本发明涉及活性化合物的筛选，特别是涉及异荭草素在制备与胰岛素抵抗相关疾病中的用途。
背景技术：
胡芦巴(trigonellafoenum-graecuml.)是豆科、胡芦巴属、一年生草本植物，又名香豆子、香草儿等，主要分布在中国、印度、非洲北部等国家。胡芦巴作为一种药食同源的经济作物，具有悠久的药用和食用历史，在许多中国古籍药典中均有记载。《本草纲目》记载，胡芦巴对于治疗“寒湿脚气”、“小肠气痛”、“阴肿痛”、“气攻头痛”等疾病有显著的疗效。《嘉佑本草》记载：胡芦巴“主元脏虚冷气；得附子、硫黄治肾虚冷，腹胁胀满面色青黑；得怀香子、桃仁，治膀胱气”；《藏药志》中记载：“苦、温；治肺脓肿，并能止泻”。现代药理学对胡芦巴的成分及其主要活性进行了较为广泛的研究，研究结果发现胡芦巴含有多种活性成分，如油脂、胡芦巴胶、多糖、皂苷、黄酮、萜类、胡芦巴碱、香豆素、4-羟基异亮氨酸等。
已有的研究结果表明，胡芦巴具有明确的降血糖作用。周玖瑶(葫芦巴对链佐霉素诱导糖尿病模型大鼠药理研究.中华中医药学刊,2007,25(5):1005-1007.)等通过给大鼠腹腔注射50mg/kg链佐霉素(streptozotocin,stz)建立胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus,iddm)动物模型，分别灌胃给予胡芦巴煎液和格列齐特溶液作为治疗组和阳性对照组，连续给药20天；测定大鼠血脂、血糖值、肝组织gsh、血清sod和no含量。结果表明，胡芦巴能明显降低iddm大鼠血糖水平，明显降低hdl-c、tg、tc，血清中no、sod水平明显升高，对stz引起的ⅱ型糖尿病大鼠有明显的改善作用。孙晓风(胡芦巴总皂苷对血脂紊乱模型大鼠生化指标的影响.新疆医科大学学报,2005,28(2):101-103.)等通过对血脂代谢发生紊乱的大鼠饲喂胡芦巴皂苷提取物，发现不同剂量胡芦巴皂苷提取物处理模型组大鼠，与模型组比较，其体内血清tg﹑低密度脂蛋白(ldl)﹑高密度脂蛋白(hdl)﹑胆固醇(tc)代谢含量呈显著下降的趋势。魏友霞(葫芦巴种子提取物对糖尿病大鼠的影响.中成药,2007,29(3):450-451.)等也采用了sd大鼠高热量饲料(8周)喂饲，以链佐霉素(stz)造模，然后以胡芦巴的水提物(主要成分为多糖)和醇提物(主要成分为不饱和脂肪酸)进行治疗(6周)，检测血糖(glu)，总胆固醇(tc)，甘油三酯(tg)和高密度脂蛋白(hdl-c)，各治疗组与对照组比较各指标均显著降低，hdl-c升高，水提组优于醇提组，有显著性差异，表明胡芦巴水提液在降低大鼠血糖同时，还能起到调节血脂代谢的作用。gupta(effectoftrigonellafoenum-graecum(fenugreek)seedsonglycaemiccontrolandinsulinresistanceintype2diabetesmellitus:adoubleblindplacebocontrolledstudy.journaloftheassociationofphysiciansofindia,2001,49:1057-1061.)等发现，给予ii型糖尿病患者每天1g胡芦巴水提物，两个月后，与对照组相比较，胡芦巴处理组血糖水平、血清tg和胰岛素浓度明显下降，同时病人胰岛素敏感性和高密度脂蛋白胆固醇显著升高。但是目前研究结果都是在胡芦巴提取物或提取部位的基础上进行的，其单体化合物的研究报道仍然很少，其具体的功效化合物及其作用机制也尚不明确。
技术实现要素：
本发明提供了如下葫芦巴黄酮类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病及相关领域的药物中的应用，所述化合物选自荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素其中之一或两者以上的组合。
化合物结构式如下：
(i)---异荭草素，(ii)---牡荆素，(iii)---异牡荆素，(iv)---荭草素。
具体地，本发明提供了上述黄酮类化合物在制备预防和/或治疗胰岛素抵抗的药物中的应用。
进一步地，所述药物是预防和/或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的药物。
进一步地，所述疾病包括高血脂、心血管类疾病、糖尿病、高血压或代谢综合征。
进一步地，所述药物是抑制脂肪细胞分化的药物。
进一步地，所述药物是抑制pparγ、c/ebpα或/和fas的药物。
进一步地，所述药物是改善线粒体功能损伤的药物。
进一步地，所述药物通过调控胰岛素信号通路和/或ampk信号通路中相关蛋白表达水平达到所述目的。
进一步地，所述药物通过提高胰岛素信号通路中akt蛋白的磷酸化水平，和/或，提高ampk信号通路中ampk蛋白的磷酸化水平达到所述目的。
另外，本发明还提供了异荭草素作为akt蛋白激动剂或ampk蛋白激动剂的应用。
另外，本发明还提供了异荭草素、牡荆素作为pparγ拮抗剂或c/ebpα拮抗剂的应用。
异荭草素、牡荆素能够降低脂肪因子pparγ和c/ebpα的转录水平，从而实现对脂肪组织发生的调节作用。
另外，本发明还提供了上述黄酮类化合物在制备抑制脂肪细胞分化或/和修复线粒体损伤的药物中的应用。
需要说明的是，本发明中所用术语“激动剂”是指化合物因其存在所导致产生的蛋白质的生物活性与由蛋白质的天然配体的存在所产生的生物活性相同。
本发明中所用术语“拮抗剂”是指化合物因其存在所导致产生的蛋白质的生物活性强度降低。
