本发明涉及一种磁性纳米氧化铁粒子造影剂的制备方法，属于造影剂技术领域。
背景技术：
随着现代影像学的发展，人们有能力并更加渴望在非侵入性诊断时就得到足够的证据来判断疾病的类型和发展阶段，即在不实质性侵入人体内部情况下得到诊断结果，并尽可能不采用会对人体造成一定创伤和痛苦的侵入性诊断方法。现代医学成像技术主要包括超声成像、磁共振成像、电子计算机断层扫描成像和光学成像等。在科学研究和临床实践中，为了更好地将病变组织和正常组织区域进行精确分辨以进行医学诊断，需要对医学图像的对比度进行调节，并且提高医学成像的灵敏度，从而更好地为医学诊断提供参考，因此需要向生物体内注入可以增强成像的分辨率和提高成像灵敏度的物质，这种物质被称为造影剂。根据不同的成像方式又将其分为超声造影剂、磁共振造影剂、ct造影剂和荧光成像造影剂等等。由于各种成像技术原理的不同，各种成像技术对疾病的诊断也必然存在一定的盲区和缺陷，如果能将各种成像模式整合到一起，则可能在一次对患者检查中得到各种有效信息并且通过3d建模的形式加以重建分析，将所得结果与正常人群加以对照，通过计算机算法的改进来辅助职业医生来对其诊断，则诊断过程中发生误诊和漏诊的可能性将大大降低，病人的生命安全也将得到保证，因此对多模式成像试剂的研发也就成了摆在科研人员面前的热点和首先必须要解决的问题。
为了减少诊断和治疗时注入药物的痛苦，并且为了对治疗的整个过程进行全程的医学成像的监测，临床医生和患者都特别希望将诊断制剂和治疗制剂进行有效的整合，使一种药物同时实现成像和治疗的双重功能。这种将诊断和治疗结合在一起的方式，一方面因为节约时间而在急救方面具有独特的优势，另一方面也能够实现治疗的全程跟踪可控，从而使治疗过程更加安全透明。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对现有造影剂成像敏感度低，速度慢的问题，提供了一种磁性纳米氧化铁粒子造影剂的制备方法的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
（1）将表面双键的聚甘油树枝状大分子、聚乙烯醇改性纳米氧化铁加入丙酮中，常温下以1500～2000r/min转速搅拌20～30min，超声分散10～15min，得分散液；
（2）将叔丁醇，氮甲基吗琳氮氧化物和去离子水加入分散液中，常温下以300～400r/min转速搅拌混合40～60min，得混合物；
（3）将锇酸钾加入混合物中，常温下以200～300r/min转速搅拌20～24h，得混合反应物；
（4）将混合反应物置于丙酮中沉淀，得粗产物；
（5）将粗产物用甲醇稀释，过滤，取固体旋转蒸发，置于60～80℃下真空干燥1～2h，得磁性纳米氧化铁造影剂。
所述的表面双键的聚甘油树枝状大分子、丙酮、叔丁醇、氮甲基吗啉氮氧化物、锇酸钾、聚乙烯醇改性纳米氧化铁、去离子水的重量份为15～20份表面双键的聚甘油树枝状大分子、100～120份丙酮、30～40份叔丁醇、20～30份氮甲基吗啉氮氧化物、0.1～0.3份锇酸钾、5～10份聚乙烯醇改性纳米氧化铁、50～60份去离子水。
步骤（3）所述的混合反应物与丙酮的质量比为1∶5。
步骤（1）所述的表面双键的聚甘油树枝状大分子的具体制备步骤为：
（1）将氢化钠、β-环糊精加入n，n-二甲基甲酰胺中，常温下以200～300r/min转速搅拌15～20min，得浊液；
（2）将浊液置于冰浴中冷却并将溴丙烯缓慢滴加至浊液中，得混合浊液；
（3）将混合浊液通入氮气保护并在常温下以300～400r/min转速搅拌8～10h，得反应浊液；
（4）将反应浊液减压蒸发，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释并过滤，再用正己烷洗涤3～5次，置于60～80℃下真空干燥1～2h，得表面双键的聚甘油树枝状大分子。
