本发明涉及一种纳米颗粒组合物。更具体地，涉及用于递送药物等的纳米颗粒组合物。
背景技术：
为了克服递送药物至恶性脑肿瘤进行治疗的障碍而正进行挑战。由于恶性脑肿瘤的复杂性质、恶性脑肿瘤在大脑中形成的位置问题，脑肿瘤在全世界的致死率都很高。脑肿瘤中，胶质母细胞瘤在高度组织化且复杂化的恶性细胞网络的支持下，发生转移，从原发灶扩散到新区域，会迅速扩散到整个大脑。这种胶质母细胞瘤的快速增殖能力仍然是常规治疗如外科肿瘤切除和化疗等的重要障碍之一。化疗有限的成功率的另一个主要障碍，就是几乎所有化疗剂都无法克服大脑的内在防御机制。有报道称，只有约不足1％的化疗剂能通过全身给药而到达中枢神经系统肿瘤的脉管结构。这是因为存在高度选择性的血脑屏障。作为治疗脑疾病而存在的课题是克服将化疗剂递送至大脑特定区域的困难性。因此，有对能够通过血脑屏障的各种药物递送系统(dds)进行了研究。例如，非专利文献1记载了将金粒子用作通过血脑屏障的药物递送系统。非专利文献2记载了与转铁蛋白和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽结合的双靶向脂质体，用于胶质瘤的靶向疗法。但是，非专利文献2没有记载含有脂肪酸作为膜成分的脂质体。非专利文献3记载了由作为核糖体失活蛋白的麻疯树毒蛋白(curcin)和混合固体脂质纳米载体组成的纳米制剂，用于治疗胶质母细胞瘤。但是，非专利文献3没有记载在纳米颗粒表面结合有对靶细胞有特异性的物质。现有技术文献非专利文献非专利文献1：chengy.,etal.,blood-brainbarrierpermeablegoldnanoparticles:anefficientdeliveryplatformforenhancedmalignantgliomatherapyandimaging.,small,10(24),5137-5150,2014.非专利文献2：qinl.,etal.,adual-targetingliposomeconjugatedwithtransferrinandarginine-glycine-asparticacidpeptideforglioma-targetingtherapy,oncologyletters,8,2000-2006,2014非专利文献3：mohamedms.,etal.,structurallydistincthybridpolymer/lipidnanoconstructsharboringatype-iribotoxinascellularimagingandglioblastomadirectedtherapeuticvectors.macromolecularbioscience,14,1696-1711,2014.技术实现要素：发明所要解决的问题在上述情况下，需要能够通过血脑屏障，药物递送效率高，且更安全的药物递送系统。因此，本发明的目的在于提供一种可用于能够通过血脑屏障的药物递送系统，且细胞毒性低的组合物。解决问题的技术方案为了解决上述问题，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，在表面结合有对靶细胞有特异性物质的纳米颗粒能够通过血脑屏障，有效地递送至脑内(特别是脑肿瘤)，从而完成了本发明。本发明包含以下方式：[1]一种纳米颗粒组合物，其含有表面结合有对肿瘤细胞有特异性的第一物质和第二物质的纳米颗粒，其中，对肿瘤细胞有特异性的第一物质是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列的肽，对肿瘤细胞有特异性的第二物质是铁结合性蛋白，所述纳米颗粒具有外层和由该外层包裹的囊泡，且所述纳米颗粒含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂作为膜成分。[2]根据[1]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述熔点为30℃以上的脂肪酸是硬脂酸，所述非peg化磷脂是磷脂酰胆碱。[3]根据[1]或[2]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述peg化磷脂是与peg结合的磷脂酰乙醇胺。[4]根据[3]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺是dspe。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中，所述peg化磷脂具有氨基修饰的peg。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的纳米颗粒组合物，其含有的所述第一物质和所述第二物质的质量比是2:8～8:2。