一种免疫原和抗体的复合疫苗及其制备方法与流程

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种免疫原和抗体的复合疫苗及其制备方法。

背景技术：

疫苗和抗体归属于药物中的生物制品类，是防控细菌、病毒等病原引起的疫病及生物毒素(如蛇毒)所致疾病的特异药品。英国詹呐(edwardjenner)于1798年发明了预防人类天花的牛痘疫苗。180年后，即1979年，人类应用该疫苗成功消灭了对其危害极大的天花病。1881年，巴斯德(louispasteur)首先发现灭活的禽霍乱巴氏杆菌的免疫效力，同时又研制出炭疽、狂犬病的人工致弱的活疫苗。之后，各种疫苗应运而生。除了广泛知晓的针对病原微生物的疫苗和类毒素外，还有针对蛇等分泌的生物毒素的疫苗、针对过敏原的抗过敏疫苗、针对生物激素研制的去势、避孕及促生长的疫苗。近年来，抗肿瘤的疫苗已是研究热点。

疫苗中的有效成分称为免疫原(免疫学称为抗原)。免疫原在递呈细胞的帮助下诱导t、b淋巴细胞产生特异的主动免疫应答，或产生细胞因子，如白介素或干扰素，或产生如细胞毒性t淋巴细胞这样的特异免疫细胞，或分化为浆细胞分泌抗体，发挥特异免疫效力。疫苗中的免疫原可区分为活的和死的两大类。活的免疫原是指能够繁殖的细菌或能够复制的病毒，但必须是对动物无毒力或低毒力，其诱导动物的主动免疫应答所需时间短，通常为数天。活的免疫原存在潜在的生物安全性问题，原因是其需要繁殖或复制才能诱导出免疫力。而在其繁殖和复制时可出现毒力返强引发疫病灾难。因此，危害重大的病原，如口蹄疫病毒、高致病力禽流感病毒等不能制成活疫苗。

死的免疫原是无繁殖或复制能力的免疫原的总称。传统的死免疫原是用化学试剂和物理方法杀灭病原制备的。由于化学试剂如甲醛溶液不能灭活病毒核酸，而存生物安全隐患，之后用超声波、高压等物理方法及用酶等生物化学方法破碎裂解病原，提取其有效组分制成亚单位疫苗。1980年代后，基因重组技术及利用原核或真核生物表达技术，亚单位疫苗有了新的制备方法。近十年来，利用基因重组技术还创新出生产空壳病毒制作成有效的疫苗。转基因技术将免疫原基因在植物中表达也可生产出亚单位疫苗。随着技术革新，化学合成成本下降，合成肽或多糖类免疫原也已经商品化。死的免疫原在佐剂，尤其是油乳佐剂的帮助下，在动物体内诱导出坚强且长期的免疫效力，维持时间6个月以上，且不存在生物完全性问题，在动物疫苗产业中占有绝对主体地位。

所有的疫苗，其免疫原无论是活的还是死的，接种后均需要经过一段时间才能诱导动物产生主动免疫效力。这种免疫效力自疫苗接种后，从无到有，从无效、低效到有效，再到高效，最后消失，呈现出免疫保护的有限性。疫苗接种至动物机体产生出有效免疫力所需要的时间称为疫苗诱导期。此时，动物尽管接种了疫苗，但如遇病原袭来仍会发病。由此，疫苗的诱导期被称为空白期或窗口期。活的免疫原的免疫空白期较短，一般为数天。而死的免疫原的免疫空白期则较长，一般为10～14天，个别的，如禽流感灭活疫苗，超过20余天。

抗体是免疫原诱导生物机体针对该免疫原产生的免疫球蛋白。针对病原或生物毒素的抗体具有紧急治疗和短期预防效力。贝林(e.adolfvonbehring)发现了白喉杆菌的抗体，并藉此获得了生物与医学领域第一块诺贝尔奖。血清、黏液、卵生动物的卵黄和哺乳动物的乳汁中均有抗体存在。依据其来源区分为血清抗体、蛋(卵)黄抗体、乳源抗体。现代生物技术还创新出了单克隆抗体(milsten，1982)、基因工程抗体等。