本发明的有益效果是：本发明从葫芦巴中提取7种化合物，对这几种化合物进行活性研究，利用3t3-l1细胞建立胰岛素抵抗(ir)模型，进一步从线粒体功能紊乱的层面对化合物降血糖活性进行深入的研究，探讨了7种化合物对糖尿病的预防和治疗机制，结果表明，本发明所述化合物能够抑制3t3-l1细胞的分化，抑制脂滴积累，降低tg含量，并通过相关信号通路降低脂肪因子的转录水平，另外，所述化合物还通过降低细胞中ros的水平，恢复3t3-l1细胞线粒体膜电势，促进细胞中atp的产生，防止线粒体dna损伤，并促进线粒体的发生。
附图说明
图1胡芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞活力的影响(x±s,n＝4)；
图2诱导不同时间的3t3-l1细胞的形态(200×)，其中，a图为正常细胞，b图为完全汇合后的正常细胞，c图为诱导第4天的细胞，d图为诱导第8天的细胞；
图3胡芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞分化过程中脂滴产生的影响(200×)；
图4胡芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞分化过程中tg含量的影响(##p<0.05vscon；*p<0.05，**p<0.01vsmod)；
图5胡芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞分化过程中脂肪因子表达的影响；
图6dex处理不同时间3t3-l1细胞对2-nbdg的摄取(**p<0.01)；
图7dex处理不同时间3t3-l1细胞中akt的磷酸化水平；
图8胡芦巴化合物对3t3-l1细胞2-nbdg摄取的影响(x±s,n＝4,*p＜0.05,**p＜0.01)；
图9胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中p-akt表达的影响；
图10胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中p-ampk表达的影响；
图11胡芦巴化合物对3t3-l1细胞pparγ转录水平的影响；
图12胡芦巴化合物对3t3-l1细胞c/ebpα转录水平的影响；
图13胡芦巴化合物对3t3-l1细胞ap2转录水平的影响；
图14胡芦巴化合物对3t3-l1细胞srebp1c转录水平的影响；
图15胡芦巴化合物对3t3-l1细胞fas转录水平的影响；
图16流式细胞仪检测胡芦巴化合物对3t3-l1细胞ros水平的影响；
图17激光共聚焦检测胡芦巴化合物对3t3-l1细胞ros水平的影响；
图18流式细胞仪检测胡芦巴化合物对3t3-l1细胞膜电势产生速率的影响；
图19胡芦巴化合物对3t3-l1细胞atp合成的影响；
图20胡芦巴化合物对3t3-l1细胞线粒体dna损伤的影响；
图21胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中nrf1转录水平的影响；
图22胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中pgc-1转录水平的影响；
图23胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中tfam转录水平的影响。
需要说明的是，ori表示荭草素，iori表示异荭草素，vit表示牡荆素，ivit表示异牡荆素，rhac表示土大黄苷，drhac表示脱氧土大黄苷，rhag表示丹叶大黄素，相应分组表示相应的化合物干预组，con组表示正常组，mod组表示模型组，rosi(罗格列酮)组表示阳性对照组，insulin组表示胰岛素孵育组，vehicle组表示正常组中胰岛素未处理组。
具体实施方式
荭草素、异荭草素、牡荆素和异牡荆素为4种黄酮类化合物，土大黄苷、脱氧土大黄苷、丹叶大黄素为3种二苯乙烯类化合物。
一、胡芦巴化合物对3t3-l1细胞分化的影响
(1)胡芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞活力的影响
通过mtt法测定荭草素，异荭草素，牡荆素，异牡荆素，土大黄苷，脱氧土大黄苷，丹叶大黄素这7种葫芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞的活力的影响。将3t3-l1前脂肪细胞接种至96孔培养板，每孔1×104个细胞(150μl培养液)，用含10％胎牛血清的dmem培养液培养12h至细胞完全汇合，换以用无血清培养基配制的浓度分别为0，0.1，1，10，50，100μm的化合物150μl处理细胞48小时，每个浓度设置4个复孔。孵育完成后每孔加入10μl新鲜配制的终浓度为5mg/mlmtt溶液继续培养4h后，吸除培养孔中的液体终止反应，每孔加入100μldmso，平板震荡器上充分振摇10min，使结晶充分溶解，立即在酶标仪上测定吸光度，检测波长为490nm。按以下公式计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝(药物组od/空白组od)×100％
当细胞存活率大于80％时，认为药物对细胞活力影响小，即药物对培养细胞基本不呈现毒性作用，并以此作为本研究选取化合物最适浓度的标准，并为进一步实验的工作浓度确定最佳范围。实验结果如图1所示。
