本发明涉及药学的技术领域，具体说是艾曲波帕乙醇胺在抗结核分枝杆菌感染中的应用。
背景技术：
结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)是引起结核(tb)的致病性细菌，主要通过呼吸道传播，能够引起咳嗽、胸痛、咯血，呼吸困难等症状。健康人感染结核菌并不一定发病，只有在机体免疫力下降时才发病。世界卫生组织(who)统计表明，全世界每年发生结核病800～1000万，每年约有300万人死于结核病，是造成死亡人数最多的单一传染病。1993年who宣布“全球结核病紧急状态”，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题。
结核菌属分枝杆菌，于1882年由德国微生物学家robertkoch发现。在显微镜下，结核菌为细长稍弯曲或直的杆菌。结核分枝杆菌是专性需氧菌，生长很缓慢，在固体培养基上，结核菌增代时间为18-20h，培养时间需8天以上至8周，在大部分培养基上菌落呈粗糙型。mtb具有蜡质细胞壁，对干燥环境以及强酸强碱都具有极强的抵抗力，也不会被多种化学消毒剂渗透。结核菌实际上包括人型、牛型、鼠型和非洲型，为结核分枝杆菌复合群，其中人型、牛型和非洲型为致病菌。
结核病是一个全球性的健康问题，每年都能引起100多万人的死亡，近年来，在结核病的控制方面，由于抗生素的滥用及其联合用药，导致多种耐药菌株的出现，尤其是mtb和hiv的协同感染已被证实是致死性的。近年来，来自tb高发国家的移民、hiv携带者和社会边缘人群(如药物成瘾者和囚犯)中tb的发病率也呈上升趋势，这些现状都使我们控制结核分枝杆菌的面临严峻的挑战。所以，我们迫切的需要寻找结核分枝杆菌中的新型靶点，进而针对这些靶点开发新型的抗结核分枝的药物。结核分枝杆菌编码的蛋白酶具有100多种，这些蛋白酶的结核分枝杆菌的生长周期中发挥着重要的作用，然而，对于蛋白酶的研究却很少。在蛋白的翻译过程中，氨肽酶是选择性的除去新合成蛋白质和肽的n-末端的蛋白酶，是维持许多病原体微生物生长必不可少的蛋白酶。亮氨酸氨基肽酶(lap)作为细胞溶质低聚金属氨基肽酶，是肽家族m17的典型成员，亮氨酸氨基肽酶对于分枝杆菌的体内存活和致病性都是不可缺少的。因此，亮氨酸氨肽酶也成为一个关键的抗结核分枝杆菌的药物靶标，所以针对亮氨酸氨肽酶进行抑制剂筛选对结核分枝杆菌感染的相关的药物研发具有很大的意义。
艾曲波帕乙醇胺，英文名是eltrombopag，是双腙类的化合物，它是血小板生成素受体(tpor)的非肽激动剂，主要用于治疗长期血小板减少的患者。但迄今为止，艾曲波帕乙醇胺在抗结核分枝杆菌感染中的应用未见报道。
技术实现要素：
针对相关技术中的问题，本发明提供艾曲波帕乙醇胺在抗结核分枝杆菌感染中的应用。
本发明还提供了针对结核分枝杆菌中亮氨酸氨肽酶的抑制剂。
本发明所涉及艾曲波帕乙醇胺cas号为496775-62-3，购买于selleck.cn公司。在分子水平上，通过设立阴性对照，发现艾曲波帕乙醇胺对结核分枝杆菌中的亮氨酸氨肽酶有很好的抑制活性，之后通过刃天青微孔板法测定化合物对mycobacteriumsmegmatis的最小抑菌浓度,发现艾曲波帕乙醇胺对于与结核分枝杆菌同源性比较高耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)具有很强的抑制作用，因此该化合物有望作为抑制结核分枝杆菌感染的潜在药物。
本发明提供一种用于预防或治疗结核分枝杆菌中的亮氨酸氨肽酶(mtlap)感染的药物，其活性成分为艾曲波帕乙醇胺，该药物包含上述含有艾曲波帕乙醇胺以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
本发明具有的优点和积极效果是：
本发明的针对结核分枝杆菌中的亮氨酸氨肽酶(mtlap)的抑制剂，这种抑制剂为艾曲波帕乙醇胺。艾曲波帕乙醇胺对结核分枝杆菌中的亮氨酸氨肽酶活性具有显著的抑制效果。
附图说明
图1是艾曲波帕乙醇胺对结核分枝杆菌中的亮氨酸氨肽酶的抑制作用示意图
图2是艾曲波帕乙醇胺对结核分枝杆菌中的亮氨酸氨肽酶的ic50的测定示意图
具体实施方式：
为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。
1.结核分枝杆菌中亮氨酸氨肽酶(mtlap)的表达与纯化
根据文献(theactivityofahexamericm17metallo-aminopeptidaseisassociatedwithsurvivalofmycobacteriumtuberculosis[j].frontiorsinmicrobiology,2017,27(3):00504.)
