一种异鼠李素的新用途
【专利摘要】本发明公开了一种异鼠李素的新用途，所述的新用途是指以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗肠炎的药物或保健食品。研究结果表明：异鼠李素可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻、血便、结肠缩短和组织病理损伤等症状，可抑制结肠组织炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达，因此，以异鼠李素作为活性成分可望开发成治疗肠炎的药物或保健食品，尤其可望开发成治疗溃疡性结肠炎的药物或保健食品。
【专利说明】一种异鼠李素的新用途【技术领域】
[0001]本发明涉及异鼠李素的一种新用途，具体说，是涉及异鼠李素在制备治疗肠炎的药物或保健食品中的应用，属于中药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]溃瘍性结肠炎(Ulcerativecolitis, UC)属于炎症性肠病(Inf lammatory boweldisease, IBD)，其病因及发病机制目前尚不清楚，免疫系统异常是造成炎症和组织损伤的内在因素，并与遗传、环境、微生物等因素密切相关。临床表现主要是腹泻、腹痛、粘液脓血便和反复发作。结肠镜检可见黏膜充血、水肿、糜烂出血及溃疡。国外流行病学资料显示，本病可发生于任何年龄，多见于20-40岁的青壮年，在15-25岁好发人群中发病率为50~100/10万。近年来随着生活水平的提高，饮食结构、生活方式的改变，在我国发病率呈逐年上升趋势。本病病程长，反复发作，严重影响患者生活质量，且长期患者中有5~10%发生癌变，临床上至今尚无有效治疗措施，被世界卫生组织列为现代难治病之一。
[0003]目前治疗UC的西药主要有氨基水杨酸类、糖皮质激素类以及免疫抑制剂。效果都不很理想，且副作用大，不易长期使用。柳氮磺胺吡啶(SASP)是目前临床最常用的药物，适用于中度、轻度和慢性UC患者。口服后在肠内分解为磺胺吡啶及5-氨基水杨酸。对结肠肠壁组织有特别亲和力，起到抗炎作用。口服SASP后有10%~40%的患者出现恶心、消化不良、头痛、白细胞下降等不良反应，偶有引起关节痛、皮疹、蛋白尿及胰腺炎等，多数不良反应都归因于SASP的磺胺吡啶部分。
[0004]由于我国中药资源丰富，从天然植物中筛选具有活性的新化合物或已知结构的天然化合物的新用途已成为新药开发的主要途径之一。因此，本领域迫切需要从天然植物中寻找高效、低毒的治疗UC的药物。
[0005]异鼠李素是从银杏、沙棘等药用植物中分离提纯的黄酮类化合物，亦广泛存在于其他多种植物的花、果实和叶中。大量研究发现，异鼠李素具有保护心血管(抗心肌缺氧、缺血，缓解心绞痛、抗心律失常、降低血清胆固醇、促进血流通畅等)、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗过敏及调节免疫功能等多种生物活性。但目前未见异鼠李素可作为活性成分用于制备治疗肠炎的药物或保健食品的相关报道。
[0006]在饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium, DSS)直接给动物自由饮用，造成结肠黏膜的组织结构破坏和炎性细胞浸润，是国际通用的溃疡性结肠炎造模方法(Gastroenterology, 1990,98:694-702 ;Digestive Disease and Science,1993,38:1722-34)。此种造模方法引起的病灶部位主要集中于结肠，也可累及小肠，其症状类似人类溃瘍性结肠炎(Yatrik M Sha, etal.Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol.2007，292:G1114_1122)，所以目前被广泛采用(中国专利00118309.5“二甲硅油治疗溃疡性结肠炎的应用”)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种异鼠李素的新用途，以充分发挥异鼠李素在临床中的药用价值。
[0008]本发明所述的异鼠李素的一种新用途，是指以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗肠炎的药物或保健食品。
[0009]作为一种优选方案，所述的异鼠李素的一种新用途，是指以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗小肠炎或/和结肠炎的药物或保健食品。
[0010]作为进一步优选方案，所述的异鼠李素的一种新用途，是指以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物或保健食品。
[0011]上述的异鼠李素的纯度推荐>50%，以>90%较佳，以>98%最佳。
[0012]上述的药物可以是任何可药用的剂型，包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如:胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
[0013]实验结果表明，异鼠李素可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻、血便、结肠缩短和组织病理损伤等症状，可抑制结肠组织炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达。因此，以异鼠李素作为活性成分可望 开发成治疗肠炎的药物或保健食品，尤其可望开发成治疗溃疡性结肠炎的药物或保健食品。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠体重的影响；
