是0。在一些这样的方面中，支架为c1-3亚烃基或c1-3杂亚烃基。在一些这样的方面，亚烃基是直链或支链的。
在一些方面，配体官能试剂偶联物由式iv或iva或其盐表示，其中圆圈表示支架，为c1、c2、c3或c4直链或支链亚烃基，r是0，m+q的总和为1。
在一些方面，配体官能试剂偶联物由式iv或iva或其盐表示，其中圆圈表示支架，为c1、c2、c3或c4直链或支链亚烃基，m和r是0。
在一些方面，m和r是0，
在一些方面中，在碱性单元的碱性部分和马来酰亚胺或琥珀酰亚胺(水解或非水解)的氮原子之间具有不少于2个、不多于6个居间原子，和在吸电子基和马来酰亚胺或琥珀酰亚胺环(水解或非水解)的氮原子之间具有不多于5个原子、不多于4个原子、不多于3个原子或不多于2个居间原子。
在一些方面，m2为琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺和ll是存在的。在一些方面，m2为琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺和ll是不存在的。在一些方面，m2为马来酰亚胺环或水解马来酰亚胺和ll是存在的。在一些方面，m2为马来酰亚胺环或水解马来酰亚胺和ll是不存在的。在一些方面，当m2为马来酰亚胺环或水解马来酰亚胺时，ll是存在或不存在的，和当m2为琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺时，ll是存在的。在各自的这些实施方式中，当l和ll存在，l和ll可以是相同的配体单元或不同的配体单元。在一些实施方式中，其中，l和ll存在是相同的配体单元，马来酰亚胺或琥珀酰亚胺可以在配体单元的相同或不同多肽链上偶联到配体单元。
在各自的这些实施方式中，亚烃基和杂亚烃基可以是直的或分支的。在一些方面，亚烃基或杂亚烃基链将是直链。在其他方面，它将是分支的。
在各自的这些实施方式中，p可以为1-20，优选1-12，甚至更优选1-10或1-8。
|在一些方面，其中支架本身直接连接到任选的第二接头装配体或d'，(例如，在选定的实施方式中，当q是0或者当q是0和r是0)，支架将包括适合连接到任选的第二接头装配体或d'的反应位点。
在一些方面，其中支架本身直接连接到任选的第二接头装配体或d'，(例如，在选定的实施方式中，当q是0或者当q是0和r是0)，支架将包括适合连接到a或d'的反应位点。
马来酰亚胺环可经由一个或两个硫醚键偶联到配体单元，如以下示出，以非水解和水解两种形式，琥珀酰亚胺环可经由两个硫醚键偶联到配体单元，如以下示出，以非水解和水解两种形式，其中波浪线表示到接头偶联物或接头-官能试剂偶联物的剩余部分的连接位点：
在实施方式中，其中马来酰亚胺环，水解马来酰亚胺，琥珀酰亚胺环，或水解琥珀酰亚胺通过两个硫醚键偶联到配体，p典型地为1到10，或1至8，或1至4，和马来酰亚胺或琥珀酰亚胺可以偶联到配体的相同或不同的多肽链上。在一些方面，配体是抗体。在其它方面中，配体是非抗体蛋白。
具有支链的或非支链的接头的官能试剂-接头偶联物可以由下式表示：
或其盐(如药学上可接受的盐)
其中，
d'是药物单元、检测单元或稳定单元；
lo是任选的第二接头装配体，是存在的；
q和z是氢或卤素，其中q和z中至少一个是卤素；
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以为c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地，包括适合用于连接到lo、a、w、y或d'的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；
w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；
-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1；
a为任选的延伸单元，