特异抗体对雏禽疫病防控很有效。利用产蛋鸡作为生物反应器生产特异蛋黄抗体，采取提取技术制造出不含脂类的精制蛋黄抗体注射液。《精制鸡传染性法氏囊病蛋黄抗体》于2000年时获得我国政府批准商品化生产，开启了蛋黄抗体类药品新领域。抗小鹅瘟、鸭肝炎等疫病精制蛋黄抗体相继实现商品化，不仅有注射针剂，还创新了冻干粉针剂。

抗体类药品行肌内、皮下或静脉途径注射给药。肌内或皮下注射后可被迅速吸收入血，扩散到全身发挥免疫效力。由于吸收的抗体不属于自己产生，而是被动获得，在体内会被代谢降解。机体被动获得的抗体，其免疫效力维持时间较短。人类的igg型中的igg1、igg2和igg4亚型半衰期最长，为23天，而igg3仅为8天，igm和iga型抗体的半衰期分别为5.1天和5.8天。因此，被动抗体仅用于紧急防治。在医学上，如狂犬病、破伤风等病预防，视伤口情况将抗体与疫苗联用，依靠抗体快速吸收入血即刻发挥免疫效力，待其效力下降时疫苗诱导出主动免疫。抗体与疫苗的联用，抗体弥补疫苗的免疫空白期。抗体和疫苗作为防治同一病的两种不同的药物，医学实践中不可以混合也不可以在同一局部进行注射，而是采取远离部位的分部位注射，如抗体注射在左臂，疫苗接种到右臂上。但是，医学上对于抗体与疫苗联用的有效技术难以在动物养殖实践中应用，动物数量巨大，且保定困难，两针药在不同部位注射费事费时，对动物应急大，影响其生长，甚至引发其他疾病问题。

2000年左右，欧洲国家创新出活的免疫原和抗体反应生成抗原抗体复合物疫苗(immunocomplexes，ic)。鸡传染性法氏囊病ic疫苗是世界上第一个商品化ic疫苗，但迄今未见第二个ic疫苗商品化生产。鸡传染性法氏囊病ic疫苗需采取自动化机器给鸡胚18胚龄时行胚内注射接种，效果很好。ic疫苗必须是活的病毒为免疫原，与其特异抗体反应的比例要求很苛刻，否则无效。这可能是ic疫苗只有第一而无第二的重要因素。文献记载，1950年代，我国生产的猪瘟结晶紫灭活疫苗因病毒灭活不彻底，在疫苗使用时加入猪瘟病毒的高免血清混合注射接种也有效果。但是，因存在严重生物安全隐患，该疫苗生产批文被我国政府取缔。

鸡、鸭、鹅等肉禽，生长期短，规模养殖特别易发疫病。尽管我国批准了禽类疫病防控的疫苗生产，但由于幼小禽类免疫应答反应较差，疫苗即便出壳即接种但也难控疫病发生。死的免疫原免疫诱导期内长，禽类在疫苗免疫诱导期内发病的现象时有发生。抗生素或抗病毒药物就成为疫苗诱导期间预防禽类疫病的重要武器。随着耐药性问题愈来愈严重，肉、蛋中的抗生素、抗病毒药物残留日益被世人重视，上升成为食品安全民生问题，急需解决。

针对目前免疫原免疫诱导期内长，禽类在疫苗免疫诱导期内发病的现象时有发生的问题，采用即注射疫苗又注射抗体双重免疫即可解决上述问题。但仍存一些技术问题需要解决，技术问题如下：

1.抗体为水溶性蛋白，注射后迅速被吸收入血，形成免疫效力，但效力维持时间短，长者十余天。疫苗注射接种后诱导动物自身产生出坚强而长时间的免疫效力，但其存在免疫空白期问题，长者十余天，甚至二十余天。出壳或出生后三周龄内，畜禽极其容易感染疫病，依靠常规疫苗预防时有疫病发生。免疫原和其抗体优点、缺点均非常突出。如何将免疫原和其抗体的优点相加，优势互补，同时避开两者的缺点，是本发明人所要解决的技术问题，为此，本发明提供一种免疫原和抗体的复合疫苗，并实现核心技术目标。