从图1可以看出，在100μm以内黄酮类化合物对3t3-l1前脂肪细胞活力基本没有影响，细胞活力均在90％以上；二苯乙烯类化合物在100μm时，细胞活力明显下降，尤其是脱氧土大黄苷，细胞活力降至30％以下，但在10μm以内三种化合物对细胞活力影响较小，均在90％以上。因此，最终选用10μm作为胡芦巴化合物的处理浓度对其进行研究。
(2)3t3-l1前脂肪细胞的诱导分化
采用“经典鸡尾酒法”(structure-activityrelationshipandclassificationofflavonoidsasinhibitorsofxanthineoxidaseandsuperoxidescavengers[j].journalofnaturalproducts,1998,61(1):71-76.)对3t3-ll前脂肪细胞进行诱导，在诱导的第8天时90％以上的细胞呈现脂肪细胞形态，说明细胞已分化成熟脂肪细胞。3t3-l1前脂肪细胞是成纤维细胞，呈典型的梭形或不规则三角形，不具有分泌脂滴的能力(图2中a图)，当细胞完全汇合后处于生长停滞期，但经诱导剂诱导分化后，细胞由成纤维细胞样，变圆，变亮，第4天后观察有分散的小脂滴(图2中c图)，继续培养，到第8天，脂滴显著增多，95％的细胞分化为成熟脂肪细胞，且围绕于细胞核周围，呈“指环”状的结构，为成熟脂肪细胞形态(图2中d图)，说明3t3-l1前脂肪细胞完全诱导分化成脂肪细胞。
(3)葫芦巴化合物对3t3-l1细胞脂滴积累的影响
实验中分别设置正常组(con组)，模型组(mod组)，阳性对照组(rosi组)和化合物处理组，在诱导的第0天至第4天，con组于正常培养液中继续培养，mod组于诱导液中培养，而rosi组和化合物处理组分别于含有1μm的rosi和10μm的胡芦巴化合物的诱导液中培养，在诱导的第四天换成正常培养液继续培养，每2天换一次培养液。直至诱导的第8天进行油红o染色，显微镜下观察、拍照，观察脂滴积累情况，实验结果如图3所示。
图3表明，con组中没有出现脂滴，形态和前脂肪细胞基本相似为梭型或三角形，说明con组的细胞没有进行分化或分化程度比较低。而模型组中细胞质中有大量的脂滴聚集，其中95％以上的细胞呈现典型的成熟脂肪细胞的状态。rosi组中脂滴更加明显，甚至比模型组中还要多，说明rosi可以促进脂滴的积累，加速细胞分化为成熟的脂肪细胞。化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素对脂滴的形成有明显的抑制作用，可以显著减少诱导过程中脂滴的积累，抑制细胞的分化，而荭草素，牡荆素和异牡荆素对脂滴的积累没有明显的抑制作用；二苯乙烯类化合物中，土大黄苷具有较强的抑制3t3-l1前脂肪细胞分化过程中脂滴积累的作用，可以显著抑制细胞的分化，而脱氧土大黄苷的抑制作用比较弱，细胞中也有较多的脂滴产生，但丹叶大黄素对3t3-l1前脂肪细胞分化基本没有影响，其脂滴产生数量与mod组基本相当。
(4)胡芦巴化合物对3t3-l1细胞tg含量的影响
在利用油红o染色研究胡芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞分化过程中脂滴积累的影响的同时，利用tg含量测定试剂盒(购自北京北化康泰临床试剂有限公司)对细胞中tg的含量进行了定性的研究，按照说明书的方法对每个处理细胞裂解液中的tg含量进行了测定，实验结果如图4所示。
图4表明，con组中的tg含量较低只有0.03mmol/gprot左右；而模型组中tg含量显著增高，达到0.05mmol/gprot；rosi处理组中tg含量达到0.08mmol/gprot，说明rosi促进3t3-l3细胞分化过程中tg的积累；药物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素对脂滴的形成有明显的抑制作用(p<0.05)，可以显著减少诱导过程中tg的积累，抑制细胞的分化，而荭草素，牡荆素和异牡荆素对脂滴的积累没有明显的抑制作用；二苯乙烯类化合物中，土大黄苷具有较强的抑制3t3-l1前脂肪细胞分化过程中tg积累的作用，可以显著抑制细胞的分化，而脱氧土大黄苷的抑制作用比较弱，细胞中也有较多的脂滴产生，但丹叶大黄素对3t3-l1前脂肪细胞分化有微弱的促进作用，这与上述油红o染色结果也进本一致。
(3)3t3-l1细胞脂肪因子表达的检测
在细胞进行诱导分化的过程中，诱导的第0-4天加入10μm化合物处理。在细胞诱导的第8天收集细胞，提取胞浆蛋白，采用bca法测定蛋白含量，定量后进行sds-page电泳，研究葫芦巴化合物对3t3-l1前脂肪细胞分化过程中脂肪因子pparγ，c/ebpα和fas的表达的影响，实验结果如图5所示。
图5表明，在未分化的3t3-l1前脂肪细胞中，pparγ，c/ebpα和fas都处于本底的低表达水平，而在分化成熟的脂肪细胞中，其表达水平均显著升高。而4种黄酮类化合物均可以降低3种脂肪因子的表达，但抑制的水平有所不同，其中荭草素对fas和pparγ的抑制效果最为明显，而异荭草素对c/ebpα的表达具有非常强烈的抑制效果，同时牡荆素对pparγ的表达也具有显著的影响。二苯乙烯类化合物中，土大黄苷和丹叶大黄素均能降低fas的表达水平，而脱氧土大黄苷对fsa的表达没有影响；土大黄苷和脱氧土大黄苷均能降低pparγ，c/ebpα的表达水平，且土大黄苷的效果更加明显。在3t3-l1前脂肪细胞分化的过程中，脂肪因子起着重要的调控作用，并且随着细胞的分化，脂肪因子的表达也发生相应的变化。pparγ和c/ebpα在前脂肪细胞中处于很低的表达水平，而在成熟的脂肪细胞或组织中表达水平显著增高，他们在脂肪细胞分化的过程中对脂质的形成和储存以及糖脂的代谢起着关键的作用。通过调节pparγ和c/ebpα的表达水平，可以调节分化过程的脂肪特异性因子的表达变化，例如ap2，srebp1c，fas等，从而调节脂肪细胞的分化。fas是脂肪酸合酶，直接负责脂肪酸的合成，fas的表达水平升高直接导致脂质的积累。
