水溶性富勒烯结构在制备AMPK调节剂中的应用的制作方法

本发明涉及富勒烯领域，具体涉及水溶性富勒烯结构在制备ampk调节剂中的应用，还具体涉及水溶性富勒烯结构在制备治疗ampk介导的疾病的药物中的应用。

背景技术：

ampk(amp-activatedproteinkinase)即amp依赖的蛋白激酶。ampk是一个异源三聚体蛋白，由α、β和γ三个亚基组成，其中：α亚基起催化作用，含有一个典型的丝、苏氨酸蛋白激酶的催化区域，其中的苏氨酸172位点及其磷酸化对ampk活性的调节起重要作用，而β和γ亚基在维持三聚体稳定性和作用底物特异性方面起重要作用，所有亚基在真核生物中具有高度保留性。

富勒烯是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。这类物质指的是由碳原子组成的笼状结构，其含量最多的分子是c60，然后是c70、c84，其次是含量相对较少的c76、c78、c82等。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，称之为内嵌富勒烯，如la@c60，表示la内嵌在c60的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供水溶性富勒烯结构在制备ampk调节剂中的应用。本发明的目的之二在于提供水溶性富勒烯结构在制备治疗ampk介导的疾病的药物中的应用。本发明的目的之三在于提供一种ampk调节剂。本发明的目的之四在于提供一种治疗ampk介导的疾病的药物组合物及方法。本发明的目的之五在于提供一种改善ampk介导的疾病的保健品。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性富勒烯结构在制备ampk调节剂中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括以下的至少一种：水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐。

本发明还提供了一种水溶性富勒烯结构在制备治疗ampk介导的疾病的药物中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括以下的至少一种：水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐。

本发明还提供了一种ampk调节剂，包括至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构作为有效成分：水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐，所述ampk调节剂还包括可药用的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

本发明还提供了一种治疗ampk介导的疾病的方法，包括向患有ampk介导的疾病的受试者施用有效量的至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构：水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐。

本发明还提供了一种治疗ampk介导的疾病的药物组合物，其包括至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构作为有效成分：水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐，所述药物组合物还包括可药用的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

本发明还提供了一种改善ampk信号通道介导的疾病的保健品，其包括至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构作为有效成分：水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐，所述药物组合物还包括适用于保健品的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的改性空心富勒烯包括选自下组的一种或多种：(1)在空心富勒烯本体的碳笼外表面修饰有亲水基团的改性空心富勒烯；(2)空心富勒烯本体的碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的改性空心富勒烯；(3)空心富勒烯本体被具有生物相容性的载体材料负载而形成的改性空心富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系的空心富勒烯。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯包括选自下组的一种或多种：(1)在内嵌金属富勒烯本体的碳笼外表面修饰有亲水基团的改性内嵌金属富勒烯；(2)内嵌金属富勒烯本体的碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的改性内嵌金属富勒烯；(3)内嵌金属富勒烯本体被具有生物相容性的载体材料负载而形成的改性内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系的内嵌金属富勒烯。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，空心富勒烯本体包括一种或多种通式为c2m的由碳原子组成的笼状结构，20≤m≤60，可选的30≤m≤60，进一步可选的m为30或35或42。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，内嵌金属富勒烯本体包括m@c2n、m2@c2n、ma@c2n、m3n@c2n、m2c2@c2n、m2s@c2n、m2o@c2n和mxa3-xn@c2n中的一种或多种，其中：m、a均代表金属元素且m、a均选自sc、y和镧系金属元素中的任意一种，20≤n≤60，可选的30≤n≤60，n为41或30或35；0≤x≤3。n代表氮元素，c代表碳元素，s代表硫元素，o代表氧元素，镧系金属元素包括la、ce、pr、nd、pm、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb和lu。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基或亲水性氨基酸残基中的一种或多种。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的改性空心富勒烯的通式为c2a(oh)b；20≤a≤60，可选的30≤a≤60，进一步可选的a为30或35或42；0<b≤50，可选的0<b≤30，10≤b≤30，20≤b≤30，进一步可选的b＝13、20、22、24或26。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的通式为metallofullerene-(oh)c；metallofullerene代表内嵌金属富勒烯本体，0<c≤50，可选的0<c≤30，10≤c≤30，20≤c≤30，进一步可选的c＝13、20、22、24或26。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的通式为m@c2d(oh)e；m选自稀土金属，可选的稀土金属为gd或la；20≤d≤60，进一步可选的30≤d≤60，d为41或30或35；0<e≤50，可选的0<e≤30，10≤e≤30，20≤e≤30，还可选的e＝13、20、22、24或26。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，水溶性的改性空心富勒烯为c70(oh)24；水溶性的改性内嵌金属富勒烯为gd@c82(oh)26。