2.免疫原和其抗体是一对矛盾体，两者相遇即会发生反应，生成抗原抗体复合物，各自的免疫效力均会下降，甚至消失。因此，本发明的一种免疫原和抗体的复合疫苗中免疫原和其抗体同时存在，尽显优点而避缺陷，其核心技术是将两者隔离，程序释放，即抗体先释放且快速，免疫原后释放且缓慢，实现抗体对免疫原诱导主动免疫不会造成不良影响，抗体的免疫效力维持时间足够弥补免疫原的免疫空白期，实现接种即刻产生有效特异免疫。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种免疫原和抗体的复合疫苗及其制备方法，将免疫原与特异抗体采取隔离和程序释放技术制成复合疫苗，接种后抗体迅即被吸收即刻产生有效免疫保护，其免疫保护临近消失前，免疫原诱导出坚强有效的主动免疫，实现了抗体的特异被动免疫与疫苗诱导的特异主动免疫无缝连接，相加互补。

具体的说，免疫原和抗体的复合疫苗是将抗体和疫苗两种生物制品混合制成一种生物制品，采取油相将抗体与免疫原隔离，采取改良的水包油包水(w/o/w)乳液剂型，实现抗体先期、快速(注射后30min～2h入血、24h～72h达到峰值)的释放和被吸收入血，分布全身发挥免疫保护效力。免疫原由于油乳佐剂的包裹，释放非常缓慢，在抗体效力消失前才诱导出有效的主动免疫。由于被动吸收的抗体被代谢降解，因此不会对免疫原的主动免疫作用造成不良影响。通过对复合疫苗中的抗体的效价控制，实现抗体免疫效力的维持时间与免疫原的免疫诱导期相近或相同。这样，复合疫苗中的抗体刚好弥补上疫苗的免疫诱导期，即免疫原和抗体的复合疫苗接种后无免疫空白期了，接种即产生有效的免疫力。本发明的复合疫苗特别适用于家禽，尤其是生长期较短的肉用家禽，包括鸡、鸭和鹅。

为实现以上本发明的目的，采用如下实施方案：

在一实施方案中，本发明的一种免疫原和抗体的复合疫苗，由中心层的免疫原相、中间层的包覆免疫原相的油相和外周层的包覆油相的抗体相组成,其特征在于：

1)所述中心的免疫原相，主要由免疫原溶液占96～99％v/v和乳化剂占1.0～4.0％v/v混合制成；

2)所述中间的油相，主要由矿物质油或植物油占92～96％v/v、乳化剂占4.0～8.0％v/v和稳定剂占0.5～4％w/v配制而成,或者油相为油相佐剂montanide^tmisa71vg；

3)所述外周的抗体相，主要由抗体溶液占96.2～99.7％v/v和乳化剂占0.3～3.8％v/v配制而成；

4)所述复合疫苗为水包油包水型乳液体系，其中，免疫原相占比为15-32％v/v，油相占比为40-72％v/v和抗体相占比为5.0-39％。

在上述实施方案中，上述本发明的复合疫苗，所述免疫原包括以下任何一种来源的免疫原：

1)采用化学试剂或温度等物理方法灭活的细菌、枝原体、衣原体、立克次氏体、病毒等微生物而获得的免疫原；

2)采用化学试剂或温度等物理方法将细菌、真菌等微生物代谢产物、毒素及蛇等生物毒素而获得的类毒素免疫原；

3)采取超声波、高压、冻融等技术将细菌、病毒等微生物破碎裂解获得的亚单位免疫原；

4)采取基因重组并在原核或真核细胞表达制备的蛋白质、肽、脂多糖、核酸及空衣壳病毒(假病毒)获得的免疫原；

5)采取化学合成法制备的肽类、寡糖获得的免疫原。

上述本发明的复合疫苗，所述抗体包括以下任何一种来源的抗体：

1)用动物或实验动物制备的血清抗体；

2)用鸡、鸭、鹅等禽类制备的蛋(卵)黄抗体；

3)用奶牛、奶山羊等动物乳制备的乳源抗体；

4)用动物血清、蛋(卵)黄抗体、乳源抗体提取纯化获得的免疫球蛋白；

5)用杂交瘤技术制备的单克隆抗体；

6)用基因重组及原核、真核细胞表达技术制备的单链抗体或嵌合抗体。

在上述实施方案中，上述本发明的复合疫苗，所述外周层的抗体(或免疫球蛋白)和中心层的免疫原被中间层的油相隔离，使所述外周层的抗体(或免疫球蛋白)和中心层的免疫原不相遇和不发生抗原抗体反应。