二、胰岛素抵抗(ir)模型的建立
首先采用“经典鸡尾酒法”对3t3-ll前脂肪细胞进行诱导，使其成为成熟的脂肪细胞。然后采用糖皮质激素的长效类似物地塞米松(dex)建立ir模型，实验中取诱导分化成熟的3t3-l1脂肪细胞，用1μmdex处理细胞48小时，而空白组用普通高糖dmem处理细胞。处理完成后检测胰岛素刺激下的3t3-l1细胞对2-nbdg的摄取量和akt的磷酸化水平，进而评价ir是否建立成功。
细胞对2-nbdg的摄取量检测方法：在建立的ir模型基础上，将细胞分为两组，一组用含有100nm胰岛素的无糖dmem孵育15min，另一组用无糖dmem处理相同时间。胰岛素孵育完成后用dpbs洗2遍，改用含有100μm2-nbdg的无糖dmem孵育1小时，孵育完成后弃掉培养液，dpbs洗2遍，每孔加入500μl胰酶37℃消化10min(5分钟左右时在试验台上轻轻振荡平板)，每孔加入3.5mldpbs吹打均匀，用移液枪吸入5ml的圆底离心管中，1000rpm离心10min，dpbs洗2遍。最后加入500μldpbs重悬，过膜后转入流式管，488nm，515～545nm波长下流式细胞仪检测。
akt的磷酸化水平检测方法：在建立的ir模型基础上，在处理的第48小时westernblotting检测细胞在胰岛素刺激(100nm胰岛素孵育15min)下的akt的磷酸化水平。
实验结果见图6和图7，在dex处理48小时以后，胰岛素刺激下细胞对2-nbdg的摄取能力显著下降，同时akt的磷酸化水平也随之降低。这说明pi3k/akt信号通受到损害，使得胰岛素经信号转导传递到细胞内的信号无法继续往下游传递或传递效率降低，从而使细胞对胰岛素的敏感性降低。据此判断ir模型成功建立。
三、葫芦巴化合物对ir模型的改善作用
(1)3t3-l1细胞对2-nbdg摄取能力的检测
将分化成熟的细胞分为空白对照组、模型组、阳性对照组和化合物处理组，除空白组用完全培养液培养外，其余各组用1μmdex处理建立ir模型，其中阳性对照组在dex处理的同时加入1μm的rosi，而化合物处理组在dex处理的同时加入10μm的胡芦巴化合物。处理48小时后，空白对照组和模型组内部分别分为2小组，其中一组用100nm的胰岛素处理15min，而另一组改用dmem处理相同时间，阳性对照组和化合物处理组同样用100nm的胰岛素处理15min。处理完成后所有实验组改用含有100μm2-nbdg的无糖dmem孵育1小时，处理后488nm，515～545nm波长下流式细胞仪检测。
2-nbdg(2-(n-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)主要用于细胞对葡萄糖摄取能力的检测。机体或细胞发生ir之后，由于外围组织对胰岛素敏感性降低，脂肪组织和骨骼肌对葡萄糖的摄取能力下降，从而导致血液中葡萄糖的浓度升高。
本实验利用3t3-l1细胞建立ir模型来评价胡芦巴化合物改善ir的作用效果，实验中胡芦巴化合物处理细胞完成后，采用荧光标记的葡萄糖类似物2-nbdg检测3t3-l1细胞对葡萄糖摄取能力，实验结果如图8所示。
图8显示，胰岛素刺激后(insulin组)细胞对2-nbdg的摄取能力显著增强，而ir组中胰岛素刺激后(dex+insulin组)细胞对2-nbdg的摄取能力变化不大，与insulin组相比差异极显著(p＜0.01)，说明ir模型建立成功。而dex+insulin+rosi组中细胞对2-nbdg的摄取能力恢复，明显高于dex+insulin组，且差异极显著(p＜0.01)，说明rosi可以改善胰岛素刺激下3t3-l1脂肪细胞对2-nbdg的摄取能力。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中荭草素(p＜0.05)和异荭草素(p＜0.01)能不同程度促进胰岛素刺激下3t3-l1脂肪细胞对2-nbdg的摄取，且与dex+insulin组相比具有差异显著性。二苯乙烯类化合物中土大黄苷也能够够提高胰岛素刺激下3t3-l1脂肪细胞对2-nbdg的摄取，与dex+insulin组相比差异极显著。
综上所述，胡芦巴化合物中黄酮类化合物和二苯乙烯类化合物均能改善胰岛素刺激下3t3-l1脂肪细胞对2-nbdg的摄取能力，其中化合物异荭草素和土大黄苷的效果最佳，说明异荭草素和土大黄苷具有改善ir症状，治疗糖尿病的潜力。
(2)3t3-l1细胞akt和ampk磷酸化的检测
本发明研究了胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中akt/pakt和ampk/pampk的表达水平的影响，实验操作同“2-nbdg摄取能力的检测”所述，最后用westernblotting检测相关蛋白的表达情况，实验结果如图9和10所示。