[0015]图2体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠血便发生率的影响；
[0016]图3体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响；
[0017]图4-5体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理的影响；
[0018]图6体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的TNF-α表达的影响；
[0019]图7体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的IL-6表达的影响；
[0020]图中:a表示正常对照组，b表示模型对照组，c表示阳性对照组，d表示用药组。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。
[0022]实施例中所用的异鼠李素来源为市售，如Sigma化学公司、成都曼斯特生物科技有限公司等，所用样品的纯度均符合药用标准。
[0023]实施例
[0024]1、实验材料
[0025]1.1 药材
[0026]异鼠李素(CAS:480-19-3，分子量316.26，HPLC纯度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司);葡聚糖硫酸钠(DSS，CAS:9011-18-1,分子量35000~44000，由MP BiomedicalLLC公司生产);柳氮磺胺吡啶(SASP，CAS:599-79-1，分子量398.39，HPLC纯度≤98%，由Sigma公司生产)。
[0027]1.2实验动物
[0028]体重20±2g的C57BL/6小鼠(8_10周)，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号:SYXK (沪)2009-0069。置于常规饲养环境，自由进食和饮水。
[0029]2、实验方法
[0030]2.1溃疡性结肠炎模型的建立
[0031]选择体重均一的C57BL/6小鼠(20±2g，8_10周)，将DSS加入蒸馏水中配成5%(w/V)的溶液，直接给小鼠自由饮用。
[0032]2.2分组及给药方法
[0033]正常对照组:10只，给予正常饮食。
[0034]模型对照组:10只，给予5%DSS溶液自由饮用5天，从第5天开始换成正常饮用水，同时灌胃给予生理盐水连续7天。
[0035]阳性对照组:10只，给予5%DSS溶液自由饮用5天，从第5天开始换成正常饮用水，同时灌胃给予SASP (350mg/kg)连续7天。
[0036]用药组:10只，给予5%DSS溶`液自由饮用5天，从第5天开始换成正常饮用水，同时灌胃给予异鼠李素(50mg/kg)连续7天。
[0037]2.3肠炎的评估
[0038]实验期间每天记录体重变化，腹泻症状及血便症状。实验结束后麻醉并颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，取出结肠，测量从盲肠到直肠的结肠长度。并取结肠做组织切片，进行H&E染色。
[0039]结肠标本病理评分:(I)炎症细胞的渗出评分标准:0分-黏膜固有层内有极少量炎症细胞，I分-黏膜固有层内有较多的炎症细胞或黏膜固有层内的炎症细胞增多，2分-炎症细胞扩散至黏膜下层，3分-全层均有炎症细胞渗出；(2)组织损坏评分标准:0分-无黏膜损伤，I分-非连续的黏膜上皮损坏，2分-表层黏膜糜烂，3分-广泛的黏膜破损并向肠壁深层扩展；将炎症细胞的渗出和组织损坏计分相加，计算出组织病理评分(1-6分)。
[0040]2.4荧光定量RT-PCR检测结肠组织的TNF- α和IL-6的表达
[0041]体内药效实验结束后取结肠组织，用Trizol试剂提取结肠总RNA并定量，取
3μ gRNA用M-MLV反转录酶制备cDNA。以cDNA为模板，在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR 反应体系:2X SYBR Premix Ex Taq (TakaRa, cat:DRR420A) 5 μ L> ForwardPrimer 0.4 μ L、Reverse Primer 0.4uL、50XR0X Reference Dye 0.4 μ L、cDNAl μ L、dH20
2.8 μ L，总体积为10 μ L。PCR反应参数:95°C、30s预变性，95°C、5s变性，60°C、30s退火，共40个循环。每次扩增设置β-actin内参照。引物序列如下:
[0042]mTNF- α:正义链 5，—CGTGGAACTGGCAGAAGAGG—3，，
[0043]反义链5’ 一AGACAGAAGAGCGTGGTGGC—3’ ；
[0044]mIL-6:正义链 5，ACCACGGCCTTCCCTACTTC—3，，
[0045]反义链5’ 一CATTTCCACGATTTCCCAGA—3’ ；[0046]β -Actin:正义链 5’ 一CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT—3’，
[0047]反义链5，GGTCTTTACGGATGTCAACG—3，。
[0048]用PCR扩增仪自带软件进行荧光定量分析，并得出Ct值。通过计算2_ΛΛετ得出各组基因的相对表达水平。
[0049]2.5统计分析
[0050]所有实验数据均重复3次，结果以平均值土标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件对实验数据采用单向方差分析(One-way ANOVA)及LSD检验，P〈0.05为统计学上差异有显著性。
[0051]3、结果
[0052]3.1异鼠李素对溃疡性结肠炎的治疗作用
[0053]3.1.1对溃疡性结肠炎小鼠体重的影响
