一种灭活益生菌制品、制备方法及其应用与流程

本发明涉及灭活益生菌制品、制备方法及其应用。

背景技术：

益生菌在临床应用非常广泛，能够帮助治疗各种原因所致的腹泻及其引起的紊乱，还可以抑制有害菌生长、减少外来致病菌产生的感染、调节人体免疫力、抑制和延缓某些癌症的进程等等。益生菌的出现，给人们健康带来了福音，对于诸多疾病的康复都有很好的辅助作用，其临床疗效大家有目共睹、毋庸置疑。主要机理如下：

1.生物杀手作用

益生菌的代谢产物，如有机酸(如乙酸、丙酸、乳酸)、细菌素、过氧化氢等活性物质的作用，使肠道ph下降，可抑制或杀死致病菌。

2.生物屏障作用

定植于肠黏膜上皮细胞之间，形成生物膜样结构，阻碍外袭菌的占位和繁殖。紧密结合，与其他厌氧菌一起共同占据肠黏膜表面，形成生物屏障。通过竞争性抑制，与致病性微生物争夺在肠道黏膜的黏附位点，从而占位，参与肠生物屏障的构建，竞争或排斥过路菌和外袭菌的定植。

3.免疫作用

刺激免疫系统，促进免疫因子的分泌，激活免疫细胞，促进免疫系统的发育、成熟，有利于杀灭致病微生物，提高特异性抗体iga产生。

益生菌可以理解为“健康的菌”，这意味着益生菌通常有益于健康而不会导致疾病。但是，临床应用过程中发现，益生菌也可能导致机体产生不良反应，如细菌性和真菌性脓毒血症、全身性感染、促发有害代谢活动、过度免疫刺激、基因转移及胃肠道不良反应等，尤其是在某些特殊人群中需警惕益生菌可能的严重不良反应，如早产儿及免疫功能低下者。

有研究表明，使用酵母菌的患者菌血症的发生率约为1/560万，而乳酸菌更是高达1/100万。整体来说，益生菌导致的全身性感染发生率高达0.05％～0.4％。益生菌可能导致菌血症、真菌血症及脓毒血症的发生，其引发感染的危险程度，除了与个体因素有关外，还和益生菌的种类及剂量有关。发生感染的患者中，大部分是免疫不成熟的早产儿或免疫受损的成人，这也是益生菌相关感染最主要的危险因素。益生菌导致全身感染的危险因素包括，免疫低不成熟、低下或抑制，重症疾病，中心静脉置管及肠上皮屏障损害。这些危险因素均能在临床上遇到，严重疾病、各种血液肿瘤病常存在不同程度的免疫力低下，这种情况下，如果使用益生菌不当，则益生菌引起的菌血症和脑膜炎感染的风险的可能性会大大增加。然而，临床实践中经常遇到这种情况，患者存在严重感染，合并明显的消化道症状(如腹泻)，这时候除了对症治疗外，常常会使用益生菌。事实上，许多报道均表明，严重疾病的时，患者由于疾病应激，常伴有粘膜溃疡或粘膜下层的暴露，这时候肠道的屏障功能受到严重挑战，如果使用益生菌有可能导致细菌移位及继发性菌血症。除了上述危险因素外，急性重症胰腺炎患者应用益生菌不但不能降低感染率，反而可能增加病死率，因此益生菌不适用与急性重症胰腺炎患者。此外，急性胰腺炎、粘膜炎症、氧需求增加所致的肠道灌注不足也可能与益生菌有关。

因此，对于免疫力尚未发育成熟的早产儿以及免疫力低下的临床病人，活性益生菌面临着安全性的问题，灭活益生菌可以为临床应用提供了一种选择。相比较而言，灭活状态的益生菌具有更高的安全性，灭活之后的益生菌不会在体内生长繁殖，不用担心侵染，依赖等问题，也不会引起噬菌体污染暴发；也不用担心活菌体的突变、非正常部位转移以及抗药性基因转移等风险，并且质量稳定性高、无需冷藏、不受生产、运输等环境因素的影响，具有更广泛的应用。