研究表明，akt和ampk信号通路在代谢疾病的发病过程中起着关键的作用，尤其是在胰岛素级联放大调控葡萄糖转运的过程中。在细胞的生长、增殖以及代谢过程中pi3k/akt信号通路起着重要作用，它受到多种因子的调节，如表皮生长因子和胰岛素样生长因子等的正性调节以及pten等分子对的重要负调节以维持细胞和生命的稳态。pi3k/akt信号通路是胰岛素的主要下游分子通路，在胰岛素行使其代谢功能的时候，一般认为akt2行使了最重要的功能，当胰岛素刺激后akt的磷酸化水平会显著增加，而机体或细胞进入ir状态后，对胰岛素不敏感，akt磷酸化水平降低。图9表明，insulin组中胰岛素刺激后细胞中akt的磷酸化水平显著升高，而ir组(dex+insulin组)中胰岛素刺激后细胞中akt的磷酸化水平与胰岛素组相比显著降低，说明ir模型建立成功，这与2-nbdg摄取试验结果一致。而dex+insulin+rosi组细胞中akt的磷酸化水平与dex+insulin组相比明显升高，说明rosi可以改善胰岛素刺激下3t3-l1脂肪细胞中akt的磷酸化水平，进而改善ir症状，这也与前期文献调研结果一致。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素和二苯乙烯类化合物中的土大黄苷可以显著提高胰岛素刺激下3t3-l1脂肪细胞中akt的磷酸化水平。
腺苷酸活化蛋白激酶ampk是一种重要的蛋白激酶，在协调代谢和能量平衡方面发挥重要作用。ampk被激活后在增加骨骼肌对葡萄糖摄取、增强胰岛素敏感性、增加脂肪酸氧化以及调节基因转录等方面发挥重要作用。由于其在调节糖和脂肪酸代谢方面的作用，ampk可能为治疗肥胖、胰岛素抵抗和ⅱ型糖尿病提供了新的药理靶点。胡芦巴化合物对3t3-l1脂肪细胞中ampk磷酸化水平的影响结果见图10，结果显示，黄酮类化合物中的iroi和二苯乙烯类化合物中土大黄苷可以活化ampk，增加其磷酸化水平，从而促进细胞对葡萄糖摄取、增强胰岛素敏感性。
(3)3t3-l1细胞脂代谢基因转录水平的检测
实验操作同“2-nbdg摄取能力的检测”所述，处理完成后收集细胞，trizol法抽提总rna，然后进行逆转录合成cdna，最后利用实时荧光定量pcr法检测胡芦巴化合物对ir状态下3t3-l1细胞脂代谢相关基因转录水平的变化。
相对定量分析时，目的基因的表达采用比较ct值的方法，用内参基因β-actin来校正差异，变化的倍数量为2-△△ct。计算公式为：变化倍数＝2-△△ct，其中，△△ct＝(ct目标基因-ct内参基因)化合物处理组-(ct目标基因-ct内参基因)control。
实时荧光定量pcr具体条件如下：
根据文献提供的基因序列，引物由上海生物工程股份有限公司合成，β-actin(genbank序列号:nc_000071.6、pparγ(genbank序列号:nm_001308354.1)、c/ebpα(genbank序列号:nm_001287523.1)、ap2(genbank序列号:m84651.1)、srebp1c(genbank序列号:ab046200.1)、和fas(genbank序列号:nm_007988.3)的引物序列如表1所示。
表1实时荧光定量pcr引物序列
配制pcr扩增反应体系，如表2所示。
表2实时荧光定量pcr反应体系组分
将上述反应液放入荧光定量pcr仪中进行扩增，pcr反应条件如表3所示。
表3实时荧光定量pcr反应程序
每个循环结束后采集荧光信号，最后绘制熔解曲线以确定反应产物有无引物二聚体及非特异性扩增，当荧光信号强度超过基线时，其域循环数被记录下来。在实时荧光定量pcr中，ct值被认为与被扩增基因的初始浓度密切相关。
现在研究认为脂肪组织是ir产生的始发部位，除了能调节人体能量储存和营养平衡外，还是一个活跃的内分泌器官，可以分泌多种细胞因子如tnf-α、瘦素、脂联素和抵抗素等。胰岛素抵抗发生往往与肥胖症相关，由于体脂的堆积，肌肉和其他组织对葡萄糖的利用率降低，造成胰岛素抵抗和高胰岛素血症。而脂肪组织的发生主要与脂肪因子的表达密切相关，本研究通过实时定量荧光pcr的方法研究了胡芦巴化合物对ir状态下的3t3-l1细胞脂肪因子pparγ、c/ebpα、ap2、srebp1c和fas等的转录水平的影响。
图11表明，ir组(dex处理组)中pparγ的转录水平显著增高，说明处于ir状态的细胞中pparγ的表达上升。rosi组中pparγ的转录水平与dex组相比明显下降，而胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素和牡荆素以及二苯乙烯类化合物中的土大黄苷和脱氧土大黄苷能够降低pparγ的转录水平，并且与ir组相比均具有差异显著性。
c/ebpα即ccaat/增强子结合蛋白α，在脂肪细胞分化的终末阶段大量表达，与pparγ共同作用，开启一系列脂肪特异性基因的表达，从而合成、摄取和储存长链脂肪酸，并使细胞停止增殖，呈现完全分化状态。为了研究其在处于ir状态的脂肪细胞中的表达情况，本发明研究了其转录水平的变化。结果见图12，图12显示，与vehicle组相比，ir组(dex处理组)中c/ebpα的转录水平显著增高，并且rosi能够增强c/ebpα的转录水平，说明rosi能促进脂质的代谢，增加脂肪细胞中脂质的合成。而胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中iroi和牡荆素和二苯乙烯化合物中土大黄苷能够降低c/ebpα的表达，并且与ir组相比差异极显著。