上述结构通式中c2a(oh)b、metallofullerene-(oh)c和通式m@c2d(oh)e表示羟基连接于空心富勒烯本体或内嵌金属富勒烯本体上。通式中b，c，e都是通过检测计算得出的统计平均值。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述亲水性生物小分子包括氨基酸和肽链中的至少一种。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述具有生物相容性的载体材料包括脂质体和细胞膜载体的至少一种。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的改性空心富勒烯是通过对空心富勒烯本体进行水溶性改性获得的；所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯是通过对内嵌金属富勒烯本体进行水溶性改性获得的。

上述应用、方法、ampk调节剂、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：

(1)表面修饰羟基的方法为：将空心富勒烯本体和/或内嵌金属富勒烯本体、双氧水和碱溶液混合并进行反应至空心富勒烯本体和/或内嵌金属富勒烯本体全部溶解，将所得反应液过滤，滤液洗涤，之后收集沉淀然后透析，得到与本体相应的水溶性羟基衍生物。

可选的，表面修饰羟基的方法为：(a)将质量百分含量为1-30％的双氧水和质量百分含量为10-80％的氢氧化钠水溶液和/或氢氧化钾水溶液按照体积比为1-10:1混合得到混合液，在每10-200ml混合液中加入20-500mg空心富勒烯本体和/或内嵌金属富勒烯本体(如：c60固体或c70固体或gd@c82固体)，在50-80℃的条件下搅拌至固体全部溶解，过滤，保留滤液；(b)将所述滤液加入过量的浓度为85％-100％的乙醇进行洗涤，并收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液；(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理(可选的透析至所述溶液在室温的电导率小于1μs/cm；可选的，透析所使用的透析袋的截留分子量mw＝3500)。进一步可选的透析处理后还包括冷冻干燥的步骤，以便获得相应的固体。

进一步可选的，表面修饰羟基的方法为：(a)将质量百分含量为20-30％的双氧水和质量百分含量为10-20％的氢氧化钠水溶液和/或氢氧化钾水溶液按照体积比为1-4:1混合得到混合液，在每10-20ml混合液中加入20-150mg空心富勒烯本体和/或内嵌金属富勒烯本体(如：c60固体或c70固体或gd@c82固体)，在50-60℃的条件下搅拌至固体全部溶解，过滤，保留滤液；(b)将所述滤液加入过量的浓度为85％-100％的乙醇进行洗涤，并收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液；(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理。

(2)表面修饰氨基的方法为：将上述步骤中的氢氧化钠水溶液和/或氢氧化钾水溶液替换成氨水即可。

(3)物理包覆的方法为：将空心富勒烯本体和/或内嵌金属富勒烯本体与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到与本体相应的包覆的水溶性富勒烯结构，如聚乙二醇包覆的空心富勒烯和/或聚乙二醇包覆的内嵌金属富勒烯，聚乙烯吡咯烷酮包覆的空心富勒烯和/或聚乙烯吡咯烷酮包覆的内嵌金属富勒烯。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，所述ampk介导的疾病包括：糖脂代谢疾病，高血压，细胞凋亡自噬相关的生理状况或疾病，发炎性生理状况或疾病中的至少一种；可选的，所述糖脂代谢疾病包括糖尿病及糖尿病并发症，胰岛素抵抗，伤口难愈合，伤口愈合过程预防疤痕形成中的至少一种。