a'为a末端任选的延伸单元组分；
a'为0或1；和
u为1-20，条件是当u为2-20，a存在；当u为1时，a可以存在或不存在。
在一些方面，卤素是溴。
he和bu，lo，a，w和y具有为药物-接头偶联物提供的含义。此外，对于圆圈、he、bu、lo、a、w和y各特别例举的选择的实施方式同样适用于这些偶联物。
在一些方面，m和r是0，
配体-接头偶联具有支链或非支链接头，可以由下式表示：
或其盐(如药学上可接受的盐)；
其中，
l是配体单元；
ll是配体单元，可以存在或不存在，其中l和ll可以是相同或不同的配体单元；
rg是lo或
lo是存在的任选的第二接头装配体；和
m2是马来酰亚胺环、水解马来酰亚胺、琥珀酰亚胺环或水解琥珀酰亚胺，通过硫醚键偶联到l或ll中的至少一个；和
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以为c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地，包括适合用于连接到lo、a、w、y或fa的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；
下标p为1至20；
w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；
-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1；
a为任选的延伸单元，
a'为a末端任选的延伸单元组分；
a'为0或1；和
u为1-20，条件是当u为2-20，a存在；当u为1时，a可以存在或不存在。
l，he和bu，lo，a，w和y具有为配体-药物偶联物提供的含义。此外，对于圆圈、l、he、bu、lo、a、w和y各特别例举的选择的实施方式同样适用于这些偶联物。
在一些方面，m和r是0，
支链或非支链接头可以由下式表示：
或其盐(如药学上可接受的盐)；
其中，
rg是lo或
lo是存在的任选的第二接头装配体；
q和z是氢或卤素，其中q和z中至少一个是卤素；
bu是碱性单元；
he是包括吸电子基的水解强化剂；
圆圈表示支架，可以为c1-8亚烃基、c1-8杂亚烃基、c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基，和任选地，包括适合用于连接到lo、a、w、y或rg的反应位点；
下标m、q和r各自为0或1，且m+q+r的总和为0、1或2，条件是当m+q+r为0时，支架是c6-10亚芳基或c4-10杂亚芳基；
w-为任选的可切割单元，下标w'为0或1；
-y-为任选的间隔单元，下标y'为0或1；
a为任选的延伸单元，
a'为a末端任选的延伸单元组分；
a'为0或1；和
u为1-20，条件是当u为2-20，a存在；当u为1时，a可以存在或不存在。
he和bu，lo，a，w和y具有为配体-药物偶联物提供的含义。此外，对于圆圈、he、bu、lo、a、w和y各特别例举的选择的实施方式同样适用于这些偶联物。
在一些方面，r和m是0，
制备单-或二硫代卤代马来酰亚胺以及二硫代琥珀酰亚胺的方法和偶联它们到配体的方法是本领域已知的，参见例如，ryan等,chem.commun.,2011,47,5452-5454和smith等,j.am.chem.soc.2010,132(6),1960-1965。
实施例
实施例1-代表性自稳定组分的合成
马来酰基-赖氨酸(boc)oh(maleyl-lysine(boc)oh)
在50ml的圆底烧瓶中，h-lys(boc)-oh(246毫克，1毫摩尔)和马来酸酐(98毫克，1毫摩尔)溶于1毫升(4体积)乙酸中，溶液在室温下搅拌3小时。在旋转蒸发仪上将反应混合物浓缩至油状物，并且通过加入约10毫升二氯甲烷沉淀产物。通过真空过滤收集沉淀物，用二氯甲烷洗涤，并在真空烘箱中干燥过夜。回收270毫克产物，为白色粉末(85％产率)。
马来酰基-赖氨酸(boc)-oh(maleoyl-lysine(boc)-oh)