因此提供用于临床病人的灭活益生菌是非常有必要的，以解决现有活菌类制品给早产儿、临床病人等这类特殊人群带来的毒副作用，如细菌性和真菌性脓毒血症、全身性感染、促发有害代谢活动、过度免疫刺激、基因转移及胃肠道不良反应等，同时也可以克服活菌类制品受环境条件(温度、水分、湿度、酸碱度等)影响质量稳定性差、需冷藏存放等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决在临床应用过程中发现的活菌可能导致机体产生不良反应，如细菌性和真菌性脓毒血症、全身性感染、促发有害代谢活动、过度免疫刺激、基因转移及胃肠道不良反应等，尤其是在某些特殊人群中需警惕益生菌可能的严重不良反应，而本发明提供的用于临床病人的灭活益生菌制品，以灭活乳酸菌细胞及其发酵代谢产物为主要有效成分，并且通过试验证实灭活嗜酸乳杆菌具有完整的细胞结构，能够很好地黏附于肠道上皮细胞，并且能够对致病菌如白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等常见致病菌的黏附作用产生显著的拮抗效果，不仅如此，嗜酸乳杆菌发酵上清液还能够抑制致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的生长。因此本发明所述灭活益生菌可用于临床病人，预防和治疗致病菌感染引起的相关疾病。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于临床病人的灭活益生菌制品，包括如下质量配比的组分：灭活益生菌细胞及发酵产物25-50份，其中灭活益生菌细胞10⁸～10¹¹cfu/g，其余为辅料。

本发明灭活益生菌制品，进一步地，所使用益生菌属于国家卫生与计划生育委员会公布的可食用的菌株，包括可用于食品的菌种、可用于婴幼儿食品的菌种或可用于保健食品的菌种中一种或多种。

本发明灭活益生菌制品，进一步地，所述辅料包括但不限于赋形剂、保护剂、食品添加剂或营养强化剂的一种或多种。

本发明还提供灭活益生菌制品的制备方法，包括以下步骤：

1.选取乳酸菌发酵培养，发酵至细胞数达到10⁷cfu/ml以上；

2.发酵培养结束后，将发酵液进行灭活处理；

3.将灭活后的发酵液离心，分离获得湿细胞泥，按质量体积比1:2～1:10适量加入保护剂，进行冷冻干燥后获得灭活益生菌菌体干粉；

4.将灭活后的发酵液离心，分离获得发酵上清液，浓缩后按体积质量比10:1～2:1适量加入赋形剂，进行冷冻干燥后获得灭活发酵上清液干粉；

5.将步骤3和步骤4获得的干粉进行混合，获得的含有菌体和代谢产物的灭活益生菌粉制品。

或将步骤2所获得的灭活后的发酵液进行浓缩，浓缩之后的发酵液按体积质量比10:1～2:1适量加入赋形剂，进行冷冻干燥后获得的含有菌体和代谢产物的灭活益生菌粉制品。

或将步骤1所得发酵液浓缩后按体积质量比10:1～2:1适量加入赋形剂进行烘干灭活干燥后获得的含有菌体和代谢产物的灭活益生菌粉制品。

优选地，所述保护剂和赋形剂为脱脂奶粉、乳糖、海藻糖、磷酸氢二钠、蔗糖、维生素c、谷氨酸钠、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、淀粉中的一种或多种。

本发明涉及使用益生菌的一种或多种灭活菌株的方法，优选地，所述灭活方法可以是热灭活、冷冻灭活或者化学灭活，并且所选灭活方法使得灭活菌株与有活力菌株相同或相似的生物反应属性，拥有与活性益生菌相同甚至更好的效果。

本发明所述的灭活益生菌制品，其中益生菌是无活力的，但是其细胞组分仍然保持与活性益生菌有活力或未灭活细胞相同或相似的生物反应属性，拥有与活菌相同甚至更好的效果，益生菌发酵后经过灭活处理，灭活的益生菌细胞不仅能高效黏附到人和动物的肠道上皮细胞，而且能抑制致病菌对对肠道上皮细胞的黏附，其发酵代谢产物还能够抑制致病菌的生长繁殖。除此以外，与活菌相比，本发明所述灭活益生菌至少具有以下优点：灭活益生菌不会在体内生长繁殖，不用担心侵染，依赖等问题，不会引起噬菌体污染暴发，也不用担心活菌体的突变、非正常部位转移以及抗药性基因转移等风险，从而具有更高的安全性，并且质量稳定性高(无需冷藏、不受生产、运输等环境因素的影响，对高温、干燥以及辐射等环境具有很强的抗性)，可能还可以有效吸附有害物质如霉菌毒素、重金属等，因此具有更广泛的应用。

附图说明

图1.灭活前后细胞完整性；

图2.灭活与活性嗜酸乳杆菌对肠道上皮细胞cao-2的黏附能力对比；

图3.灭活嗜酸乳杆菌对白色念珠菌黏附力的拮抗能力；

图4.灭活嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌黏附力的拮抗能力；

图5.灭活嗜酸乳杆菌对大肠埃希菌黏附力的拮抗能力；

图6.嗜酸乳杆菌发酵上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌能力；

图7.嗜酸乳杆菌发酵上清液对大肠埃希菌的抑菌能力。

具体实施方式

下面将提供下文所述的本发明实施方案、一个或多个实施例的详情以供参考。提供各实例是为了解释本发明，而不是对本发明的限制。实际上，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和变动。

