一种艾塞那肽口服纳米颗粒的制作方法

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及含有艾塞那肽的口服纳米粒及其制备方法。

背景技术：

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的全身代谢性疾病，表现为胰岛素分泌缺陷或胰岛素生物作用出现障碍。据统计,目前全球范围内约有1.4亿糖尿病患者,而由于人口老龄化，肥胖发病率增加等因素，估计在2025年全球糖尿病患者将达到3亿。i型糖尿病，其特征是胰岛素分泌能力降低或彻底丧失，临床治疗需每天皮下注射胰岛素；ii型糖尿病，其特征是人体无法有效利用胰岛素，糖尿病患者中有90％是ii型糖尿病。

艾塞那肽是一种全新类型的ii型糖尿病治疗药物，是目前唯一可以帮助ii型糖尿病患者同时控制血糖和体重的治疗药物。艾塞那肽作为多肽类药物，目前临床上常用的给药方式为皮下注射给药，艾塞那肽注射液(百泌达)已于2005年在美国上市，2007年在欧洲上市，2009年获中国cfda批准上市，作为二甲双胍药物的辅助治疗药物。半衰期短(t1/2约2.4h)，不能持续控制血糖，导致药效受到一定局限，；是在基础上进一步研究开发的是艾塞那肽长效缓释微球，于2011年获欧洲emea批准上市，2012年获美国fda批准上市。目前艾塞那肽注射液(byetta)和艾塞那肽缓释微球(bydureon)用于治疗ii型糖尿病，两者均可很好的控制血糖水平，而且不会引起低血糖症。然而，现临床的艾塞那肽临床给药方式均为注射给药，糖尿病治疗需要患者长期注射给药，这给患者带来很大痛苦，同时注射剂使用不便，需要由技术熟练的人注射，且制造过程复杂，生产成本高。

口服途径是目前应用最广、更加方便的给药方式，但是口服给药经过胃肠道吸收，胃肠道不仅起着吸收水分、营养物质和电解的作用，同时还是机体抵抗外源异物的第一道有效屏障。因此蛋白多肽类药物的口服给药研究十分具有挑战性。艾塞那肽等蛋白多肽类药物经口服给通常会在胃肠道中被降解破坏，同时小肠上皮会阻碍药物的吸收。由于以上原因，使得蛋白多肽类药物口服生物利用度低，大多数蛋白质多肽类药物很少或不能经胃肠道吸收，限制了其临床应用。如果艾塞那肽可以口服给药，可以极大地提高患者顺应性，而且生产过程无菌要求较低，可以降低生产成本。因此，为了扩大艾塞那肽制剂的临床应用，急需开发一种给药更加方便的艾塞那肽口服制剂。

技术实现要素：

本发明提供了一种艾塞那肽口服纳米粒，纳米粒由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物包裹艾塞那肽再和fc抗体片段(-sh)结合。fc抗体片段(-sh)与高分子聚合物发生迈克尔加成反应修饰纳米粒，从而提高纳米粒在小肠部位的吸收效率，提高艾塞那肽的口服生物利用度。

本发明提供的一种艾塞那肽纳米粒，所述纳米粒中艾塞那肽包裹在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物中形成纳米粒，艾塞那肽与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物，重量比为1:50～1:1，优选1:16.7。

本发明所述的纳米粒，可以是艾塞那肽的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物形成的纳米粒与fc抗体片段结合形成，艾塞那肽的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物纳米粒与fc抗体片段的摩尔比比为100:1～30:1，优选60:1。

本发明所述艾塞那肽口服纳米粒采用下述方法制备：称取艾塞那肽和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物，用有机溶剂溶解聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物，得到的油相加入到艾塞那肽粉末中，超声得到初乳，将初乳加入到pva溶液中，超声得到复乳，将复乳加入pva溶液中搅拌，挥发有机溶剂，获得纳米粒，将制备的纳米粒浓缩，将浓缩的纳米粒与fc抗体片段在氮气下以反应，使用葡聚糖g50柱分离靶纳米颗粒和游离的lmwp，获得fc抗体片段结合的艾塞那肽peg-plga纳米粒。