所述的氢化钠、n，n-二甲基甲酰胺、β-环糊精、溴丙稀的重量份为10～15份氢化钠、60～80份n，n-二甲基甲酰胺、10～15份β-环糊精、15～20份溴丙稀。
步骤（2）所述的溴丙烯的滴加时间为10～15min。
步骤（3）所述的保护氮气的气体流速为20～30ml/min。
步骤（1）所述的聚乙烯醇改性纳米氧化铁的具体制备步骤为：
（1）将三氯化铁加入去离子水中，在30～35℃水浴下以100～150r/min转速搅拌15～20min，得溶液；
（2）将溶液置于-4～0℃冰箱中冻结5～10min，得铁离子溶液；
（3）将聚乙烯醇加入铁离子溶液中，在80～85℃水浴下以550～600r/min转速剧烈搅拌25～30min，得混合溶液；
（4）将氨水缓慢滴加至混合溶液中，滴加时间15～20min，在40～45℃水浴下以550～600r/min转速加热剧烈搅拌2～2.5h，得反应液；
（5）将反应液置于离心机中以5000～5500r/min转速离心分离，取下层固体，得黑色固体；
（6）将黑色固体用无水乙醇溶液清洗3～5次，再用去离子水清洗3～5次，得清洗后的黑色固体；
（7）将清洗后的黑色固体置于55～60℃中真空干燥1.5～2h，得聚乙烯醇改性纳米氧化铁。
所述的三氯化铁、聚乙烯醇、氨水、去离子水的重量份为20～30份三氯化铁、40～60份聚乙烯醇、15～20份质量分数20%的氨水、100～120份去离子水。
步骤（7）所述的聚乙烯醇改性纳米氧化铁的粒径为40～50nm。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明以三氯化铁为原料，并通过添加聚乙烯醇，制备磁性纳米氧化铁造影剂，大多数纳米载体有着共同的优点，首先，其特殊的尺寸使其不会很快地排出体外，同时也不会很快地被单核巨噬细胞系统捕获，因而体内循环时间更长，其次，纳米颗粒可以搭载更多的功能基团，而当其连接多个或多种靶向基团时，可提高对靶点的亲和力以及靶向性，再次，纳米颗粒能够携带多种功能基团起协同或辅助作用，最后，一些响应型的纳米颗粒可以精确地控制药物和小分子探针的释放，这对于减少副作用，提高准确性极其重要，磁性纳米氧化铁能高效地引起水质子自旋去相位差，衰减自旋－自旋弛豫时间，磁性氧化铁纳米颗粒的团聚体表现出很强的弛豫时间衰减能力，利用这个磁性弛豫开关性质，能有效实现对于分子以及分子间作用力的检测，从而提高纳米材料造影剂的成像速度，聚乙烯醇对磁性氧化铁纳米粒子的功能化改性展现出较高的横向弛豫效能，在溶液中有很好的单分散性，能有效提高造影剂的敏感度；
（2）本发明通过树枝状大分子连接聚乙烯醇改性纳米氧化铁，制备磁性纳米氧化铁造影剂，树枝状大分子是一种超支化三维球形大分子，具有结构明确、表面基团多等特点，一般树枝状大分子包括3个部分：中间的核、围绕着核的分枝以及多官能团的表面，代数越高的树枝状大分子其分子的密度越大，形态上也越接近球形，树枝状大分子的末端有大量的活性基团，粘度随分子量先增加后减小，具有单分散性，结构确定，纳米尺寸，内含空穴，吸附能力高于线性高分子，树枝状大分子因其独特的化学结构而具有一系列有利于生物应用的特点，树枝状大分子的分子量分布范围窄，单个分子即具有纳米尺寸，具有多化位效应，并且易于通过修饰表面基团改变其理化化质，树枝状大分子表面功能基团为连接药物物和靶向基团提供了充分的可能性，内部的空腔化可以包裹聚乙烯醇改性纳米氧化铁，枝状大分子不仅可以过处理自带荧光，同时连接靶向基团和小分子的造影剂，增强其被特定细胞吞嘘的能力，从而提高造影的特异性，还可以同时连接多种小分子造影剂，构建更加稳定，靶向性更强的荧光探针。
具体实施方式