上述本发明的复合疫苗，皮下或肌内注射接种后，所含有的抗体迅速释放，30min～2h内被吸收入血发挥免疫效力，诱导期后免疫原诱导机体产生有效的主动免疫效力，所述抗体免疫效力的维持时间与免疫原的诱导期相同或相近。其中，所含有的免疫原能在抗体的免疫效力下降到无效之前的4～6天内诱导机体产生出有效的主动免疫效力，且其免疫效力的产生及维持时间不会受到复合疫苗中所含有的抗体的不良影响。

在上述实施方案中，上述本发明的复合疫苗，所述水包油包水型乳液(w/o/w)，其中，中心层的免疫原相占比为15.25～31.67％v/v、中间层的油相占比为40.67～71.25％v/v和外周层的抗体相占比为5.0～39.0％v/v配制而成。

在上述实施方案中，本发明的复合疫苗，所述乳化剂选自吐温、单甘油脂肪酸酯、聚甘油油酸酯和司班中一种或多种，优选为司班80或吐温80；所述油相中的稳定剂为硬脂酸铝或其类似物。

在另一实施方案中，本发明提供了一种免疫原和抗体的复合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)免疫原溶液中加入乳化剂，混合均匀配制成免疫原相；

2)在含有抗体的溶液中加入乳化剂，混合均匀后配制成抗体相；

3)将span80和硬脂酸铝加入到植物油或/和矿物质油中，高压灭菌后，振摇混合均匀，即成油相；

4)将免疫原相缓慢加入油相中，采取高速搅拌、高压均质或胶体磨等方式进行乳化，制成油包水(w/o)型乳液的中间体；

5)将抗体相加入到步骤4)所获得的中间体中，选用低速搅拌或均质或颠倒混合方法中的一种或两种，制成水包油包水(w/o/w)型乳液，即为复合疫苗成品。

在上述另一实施方案中，本发明的一种免疫原和抗体的复合疫苗的制备方法，所述乳化剂选自吐温、单甘油脂肪酸酯、聚甘油油酸酯和司班中的一种或多种，优选为司班80或吐温80，所述油相也可以选用商品化矿物油佐剂montanide^tmisa71vg。

在上述另一实施方案中，上述本发明的制备方法，步骤5)中的水包油包水型乳液，其中，免疫原相占比为15-32％v/v，油相占比为40-72％v/v和抗体相占比为5.0-39％v/v。

在上述另一实施方案中，本发明的制备方法，步骤5)中所述体抗相与所述中间体的体积比为：

1)当抗体或免疫球蛋白原料为液体时，制成的抗体相与中间体的配合比为31.0～39.0:61.0～69.0v/v，或

2)当抗体或免疫球蛋白原料为冻干制剂或干粉时，用生理盐水溶解制成抗体溶液，再制备成抗体相，所述抗体相与中间体的配合比为5.0～39.0:61.0～95.0v/v。

在上述另一实施方案中，本发明的制备方法，所述步骤4)中的乳化优选采取高速搅拌方式进行乳化，搅拌转速高于6500转/min；所述步骤5)中，优选低速搅拌乳化，搅拌速度低于6500转/min。

在一具体实施方案中，一种免疫原和抗体的复合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)免疫原相制备，其配方为，免疫原溶液占96％～99％、乳化剂占1.0％～4.0％(v/v)。量取(生产实际中可称重)乳化剂，加入免疫原溶液中，以60转/min～100转/min搅拌使乳化剂充分溶解，混合均匀，乳化剂为单一试剂，即吐温(tween)80或其衍生物的一种。

2)包裹免疫原的油相制备，其配方为：矿物质油(或植物油)占92％～96％、乳化剂占4％～8％、稳定剂占0.5％～4％(v/v)。称(或量)取乳化剂和稳定剂，加入矿物质油中，置高压灭菌后，充分振摇混匀。乳化剂为司班(span)80及其衍生物的一种，稳定剂为硬脂酸铝。