实施例1：不同灭活温度、灭活时间的筛选

随着对益生菌研究的深入,人们发现灭活状态的益生菌在多个方面较活菌具备更大的优势。研究灭活益生菌,主要采用的灭活方法有热灭活、γ-射线灭活、紫外线灭活和酸灭活。热灭活是灭活方法中最重要也是应用最为广泛的一种，具有安全性性高、无残留、易操作等优点。当环境温度超过益生菌生长的最高生长温度后,就会导致益生菌细胞成分发生不可逆的失活死亡。不同的益生菌对温度的敏感性不一样,益生菌的抗热性越高,灭活所需要的温度要求就越高,灭活所需要的时间就越长。

以灭活之后益生菌细胞的成活率为指标，筛选灭活工艺，同时观察灭活之后细胞的完整性。

嗜酸乳杆菌的培养方法：在无菌环境下，接种嗜酸乳杆菌于300ml液体培养基的500ml三角瓶中，置于37℃培养箱中，静置培养24h(每隔2h轻轻手动摇匀一次)，培养结束后进行活菌数的测定。

灭活方法：培养结束，用10ml移液枪反复吹打均匀，取10ml/管(离心管)，用于灭活试验，将水浴锅温度调整到试验设计温度，除对照组外，其余离心管置于不同温度的水浴锅内，手动震荡。按照试验设计灭活时间，时间到达后分别取出离心管，用纯化水迅速冷却。取样进行活菌数的测定。

表1.不同灭活参数灭活之后的细胞存活率

表2.不同灭活参数灭活之后的细胞存活率

表3.不同灭活参数灭活之后的细胞存活率

表4.不同灭活参数灭活之后的细胞存活率

如表1-4的结果可知，当温度达到75℃，灭活时间达到10min，嗜酸乳杆菌可以被完全灭活，细胞成活率都为0‰，并且通过显微镜观察如图1可知灭活之后的细胞完整性良好，与灭活之前无差异，而细胞完整性是乳酸菌发挥益生作用的重要前提。因此后续试验可选择75℃以上、10min以上的灭活工艺。

实施例2：对比灭活与活性嗜酸乳杆菌对肠道上皮细胞cao-2的黏附能力

致病菌人侵宿主的第一步是黏附，进而表达毒力因子，作用于被感染的宿主细胞使其发生病变，益生菌具有抵御外籍菌定植所表现出的定植抗性，即益生菌通过黏附素与黏膜上皮细胞受体黏附，然后占位定植，以阻止致病菌与黏膜受体结合产生黏附。因此益生菌对黏膜细胞的黏附是益生菌发挥其黏膜保护作用的首要条件，使其定植在肠道，从而在生态位上竞争性的抑制其它致病菌的黏附，调节免疫系统，修复受损的肠道粘膜。传统观点认为，只有活菌才具有粘附能力，但根据国外的研究发现，灭活乳酸菌也具有与活菌相同的黏附能力。

将人结直肠腺癌细胞caco-2培养长成单层细胞后，胰酶消化，将细胞以每毫升1×10⁵个细胞的量加入到6孔组织细胞培养板中，37℃条件下于co²培养箱中恒温培养至长成单层细胞后进行黏附试验。将caco-2细胞培养板用无菌pbs清洗2次，加入1ml制备好的嗜酸乳杆菌活菌体悬液或灭活嗜酸乳杆菌体悬液(10⁸cfu/ml)，每个样品重复3孔，在co²培养箱中37℃培养2h。之后移去菌体悬液，用无菌pbs洗涤4次，以除去未黏附的嗜酸乳杆菌，然后每孔用无水乙醇固定30min，清洗后，进行革兰氏染色，干燥后计数。显微镜随机观察20个400×视野，记录100个细胞上黏附的嗜酸乳杆菌数。

黏附实验重复3次，运用统计学方法计算黏附指数的平均数和标准差。

如表5和图2所示，通过对比灭活嗜酸乳杆菌和活性嗜酸乳杆菌对人结直肠腺癌细胞cao-2的黏附指数，试验结果表明，两种状态的嗜酸乳杆菌均能够黏附于人结直肠腺癌细胞cao-2，且灭活之后的嗜酸乳杆菌表现出更好的黏附能力，而良好的黏附能力正是是乳酸菌进行占位定植发挥其黏膜保护作用的重要前提，通过黏附素与黏膜上皮细胞受体黏附，然后占位定植，以阻止致病菌与黏膜受体结合产生黏附。因此本实例通过灭活乳酸菌具有良好的黏附能力表明其能够在肠道进行占位定植，进而阻止致病菌对肠道上皮细胞的黏附，调节免疫系统，修复受损的肠道粘膜，最终达到预防和治疗致病菌引起的相关疾病的效果。

