龙胆提取物的应用的制作方法

本发明涉及植物提取物领域及日化领域，具体涉及龙胆提取物的应用。

背景技术：

皮肤覆盖于人体表面，与外界环境直接接触，除了能够保护机体免受外界各种因素的伤害，同时作为一面镜子反应机体的健康状态。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。真皮主要由胶原构成，i型胶原是大多数结缔组织中发现的原纤维形成性胶原蛋白，随着年龄的增长，胶原逐步降解，胶原的降解致使皮肤失去弹性，最终导致衰老。

i型胶原α1链col1a1(collagentypeialpha1chain)基因编码i型胶原的前α1链，促进i型胶原蛋白的合成。在正常人体皮肤中，i型胶原蛋白存在于真皮中，超过70％的真皮干重由胶原蛋白组成，约占真皮胶原总量的80％。i型胶原蛋白增强和支持皮肤组织，但其含量随着年龄的增加而减少。

骨形态发生蛋白1bmp-1(bonemorphogeneticprotein1)基因编码合成的骨形态发生蛋白1，是一种前胶原c端肽酶(pcp)，参与真皮层的i型和iii型胶原的形成，又加工处理层黏连蛋白，使基质装配与生长因子活化同步，促进形态发生和组织重塑。该基因表达，有助于i型和iii型前胶原的加工成熟，加快i型和iii型的前胶原向i型和iii型的原胶原转化，合成与装配细胞外基质，提高皮肤结构稳固性，延缓皮肤衰老。

表皮生长因子受体egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)基因编码合成的表皮生长因子受体，是跨膜糖蛋白，是蛋白激酶超家族的成员。该蛋白质是表皮生长因子家族成员的受体，通过与配体(表皮生长因子)的结合诱导细胞增殖。该基因的表达上调有助于细胞增殖，实现延缓皮肤衰老的功效。

因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。

龙胆，学名为gentianascabrabunge，是一种独特的高山植物，野生于海拔400～1700米的山区坡地、林缘草甸及河滩等。每逢8、9月花期，会盛开出成片的幽蓝色钟型小花，花冠筒状钟形，长4～5厘米，裂片卵形，尖，褶三角形，颜色深邃而神秘，龙胆属也因此拥有了世界三大高山名贵花卉之一的美誉。

龙胆药疗用途的历史很久远，藏本草书目《晶珠本草》曾记载：苦寒、清目利胆、具清热解毒、消炎愈痔。在藏区和林区，美丽的龙胆草被视为一种疗效独具的天然植物药材，广泛用于清热和皮肤炎症等。目前龙胆大多应用于药品领域，起到清热、抑菌、消炎作用。

现代研究也表明，龙胆具有多种药理作用和临床应用价值。其蕴含的龙胆苦苷等裂环烯醚萜苷类有效成分，具有优良的抑菌抗炎功效；蕴含的齐墩果酸、阿魏酸等成分，可帮助机体抗氧净化。

本发明首次提出龙胆提取物具有提高胞外基质相关基因和抗衰老相关基因表达的能力，稳固皮肤，适用于制备具有延缓衰老功效的皮肤外用剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种龙胆提取物的应用，该龙胆提取物具有促进细胞外基质合成和抗衰老的作用，可用于制备具有稳固皮肤结构和抗衰老功能的皮肤外用剂。

龙胆提取物能够提高与胞外基质相关的基因、与抗衰老相关的基因的表达。

优选的，所述与胞外基质相关的基因为促进胶原蛋白合成的基因，尤其是促进i型胶原α1链的生成和/或促进更优选为col1a1基因和/或bmp-1基因。

优选的，所述的与抗衰老相关的基因为促进细胞增殖的基因，更优选为egfr基因。

龙胆提取物在含量100μg/ml时，可促使皮肤模型中与胞外基质相关的col1a1基因表达上调1.67倍，表达强度提高67％；与胶原蛋白转化相关的bmp-1基因表达上调1.5倍，表达强度提高50％。在含量1μg/ml时，可促使皮肤模型中与细胞增殖相关的egfr基因表达上调1.82倍，表达强度提高82％。

i型胶原α1链(col1α1)基因col1a1促进i型胶原α1链的生成，进而促进真皮中i型胶原蛋白的生成，合成和装配细胞外基质，增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老。

骨形态发生蛋白1(bmp-1)基因促进骨形态发生蛋白1的生成，进而促进真皮中i型和iii型的前胶原向i型和iii型的原胶原转化，合成和装配细胞外基质，增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老。

表皮生长因子受体(egfr)基因促进表皮生长因子受体的合成，提高表皮生长因子受体与表皮生长因子组合，促进细胞分裂增殖，延缓皮肤衰老。

龙胆提取物可通过上调i型胶原α1链(col1α1)基因和/或骨形态发生蛋白1基因的表达，加快细胞外基质的装配与合成，增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老。