3)抗体相的制备，配方为：抗体溶液占96.2％～99.7％(v/v)、乳化剂占0.3％～3.8％(v/v)。量取乳化剂，加入抗体溶液中，以60转/min～100转/min搅拌，使乳化剂充分溶解，混合均匀。乳化剂为单一试剂，即吐温(tween)80或其衍生物的一种。

4)免疫原和抗体的复合疫苗的配制，配方为：免疫原相占比15.25％～31.67％、油相占40.67％～71.25％、抗体相占5.0％～39.0％；

5)水包油包水乳液的制备，包括以下步骤：

a)配制乳液中间体，配方为：油相占66.6％～75.0％(v/v)、免疫原溶液占25.0％～33.3％(v/v)，先将油相加入容器中，启动电源，调转速至6500转/min，边搅拌边缓慢加入免疫原相，加毕，将转速调高至12000转/min～24000转/min，继续搅拌3min～10min，即为乳液中间体。抽样检测，滴于水面，呈油珠状为合格；加入10ml尖底离心管中，3000转/min离心15min，管底析出水相应不超过0.5ml。

b)成品的配制。其配方为：乳液中间体占61％～69％、抗体相占31.0％～39.0％(v/v)。称(量)取抗体相，加入中间体中，启动电源，搅拌速度调至500转/min～6500转/min，搅拌1min～5min。静置30min～2h，再次搅拌混合，调转速为100转/min～3000转/min，时间1min～5min。也可采取颠倒方式进行第二次混合，方法是，罐口密封后，将其正置和倒置，轮回50～100次，频率为20次～30次/min。抽样检测，合格即为水包油包水乳液即本发明的免疫原和抗体的复合疫苗成品。

6)成品检验。免疫原和抗体的复合疫苗成品，除生物制品所需的装量检验、安全性、无菌检验等常规检测检验外，还应进行如下检验，应合格：

a)物理外观应符合以下性状：一种成品为均匀稳定的乳液，置4～8℃和室温保存3个月呈均匀乳白色，保存有效期内无分层现象。另一种成品为分两层的液体，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，振摇后均匀混合后2小时内不发生分层现象。具体的，该分层成品置4℃～8℃和室温放置2h后即开始出现分层，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，体积小于或等于0.1ml～13ml/100ml时为合格。

b)剂型，为水包油包水型乳剂。取少量成品振摇混匀后的成品，滴于冷水表面应呈云雾状扩散。

c)稳定性，室温或冷藏放置72h观察，产品呈均匀白色乳液，无分层现象，瓶底部仅见痕量细小水珠。取10ml成品加入尖底玻璃离心管中，3000转/min离心15min，分为两层，上层为乳白色均匀乳液，下层为澄清透明液体，其体积小于等于1.4ml～2.2ml/10ml。

d)黏度，应符合《中华人民共和国兽药典》2015版要求。

e)效力检验：采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。血清学方法为：按照使用说明书规定的剂量，用雏禽作为实验动物，皮下或肌内接种后，从注射后30min和2h采集血液，分离血清。采取免疫血清学方法检测抗体效价，应符合产品质量标准要求。免疫攻毒法为：采用易感动物作为试验动物，按照使用说明书规定的剂量进行免疫，于易感日龄用强毒(菌)攻击，对照组发病率或死亡率应高于90％，免疫组保护率应高于80％。

在上实施具体实施方案中，本发明的一种免疫原和抗体的复合疫苗及其制备方法，其中，

a)所述抗体包括来自动物血清抗体、禽类蛋黄抗体、免疫球蛋白抗体、单克隆抗体、基因重组抗体。从效力针对性分类，包括针对病原及其代谢产物的抗体和针对生物(如蛇等)的毒素的抗体或免疫球蛋白。

b)所述免疫原，包括细菌、病毒等微生物及其代谢产物被甲醛或其他化学物质杀灭或脱毒制成的疫苗和类毒素，也包括采取适宜温度灭活制成的疫苗或类毒素。同时包括采取破碎技术从细菌、病毒等微生物中提取的组分(又称为亚单位)、采取基因重组表达制备的多肽、空衣壳病毒等及化学合成技术制成的肽、多糖等制备的疫苗。