马来基-lys(boc)-oh(100毫克，0.29毫摩尔)经分子筛悬浮于配有冷凝器的50毫升圆底烧瓶内的甲苯(3ml)和三乙胺(224微升)中。加入dma(～150微升)以助溶解。溶液加热至125℃回流4小时，之后lcms检测反应完成。旋转蒸发将反应混合物浓缩至干，再溶解于dmso中，并采用制备型hplc进行纯化。分离56毫克产物，为白色粉末。(60％产率)
马来酰基-dpr(boc)oh
以与马来酰基-赖氨酸(boc)oh相同的方式制备马来酰基-dpr(boc)oh。(503毫克，67％)
马来酰基-dpr(boc)-oh
以与马来酰基-lys(boc)相同的方式制备马来酰基-dpr(boc)-oh。(340毫克，71％)
马来酰基-二甲基赖氨酸
以与马来酰基-lys(boc)-oh相同的方式制备马来酰基-二甲基赖氨酸，不同之处在于添加二氯甲烷后产物不沉淀。反而，采用1:1二氯甲烷/己烷共蒸发油状物，直到获得白色泡沫，真空干燥过夜。(109毫克，99％)
马来酰基-二甲基赖氨酸
在10毫升圆底烧瓶中，将马来酰基-二甲基赖氨酸(100毫克)溶解在乙酸(1ml)中并回流4小时。4小时后，在旋转蒸发仪上将反应混合物浓缩至干，并在高真空下干燥得到白色泡沫状物。粗品nmr基于6.9ppm处单峰比例显示约80％的转化和来自原料的烯烃质子。
实施例2-mdpr-val-cit-pab-mmae的合成
通过使用肽偶联标准方法将boc保护的mdpr偶联到val-cit-pab-mmae制备mdpr-val-cit-pab-mmae。在最后步骤去除boc基团。
流程：
fmoc-val-cit-pab-mmae的制备
将mmae(5.34克，6.94毫摩尔)、fmoc-val-cit-pab-oco-pnp(5.0克，6.94毫摩尔)和hobt(1.4毫摩尔)加入到充以氮气的250毫升圆底烧瓶中并溶解在15毫升dma中。然后加入dipea(2.44毫升，14毫摩尔)，并在惰性气氛下于室温下搅拌溶液过夜。通过制备型hplc分离产物，使用线性梯度从30％的mecn(0.05％tfa)至100％mecn(0.05％tfa)，经40分钟。在旋转蒸发仪上将含产物的级分浓缩，得到白色粉末，得到3.2克(34％)。
val-cit-pab-mmae的制备
在室温下搅拌3.2克fmoc-val-cit-pab-mmae于7毫升dmf和7毫升二乙胺中的溶液3小时。然后在旋转蒸发仪上将反应混合物浓缩至粘稠的油状物。产物于乙醚(100毫升)中沉淀并过滤得到2.0克产物，为灰白色粉末，其在使用时无需进一步纯化。
mdpr(boc)val-cit-pab-mmae的制备
在50毫升圆底烧瓶中，将mdpr(boc)-oh(25毫克，0.089毫摩尔)、val-cit-pab-mmae(100毫克，0.089毫摩尔和hatu(41毫克，0.107毫摩尔)溶于2毫升dmf。加入dipea(34微升)，在室温下搅拌溶液1小时。用1毫升dmso稀释反应混合物，由制备型hplc分离产物。(70毫克，56％)
mdpr-val-cit-pab-mmae的制备
将上述物质溶解于2毫升10％tfa/二氯甲烷，并在室温下搅拌1小时。反应混合物浓缩至干，重新溶解于1毫升dmso中，并通过制备型hplc纯化。(56毫克，86％)
实施例3-监测硫代琥珀酰亚胺水解
可通过电喷雾质谱监测自稳定生物偶联物的硫代琥珀酰亚胺水解，因加入水到偶联物导致偶联物可观察的分子量增加18道尔顿。当通过完全还原人igg1抗体的链间二硫键和偶联马来酰亚胺到所得半胱氨酸制备偶联物时，抗体的各轻链将包含单一的马来酰亚胺修饰和各重链将包含三个马来酰亚胺修饰(参见图1，上图)。获得的硫代琥珀酰亚胺完全水解后，轻链的质量因此将增加18道尔顿，而重链的质量将增加54道尔顿。这示于图1(底部)，其中本发明的自稳定马来酰亚胺药物-接头(mdpr-val-cit-pab-mmae，分子量1289da)偶联以及随后水解为完全还原的抗-cd30抗体cac10。重链上单一n连接糖基化位点的存在导致在未偶联的抗体内观察到的质量不均匀性。