上述应用中的药物、上述ampk调节剂或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物、该ampk调节剂或该药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。

上述应用中的药物、上述ampk调节剂或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(watersyrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。

上述应用中的药物、上述ampk调节剂或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物、该ampk调节剂或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

上述应用中的药物、上述ampk调节剂或上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物、所述ampk调节剂或所述药物组合物以液体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/ml，可选的为0.01-10mg/ml，0.01-20mg/ml，0.01-30mg/ml，0.01-40mg/ml，0.01-50mg/ml，50-100mg/ml；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/g，可选的为0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g，0.01-50mg/g，50-100mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为人或动物，动物可以为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猴子等。

上述方法在另一种实施方式中，所述有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-100mg/kg/d，可选的为1-50mg/kg/d，1-20mg/kg/d，1-10mg/kg/d，10-100mg/kg/d施用疗程可以为5天-30天，根据病情可短期服用或长期服用；有效成分的施用方式可以为口服、静脉注射或腹腔给药。

本发明所用的术语“ampk调节剂”是指可以调节ampk表达和/或活化的产品，既可包括正向调节也可以包括逆向调节，如：既可包括上调促进ampk的表达、活化，也可包括下调抑制ampk的表达、活化。

本发明所用的术语“治疗”包括其通常被接受的含义，该含义包括阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止或逆转所产生症状或预期病变的发展。照此，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。

本发明所用的术语“有效成分”、“有效成分水溶性富勒烯结构”或“水溶性富勒烯结构”均指的是水溶性的改性空心富勒烯、水溶性的改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性的改性空心富勒烯和所述水溶性的改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐。

本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“空心富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的空心富勒烯原料。

本发明所用的术语“内嵌金属富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的内嵌金属富勒烯原料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的水溶性富勒烯结构可以通过促进ampk的表达和激活来降低血糖、减少炎性因子。

附图说明

图1a为实施例1制备得到的c70(oh)n的热重分析及微商热重曲线。图1b为实施例1制备得到的gd@c82(oh)n的热重分析及微商热重曲线。

图2为实施例2中空白组、模型组和gd@c82(oh)n实验组的小鼠在治疗过程中的血糖变化。

图3为实施例2中空白组、模型组、gd@c82(oh)n实验组和抑制剂组的小鼠在治疗第14天时的血糖水平。

图4为实施例2中空白组、模型组、gd@c82(oh)n实验组的小鼠在治疗后肝脏中ampk的相对mrna表达水平,即：将空白组的ampkmrna表达水平设为1。

图5为实施例2中空白组、模型组、gd@c82(oh)n实验组和抑制剂组的小鼠的肝脏中ampk和172位苏氨酸磷酸化ampk蛋白表达分析示意图。

图6为实施例2中空白组、模型组、gd@c82(oh)n实验组和抑制剂组的小鼠的肝脏中pampk/ampk的定量蛋白表达，即：将正常组的pampk/ampk蛋白表达量比值设为1。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

在本申请中作为示例性所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的实验方法等，如无特殊说明，均为常规实验方法。以下实施例所用原料gd@c82固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量1141，纯度为99.1％。以下实施例所用原料c70固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量840，纯度99％。

实施例1、水溶性富勒烯c70(oh)n/金属富勒烯gd@c82(oh)n的制备

称取100mgc70固体，7ml30％的双氧水和3ml10％的氢氧化钠溶液，将三者混合后在50℃的条件下反应，至c70粉末全部溶解后过滤；将所得过滤液用过量乙醇洗涤以除去过量h2o2和naoh并经过离心(转速：10000r/min，时间：4min)后去除上层无色液体，将收集的沉淀溶于超纯水中得到澄清溶液，使用m.w.＝3500透析袋将该澄清溶液在超纯水中透析，室温透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，冷冻干燥后得到空心富勒烯羟基化衍生物c70(oh)n固体。