c)在上述制备方法中，当抗体原料为固体粉剂时抗体相的配制：步骤3)所述的抗体溶液中的抗体为直接或粗、精制提取后采取冻干或其他技术进行干燥制成固体粉剂时，用生理盐水、pbs任一种液体稀释成抗体(或免疫球蛋白)溶液，再制成抗体相，其与步骤4)所述的中间体的配合比为，61～95：5～39(v/v)。

d)在上述制备方法中，在步骤4)中所述的复合疫苗制备方法中的乳化及混合方式，匀浆机、均质机和胶体磨任选其一。

e)在上述制备方法中，两种不同物理外观的成品配制：按照上述步骤5)的b)所述的成品，进一步分为两种物理外观性状的产品。一种成品为均匀稳定的乳液，置4℃～8℃和室温保存3个月呈均匀乳白色，无分层现象。另一种成品为分两层的液体，该种成品置4℃～8℃和室温放置2h后即开始出现分层，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，透明液体的体积小于或等于0.1ml～13ml/100ml时为合格。该种性状的成品，人力振摇，或者将瓶颠倒20次～100次，呈均匀乳液状，为乳白色，2h内不会再分层。该种成品即便为500ml大容量规格，正常注射接种所需时间为10min～30min。因此，其稳定性能够满足每瓶复合疫苗一次振摇全部注射完毕。

本发明的免疫原和抗体的复合疫苗，其技术特点及有益效果是：

1)免疫原和抗体的复合疫苗为一种新型疫苗，技术上有两个特点。一是，同时含有抗体和免疫原，但两者被有效隔离，避免了相遇反应生成抗原抗体复合物导致两者的免疫效力下降。二是，采取程序释放技术，抗体先期且快速释放，在注射接种后30min～2h即被吸收入血，发挥免疫效力。免疫原则后期释放，在抗体效力失能前4天～6天时诱导有效的主动免疫。三是，产品稳定性好，使用方便。采取水包油包水(w/o/w)乳液剂型，优选的配方及配制工艺，确保了产品稳定性，粘度低，方便注射接种使用。

2)免疫原和抗体的复合疫苗为一种新型疫苗，其有益效果是：将抗体的特异性被动免疫与免疫原诱导的特异性主动免疫无缝连接，相加互补，实现接种即刻产生有效免疫保护。免疫原和抗体的复合疫苗在动物上使用后，将极大地降低疫苗的免疫诱导期内的发病几率。对于细菌性疫病而言，免疫原和抗体的复合疫苗的使用，将大幅度减少抗生素在动物，尤其是肉用禽类上的使用量。而对于病毒性疫病而言，免疫原和抗体的复合疫苗的使用，将大幅度减少抗病毒的化学药物在动物上的应用。免疫原和抗体的复合疫苗的这些有益效果为解决细菌和病毒的耐药性问题的解决提供有效的武器，其结果无疑有利于食品安全和生物安全。

附图说明

图1：工艺流程示意图。

图2：免疫原和抗体的复合疫苗组成示意图，外层为抗体，中间层为油相，内部免疫原。

图3：免疫原和抗体的复合疫苗显微拍摄图。

具体实施方式

本发明不限于以下实施案例，采用与本发明实施例相同或近似的配方，而得到的其他抗体与灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗等复合疫苗的制备方法及工艺，在不偏离本发明精神实质范围内均属于本发明的保护范围之内。

以下实例中所述油相采用埃克森美孚公司(exxonmobilcorporation)产品，型号为marcol52；所述进口油佐剂为赛比克(seppic)公司产品，型号为montanide^tmisa71vg；所述鸭疫里默氏菌免疫原由重庆更尚科技有限公司提供(代号：ra-sc株)，菌液a525为2.0；所述禽流感(h9亚型)免疫原由肇庆大华农生物药品有限公司提供(批号：01708026)；所述鸭疫里默氏菌精制蛋黄抗体由重庆更尚科技有限公司提供(代号：ra-igy)，免疫沉淀抗体效价为4log2；所述禽流感(h9亚型)精制蛋黄冻干抗体(ss株)由重庆更尚科技有限公司提供(代号：h9-igy)，hi效价为1:1024。