实施例4–监测t1/2水解
通过监测自稳定生物偶联物(mdpr-val-cit-pab-mmae)质谱上一定时间范围的非水解和水解峰强度，可以评价水解动力学特性。这通过绘制各时间点已经水解的全部物质的百分比与时间的关系(图2，顶部)完成。然后将这些数据拟合成指数方程：
y＝ymax×(1-e(-kt))
其中y是在t时观察到的水解百分率，ymax是渐近最大％水解，而k是水解速率常数。水解反应半衰期定义为
t1/2＝in(2)/k。
当在还原higgl抗体的轻链进行这个过程中，分析是相当简单的，因为每个轻链只有一个偶联位点，且反应是简单的进程，从未水解的物质到水解物质，有18道尔顿质量变化。对重链进行这种分析是复杂的，事实是一共有三个偶联位点，随偶联物进行水解产生+18，+36，和+54道尔顿的一系列峰。重链的分析因多个糖型的存在进一步复杂化。仅通过评价由最丰富糖型(从54195da到54250da转变)产生的峰和假设这些峰是全部重链糖型的合理替代进行图2中的分析。图2中明显看出，对于轻链和重链所观察到的动力学特征很相似。由于这个原因，并因为以上提及的重链上定量水解速率增加的复杂性，由轻链水解的评估来确定表征偶联到抗体的自稳定马来酰亚胺水解速率的大部分数据。
这种方法的一个限制是电喷雾离子化过程中易于在所观察到的峰内产生小部分钠加合物(在用于产生图2中数据的条件下，约10％)，其具有大于母体质量22道尔顿的观察质量。许多质谱仪没有足够高的分辨率，随着总分子量超过25000道尔顿，无法分辨这种+22质量与蛋白水解造成的+18质量。因此，在水解度低的早期时间点时，约20道尔顿的峰的出现是不容易通过实验分离的这两种效应的组合。因此，在最早时间点水解产物的百分比的估计可能是过高估计，但这种效应的幅度随着反应朝向完成进行而减小。
实施例5-评估自稳定接头装配体的碱性基团和马来酰亚胺之间的间隔
假设临近马来酰亚胺毗邻的碱性氨基的存在会加速用那些马来酰亚胺制备的硫代琥珀酰亚胺的水解，从而导致稳定的生物偶联物。马来酰亚胺和碱性氨基之间的距离被认为是设计这样的自稳定单元的重要参数。为评估该间距的作用，制备具有以下通式结构的一系列马来酰亚胺：
其中x变化范围为1至4。然后在ph8和37℃这些马来酰亚胺结合到完全还原的igg1并通过电喷雾质谱法立即监测以确定水解速率。碱性基团和马来酰亚胺之间的距离与水解速率成反比--即，距离越大，水解越慢。这个结果说明将碱性氨基定位于靠近马来酰亚胺导致采用马来酰亚胺制备的生物偶联物的琥珀酰亚胺环的水解速率增加。然而，即使具有本文测试的最短间隔(x＝1)，抗体偶联物必须在ph8和37℃下保持约5小时，以达到完全水解(约5个半衰期)。抗体或其它蛋白长期暴露于该条件可能会导致共价修饰和错误折叠事件，因此寻找具有甚至更快水解速率的马来酰亚胺。
为了制备具有更快水解速率的生物偶联物，制备具有以下通式的一系列马来酰亚胺：
其中x＝1-4和r＝val-cit-pab-mmae。然后在ph8和37℃将这些马来酰亚胺偶联至完全还原的人igg1，并通过电喷雾质谱立即监测以确定水解速率。如图4(上图)所示，碱性基团和一系列结构相关化合物中的马来酰亚胺之间的距离对水解反应进程产生深远的影响。如在前实施例中，马来酰亚胺和碱性胺之间的距离越短，水解越快。因为已知碱性条件(即高ph)增加马来酰亚胺和琥珀酰亚胺环水解的速率，这种效应可以认为是一般碱机理分子内催化的实施例。在这系列中，x＝2和x＝3的化合物在3小时孵育过程中没有达到完全水解，反而分别在约80％和50％(相对最大获得水解标准化的图)达到渐近。这一现象可以由竞争反应产生，诸如琥珀酰亚胺环上的伯胺的直接亲核攻击，或者可能是由于导致双相水解动力学的马来酰亚胺内的同分异构体杂质。
实施例6-水解动力学