本发明龙胆提取物可通过上调表皮生长因子受体基因的表达，加快细胞增殖，延缓皮肤衰老。

本发明龙胆提取物有助于细胞增殖、加快实现胶原蛋白转化，并同步促进细胞基质装配和合成，稳固皮肤结构，延缓皮肤衰老。

上述龙胆提取物指以任何合理方式提取得到的含有效成分的提取物。

所述龙胆提取物的制备方法，包括以下步骤：以龙胆为原料，用溶剂提取，提取后取滤液。所述溶剂包括水、有机溶剂或者有机溶剂与水的任意混合物，有机溶剂为醇类、酯类、酮类、醚类等；所述有机溶剂优选为亲水性有机溶剂或者亲水性有机溶剂的水溶液，亲水性有机溶剂优选为醇；进一步，优选的溶剂为60％～85％(体积比)乙醇，更进一步优选为70％乙醇。

提取1～3次，优选为2次；每次提取时间为20～80分钟，优选为30分钟。

提取方法为超声法、浸提法、超临界法、渗漉法、回流法或者蒸馏法等提取方法，其中，超声法、浸提法、渗漉法在室温下进行。提取方法优选为超声提取。

每次提取时，龙胆与溶剂的用量比为1kg/5～20l，优选的用量比为1kg/10l。

滤液可进一步浓缩或者浓缩干燥。

浓缩的方式为减压浓缩。

浓缩干燥的方式为真空干燥或者冷冻干燥。

所述龙胆指龙胆全草或者龙胆根茎，龙胆的含水量不超过10％，更优选低于5％；并且粉碎为5～500目的颗粒。

本发明的一个优选实施方式中，龙胆提取物的制备方法为，将含水量低于10％、50～200目的龙胆和70％乙醇(体积浓度)按1kg/10l混合后，室温超声提取2次，每次30分钟；合并滤液后去除溶剂并干燥。

上述龙胆提取物可用于制备皮肤外用剂，所述龙胆提取物作为所述皮肤外用剂中促进细胞外基质装配与合成活性成分、稳固皮肤结构活性成分及抗衰老活性成分中的一种或者多种。

上述龙胆提取物的用量为0.0001wt％～5wt％。

用作稳固皮肤结构活性成分、促进细胞增殖、提高表皮生长因子受体基因egfr表达时，龙胆提取物的用量为0.0001wt％～5wt％。用作促进细胞外基质装配与合成活性成分、稳固稳固皮肤结构、促进col1a1基因和bmp-1基因表达时，龙胆提取物的用量为0.01wt％～5wt％。

所述促进细胞外基质装配与合成活性成分在于提高i型和iii型胶原蛋白合成。

所述稳固皮肤结构活性成分在于提高i型和iii型胶原蛋白合成。

所述抗衰老活性成分在于提高i型和iii型胶原蛋白合成和/或细胞增殖。

所述i型和iii型胶原蛋白合成的提高在于i型胶原α1链基因和/或骨形态发生蛋白1基因的高表达。

所述细胞增殖的提高在于表皮生长因子受体基因的表达。

一种皮肤外用剂，具有调节真皮细胞外基质装配和合成的功效和/或抗衰老的功效，尤其是提高i型胶原α1链基因col1a1基因和/或骨形态发生蛋白1基因表达、提高表皮生长因子受体基因egfr表达的皮肤外用剂，含有上述龙胆提取物。其中，龙胆提取物的含量为0.0001wt％～5wt％，优选为0.0001wt％～3wt％。

皮肤外用剂指以涂抹、喷洒或者其它类似方法，散布于人体表面的任何部位，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态的产品。皮肤外用剂可以是基础化妆品、面部化妆品、头部护理品、身体护理品，起到清洁、护理、美化、保养等作用。

皮肤外用剂的剂型无特殊限制，可根据使用情况而定，如洁面霜、精华液、乳液、霜膏、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水、啫喱、气雾或者喷雾等。

含有龙胆提取物的皮肤外用剂还可以含有其它活性成分，包括美白活性成分、保湿活性成分、抗氧化活性成分、抗皱活性成分、抗过敏活性成分或者皮脂腺抑制活性成分中的一种或者多种；

所述的皮肤外用剂中还含有增稠剂、增溶剂、防腐剂、表面活性剂、芳香剂、调色剂、促渗剂、保湿剂、乳化剂、塑形剂或者珠光剂中的一种或者多种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明龙胆提取物提高与装配细胞外基质相关的和抗衰老相关的基因和/或蛋白的表达能力，稳固皮肤结构，延缓皮肤衰老。

(2)本发明龙胆提取物显著的稳定皮肤结构和抗衰老效果，能够应用于制备皮肤外用剂，尤其是具有稳固皮肤结构、抗衰老作用的皮肤外用剂。

(3)本发明龙胆提取物的制备工艺简单，工艺条件易于控制，制备成本低。

(4)提取物活性高，在含量极低的情况下就可以产生显著效果，天然、安全且有效，不刺激皮肤。

附图说明

图1是龙胆提取物促进i型胶原α1链基因表达结果示意图。

图2是龙胆提取物促进骨形态发生蛋白1基因表达结果示意图。

图3是龙胆提取物促进表皮生长因子受体基因表达结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步示例性地详细说明本发明。需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