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中，所述纳米颗粒还含有药物。[8]根据[7]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述药物是抗癌剂。[9]根据[1]～[8]中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中，所述纳米颗粒还含有显影剂。[10]一种纳米颗粒组合物的制造方法，所述纳米颗粒组合物含有表面结合有对肿瘤细胞有特异性的第一物质和第二物质的纳米颗粒，所述方法包括以下步骤：步骤(i)，从在挥发性有机溶剂中含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液中除去挥发性有机溶剂，以形成膜；步骤(ii)，在缓冲液中对在步骤(i)中得到的膜进行超声波处理，生成纳米颗粒；以及步骤(iii)，使对肿瘤细胞有特异性的第一物质和第二物质与在步骤(ii)中得到的纳米颗粒表面结合，其中，对肿瘤细胞有特异性的第一物质是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列的肽，对肿瘤细胞有特异性的第二物质是铁结合性蛋白。[11]根据[10]所述的方法，其中，在所述步骤(ii)中，缓冲液含有药物，并生成含有药物的纳米颗粒。[12]根据[11]所述的方法，其中，所述药物是抗癌剂。[13]根据[10]～[12]中任一项所述的方法，还包括将显影剂导入到纳米颗粒中。[14]一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有[8]所述的纳米颗粒组合物。[15]根据[14]所述的药物组合物，其中，癌症是脑肿瘤。[16]一种癌症的治疗方法，其包括向患有癌症的受试对象给予[14]或[15]所述的药物组合物。[17]根据[16]所述的方法，其中，癌症是脑肿瘤。[18]一种用于对肿瘤细胞成像的组合物，其含有[9]所述的纳米颗粒组合物。[19]一种检测脑肿瘤的方法，其包括以下步骤：向有此需要的受试对象给予[18]所述的组合物，以及检测显影剂在脑内的定位。[20]一种用于监测脑肿瘤治疗效果的方法，其包括以下步骤：向有此需要的受试对象给予[18]所述的组合物，以及检测显影剂在脑内的定位。本发明还包含以下方式：[101]一种组合物，其含有下述式(1)所示的化合物、熔点为30℃以上的脂肪酸，以及磷脂。[化1][式(1)中，m1～m2彼此独立地为10～25的整数；n为20～60的整数；m3为0～10的整数；r为羧基、氨基或含有氨基的基团；x+为阳离子。][102]根据[101]所述的组合物，其还含有药物。[103]根据[102]所述的组合物，其中，所述药物是麻疯树毒蛋白。[104]根据[101]～[103]中任一项所述的组合物，其中，在式(1)所示的所述化合物中，式(1)中的r含有对靶细胞有特异性的第一物质。[105]根据[101]～[104]中任一项所述的组合物，其中，在式(1)所示的所述化合物中，式(1)中的r含有对靶细胞有特异性的第二物质。[106]根据[104]或[105]所述的组合物，其中，对靶细胞有特异性的所述第一物质是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列的肽。[107]根据[105]或[106]所述的组合物，其中，对靶细胞有特异性的所述第二物质是转铁蛋白。[108]根据[101]～[107]中任一项所述的组合物，其为直径500nm以下的颗粒状。[109]根据[102]～[108]中任一项所述的组合物，其用于治疗脑肿瘤。本发明还包含以下方式：[1001]一种纳米颗粒组合物，其含有表面结合有对肿瘤细胞有特异性的第一物质和第二物质的纳米颗粒，其中，对肿瘤细胞有特异性的第一物质是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列的肽，对肿瘤细胞有特异性的第二物质是铁结合性蛋白，所述纳米颗粒具有外层和由该外层包裹的囊泡，且所述纳米颗粒含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂作为膜成分。[1002]根据[1001]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述peg化磷脂是dspe-peg(2000)胺，所述脂肪酸是硬脂酸，所述非peg化磷脂是磷脂酰胆碱。