实施例1鸭疫里默氏菌免疫原和抗体的复合疫苗的制备

制备工艺流程见图1

1)免疫原相制备：于鸭疫里默氏菌灭活菌苗溶液中，加入终浓度为3.5％(v/v)无菌吐温80，混匀后即得免疫原相。

2)油相配制：于进口白油中加入终浓度为5％(v/v)司班(span)80，再按总体积的3％加入硬脂酸铝，高压灭菌20min，混匀后即得油相。

3)抗体相的制备：于精制鸭疫里默氏菌蛋黄抗体溶液中，加入终浓度为0.9％(v/v)的无菌吐温80，混匀后即为抗体相。

4)中间体的配制：免疫原相与抗体相体积比为1:2。于无菌环境下，启动匀浆机，将油相加入乳化罐中，调转速至6500转/min，边搅拌边缓慢加入免疫原相。免疫原相加毕后，将转速调高到13500转/min，继续搅拌3min～6min即成中间体。抽样检测，样品滴于水面呈油珠状为合格。

5)复合疫苗配制：中间体与抗体相体积比为64:36，于无菌环境下，将抗体相加入中间体中，启动匀浆机，调转速至3000转/min，搅拌2min后停止搅拌。静置1h后，再次启动匀浆机，转速调至1000转/min，搅拌2min～4min即为成品。抽样检测，样品呈均匀乳剂且滴于水面呈云雾状扩散为合格。同时，取样品10ml加入尖底玻璃离心管中，3000转/min离心15min，分为两层，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，其体积小于等于2.2ml为合格。

6)成品检验：应符合权利要求7、上述步骤5)。其中效力检验如下：采用免疫攻毒法。取4日龄雏鸭(杂交肉鸭)50只，分为a、b、c、d、e五组，每组11只。a、b、c三个组为ra复合疫苗免疫组，接种日龄分别为4日龄、7日龄和10日龄，剂量均为1.0ml，途径为腿部肌内注射。d组为攻毒对照组，分别于4、7、10日龄注射lb。e组为饲养对照组，不作任何处理。a、b、c、d四个组于18日龄时进行攻毒。攻毒菌株为鸭疫里默氏杆菌sc株，剂量为200ld50/0.3ml，途径为腿部肌内注射。攻毒后于每天8:00、12：00和17:00各观察一次，记录发病和死亡情况，连续观察7-10天。对照组发病数和死亡数应大于9只，免疫组应至少保护8只。

实施例2鸭疫里默氏菌免疫原和抗体的复合疫苗的制备

1)免疫原相制备：于鸭疫里默氏菌灭活菌苗溶液中，加入终浓度为2％(v/v)无菌吐温80，混匀后即得免疫原相。

2)油相配制：于进口白油中加入终浓度为8％(v/v)司班(span)80，再按总体积的2.5％w/v加入硬脂酸铝，高压灭菌20min，混匀后即得油相。

3)抗体相的制备。于精制鸭疫里默氏菌蛋黄抗体溶液中，加入终浓度为0.6％(v/v)的无菌吐温80，混匀后即为抗体相。

4)中间体的配制：免疫原相与抗体相体积比为1:2.3。于无菌环境下，启动匀浆机，将油相加入乳化罐中，调转速至6500转/min，边搅拌边缓慢加入免疫原相。免疫原相加毕后，将转速调高到21500转/min，继续搅拌3min～5min即成中间体。抽样检测，样品滴于水面呈油珠状为合格。

5)复合疫苗配制：中间体与抗体相体积比为62:38，于无菌环境下，将抗体相加入中间体中，启动匀浆机，调转速至1000转/min，搅拌4min后停止搅拌。静置1h后，再次启动匀浆机，转速调至3000转/min，搅拌1min～3min即为成品。抽样检测，样品呈均匀乳剂且滴于水面呈云雾状扩散为合格。同时，取样品10ml加入尖底玻璃离心管中，3000转/min离心15min，分为两层，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，其体积小于等于2.2ml为合格。