称取100mggd@c82固体，7ml30％的双氧水和3ml10％的氢氧化钠溶液，将三者混合后在50℃的条件下反应，至gd@c82粉末全部溶解后过滤；将所得过滤液用过量乙醇洗涤以除去过量h2o2和naoh并经过离心(转速：10000r/min，时间：4min)后去除上层无色液体，将收集的沉淀溶于超纯水中得到澄清溶液，使用m.w.＝3500透析袋将该澄清溶液在超纯水中透析，室温透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，冷冻干燥后得到内嵌金属富勒烯羟基化衍生物gd@c82(oh)n。

对上述制备得到的c70(oh)n进行元素分析(flashea1112)，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。在元素分析的结果中，所述c70(oh)n中，c含量为37.85％，h含量为1.51％，n含量<0.3％。从图1a热重分析得到，c70(oh)n固体粉末中含3.7％的水，结合元素分析中h含量与c含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基。所以c70(oh)n的平均结构式为c70(oh)24。

对上述制备得到的gd@c82(oh)n进行元素分析，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。在元素分析的结果中，所述gd@c82(oh)n中，c含量为36.95％，h含量为2.36％，n含量0％。从图1b热重分析可知，gd@c82(oh)n固体粉末中含12.6％的水，结合元素分析中h含量与c含量的比值，可推算碳笼表面修饰了26个羟基。所以gd@c82(oh)n的平均结构式为gd@c82(oh)26。通过动态光散射(dls)测定水溶性衍生物的粒径，gd@c82(oh)n材料的粒径约为145.2nm，可以向生物体内注射。

实施例2、水溶性金属富勒烯gd@c82(oh)n活化ampk。

ampk是生物能量代谢调节的关键因子，是细胞能量的感应器及能量代谢平衡调节器。该激酶能够通过感受细胞能量状态来维持真核细胞的atp生成和消耗的平衡，能够有助于纠正代谢紊乱，使细胞代谢趋于生理平衡。乙酰辅酶a羧化酶(acc)和羟甲基戊二酸单酰coa还原酶(hmgp)分别是脂肪酸和胆固醇合成的关键酶，均是ampk的作用靶点。活化的ampk可以使两者磷酸化失活，从而抑制脂肪的生成。同时，ampk能够诱导葡萄糖转运体4向浆膜转移，能够通过磷酸化转录因子开启葡萄糖转运体4的表达，并且，肝细胞中激活ampk不仅可以抑制糖异生减少糖的合成，还通过磷酸化调节糖原的合成。总之，ampk可以调节糖代谢和脂质代谢，是治疗代谢疾病如肥胖，糖尿病等的靶点。除了能量调节器之外，ampk也参与多个细胞机制的调节。ampk的活化也可以调节细胞分化，细胞自噬，炎症反应，老化及分化等。

(1)实验方法

实验动物为db/db糖尿病小鼠，购自南京动物模式中心，引自美国杰克逊实验室。此小鼠是广泛应用的2型糖尿病动物模型，其为瘦素受体基因缺陷导致肥胖后发展为糖尿病的小鼠模型，瘦素受体(leptinreceptor，lepr)的自发性突变会引起多食、消渴、多尿等症状。db/db小鼠在4～8周出现高糖血症。

实验动物分组：实验动物随机分为4组，每组6只；a组取6只db/m无糖尿病的小鼠作为空白组，其给药治疗为施用与c组所用药物等体积的生理盐水；b组取6只db/db小鼠作为模型组，其给药治疗为施用与c组所用药物等体积的生理盐水；c组取6只db/db小鼠作为gd@c82(oh)n实验组，其给药治疗为施用按照实施例1的方法制备的gd@c82(oh)n；d组为抑制剂组，抑制剂组小鼠除了按照gd@c82(oh)n实验组小鼠施用gd@c82(oh)n的方法施用gd@c82(oh)n以外，在第14天测血糖前口服给药ampk抑制剂compoundc，30mg/kg/次。a-d组均采用腹腔给药的方式，各组小鼠的周龄进入第10周开始给药，每天给药1次，gd@c82(oh)n的给药剂量为10mg/kg/d，连续给药两周。