前面的实施例说明，碱性基团对生物偶联物内琥珀酰亚胺环水解的速率的影响，取决于碱性基团与母体分子的马来酰亚胺之间的距离。然而，可以预期吸电子或供电子基的存在也将影响环水解的速率，因为这些基团将影响环羰基碳上的电子密度(因此的亲电性)。在实施例5的偶联物中，羰酰胺基团相对于环氮原子存在于α位(即在环氮和羰酰胺的羰基碳之间存在一个碳原子)。由于羰酰胺是弱吸电子基，它的存在可能影响所观察到的水解速率。为更好地理解碱性氨基和吸电子羰酰胺基团对观察到的水解速率的相对贡献，一系列马来酰亚胺在ph7.4，22℃偶联到还原的人igg抗体，并通过质谱法确定水解速率(图5)。这些马来酰亚胺在α位仅包含羰酰胺(三角形)，在β位仅包含伯胺(倒三角)，或羰酰胺和伯胺两者(圆圈)。还评价不包含接近马来酰亚胺的基团的对照马来酰亚胺，尽管它的水解缓慢以致在这些条件下没有观察到反应，没有数据被绘制。在这些条件下，包含碱性基团和吸电子基的自稳定马来酰亚胺，产生水解t1/2仅为12分钟的生物偶联物，而仅含有胺的马来酰亚胺得到t1/2为2.5小时，且仅含有羰酰胺的马来酰亚胺得到t1/2为24小时。这结果表明，碱性基团和吸电子基协同作用得到具有非常快水解动力学特性的偶联物，在所需温和条件下最方便用于制备生物偶联物。用二氨基丙酰马来酰亚胺制备的偶联物(圆圈)表现出理想的水解特征，在非常温和条件下t1/2小于15分钟，反应在约2小时内接近100％完成。
实施例7-评估自稳定接头装配体的马来酰亚胺和羰酰胺之间的间距
在以上实施例5和6中示出的采用自稳定二氨基丙酰马来酰亚胺基药物接头酸(dpr)制备的偶联物中观察到的快速和完全的琥珀酰亚胺水解表明碱性基团和吸电子基对设计的重要性。第二，采用二氨基丙酸制备异构马来酰亚胺基药物-接头以进一步评价这两组分在所得偶联物水解行为中的作用。结构命名为α-马来酰亚胺基dpr和β-马来酰亚胺基dpr，如下所示：
两种dpr马来酰亚胺具有碱性伯胺，与马来酰亚胺基氮隔开两碳原子。二者还具有吸电子羰酰胺基，但是马来酰亚胺氮与羰酰胺的距离有1到2个碳单元的不同(分别是α和β)。最后，碱性胺和羰酰胺之间的间隔也有1到2个碳单元不同(分别是β和α)。总的来说，这意味着相对于α-dpr，在β-dpr中，羰酰胺对马来酰亚胺环表现出较少的吸电子影响，但对伯胺有更多的吸电子影响。预计可通过降低马来酰亚胺的亲电性和伯胺的碱性来减缓水解速率。当这些马来酰亚胺基药物接头偶联至还原的抗体，并监测琥珀酰亚胺水解时，相对于α-dpr，β-dpr观察到低17倍的水解速率(图6)。该实施例说明碱性基团和吸电子基如何相对位置可以用来“调整”水解速率。
实施例8-15
为了评价采用自稳定药物-接头制备的adc的稳定性和药理学活性，制备自稳定马来酰亚胺基-药物-接头。这种药物-接头包含马来酰亚胺基-dpr基，通过蛋白酶可可切割的val-citpab自-分解基团(本文中称为马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae)偶联到细胞毒性剂mmae。为作比较，利用非自稳定药物-接头(本文中称为马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae)。这些试剂间唯一区别是马来酰亚胺和val-cit接头的缬氨酸基团之间的单元。可以分别使用马来酸酐、单保护的二氨基丙酸和氨基己酸制备这些药物-接头的马来酰亚胺单元。
实施例8-评价缓冲液中配体-药物偶联物的稳定性
在标准的缓冲液体系，基本没有检测到马来酰亚胺从使用硫醇-马来酰亚胺制备的生物偶联物的消除，因为消除的马来酰亚胺与硫醇很快再次发生反应，导致平衡远远偏向完整偶联物一侧。然而，将硫醇清除剂加入缓冲液创建了这样一个系统，其中，从生物偶联物消除的马来酰亚胺反而能够与清除剂反应，导致马来酰亚胺从蛋白持久的，可观察到的损失。与非稳定己酰基药物接头平行，利用自稳定二氨基丙酰(dpr)马来酰亚胺基药物接头制备的抗体-药物偶联物进行使用这种系统的实验。使用完全还原的人igg1，以每抗体8个药物制备马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae或马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae的adc。