6)成品检验。同实施例1的6)。

实施例3鸭疫里默氏菌免疫原和抗体的复合疫苗的制备

1)免疫原相的制备：于鸭疫里默氏菌灭活菌苗溶液中，加入终浓度为4％(v/v)无菌吐温80，混匀后即得免疫原相。

2)免油相的制备：使用进口油佐剂，直接作为油相使用。

3)抗体相的制备。于精制鸭疫里默氏菌蛋黄抗体溶液中，加入终浓度为1.8％(v/v)的无菌吐温80，混匀后即为抗体相。

4)中间体的配制：免疫原相与抗体相体积比为1:3。于无菌环境下，启动匀浆机，将油相加入乳化罐中，调转速至6500转/min，边搅拌边缓慢加入免疫原相。免疫原相加毕后，将转速调高到24000转/min，继续搅拌3min～5min即成中间体。抽样检测，样品滴于水面呈油珠状为合格。

5)复合疫苗配制：中间体与抗体相体积比为61:39，于无菌环境下，将抗体相加入中间体中，启动匀浆机，调转速至6500转/min，搅拌1min后停止搅拌。静置1h后，再次启动匀浆机，转速调至500转/min，搅拌3min～5min即为成品(w/o/w结构见图2和图3)。抽样检测，样品呈均匀乳剂且滴于水面呈云雾状扩散为合格。同时，取样品10ml加入尖底玻璃离心管中，3000转/min离心15min，分为两层，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，其体积小于等于2.2ml为合格。

6)成品检验：同实施例1的6)。

实施例4禽流感(h9亚型)免疫原和抗体的复合疫苗(ss株)的制备

1)免疫原相制备：于禽流感(h9亚型)免疫原溶液中，加入终浓度为3％(v/v)无菌吐温80，混匀后即得免疫原相。

2)油相配制：于进口白油中加入终浓度为6％(v/v)司班(span)80，再按总体积的2％加入硬脂酸铝，高压灭菌20min，混匀后即得油相。

3)抗体相的制备：使用生理盐水溶解禽流感(h9亚型)精制蛋黄抗体冻干粉，制备成hi效价大于等于1:1024的蛋黄抗体溶液，加入终浓度为3.8％(v/v)的无菌吐温80，混匀后即为抗体相。

4)中间体的配制：免疫原相与抗体相体积比为1:3。于无菌环境下，启动匀浆机，将油相加入乳化罐中，调转速至6500转/min，边搅拌边缓慢加入免疫原相。免疫原相加毕后，将转速调高到17500转/min，继续搅拌3min～5min即成中间体。抽样检测，样品滴于水面呈油珠状为合格。

5)复合疫苗配制：中间体与抗体相体积比为67:33，于无菌环境下，将抗体相加入中间体中，启动匀浆机，调转速至2000转/min，搅拌3min后停止搅拌。静置1h后，再次启动匀浆机，转速调至2000转/min，搅拌1min～4min即为成品。抽样检测，样品呈均匀乳剂且滴于水面呈云雾状扩散为合格。同时，取样品10ml加入尖底玻璃离心管中，3000转/min离心15min，分为两层，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，其体积小于等于2.2ml为合格。

6)成品检验：应符合以下性状：成品为均匀稳定的乳液，置4～8℃和室温保存3个月呈均匀乳白色，保存有效期内无分层现象。或者成品为分两层的液体，上层为乳白色乳液，下层为澄清透明液体，振摇后均匀混合后2小时内不发生分层现象。

其效价检验如下：

采取hi方法测定抗体效价。取7-10日龄spf鸡30只，分为a、b、c三组，每组10只。a组，腿部肌内注射接种禽流感(h9亚型)免疫原和和抗体复合疫苗0.45ml；b组，腿部肌内注射禽流感(h9亚型)灭活油乳佐剂疫苗0.3ml；c组为对照组，肌内注射生理盐水0.45ml。于免疫后3天，采血，分离血清，用禽流感病毒(h9亚型)抗原测定hi效价，对照鸡hi效价为0～1，禽流感(h9亚型)灭活疫苗免疫组鸡hi效价小于等于1:2～4，禽流感(h9亚型)免疫原和抗体复合苗免疫组鸡hi效价几何平均值应不低于1:8～～16。