[0054]图1体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠体重的影响，由图1可见:正常对照组小鼠的体重增加了 2.7±0.8%，模型组小鼠的体重减轻了 6.8±0.8%，阳性对照组小鼠的体重减轻了 0.7±0.6%，用药组小鼠的体重减轻了 2.4±0.6% ;进一步说明异鼠李素能显著抑制DSS引起的溃疡性结肠炎小鼠的体重下降(P〈0.01)。
[0055]3.1.2对溃疡性结肠炎小鼠血便发生率的影响
[0056]图2体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠血便发生率的影响，由图2可见:正常对照组小鼠无血便发生，模型组小鼠的血便发生率为90±0%，阳性对照组小鼠的血便发生率为33.3 ±5.8%，用药组小鼠的血便发生率为53.3 ±5.8% ;进一步说明异鼠李素能显著减少DSS引起的溃疡性结肠炎小鼠的血便发生率(P〈0.01)。
[0057]3.1.3对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响
[0058]图3体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响，由图3可见:正常对照组小鼠无结肠缩短发生，模型组小鼠的结肠缩短率为37.7±0.5%，阳性对照组小鼠的结肠缩短率为24.1±0.4%，用药组小鼠的结肠缩短率为31.3±0.4% ;进一步说明异鼠李素能显著改善DSS引起的溃疡性结肠炎小鼠的结肠缩短症状(P〈0.05)。
[0059]3.1.4对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理的影响
[0060]图4体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的损伤修复作用，由图4可见:模型组小鼠的结肠组织为典型炎症黏膜表现，可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润，组织结构紊乱、断裂，黏膜下层出血、水肿，毛细血管扩张；阳性对照组小鼠和用药组小鼠的结肠组织可见病变减轻，溃疡愈合，黏膜下层出血减轻。
[0061]另外，图5体现了结肠标本病理评分结果，正常对照组小鼠计分为0，模型组小鼠计分为5±0.5%，阳性对照组小鼠计分为2.5±0.5%，用药组小鼠计分为3.5±0.5%，与模型组相比，差异有显著性(P〈0.05 )。
[0062]综上结肠组织病理分析结果表明:异鼠李素可以减轻结肠黏膜组织病理损伤和炎性细胞浸润。
[0063]3.1.5对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的TNF- α表达的影响
[0064]图6体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的TNF-α表达的影响，由图6可见:模型组小鼠结肠组织TNF-α表达明显高于正常对照组(P <0.001);灌胃给予SASP或异鼠李素后，小鼠结肠组织的TNF-α表达下降，与模型组相比，差异有显著性(P< 0.001)，表明异鼠李素能显著抑制DSS引起的炎症反应中TNF-α的表达。
[0065]3.1.6对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的IL-6表达的影响
[0066]图7体现了异鼠李素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的IL-6表达的影响，由图7可见:模型组小鼠结肠组织IL-6表达明显高于正常对照组(P < 0.001);灌胃给予SASP或异鼠李素后，小鼠结肠组织的IL-6表达下降，与模型组相比，差异有显著性(P < 0.01)，表明异鼠李素能显著抑制DSS引起的炎症反应中IL-6的表达。
[0067]综上研究结果表明，异鼠李素可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻、血便、结肠缩短和组织病理损伤等症状，可抑制结肠组织炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达。因此，以异鼠李素作为活性成分可望开发成治疗肠炎的药物或保健食品，尤其可望开发成治疗溃疡性结肠炎的药物或保健食品。
[0068]最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种异鼠李素的新用途，其特征在于:以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗肠炎的药物或保健食品。
2.根据权利要求1所述的异鼠李素的新用途，其特征在于:以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗小肠炎或/和结肠炎的药物或保健食品。
3.根据权利要求2所述的异鼠李素的新用途，其特征在于:以异鼠李素作为活性成分用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物或保健食品。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的异鼠李素的新用途，其特征在于:所述的异鼠李素的纯度>50%。
5.根据权利要求4所述的异鼠李素的新用途，其特征在于:所述的异鼠李素的纯度>90% ο
6.根据权利要求5所述的异鼠李素的新用途，其特征在于:所述的异鼠李素的纯度>98% ο
【文档编号】A61P1/04GK103462957SQ201210187101
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2012年6月7日
【发明者】窦薇, 王峥涛, 张晶晶, 杨莉, 丁丽丽 申请人:上海中医药大学