通过反相hplc在聚合plrp-s柱上确定载药量，如前(sun2005)所述。还通过电喷雾质谱法确定自稳定接头的完全琥珀酰亚胺水解。这些adc放置在150mmtris缓冲液中，ph8，2.5毫克/毫升，包含10mmn-乙酰半胱氨酸作为清除剂，并在37℃孵育2周。在孵育期间的七个时间点上，取出各adc的等份样本并在-80℃冷冻。时程完成后，通过以上反相hplc方法分析全部样本以测定药物:抗体比。该研究结果示于图7。在这些条件下，采用自稳定dpr马来酰亚胺基药物-接头制备的adc在该时程上表现出最小的药物损失(经14天，8.0-7.9药物/抗体)，而采用己酰基马来酰亚胺基药物-接头制备的adc约损失它载药量的一半(经14天，8.0-3.9药物/抗体)。
实施例9-离体血浆稳定性(反相法)
通过实施例8中描述的反相hplc法评价非人血浆内人源化adc的载药量，这可以通过采用选择性结合人fc结构域的ig选择树脂(ge医疗保健公司-gehealthcare)首先分离的adc实现。使用完全还原的人igg1，以每抗体8个药物制备马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae或马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae的adc。这些adc(0.25毫克/毫升)在无菌大鼠血浆中于37℃孵育7天。在孵育期间的七个时间点上，取出各adc的50微升等份样本并在-80℃冷冻。时程完成后，从各样本纯化adc并反相hplc分析以测定药物:抗体比。该研究结果绘制于图8。如在缓冲液中观察到的，在导致马来酰亚胺基己酰基adc损失约一半药物的条件下，采用自稳定马来酰亚胺制备的adc在鼠血浆中的孵育也导致几乎没有或没有可观察到的损失。
实施例10-离体血浆稳定性(偶联药物方法)
第二实验是用来评价大鼠和人血浆中adc的离体稳定性。使用部分还原到每抗体4硫醇水平的人igg1，以每抗体4个药物制备马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae或马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae的adc(导致adc中4药物/抗体)。这两种adc掺加入大鼠和人血浆并于37℃孵育7天。在孵育期间的七个时间点上，取出等份样本并在-80℃冷冻直到时程完成。然后从各样本分离adc，mmae从分离的adc蛋白水解释放，如前所述(sanderson2005)。然后通过lc-ms/ms定量释放的mmae并根据初始值归一化各adc(图9)。在大鼠和人血浆两者中，采用自稳定马来酰亚胺制备的adc在这些条件下几乎没有或没有损失药物，而马来酰亚胺基-己酰基adc损失约一半药物。
实施例11-体内稳定性
与以上实施例10描述，用ig选择树脂纯化后可以通过反相hplc分析检测adc在大鼠血浆中的药物:抗体比。此方法适用于大鼠体内药物动力学实验获得的样品。使用部分还原到每抗体4硫醇水平的人源化igg1，以每抗体4个药物制备马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae或马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae的adc(导致药物:抗体比为4)。如前所述(sanderson2005)，通过疏水作用色谱进一步纯化这些adc以分离出包含4药物/抗体的种类。通过静脉注射以10毫克/千克将这些adc给予s-d大鼠。在5个时间点，处死各剂量组的3只动物，将收集到的血液加工成血浆并在-80℃冷冻。研究完成后，采用以上描述的ig选择树脂方法处理全部样本，除了样本体积不同。该研究中各时间点的药物:抗体比绘制于图10。如在离体大鼠血浆内观察到的，采用自稳定马来酰亚胺制备的adc表现出体内最小的药物损失，7天后从4.1药物/抗体的初始值降至3.6药物/抗体(12％下降)。在相同的时间框架内，采用马来酰亚胺基-己酰基接头制备的adc的药物:抗体比从3.9的初始值降至1.5(61％下降)。这表明离体观察到的自稳定药物-接头增加的稳定性平移入体内状态。