(2)血糖检测

开始给药前为空白组、模型组和gd@c82(oh)n实验组小鼠测血糖，作为初始0d血糖，然后开始给药治疗，每天下午给药1次，连续给药两周，在开始给药的第3d、6d、9d和14d的上午测血糖浓度。如图2所示，在治疗过程中，实验组的血糖在第6天时已经显示出降低的趋势，到第9天实验组的血糖已显著降低，说明水溶性富勒烯结构能够有效降低血糖，治疗糖尿病。

在gd@c82(oh)n起作用后，考察ampk抑制剂对gd@c82(oh)n降血糖产生的影响。仅检测抑制剂组第14天的血糖，在第14天测血糖之前为抑制剂小鼠口服ampk抑制剂compoundc，测得血糖结果如图3所示，与实验组的小鼠相比，口服ampk抑制剂compoundc后抑制剂组的小鼠的血糖有所回升，说明水溶性富勒烯结构治疗糖尿病与ampk的表达激活相关。

(3)ampk检测

治疗2周后的各组小鼠处死，并且为了考察ampk抑制剂compoundc的影响，在解剖前再次向抑制剂组的小鼠口服给药ampk抑制剂compoundc，30mg/kg/次。

取a-c组的肝脏进行q-pcr测试，检测ampkmrna的表达。取50-100mg肝脏组织，首先加triol进行研磨，离心，加氯仿/triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mrna。对mrna进行反转录成cdna，最后进行pcr扩增。

检测ampk的相对mrna表达水平(将空白组的ampkmrna表达水平设为1，其他组的相对mrna表达水平＝其他组的ampkmrna表达水平÷空白组的ampkmrna表达水平)，结果如图4所示。经过gd@c82(oh)n治疗后的实验组小鼠的肝脏的ampkmrna表达明显比未经治疗的模型组小鼠高，说明水溶性富勒烯结构能促进ampkmrna的表达。

取a-d组的肝脏进行wb测试，检测ampk和pampk(pampk是指172位苏氨酸磷酸化的ampk)的表达。另取50-100mg的肝脏组织加1ml裂解液，匀浆，离心，去上层清液，定量，电泳，取胶，转膜，封闭，结合一抗和二抗，洗涤，显影成像，得到ampk和pampk的wb条带。图5即为ampk和172位苏氨酸磷酸化的ampk蛋白表达的分析示意图。从图中可以看出经过gd@c82(oh)n治疗后的实验组小鼠的肝脏的ampk和磷酸化ampk的条带明显比未经治疗的模型组小鼠粗且颜色深，说明水溶性富勒烯结构能促进ampk和磷酸化ampk的表达。由图6的定量pampk/ampk值可以看出经过水溶性富勒烯结构治疗后的小鼠肝脏中的pampk/ampk比值增高，说明水溶性富勒烯结构能够激活ampk。而加入ampk抑制剂后，磷酸化ampk含量和pampk/ampk比值均降低，与抑制剂组小鼠的血糖回升相对应，说明水溶性富勒烯结构治疗糖尿病与ampk的表达和磷酸化激活相关。

(4)炎症因子检测

治疗后的各组小鼠，眼眶取血，1500rpm，15min，离心得到血清，用elisa的方法测炎症干扰素(ifnα)和白介素-6(il-6)的含量。结果如下表，显示治疗后的小鼠的炎症因子明显降低。

本发明以db糖尿病小鼠为模型，以水溶性内嵌金属富勒烯gd@c82(oh)n为例，研究了水溶性富勒烯结构在调节ampk表达和ampk活化中的作用，以及在治疗ampk调节的疾病中的应用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。