所述制备方法中，有机溶剂为丙酮和二氯甲烷的混合溶液，优选丙酮：二氯甲烷1:1混合溶液，优选所述艾塞那肽与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物的重量比为1:16.7，优选艾塞那肽的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物纳米粒与fc抗体片段的摩尔比为60:1。优选所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)或其改构的高分子聚合物为mpeg-plga:peg-plga-mal,优选聚合物的比例为9:1。

所述艾塞那肽口服纳米粒以口服制剂形式存在，所述口服制剂可以采用药学常规方法制备得到，优选肠溶胶囊。

附图说明

图1：5种制剂的体内生物利用度比较图

图2：5种制剂的降血糖结果比较图

具体实施方式

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1油相为二氯甲烷制备的艾塞那肽口服纳米粒

取30.06mg的plga-mpeg和3.34mg的plga-peg-mal(分子量为20000)溶于二氯甲烷(2ml)，作为油相。取800ul2.5mg·ml-1的艾塞那肽水溶液，加入油相超声形成初乳，超声功率为300w，超声时间为100s。再加入4ml3％pva外水相超声形成复乳。最后在冰水浴、500rpm的转速下，滴加到40ml0.5％pva的超纯水中。挥发有机溶剂约5h。纳米粒过0.45um水膜，测得粒径为220nm，测得包封率67％。

实施例2油相为丙酮制备的艾塞那肽口服纳米粒

取30.06mg的plga-mpeg和3.34mg的plga-peg-mal(分子量为20000)溶于丙酮(2ml)，作为油相。取800ul2.5mg·ml-1的艾塞那肽水溶液，加入油相超声形成初乳，超声功率为300w，超声时间为100s。再加入4ml3％pva外水相超声形成复乳。最后在冰水浴、500rpm的转速下，滴加到40ml0.5％pva的超纯水中。挥发有机溶剂约5h。纳米粒过0.45um水膜，测得粒径为150nm，测得包封率54％。

实施例3油相为丙酮和二氯甲烷(3:1)制备的艾塞那肽口服纳米粒

取30.06mg的plga-mpeg和3.34mg的plga-peg-mal(分子量为20000)溶于丙酮(1.5ml)和二氯甲烷(0.5ml)的混合溶剂，作为油相。取800ul2.5mg·ml-1的艾塞那肽水溶液，加入油相超声形成初乳，超声功率为300w，超声时间为100s。再加入4ml3％pva外水相超声形成复乳。最后在冰水浴、500rpm的转速下，滴加到40ml0.5％pva的超纯水中。挥发有机溶剂约5h。纳米粒过0.45um水膜，测得粒径为170nm，测得包封率52％。

实施例4油相为丙酮和二氯甲烷(1:1)制备的艾塞那肽口服纳米粒

取30.06mg的plga-mpeg和3.34mg的plga-peg-mal(分子量为20000)溶于丙酮(1.0ml)和二氯甲烷(1.0ml)的混合溶剂，作为油相。取800ul2.5mg·ml-1的艾塞那肽水溶液，加入油相超声形成初乳，超声功率为300w，超声时间为100s。再加入4ml3％pva外水相超声形成复乳。最后在冰水浴、500rpm的转速下，滴加到40ml0.5％pva的超纯水中。挥发有机溶剂约5h。纳米粒过0.45um水膜，测得粒径为139nm，测得包封率88％。

实施例5制备艾塞那肽peg-plga纳米粒

称取mpeg-plga(5,000–20,000da,50:50la:ga,w/w):peg-plga-mal(5,000–20,000da,50:50la:ga,w/w)比例为9:1共16.7mg高分子聚合物，用丙酮：二氯甲烷1:1(各0.5ml)溶解，得到油相，加入400ul艾塞那肽2.5mg/ml中，300w超声30s得到w/o初乳，将初乳加入到1％的pva溶液中，冰水浴中300w超声100s得到w/o/w复乳，将复乳加入1％pva溶液中磁力搅拌，挥发有机溶剂丙酮和二氯甲烷。测定纳米粒的包封率为85.07％。

实施例6制备艾塞那肽peg-plga纳米粒

称取mpeg-plga(5,000–20,000da,50:50la:ga,w/w):peg-plga-mal(5,000–20,000da,50:50la:ga,w/w)比例为9:1共16.7mg高分子聚合物，用丙酮：二氯甲烷1:1(各0.5ml)溶解，得到油相，加入800ul艾塞那肽2.5mg/ml中，300w超声30s得到w/o初乳，将初乳加入到1％的pva溶液中，冰水浴中300w超声100s得到w/o/w复乳，将复乳加入1％的pva溶液中磁力搅拌，挥发有机溶剂丙酮和二氯甲烷，测定纳米粒的包封率为67.70％.