按重量份数计，分别称量20～30份三氯化铁、40～60份聚乙烯醇、15～20份质量分数20%的氨水、100～120份去离子水，将三氯化铁加入去离子水中，在30～35℃水浴下以100～150r/min转速搅拌15～20min，得溶液，将溶液置于-4～0℃冰箱中冻结5～10min，得铁离子溶液，将聚乙烯醇加入铁离子溶液中，在80～85℃水浴下以550～600r/min转速剧烈搅拌25～30min，得混合溶液，将氨水缓慢滴加至混合溶液中，滴加时间15～20min，在40～45℃水浴下以550～600r/min转速加热剧烈搅拌2～2.5h，得反应液，将反应液置于离心机中以5000～5500r/min转速离心分离，取下层固体，得黑色固体，将黑色固体用无水乙醇溶液清洗3～5次，再用去离子水清洗3～5次，得清洗后的黑色固体，将清洗后的黑色固体置于55～60℃中真空干燥1.5～2h，得粒径40～50nm的聚乙烯醇改性纳米氧化铁，再按重量份数计，分别称量10～15份氢化钠、60～80份n，n-二甲基甲酰胺、10～15份β-环糊精、15～20份溴丙稀，将氢化钠、β-环糊精加入n，n-二甲基甲酰胺中，常温下以200～300r/min转速搅拌15～20min，得浊液，将浊液置于冰浴中冷却并将溴丙烯缓慢滴加至浊液中，滴加时间10～15min，得混合浊液，将混合浊液以20～30ml/min的气流速度通入氮气保护并在常温下以300～400r/min转速搅拌8～10h，得反应浊液，将反应浊液减压蒸发，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释并过滤，再用正己烷洗涤3～5次，置于60～80℃下真空干燥1～2h，得表面双键的聚甘油树枝状大分子，再按重量份数计，分别称量15～20份表面双键的聚甘油树枝状大分子、100～120份丙酮、30～40份叔丁醇、20～30份氮甲基吗啉氮氧化物、0.1～0.3份锇酸钾、5～10份聚乙烯醇改性纳米氧化铁、50～60份去离子水，将表面双键的聚甘油树枝状大分子、聚乙烯醇改性纳米氧化铁加入丙酮中，常温下以1500～2000r/min转速搅拌20～30min，超声分散10～15min，得分散液，将叔丁醇，氮甲基吗琳氮氧化物和去离子水加入分散液中，常温下以300～400r/min转速搅拌混合40～60min，得混合物，将锇酸钾加入混合物中，常温下以200～300r/min转速搅拌20～24h，得混合反应物，按质量比1∶5将混合反应物置于丙酮中沉淀，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释，过滤，取固体旋转蒸发，置于60～80℃下真空干燥1～2h，得磁性纳米氧化铁造影剂。
按重量份数计，分别称量20份三氯化铁、40份聚乙烯醇、15份质量分数20%的氨水、100份去离子水，将三氯化铁加入去离子水中，在30℃水浴下以100r/min转速搅拌15min，得溶液，将溶液置于-4℃冰箱中冻结5min，得铁离子溶液，将聚乙烯醇加入铁离子溶液中，在80℃水浴下以550r/min转速剧烈搅拌25min，得混合溶液，将氨水缓慢滴加至混合溶液中，滴加时间15min，在40℃水浴下以550r/min转速加热剧烈搅拌2h，得反应液，将反应液置于离心机中以5000r/min转速离心分离，取下层固体，得黑色固体，将黑色固体用无水乙醇溶液清洗3次，再用去离子水清洗3次，得清洗后的黑色固体，将清洗后的黑色固体置于55℃中真空干燥1.5h，得粒径40nm的聚乙烯醇改性纳米氧化铁，再按重量份数计，分别称量10份氢化钠、60份n，n-二甲基甲酰胺、10份β-环糊精、15份溴丙稀，将氢化钠、β-环糊精加入n，n-二甲基甲酰胺中，常温下以200r/min转速搅拌15min，得浊液，将浊液置于冰浴中冷却并将溴丙烯缓慢滴加至浊液