白刺种子或其提取物中ss或/和rsMTCA的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从白刺种子或其提取物中同时检测两种手性生物碱的方法。
【背景技术】
[0002] 白刺种子中含有多种活性成分，目前从白刺种子中分离得到了很多活性物质，主 要有以下几类物质，黄酮类：槲皮素、异鼠李素-7-0-a-L-鼠李糖甙、山奈素-7-0-a-L-鼠 李糖甙、异鼠李素-7-0-0-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-0-a-L-鼠李糖甙、异鼠李糖、尿囊 素、胡萝卜苷、异鼠李糖；生物碱类：L-色氨酸、尿囊素和1-甲基_1，2,3,4_四氢-0-咔 啉-3-駿基酸（1-Methyl-l，2, 3,4_tetrahydr〇- 0 -carboline-3-carboxylicacid，简称 MTCA)〇
[0003] MTCA属于吲哚类生物碱，目前吲哚类生物碱的研究已成为抗肿瘤药物活性的热 点。特别是在新药及其新药先导化合物发现中起着不可替代的作用。吲哚类生物碱抗肿瘤 成分主要对卵巢癌、淋巴癌和消化道系统癌如肝癌、结肠癌等有较显著的疗效。此外，吲哚 类生物碱抗肿瘤成分在诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡以及提高机体免疫方面亦表 现出一定的作用。MTCA活性实验表明MTCA具有较强的清除羟基自由基的能力，在细胞浓度 低于30yg/mL时对人表皮细胞Hucat时有一定的促进作用，同时对人肝癌细胞7221细胞 有促进凋亡的作用。
[0004] 研究表明MTCA广泛的存在于食品中如小麦、黑麦面粉、大豆蛋白、牛乳以及酒精 饮料如啤酒和红酒中。从食品、酒精饮料以及生物样品分离出来的MTCA通常会包括两种类 型（1S，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氢-0-咔啉-3-羧基酸（简称ssMTCA)和（1R，3S)-1-甲 基-1，2,3,4-四氢-0-咔啉-3-羧基酸（简称rsMTCA)。在两个MTCA的非对映体中，ssMTCA 的含量是rsMTCA含量的四倍之多。对两种异构体的提取分离研究，可以为更好地认识各异 构体生理活性打下基础。
[0005]
[0006] 目前，还未见对白刺种子或其提取物中的ss、rsMTCA进行HPLC检测报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就在于提供一种对白刺种子或其提取物中ssMTCA或/和rsMTCA进 行检测的方法。
[0008] 具体地，本发明提供了白刺种子中（1S，3S)或/和（1R，3S)构型的1-甲基_1，2， 3,4_四氢-咔啉-3-羧基酸的检测方法，它是采用HPLC技术进行测定的，具体操作如 下：
[0009] (1)供试品溶液的制备：
[0010] 取白刺种子，以乙醇水溶液为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油 醚进行萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10%V/V乙醇溶洗脱，收集10%V/V乙 醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物，取粗提取物制备供试品溶液即可；
[0011] (2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，对（1S，3S)或/和（1R，3S)构型的1-甲 基-1，2, 3,4-四氢-0 -咔啉-3-羧基酸进行测定即可，其中，色谱条件如下：
[0012] 色谱柱：十八烷基键合硅胶柱；
[0013] 流动相A:甲醇；流动相B:水；梯度洗脱条件：0-16min，10 % -27 %V/VA; 16-21min，27% -29%V/VA;21-35min，29% -45%V/VA;检测波长：254 ~280nm，优选为 254nm〇
[0014] 本发明一个【具体实施方式】中，使用的色谱柱型号为AgilentEclipse)(DB-C18。
[0015] 其中，步骤⑴中，提取所用乙醇的浓度为65%~95%，进一步为70%~80%，优 选为 75%V/V。
[0016] 进一步地，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂。
[0017] 更进一步地，所述大孔吸附树脂为D101树脂。
[0018] 其中，供试品溶液的溶剂为水。