实施例7制备艾塞那肽纳米粒

称取mpeg-plga(5,000–20,000da,50:50la:ga,w/w):peg-plga-mal(5,000–20,000da,50:50la:ga,w/w)比例为9:1共16.7mg高分子聚合物，用丙酮：二氯甲烷1:1(各0.5ml)溶解，得到油相，加入200ul艾塞那肽2.5mg/ml中，300w超声30s得到w/o初乳，将初乳加入到1％的pva溶液中，冰水浴中300w超声100s得到w/o/w复乳，将复乳加入1％的pva溶液中磁力搅拌，挥发有机溶剂丙酮和二氯甲烷，测定纳米粒的包封率为57.90％.

实施例8艾塞那肽单克隆抗体fc修饰的口服纳米粒

单克隆抗体fc巯基化：取1ml的1.5mg/ml的fc与41.85ul的1mg/ml的traut’s试剂反应，过g-25葡聚糖凝胶色谱柱，使用bca蛋白浓度检测试剂盒检测分离出游离的fc，得到巯基化的fc单克隆抗体。

浓缩前述实施例制备的纳米粒约1ml，然后以摩尔比plga-peg-mal：fc＝60:1的比例与166ug的巯基化fc在避光、充氮气、冰水浴的条件下反应1h。然后使用100k超滤管浓缩、洗涤纳米粒三次，去除游离的巯基化fc单克隆抗体，得到fc单克隆抗体修饰的艾塞那肽纳米粒。

试验例1：体内生物利用度研究试验

实验动物：六周龄的db/db小鼠30只，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，体重40-45g。单次给药：

(1)100μg/kg给予制备口服exenatide溶液组，口服给药组；

(2)100μg/kg给予实施例8制备的exenatide-fc靶向纳米粒，口服给药组；

(3)100μg/kg给予实施例5制备的exenatide纳米粒组，口服给药组；

(4)100μg/kg给予制备的exenatide溶液：静脉给药组；

(5)100μg/kg给予制备的exenatide溶液：皮下给药组；

分别在给药后0min，1min，5min，15min，20min，30min，45min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，取血，测试。

表1：不同制剂生物利用度研究结果

结果分析：艾塞那肽不同制剂的药释曲线和药物动力学参数见图1和表1，艾塞那肽(口服)组检出的艾塞那肽一直很低，艾塞那肽(sc)组在0.5h达到最大血浆浓度。给药4小时后，艾塞那肽在血浆中检测到含量已很低，而fc-exenatide-np可以延长艾塞那肽的体内半衰期，尽管最大血浆浓度较低，但在纳米颗粒施用8小时后达到最大血浆浓度，并且在12小时仍然检测到较高含量的艾塞那肽。与艾塞那肽(口服)组相比，艾塞那肽纳米粒显着增加了艾塞那肽在胃肠道中的血浆浓度，从而提高了口服艾塞那肽的相对生物利用度。

试验例2：降低血糖试验

实验动物：六周龄的db/db小鼠30只，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，体重40-45g。单次给药：

(1)100μg/kg给予实施例5制备的exenatide纳米粒组：，口服给药组；

(2)100μg/kg给予实施例8制备的exenatide-fc靶向纳米粒，口服给药组；

(3)100μg/kg给予口服exenatide溶液，口服给药组；

(4)等体积的生理盐水口服给药组。

(5)10ug/kgexenatide皮下注射组：

分别在给药后0min，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h从尾部收集血液，用血糖计(roche血糖仪，上海)测定血糖值。

表2：单次给药后测定的血糖值

结果分析：艾塞那肽不同制剂的降低血糖结果见图2和表2，(1)纳米粒组相比生理盐水组、口服艾塞那肽组都有降血糖优势；(2)皮下注射给药组血糖水平有一个明显的下降再回升的过程，1h最低，约10h恢复给药前水平；(3)fc靶向组相比普通纳米粒有更明显降血糖优势，24h内都平稳降低血糖，(4)fc靶向组相比其他纳米粒组降血糖效果明显。