中，滴加时间10min，得混合浊液，将混合浊液以20～30ml/min的气流速度通入氮气保护并在常温下以300r/min转速搅拌8h，得反应浊液，将反应浊液减压蒸发，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释并过滤，再用正己烷洗涤3次，置于60℃下真空干燥1h，得表面双键的聚甘油树枝状大分子，再按重量份数计，分别称量15份表面双键的聚甘油树枝状大分子、100份丙酮、30份叔丁醇、20份氮甲基吗啉氮氧化物、0.1份锇酸钾、5份聚乙烯醇改性纳米氧化铁、50份去离子水，将表面双键的聚甘油树枝状大分子、聚乙烯醇改性纳米氧化铁加入丙酮中，常温下以1500r/min转速搅拌20min，超声分散10min，得分散液，将叔丁醇，氮甲基吗琳氮氧化物和去离子水加入分散液中，常温下以300r/min转速搅拌混合40min，得混合物，将锇酸钾加入混合物中，常温下以200r/min转速搅拌20h，得混合反应物，按质量比1∶5将混合反应物置于丙酮中沉淀，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释，过滤，取固体旋转蒸发，置于60℃下真空干燥1h，得磁性纳米氧化铁造影剂。
按重量份数计，分别称量25份三氯化铁、50份聚乙烯醇、18份质量分数20%的氨水、110份去离子水，将三氯化铁加入去离子水中，在32℃水浴下以125r/min转速搅拌18min，得溶液，将溶液置于-2℃冰箱中冻结8min，得铁离子溶液，将聚乙烯醇加入铁离子溶液中，在82℃水浴下以575r/min转速剧烈搅拌28min，得混合溶液，将氨水缓慢滴加至混合溶液中，滴加时间18min，在42℃水浴下以575r/min转速加热剧烈搅拌2.2h，得反应液，将反应液置于离心机中以5250r/min转速离心分离，取下层固体，得黑色固体，将黑色固体用无水乙醇溶液清洗4次，再用去离子水清洗4次，得清洗后的黑色固体，将清洗后的黑色固体置于58℃中真空干燥1.8h，得粒径45nm的聚乙烯醇改性纳米氧化铁，再按重量份数计，分别称量12份氢化钠、70份n，n-二甲基甲酰胺、12份β-环糊精、18份溴丙稀，将氢化钠、β-环糊精加入n，n-二甲基甲酰胺中，常温下以250r/min转速搅拌18min，得浊液，将浊液置于冰浴中冷却并将溴丙烯缓慢滴加至浊液中，滴加时间12min，得混合浊液，将混合浊液以25ml/min的气流速度通入氮气保护并在常温下以350r/min转速搅拌9h，得反应浊液，将反应浊液减压蒸发，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释并过滤，再用正己烷洗涤4次，置于70℃下真空干燥1h，得表面双键的聚甘油树枝状大分子，再按重量份数计，分别称量18份表面双键的聚甘油树枝状大分子、110份丙酮、35份叔丁醇、25份氮甲基吗啉氮氧化物、0.2份锇酸钾、8份聚乙烯醇改性纳米氧化铁、55份去离子水，将表面双键的聚甘油树枝状大分子、聚乙烯醇改性纳米氧化铁加入丙酮中，常温下以1750r/min转速搅拌25min，超声分散12min，得分散液，将叔丁醇，氮甲基吗琳氮氧化物和去离子水加入分散液中，常温下以350r/min转速搅拌混合50min，得混合物，将锇酸钾加入混合物中，常温下以250r/min转速搅拌22h，得混合反应物，按质量比1∶5将混合反应物置于丙酮中沉淀，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释，过滤，取固体旋转蒸发，置于70℃下真空干燥1h，得磁性纳米氧化铁造影剂。