实施例12-药代动力学
由于马来酰亚胺基-己酰基adc都容易通过马来酰亚胺消除发生药物损失，而自稳定马来酰亚胺adc不会，预测给予等剂量的两种adc后，抗体偶联药物暴露将较大是合理的。为了证实这一预测，使用部分还原到每抗体平均4硫醇的人igg1，以每抗体4个药物制备马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae或马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae的adc(导致药物:抗体比为4)。以2毫克/千克将这两种adc给予s-d大鼠，并在7个时间点取血液样本并加工成血浆。这些血浆样本，连同为制备校准曲线的各adc的标准品，经mab选择树脂捕获和以上实施例10描述的木瓜蛋白酶释放程序以检测抗体偶联mmae的浓度。对于采用自稳定药物-接头制备的adc来说，抗体偶联药物浓度较高，差异幅度随时间增加(数据未示)。初始抗体偶联药物浓度可叠加，反映出adc的药物:抗体比和剂量等同。但是在第一天内观察到分歧，到第3天达到2倍差异。这些较高浓度导致自稳定adc的抗体偶联药物auc比马来酰亚胺基-己酰基adc的高约40％。
实施例13-毒理学
为评价自稳定马来酰亚胺对毒理学的影响，使用部分还原到每抗体平均4硫醇的人源化igg1(未知结合到任何大鼠抗原)，以每抗体4个药物制备马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmae或马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae的adc(导致平均药物:抗体比为4)。通过静脉注射以10毫克/千克将这些adc给予雌性
实施例14-释放药物的血浆浓度
以上实施例13描述的毒理学试验还包括给药1小时和24小时后抽取血液，其连同给药后4天和7天的样本通过lc-ms/ms一同分析血浆中未偶联mmae。该分析结果表明自稳定马来酰亚胺基-dpr-val-cit-pab-mmaeadc的循环mmae的峰值浓度低于马来酰亚胺基-己酰基-val-cit-pab-mmae约2倍(数据未示)。
实施例15-异种移植物活性
为评价自稳定药物接头对adc抗肿瘤活性的影响，使用包含通过马来酰亚胺基-己酰基或自稳定马来酰亚胺基-dpr基连接到抗体的val-cit-pab-mmae细胞毒性有效载荷的药物-接头，采用抗-cd30抗体cac10制备偶联物。在两组分离的cd30+人恶性肿瘤的鼠异体移植模型中评价这些adc。在第一模型(图11)中，将karpas-299(人alcl)细胞皮下移植入雌性scid小鼠，在以三个剂量(每剂量组6只鼠)每周给药1毫克/千克之前允许肿瘤生长约250立方毫米体积。相对于未治疗组，给予马来酰亚胺-己酰基adc的全部6只鼠经历某些肿瘤生长延迟，两只动物经历部分肿瘤萎缩；但是全部肿瘤向外生长，全部组具有大肿瘤实施安乐死。自稳定adc剂量组全部六只动物经历完全反应(无可检测肿瘤)，其中在研究过程中五只动物经历持久消退，仅一只动物在研究55天时它的肿瘤恢复后处死。对于采用自稳定药物-接头制备的adc，该研究结果表现出体内抗肿瘤活性显著较高。在第二模型中，将l428(人类霍奇金淋巴瘤)细胞皮下移植入雌性nsg小鼠，在以四个剂量(每剂量组6只鼠)每四天给药1毫克/千克之前允许肿瘤生长约100立方毫米体积。两adc剂量组全部动物在治疗期间经历明显的生长延迟，但是在研究第28天后全部肿瘤开始向外生长，在马来酰亚胺基-己酰基和自稳定adc之间没有显著差异。因此，在异体移植研究中采用自稳定adc观察到的肿瘤活性的提高表现出模型依赖性。