ap2是脂代谢过程中的一个重要的基因，在成熟脂肪细胞中表达升高，因此本发明研究了其在ir状态下的3t3-l1细胞中的表达情况。实验结果如图13所示，与vehicle组相比，ir组(dex处理组)中ap2的转录水平显著增高，并且rosi能够增强ap2的转录水平，说明rosi能促进脂质的代谢，增加脂肪细胞中脂质的合成，这与上述结果相一致。而胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的iroi和牡荆素与二苯乙烯类化合物中的土大黄苷均能降低ap2的表达，并且与ir组相比差异极显著。
srebp1c是脂代谢过程中pparγ和c/ebpα代谢通路下游的脂代谢相关的基因，在成熟脂肪组织和细胞中表达增强，本实验研究了其在ir状态下的3t3-l1细胞中转录水平。图14显示，与正常组相比ir组中srebp1c的转录水平显著升高，而rosi能够增强其在脂肪细胞中的表达。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素和牡荆素与二苯乙烯类化合物中的土大黄苷均能降低srebp1c的转录，并且与ir组相比差异极显著。
fas即脂肪酸合酶，是脂肪细胞中合成脂肪酸的重要酶，是srebp1c的下游基因，在成熟脂肪细胞中表达水平升高。本实验研究了其在ir状态下的3t3-l1细胞中转录水平。图15表明，与正常组相比ir组中fas的转录水平显著升高，而rosi能够增强其在脂肪细胞中的表达。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中异荭草素和牡荆素和苯乙烯类化合物中的土大黄苷均能降低fas的转录水平，并且与ir组相比具有差异显著性。
2-nbdg摄取试验结果表明，胡芦巴化合物中荭草素、异荭草素和土大黄苷均能提高胰岛素刺激下3t3-l1细胞对2-nbdg的摄取能力，且异荭草素和土大黄苷最佳，与ir最相比差异极显著；而western研究结果显示，异荭草素和土大黄苷能提高胰岛素信号通路中akt的磷酸化水平，同时能提高ampk的磷酸化水平，说明异荭草素和土大黄苷能够改善ir症状，具有治疗ⅱ型糖尿病的潜力。实时荧光定量pcr研究结果表明，异荭草素和土大黄苷能够同时降低处于ir状态的脂肪细胞中的脂质代谢相关因子的转录水平，这与糖代谢实验结果相符合，进一步验证了异荭草素和土大黄苷调节糖脂代谢紊乱，改善ir的潜力，为开发胡芦巴源治疗ⅱ型糖尿病药物提供了更有利的理论支持。
四、胡芦巴化合物对3t3-l1细胞线粒体功能的影响
(1)3t3-l1细胞ros水平的检测
流式细胞仪检测2t3-l1细胞中的ros水平：取6孔板中诱导成熟的3t3-l1细胞，分为空白对照组、模型组、rosi组和化合物处理组，除空白组继续用完全培养液培养外，其余各组用1μmdex处理细胞48小时建立ir模型，其中rosi组在dex处理的同时加入1μm的rosi，而化合物处理组在dex处理的同时加入10μm的胡芦巴化合物。最后用fitc通道流式检测荧光强度。
激光共聚焦检测3t3-l1细胞中的ros水平：实验步骤同“流式细胞仪检测2t3-l1细胞中的ros水平”所述步骤，化合物处理完成后pbs洗2次，每孔加入200μldcfh-da(dpbs配制，10μm)荧光探针37℃孵育30min，孵育完成后pbs洗2遍，于激光共聚焦显微镜fitc通道观察荧光强度，并拍照。
ros是生物体内的氧自由基，包括氧和含氧的高反应活性分子(如超氧化物阴离子、组织过氧化物和自由基等)，主要来源于线粒体，是线粒体由状态iii向状态iv转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。低水平的ros和高水平的atp是胰岛β细胞分泌胰岛素必需的，过多的ros损伤线粒体蛋白、mtdna和线粒体膜上的脂类，从而引起了线粒体损伤。但线粒体功能损伤后导致的持续、高产量的ros生成反而会减少atp生成，损伤β细胞，抑制胰岛素释放。dcfh-da本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成dcfh。而dcfh不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ros可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf，检测dcf的荧光就可以反应细胞内活性氧的水平。本实验以dcfh-da作为检测ros的荧光探针，分别采用流式细胞仪和激光共聚焦两种方法对3t3-l1细胞中的活性氧的含量进行了定量和定性分析，流式定量分析结果如图16所示，mod组(ir组)中探针的荧光强度远高于con组(正常组)，并且差异极显著，说明ir细胞中ros的产生速率升高。rosi处理组中ros产生速率与mod组相比显著降低，并且差异极显著，说明rosi能够减少细胞中ros的产生。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的荭草素、异荭草素和异牡荆素和二苯乙烯类化合物中的土大黄苷能显著降低细胞中ros的产生，且与mod组相比具有差异显著性。
激光共聚焦定性结果如图17所示，mod组中探针的荧光强度远高于con组，说明ir细胞中ros的产生速率升高。rosi处理组中探针的荧光强度与mod组相比显著降低，说明rosi能够减少细胞中ros的产生。化合物处理组中，化合物荭草素、异荭草素、异牡荆素和土大黄苷均能降低细胞中探针的荧光强度，其中化合物异牡荆素和土大黄苷效果最明显。
(2)3t3-l1细胞线粒体膜电势的检测