[0019] 其中，步骤（2)中，流动相流速为0? 5~lmL/min，优选为lmL/min;柱温为25~ 30°C，优选为 30°C。
[0020] 其中，步骤（2)中，采用面积归一法或者外标法对（1S，3S)或/和（1R，3S)构型的 1-甲基-1，2, 3,4-四氢-0 -咔啉-3-羧基酸进行测定。
[0021] 本发明还提供了白刺种子提取物中（1S，3S)或/和（1R，3S)构型的1-甲基_1，2， 3,4_四氢-咔啉-3-羧基酸的检测方法，它是采用HPLC技术进行测定的，具体操作如 下：
[0022] (1)供试品溶液的制备：
[0023] 取白刺种子提取物，溶解后制备成供试品溶液；其中，白刺种子提取物由如下方法 制备得到：
[0024] 取白刺种子，以乙醇水溶液为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油 醚进行萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10%V/V乙醇溶洗脱，收集10%V/V乙 醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物；取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制 两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的 混合液中，得到样品溶液；以20~40mL/min的流速将固定相栗入主机并充满分离螺线管， 保持温度25~30°C，主机正向旋转，转速为800~1000r/min，以1. 5~3.OmL/min的速度 栗入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254~280nm波长下 进行检测，收集出峰时间300~350min的成分，即得白刺种子提取物；
[0025] (2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，对（1S，3S)或/和（1R，3S)构型的1-甲 基-1，2, 3,4-四氢-0 -咔啉-3-羧基酸进行测定即可，其中，色谱条件如下：
[0026] 流动相A:甲醇；流动相B:水；梯度洗脱条件：0-16min，10 % -27 %V/VA; 16-21min，27% -29%V/VA;21-35min，29% -45%V/VA;检测波长：254nm。
[0027] 进一步地，步骤（1)中，固定相的流速为30mL/min，温度为30°C，主机转速为900r/ min，流动相的流速为1. 7mL/min。
[0028] 进一步地，步骤（2)、（3)中，检测波长为254nm。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] (1)本发明首次在唐古特白刺种子中发现了rsMTCA，基于MTCA在食物、医药领域 的实用性，对白刺种子或其提取物中的ssMTCA和rsMTCA的检测也显得十分必要。本发明 利用特定的流动相洗脱条件，首次实现了分别或同时对白刺种子或其提取物中的ssMTCA、 rsMTCA的检测，为白刺种子或其提取物的开发利用提供了保障。
[0031] (2)ssMTCA和rsMTCA互为光学异构体，两者仅只有在1位的甲基取代构象不同，两 者的化学性质极为相近。毋庸置疑，两者的极性也十分接近，高效液相色谱是利用不同化合 物在流动相和固定相之间的极性选择差异来对不同化合物进行分离从而实现检测的，若是 希望使用液相色谱技术将两个极性极为相似的化合物进行分离，是极其困难的。梯度洗脱 是面对复杂分离过程的首选洗脱方式，然而，梯度洗脱过程中，流动相种类、梯度程序（即 时间和相对应的流动相配比）的选择是无限的，如何选择一种适合于ssMTCA和rsMTCA的 梯度洗脱条件，是需要发明人付出大量的实践和总结、分析才能得到的。本发明最终发现 的流动相梯度洗脱条件，能够有效将白刺种子中的多种化学成分分离，更重要的是，能够将 ssMTCA和rsMTCA分开，为两者化合物的分别测定提供了基础。
【附图说明】
[0032] 图1白刺种子中ssMTCA和rsMTCA的HPLC检测图谱
[0033] 图2白刺种子提取物制备过程中的逆流色谱图
[0034] 图3白刺种子提取物中ssMTCA和rsMTCA的HPLC检测图谱
[0035] 图4ssMTCA对照品的HPLC图谱
[0036] 图5rsMTCA对照品的HPLC图谱
[0037] 图6半制备色谱图
[0038] 图7流动相梯度为0-16-21-35min(10%-29%-29%-45%甲醇）时的色谱图，其 检测的供试品溶液同实施例1