实施例3：灭活嗜酸乳杆菌对致病菌黏附于肠道上皮细胞cao-2的拮抗能力

parkesgareth等人在权威医学杂志《柳叶刀》上总结了益生菌抑制腹泻发生的机制，致病菌首先要黏附于人体肠道上皮细胞，然后大量生长繁殖，最终侵入体内，从而引起疾病，一旦益生菌切断致病菌致病的各个途径，则能够从根本上抑制疾病的发生。因此抑制致病菌黏附是乳杆菌抑制疾病发生的关键环节，将肠道致病菌从肠道上皮细胞黏附位点脱落，能够有效预防疾病的发生。

黏附拮抗试验：

1.细胞caco-2的准备：按《细胞复苏、冻存、传代、培养、冻存标准操作规程》培养细胞，caco-2细胞使用胰酶消化，37℃，5min，使用含有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基终止消化。然后低速离心机1400r/min，3min离心，使用imdm培养液通过细胞计数板调节其浓度为1×105个/ml，分别吸取2ml细胞液加入到内置盖玻片的6孔培养板各孔中，37℃，5％co2孵育箱中培养，18-24h后，caco-2细胞粘附在盖玻片上，吸出溶液，使用imdm培养基清洗3次，准备开始试验。

2.灭活嗜酸乳杆菌对的细胞caco-2的粘附拮抗试验：

排斥试验：

使用imdm培养基清洗未粘附的细胞caco-2。每孔分别加入灭活嗜酸乳杆菌悬液1ml，共2孔；同时加1ml稀释液于已制备好的细胞培养板孔中，共1孔，作为只加入致病菌的对照组，37℃，5％co2孵育箱中培养1h后，使用无菌pbs液体漂洗3次，去除未粘附的灭活嗜酸乳杆菌；每孔再加入致病菌悬液1ml，37℃，5％co2孵育箱中培养1h后终止培养，使用imdm培养基漂洗3次，取出盖玻片，自然干燥，然后甲醇固定30min，进行革兰染色，每个盖玻片油镜下随机计数50个肠道细胞，推算出每个肠道细胞的平均粘附拮抗指数。

置换试验：

使用imdm培养基清洗未粘附的细胞caco-2。每孔分别加入致病菌悬液1ml，共2孔；同时设置只加致病菌悬液1ml的对照组，共1孔；37℃，5％co2孵育箱中培养1h后，使用imdm培养基漂洗3次，去除未粘附的致病菌；每孔再分别加入灭活嗜酸乳杆菌1ml，对照组以1ml稀释液取代灭活嗜酸乳杆菌液，37℃，5％co2孵育箱中培养1h后终止培养，使用imdm培养基漂洗3次，取出盖玻片，自然干燥，然后甲醇固定30min，革兰染色，每个盖玻片油镜下随机计数50个肠道细胞，推算出每个肠道细胞的平均粘附拮抗指数。

竞争试验：

使用imdm培养基清洗未粘附的caco-2。每孔分别加入灭活嗜酸乳杆菌悬液1ml，共2孔；同时再加入致病菌悬液1ml混匀，并设置只加入1ml稀释液和1ml致病菌的对照组，共1孔；37℃，5％co2孵育箱中培养1h后终止培养，使用imdm培养基洗3次，取出盖玻片，自然干燥，然后甲醇固定30min，革兰染色，每个盖玻片油镜下随机计数50个肠道细胞，推算出每个肠道细胞的平均粘附拮抗指数，并计算出细胞粘附抑制率。

如图3所示，可知与对照组相比，添加灭活嗜酸乳杆菌之后，白色念珠菌对细胞caco-2的黏附能力大幅度下降，表明灭活嗜酸乳杆菌能够抑制白色念珠菌的黏附能力，抑制致病菌黏附是乳杆菌抑制疾病发生的关键环节，进而预防白色念珠菌感染引起的疾病。