实验步骤同“流式细胞仪检测2t3-l1细胞中的ros水平”所述步骤，488nm，529/590nm流式检测。
线粒体功能主要体现在维持氧化磷酸化的能力，而这种能力可以用线粒体内膜膜电势来评价。因为，内负外正的膜电势既保证着电子在电子传递链中的电势能，同时又保证氢离子进入线粒体内室的电势能，从而为atp合成提供必要的质子流。因此，线粒体膜电势是的高低是评价线粒体功能的重要指标之一。jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针，可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。在线粒体膜电位较高时，jc-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物(j-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，jc-1不能聚集在线粒体的基质中，此时jc-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。本实验以jc-1作为检测线粒体膜电势的荧光探针，采用流式细胞仪对3t3-l1细胞中的活性氧的含量进行了分析，实验结果如图18所示，mod组中红色/绿色的比值远高于con组，说明ir细胞中线粒体膜电势降低。rosi处理组中红色/绿色比值与mod组相比显著降低，说明rosi能升高ir导致的3t3-l1细胞线粒体膜电势降低。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的荭草素、异荭草素、异牡荆素、与二苯乙烯类化合物中的土大黄苷和丹叶大黄素能一定程度恢复3t3-l1细胞线粒体膜电势，其中化合物异牡荆素效果最明显。
(3)3t3-l1细胞atp含量的检测
实验步骤同“流式细胞仪检测2t3-l1细胞中的ros水平”所述步骤，采用增强型atp检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)进行atp含量检测，atp是生物机体主要的能量物质，由线粒体内膜氧化磷酸化产生内膜质子梯度，质子回流时促使atp合酶合成atp。atp的产生能力是线粒体功能的一个主要指标，如果线粒体内膜损伤产生质子漏或氧化磷酸化受损，atp的合成均会受损。本实验利用atp含量测定试剂盒测定了胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中atp产生的影响，实验结果如图19所示。图19显示，mod组中细胞中atp的含量显著低于con组，且差异极显著，说明ir可以导致3t3-l1脂肪细胞中atp的合成下降。与mod相比rosi处理组中细胞atp含量增加，并且差异显著。而胡芦巴胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素和牡荆素与二苯乙烯类化合物中的土大黄苷均能增加细胞中atp的含量，与mod组相比具有差异显著性。
(4)3t3-l1细胞线粒体dna损伤的检测
实验步骤同“流式细胞仪检测2t3-l1细胞中的ros水平”所述步骤，提取细胞基因组dna，琼脂糖电泳鉴定dna的完整性，将电泳完的胶放到紫外成像系统中进行观察，若条带清晰且无拖尾现象，表明dna完整性较好。
利用longpcr检测3t3-l1细胞线粒体dna的损伤，具体方法如下：
a.根据文献提供的基因序列(线粒体全基因组genbank:j01420.1)，引物由上海生物工程股份有限公司合成，线粒体相关基因的引物序列如表4所示：
表4线粒体longpcr引物序列
b.配制pcr扩增反应体系，如表5所示：
表5pcr反应体系组分
c.将上述反应液放pcr仪中进行扩增，pcr反应条件如表6所示：
表6长片段实时荧光定量pcr反应程序
表7短片段实时荧光定量pcr反应程序
d.pcr反应完成后立即进行dna电泳，长片段用1％的琼脂糖凝胶120v电泳30min左右，短片断用0.5％的琼脂糖凝胶120v电泳40-60min左右待目的条带完全分开，然后立即于凝胶成像系统中进行观察，拍照。
线粒体dna损伤的程度采用pcr扩增出的长片段目的基因与短片段目的基因的比值来表示。其中长片段中dna损伤程度越大，pcr扩增就会受阻，扩增越慢。因此dna损伤程度不同，相同时间扩增出来的目的基因的量也就不同，而短片段由于基因序列较短，dna损伤对pcr扩增影响较小。因此长片段与短片段的比值可以用来表示线粒体dna损伤的程度。
线粒体dna所含的基因组都是和线粒体电子传递链的功能有关，其序列编码2个rrna、22个trna和13个参与线粒体内膜呼吸酶组成的多肽。当活性氧形成与分解的平衡失调时，机体处于氧化应激状态。不论活性氧的增加是内源性还是外源性，均能引起线粒体dna的氧化损伤。线粒体dna自身的结构及功能特点和所在生理位置决定了其比核dna更易于受到氧化损伤的攻击，而氧化损伤引致的线粒体dna突变或其基因产物丢失又会进一步促进活性氧的释放。本实验采用longpcr的方法研究了胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中线粒体dna损伤的影响，线粒体dna损伤的实验结果如图20所示。
图20表明，线粒体mod组中长片段扩增出的目的基因与con组相比减少，说明ir模型中线粒体dna受到损伤，而rosi组中线粒体dna损伤程度明显减轻。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素组和二苯乙烯类化合物中的土大黄苷组中线粒体dna损伤受到抑制，说明异荭草素和土大黄苷对线粒体dna具有一定的保护作用。