龙胆提取物指以任何合理方式提取得到的提取物，龙胆的提取方式有超声法、浸提法、超临界法、渗漉法、回流法或者蒸馏法，提取所用溶剂有水或者有机溶剂，有机溶剂为醇类、酯类、酮类、醚类等有机溶剂，本发明实施例部分优选以乙醇作溶剂，室温下超声制备龙胆提取物，并验证龙胆提取物的稳固皮肤结构及抗衰老功效。

实施例1龙胆提取物的制备

取含水量低于5％的粉碎后过80目筛的龙胆(全草)10g，与100ml70％乙醇混合，室温下500w超声提取2次，每次30min，合并滤液，旋转蒸发至干，得龙胆提取物约3.7g。

实施例2龙胆提取物调节基因表达

一、皮肤模型的制备

从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(nhdf)及人原代角质细胞(nhek)。将人原代成纤维细胞复苏，培养消化后与胶原混合进行真皮阶段培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3d皮肤模型。

在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面培养至形成3d皮肤模型的第3天至第18天的过程中，根据所使用培养基的不同进行分组，形成空白对照(nt)组、加入龙胆提取物(100μg/ml)的阳性对照组和加入1μg/ml龙胆提取物(1μg/ml)的阳性对照组。

其中，龙胆提取物(100μg/ml)，指所得龙胆提取物在单位体积(ml)培养基中的量为100μg，约0.01wt％。

龙胆提取物(1μg/ml)，指所得龙胆提取物在单位体积(ml)培养基中的量为1μg，约0.0001wt％。

二、rna的提取

剪取3d皮肤模型组织约2*3mm，放入2mlep管中；加入1mltrizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5mlep管中；加入200μl氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；9000rpm、4℃条件下离心15min；移转上层水相(约400μl)于新1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清液后，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清液后，沉淀空气干燥5～10分钟后，溶于30μldepc(焦碳酸二乙酯)水中；分光光度计测定rna浓度。

三、基因表达分析及结果判定

根据quantigener2.0plexassay试剂盒进行rna的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析，结果见图1至图3。

由图1至图3基因表达结果可以看出，相对于空白组，添加了龙胆提取物(用量为100μg/ml)的阳性组，与胞外基质相关的col1α1基因表达提高67％，说明龙胆提取物能够增加i型胶原蛋白的生成，促进细胞基质装配和合成。

龙胆提取物含量为100μg/ml的阳性组，与胶原蛋白转化相关的bmp-1基因表达提高50％，说明龙胆提取物能够增加实现i型和iii型胶原蛋白转化，促进细胞基质装配和合成。

龙胆提取物含量为1μg/ml的阳性组，与细胞增殖相关的egfr基因表达提高82％，说明龙胆提取物有助于提高细胞增殖能力；细胞的增殖、胶原蛋白的转化以及细胞基质的装配与合成均有助于稳固皮肤结构，延缓皮肤衰老。由胞外基质相关和抗衰老功效相关的基因和/或蛋白表达量的明显升高，可推断龙胆具有诱导基底膜稳定相关的及抗衰老相关的基因表达的作用，提高皮肤结构的稳定性，延缓衰老。

1.龙胆提取物能够提高胞外基质相关基因的表达

由图1可知，添加龙胆提取物的阳性组(100μg/ml)，与胞外基质相关的col1a1基因表达上调1.67倍，较空白对照提高67％，该基因编码合成的i型胶原α1链促进真皮中i型胶原蛋白的生成，胶原蛋白是细胞外基质的重要组成成分，促成细胞外基质的装配，增强和支持皮肤组织结构的稳固性，由上所述，本发明龙胆提取物有促进胞外基质合成，稳固皮肤结构的作用。

由图2可知，添加龙胆提取物的阳性组(100μg/ml)，与胶原蛋白转化相关的bmp-1基因表达上调1.5倍，较空白对照提高50％，该基因编码合成的骨形态发生蛋白1加快真皮中i型和iii型的前胶原向i型和iii型的原胶原转化，促使细胞外基质装配与生长因子活化同步，促进形态发生和组织重塑，由上所述，本发明龙胆提取物具有调节细胞外基质装配与合成、稳固皮肤结构的作用。

2.龙胆提取物能够提高抗衰老相关基因的表达

由图3可知，添加龙胆提取物的阳性组(1μg/ml)，与细胞增殖相关的egfr基因表达上调1.82倍，较空白对照提高82％。egfr基因表达上调有助于增加表皮生长因子受体，进而提高其与表皮生长因子的组合表达率，促进细胞增殖，延缓皮肤衰老，说明本发明龙胆提取物具有抗衰老的功效。