按重量份数计，分别称量30份三氯化铁、60份聚乙烯醇、20份质量分数20%的氨水、120份去离子水，将三氯化铁加入去离子水中，在35℃水浴下以150r/min转速搅拌20min，得溶液，将溶液置于0℃冰箱中冻结10min，得铁离子溶液，将聚乙烯醇加入铁离子溶液中，在85℃水浴下以600r/min转速剧烈搅拌30min，得混合溶液，将氨水缓慢滴加至混合溶液中，滴加时间20min，在45℃水浴下以600r/min转速加热剧烈搅拌2.5h，得反应液，将反应液置于离心机中以5500r/min转速离心分离，取下层固体，得黑色固体，将黑色固体用无水乙醇溶液清洗5次，再用去离子水清洗5次，得清洗后的黑色固体，将清洗后的黑色固体置于60℃中真空干燥2h，得粒径50nm的聚乙烯醇改性纳米氧化铁，再按重量份数计，分别称量15份氢化钠、80份n，n-二甲基甲酰胺、15份β-环糊精、20份溴丙稀，将氢化钠、β-环糊精加入n，n-二甲基甲酰胺中，常温下以300r/min转速搅拌20min，得浊液，将浊液置于冰浴中冷却并将溴丙烯缓慢滴加至浊液中，滴加时间15min，得混合浊液，将混合浊液以30ml/min的气流速度通入氮气保护并在常温下以400r/min转速搅拌10h，得反应浊液，将反应浊液减压蒸发，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释并过滤，再用正己烷洗涤5次，置于80℃下真空干燥2h，得表面双键的聚甘油树枝状大分子，再按重量份数计，分别称量20份表面双键的聚甘油树枝状大分子、120份丙酮、40份叔丁醇、30份氮甲基吗啉氮氧化物、0.3份锇酸钾、10份聚乙烯醇改性纳米氧化铁、60份去离子水，将表面双键的聚甘油树枝状大分子、聚乙烯醇改性纳米氧化铁加入丙酮中，常温下以2000r/min转速搅拌30min，超声分散15min，得分散液，将叔丁醇，氮甲基吗琳氮氧化物和去离子水加入分散液中，常温下以400r/min转速搅拌混合60min，得混合物，将锇酸钾加入混合物中，常温下以300r/min转速搅拌24h，得混合反应物，按质量比1∶5将混合反应物置于丙酮中沉淀，得粗产物，将粗产物用甲醇稀释，过滤，取固体旋转蒸发，置于80℃下真空干燥2h，得磁性纳米氧化铁造影剂。
对照例：浙江某公司生产的造影剂。
试验表明：肿瘤组织独特的性质为开发诊断及化疗药物制剂提供了基础，也启发我们开发一种纳米级的造影剂。与血池显影剂不同，纳米级尺寸的显影剂由于其独特的尺寸范围，赋予了它们极强的穿透力，可以穿越肿瘤血管内皮间隙进入肿瘤组织而实现组织显影，从而超越了微泡类超声造影剂仅能发生血池内显像的局限性，拓展了超声诊断作为传统成像手段的应用范围，因此纳米级显影剂在肿瘤显影和治疗方面有很大的优势。
我们在成功制备了新型微泡造影剂的基础上，利用不同尺寸的微泡浮力不一样的特性，采用离心的方法从母液微泡悬液中分离其中的纳米级气泡。优化离心条件，得到符合使用要求的纳米级气泡，对其性状进行了初步的研究，并在动物体内评价了得到的纳米级气泡的超声显影效果。
微泡的粒径分布范围在几百纳米到几微米的范围内。这个尺寸范围可以安全通过肺滤到达外周循环。制得的微泡平均粒径在1.1～2.0um的范围内，超过8um的微泡很少。粒度呈双峰分布，分别位于400～600nm和3～5um的范围内，表明微泡中含有大量的纳米级气泡。这可能是由于超声过程中产生高的能量核，较高的表面活性剂浓度可快速降低表面张力，导致气泡成核速率增加，最终产生大量的小气泡。改变制备工艺也不能使气泡尺寸完全移到纳米尺寸范围内，表明这样的尺寸分布已经达到它们物理性质上可能达到的最小曲率半径。
调节离心时间可以改变纳米级气泡的尺寸，通过这种方法我们可以得到平均粒径在400～600nm之间的纳米级气泡。
由此可知：本发明制备的造影剂具有良好的稳定性，实现微泡药物载体同时具有良好的超声显影效果和超声控释响应特性，并具有靶向释放的功能。