(1)将含有编码mtlap基因的pet28a载体转化escherichiacolibl21(de3)的菌株，并用lb平板培养基(含50mg/l卡那霉素)筛选阳性克隆。
(2)在平板上挑取阳性克隆，37℃培养过夜后转入0.8l的lb培养基(含50mg/l卡那霉素)，当其在600nm波长处的吸光值(即，od600)达到0.6时，加入0.1mmiptg(异丙基硫代半乳糖苷，isopropylβ-d-thiogalactoside)在20℃培养16小时。
(3)用5000rpm离心10min收集细胞后高压破菌；破菌液用10000rpm离心30min后收集上清液。
(4)将上清液加入破菌buffer(20mmtris-hcl,0.5mnacl,,ph7.9)预平衡的ni-nta亲和层析柱中，使目的蛋白与ni充分结合，使目的蛋白充分富集。
(5)用含有30mm咪唑的破菌buffer洗掉未结合的杂蛋白，考马斯亮蓝g250检测流出液不变蓝时，说明大部分杂蛋白被冲洗干净。用含300mm咪唑的破菌buffer洗脱mtlap，然后用30kd的浓缩管浓缩换液，用阴离子交换层析进行纯化来获得具有电荷均一性的目的蛋白。
2.mtlap的活性测定
采用纯度大于95％的lec-amc(购自上海吉尔生化有限公司)作为底物；荧光强度测定的仪器为
蛋白缓冲液组分为20mmtris-hcl,250mmnacl，50％甘油，ph＝7.5，用缓冲液配置mtlap(终浓度80nm)，加入溶解于dmso(二甲基亚砜)的化合物(终浓度为20μm),室温放置5min,迅速加入荧光底物lec-amc，底物浓度为20μm。每30s记录一次荧光读数，共测定4500s。654rpm震荡10s，检测荧光值。阴性对照不加备选样品，其它实验条件均相同。
以时间为x轴，荧光值为y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据荧光强度以及反应时间，采用graphpadprism5软件分析前540s的酶促反应的速率。设定v0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性ra(residualactivity,ra)(vi/v0)以及抑制率ir(inhibitionrate,ir)(1-vi/v0)。
对于剩余活性<30％的化合物进行复筛，排除操作失误造成假阳性的可能。对于剩余活性<30％的化合物，设计荧光淬灭实验。综合考虑化合物的剩余活性百分率和荧光淬灭率就可以判断化合物对mtlap的抑制效果。因为该体系主要通过荧光强度筛选，所以，当本身有荧光的化合物或者是与amc类似的化合物都会对体系产生干扰。另外，本身含有淬灭基团化合物可能也会淬灭体系的荧光而造成假阳性，为了排除假阳性结果，采用先将mtlap与荧光底物反应一段时间，让体系荧光达到最大值q1、再在体系中加入与实验组等量的化合物，并检测体系的荧光值大小为q2。将两者的荧光值按照公式计算得出荧光淬灭率qr((qr＝q1-q2)/q2*100％)。当荧光
淬灭率高于20％时，为假阳性，结果需排除；当荧光淬灭率低于20％时，为阳性结果。
3.化合物艾曲波帕乙醇胺ic50的测定
在测定ic50时，我们首先配置实验所需的蛋白mtlap,终浓度为80nm，再用95％的dmso配置底物lec-amc,使其终浓度为20μm。我们首先根据初筛结果粗略的设定10个抑制剂浓度(一般是通过梯度稀释得到)，艾曲波帕乙醇胺的浓度分别是200um、100um、50um、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm、0.78125μm、0μm。之后与之前的操作基本一样，先将蛋白加入酶标板中在酶标仪中与抑制剂在37℃孵育5min后，迅速加入2μl底物，记录时间与荧光变化曲线。我们通过graphpadprism6.0软件得到蛋白酶荧光反应初速率，并拟合化合物浓度与剩余活性的量效关系曲线，得出ic50值。
4.刃天青微孔板法测定化合物对mycobacteriumsmegmatis的最小抑菌浓度
(1)菌液培养
在超净台中按照1:200的比例接种50ul的mc2155的甘油菌于50ml的离心管中，按照比例加入7h9培养基，37℃220rpm振荡培养，至od600＝1.2，(三周内可以重复使用)。加入在超净台中以1:100比例转接种子液到5ml7h9液体培养基中，37℃220rpm振荡培养，至od600＝0.5(对数期)。取菌液将其调整到od600＝0.15，并稀释100倍使用。
(2)阳性化合物利福平的稀释
实验中以利福平作为阳性对照，梯度稀释依次为，64ug/ml、32ug/ml，16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml，0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml，一般保证第6个稀释梯度为该药对野生型菌株的最小抑菌浓度。
(3)药物艾曲波帕乙醇胺的稀释
按2倍稀释梯度进行药物稀释，浓度依次是，512ug/ml、256ug/ml、128ug/ml、64ug/ml、32ug/ml，16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml。
(4)向96孔板中加40μl7h9(含有tween-80与ads)液体培养基，每个被检测菌株设3个药物平行，每一行加2μl同等浓度药物，再加稀释好的菌液40μl，轻轻摇动混匀。将其放置于37℃培养箱孵育48h.
(5)在超净台中加入8μl过滤除菌的0.02％(w/v)刃天青，继续孵育4h，于倒置放大镜上观察细菌生长情况，呈粉红色为阳性；呈蓝色则为阴性。
本发明涉及药学的技术领域，具体说是艾曲波帕乙醇胺在抗结核分枝杆菌感染中的应用，艾曲波帕乙醇胺在抑制结核分枝杆菌中亮氨酸氨肽酶时候ir>95％以上,在制备抗结核分枝杆菌中亮氨酸氨肽酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，有望成为抗结核分枝杆菌感染的潜在药物。
以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。
以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。