白色念珠菌(candidaalbicans)是引起免疫低下宿主感染的重要条件致病真菌。尽管有抗真菌药物的治疗,但真菌菌血症的病死率仍高,特别是念珠菌菌血症的病死率高达40％—80％。有报道,深部白色念珠菌感染病死率为68.9％。而白色念珠菌致病的首要条件就是黏附。该病原菌既可侵犯皮肤和黏膜，又能累及内脏。最常见的两种综合征为黏膜皮肤念珠菌病(例如口咽念珠菌病或鹅口疮，食管炎和阴道炎)和侵袭性或深部器官念珠菌病(例如念珠菌血症，慢性播散性或肝脾念珠菌病，心内膜炎等)。因此本发明所涉及的灭活嗜酸乳杆菌可预防或治疗油白色念珠菌感染引起的相关疾病，相比于活菌制剂、抗生素，灭活嗜酸乳杆菌应用于临床病人将更具有安全性、更少的副作用，减少感染的发生。

如图4所示，可知与对照组相比，添加灭活嗜酸乳杆菌之后，金黄色葡萄球菌对细胞caco-2的黏附能力大幅度下降，表明灭活嗜酸乳杆菌能够抑制金黄色葡萄球菌的黏附能力，进而预防金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83％，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

如图5所示，可知与对照组相比，添加灭活嗜酸乳杆菌之后，大肠埃希菌对细胞caco-2的黏附能力大幅度下降，表明灭活嗜酸乳杆菌能够抑制大肠埃希菌的黏附能力，进而预防大肠埃希菌感染引起的疾病。

大肠埃希菌可引起感染性疾病：①肠道外感染：泌尿道感染、菌血症、胆囊炎、肺炎、新生儿脑膜炎②肠道内感染：急性腹泻、慢性腹泻、出血性肠炎。

实施例4：嗜酸乳杆菌代谢产物对致病菌生长繁殖的抑制能力

益生菌通过和致病菌直接竞争结合位点抑制致病菌黏附；产生抗菌物质抑制致病菌生长；改变机体免疫系统等手段能够抑制致病菌在肠道的定植，而且益生菌产生一些分子能够对肠道上皮细胞的更新和功能有影响。

人体每天通过饮食等方式摄入大量致病菌，这些致病菌可能定植肠道中，但并没有引起致病，主要原因是肠道中存在的大量乳杆菌菌群能够产生各种抑菌物质抑制致病菌的大量繁殖，从而避免其引起疾病。

代谢产物体外抑制致病菌生长试验:

1.嗜酸乳杆菌发酵上清液的制备

嗜酸乳杆菌在mrs培养基中37℃厌氧培养24h，活化三代备用，将嗜酸乳杆菌的mrs培养液装入离心管中，以4000r/min的转速离心15min。然后用微孔滤膜过滤除菌，得到上清液。

2.致病菌悬液的制备

接种致病菌10ml液体培养基内，置37℃培养箱培养24h；刮取上述2-5个平皿中的新鲜菌苔至10ml生理盐水中充分混匀制成菌悬液，测定其od600值，通过分光光度计进行计数，将其终浓度调整为1×10⁵cfu/ml，2小时内使用。

3.琼脂扩散法测定嗜酸乳杆菌培养上清液的抑菌能力

分别取上述制备好的致病菌悬液400μl加入到致病菌固体培养皿中，用三角型玻璃棒涂布均匀，无菌条件下通风吹干表面液体后，用无菌镊子将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，每个平板放置3个牛津杯，分别向2个牛津杯中滴加250μl嗜酸乳杆菌培养上清液，向1个牛津杯中滴加嗜酸乳杆菌液体培养基250μl做空白对照，37℃培养24h后，测量抑菌圈直径，并拍照，每个样品每种菌悬液做3个平板。

从图6中可以看出，与对照组相比，嗜酸乳杆菌发酵上清液对致病菌金黄色葡萄球菌能够产生明显的抑制作用。可能是由于嗜酸乳杆菌发酵产生抑菌物质如乳酸、过氧化氢、抗菌肽等，从而对致病菌金黄色葡萄球菌的生长产生显著的抑制效果，进而预防或治疗因金黄色葡萄球菌感染而引起的相关疾病。

从图7中可以看出，与对照组相比，嗜酸乳杆菌发酵上清液对致病菌大肠埃希菌能够产生抑制作用。可能是由于嗜酸乳杆菌发酵产生抑菌物质如乳酸、过氧化氢、抗菌肽等，从而对致病菌大肠埃希菌的生长产生抑制效果，进而预防或治疗因大肠埃希菌而引起的相关疾病。

致病菌感染引起相关疾病的机制首先是致病菌要黏附于人体肠道上皮细胞，然后大量生长繁殖，产生毒素，从而引起疾病。而本发明的灭活益生菌制品正是通过试验验证其可以切断致病菌致病的各个途径如定植、生长等，从根本上预防和治疗相关疾病。