(5)3t3-l1细胞线粒体发生基因转录水平的检测
细胞的培养与化合物处理方法与ros水平检测实验相同，化合物处理完成后收集细胞，trizol法抽提总rna，然后进行逆转录合成cdna，最后利用实时荧光定量pcr法检测3t3-l1细胞中线粒体相关基因转录水平的变化，实时荧光定量pcr具体方法如下：
a.根据文献提供的基因序列，引物由上海生物工程股份有限公司合成，β-actin(genbank登录号:nc_000071.6)、drp1(genbank登录号:ab079133.1)、mfn1(genbank登录号:nm_024200.4)、mfn2(genbank登录号:ay123975.1)、nrf1(genbank登录号:af098077.1)、pgc-1(genbank登录号:af049330.1)和tfam(genbank登录号:ah003701.2)的引物序列如表8所示：
表8实时荧光定量pcr引物序列
b.配制pcr扩增反应体系，如表9所示：
表9实时荧光定量pcr反应体系组分
c.将上述反应液放入荧光定量pcr仪中进行扩增，pcr反应条件如表10所示：
表10实时荧光定量pcr反应程序
目的基因的表达采用比较ct值的方法，用内参基因β-actin来校正差异，变化的倍数量为2-△△ct。计算公式为：变化倍数＝2-△△ct，其中，△△ct＝(ct目标基因-ct内参基因)药物处理组-(ct目标基因-ct内参基因)control。
使用统计学软件spss16.0进行统计学分析，两组间均数的比较采用独立样本t检验，多组间均数的比较釆用单因素方差分析(one-wayanova)，实验统计数据以平均值±标准差
线粒体生物发生在维持线粒体功能和数目以满足真核细胞生理需要方面具有重要作用。疾病状态下，若线粒体损伤后，线粒体生物发生增强则有助于维持线粒体功能和细胞能量状态，进而促进组织器官修复；反之，若线粒体生物发生受损与线粒体功能障碍同时出现，则可使线粒体功能进一步恶化，加重细胞、组织功能损伤。本研究中采用实时荧光定量pcr研究了胡芦巴化合物对3t3-l1细胞中线粒体的发生相关基因nrf1、pgc-1和tfam转录水平的影响，实验结果如图21所示：
图21表明，mod组中nrf1的转录水平降低，与con组相比差异性显著，说明ir导致3t3-l1细胞中nrf1表达水平降低。rosi处理组中，nrf1转录水平显著增高，并且与mod相比差异极显著，说明rosi能够改善ir所至的nrf1转录水平的降低。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的异荭草素、牡荆素和异牡荆素与二苯乙烯类化合物中的土大黄苷均能使nrf1转录水平显著增高，其中异荭草素组和异牡荆素组与mod相比差异显著，牡荆素组和土大黄苷组与mod相比差异极显著。
图22表明，mod组中pgc-1的转录水平降低，与con组相比差异性极显著，说明ir状态的3t3-l1细胞中线粒体发生基因pgc-1表达水平降低，线粒体发生可能出现障碍。rosi处理组中，pgc-1转录水平显著增高，并且与mod相比差异极显著，说明rosi能够改善ir所至的线粒体发生基因pgc-1转录水平的降低。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物与二苯乙烯类化合物对pgc-1转录水平影响都不明显，其中荭草素、异荭草素和土大黄苷能够轻微上调pgc-1转录水平，但与mod相比不具有差异显著性。
图23表明，与con组相比mod组中tfam的转录水平降低，具有极显著性差异，说明ir状态的3t3-l1细胞中线粒体发生基因tfam表达水平降低，线粒体发生可能出现障碍。rosi处理组中，tfam转录水平显著增高，并且与mod相比差异极显著，说明rosi能够改善ir所至的线粒体发生基因tfam转录水平的降低。胡芦巴化合物处理组中，黄酮类化合物中的荭草素能够下调其转录水平，而异荭草素和异牡荆素以及二苯乙烯化合物中土大黄苷能够上调其转录水平，并且与mod组相比都具有差异极显著性。
线粒体功能损伤和胰岛素抵抗有着密切的关系，目前越来越多的证据表明，ir是诱发胰岛素抵抗的主要因素之一。细胞内活性氧产生的多少、线粒体膜电势的高低、atp的生成、线粒体dna损伤情况、线粒体的发生等都能会影响线粒体的功能，其中任何一项指标出现问题线粒体的功能均会受到影响。实验中分别对以上各项指标进行了研究。线粒体功能研究结果显示，胡芦巴化合物中荭草素、异荭草素、异牡荆素和土大黄苷能降低细胞中ros的产生，这可能与胡芦巴化合物结构中的酚羟基的数目与位置有关；与此同时荭草素、异荭草素、异牡荆素和土大黄苷还能一定程度恢复3t3-l1细胞线粒体膜电势，增加细胞中atp的产生，够保护线粒体dna受到损伤，并能一定程度上促进线粒体发生。说明胡芦巴化合物能够在一定程度上改善ir引起的3t3-l1细胞中线粒体的功能损伤，并通过缓解线粒体功能及促进线粒体发生时能来改善细胞代谢状态，进而达到改善糖脂代谢的作用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110>中国科学院西北高原生物研究所
<120>异荭草素在制备与胰岛素抵抗相关疾病中的用途
<160>0
<170>siposequencelisting1.0