[1003]根据[1001]或[1002]所述的纳米颗粒组合物，其含有的所述第一物质和所述第二物质的质量比是2:8～8:2。[1004]根据[1001]～[1003]中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中，所述纳米颗粒还含有药物。[1005]根据[1004]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述纳米颗粒还含有显影剂。[1006]根据[1001]～[1003]中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中，所述纳米颗粒还含有显影剂。[1007]根据[1004]所述的纳米颗粒组合物，其中，所述药物是抗癌剂。[1008]一种纳米颗粒组合物的制造方法，所述纳米颗粒组合物含有表面结合有对肿瘤细胞有特异性的第一物质和第二物质的纳米颗粒，所述方法包括以下步骤：步骤(i)，从在挥发性有机溶剂中含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液中除去挥发性有机溶剂，以形成膜；步骤(ii)，在缓冲液中对在步骤(i)中得到的膜进行超声波处理，生成纳米颗粒；以及步骤(iii)，使对肿瘤细胞有特异性的第一物质和第二物质与在步骤(ii)中得到的纳米颗粒表面结合，其中，对肿瘤细胞有特异性的第一物质是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列的肽，对肿瘤细胞有特异性的第二物质是铁结合性蛋白。[1009]根据[1008]所述的方法，其中，在所述步骤(ii)中，缓冲液含有药物，并生成含有药物的纳米颗粒。[1010]根据[1009]所述的方法，还包括将显影剂导入到纳米颗粒中。[1011]一种纳米颗粒组合物，其通过[1009]或[1010]所述的方法来制造。[1012]根据[1009]所述的方法，其中，所述药物是抗癌剂。[1013]一种纳米颗粒组合物，其通过[1012]所述的方法来制造。[1014]根据[1008]所述的方法，还包括将显影剂导入到纳米颗粒中。[1015]一种纳米颗粒组合物，其通过[1014]所述的方法来制造。[1016]一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有[1007]或[1013]所述的纳米颗粒组合物。[1017]根据[1016]所述的药物组合物，其中，癌症是脑肿瘤。[1018]一种癌症的治疗方法，其包括向患有癌症的受试对象给予[1016]或[1017]所述的药物组合物。[1019]根据[1018]所述的方法，其中，癌症是脑肿瘤。[1020]一种用于对肿瘤细胞成像的组合物，其含有[1006]或[1015]所述的纳米颗粒组合物。[1021]一种检测脑肿瘤的方法，其包括以下步骤：向有此需要的受试对象给予[1020]所述的组合物，以及检测显影剂在脑内的定位。[1022]一种用于监测脑肿瘤治疗效果的方法，其包括以下步骤：向有此需要的受试对象给予[1020]所述的组合物，以及检测显影剂在脑内的定位。本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-060520号的公开内容。发明效果根据本发明，可以提供一种可用于能够通过血脑屏障的药物递送系统，且细胞毒性低的组合物。附图说明图1是一实施方式的纳米颗粒代表性的透射式电子显微镜图像照片。图2是表示实施例3的细胞存活率测定结果的图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图3是表示实施例5的小鼠体重变化的图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图4是实施例6的各组小鼠的代表性的脑样品照片((a)～(f))。图5是表示实施例7的各组脑样品中肿瘤中央部切片的苏木素-伊红染色结果照片((a)～(f))。图6是表示实施例7的各组脑样品中肿瘤体积测定结果的图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图7是表示实施例9记载的将麻疯树毒蛋白或转铁蛋白引入(结合)到纳米颗粒的sds-page凝胶照片((a)和(b))。图8是表示实施例9记载的表示rgd三肽结合于纳米颗粒的maldi测定结果的图表。图9是表示实施例10记载的各组小鼠存活率的图表。图10是表示实施例12记载的各组大脑中的量子点(qd)纳米颗粒在大脑中的聚集照片。图11是表示实施例12记载的各组中的纳米颗粒聚集于肿瘤的图表((a)～(c))；误差线表示标准偏差(n＝3)。图12是表示实施例13记载的各组各脏器中平均荧光强度的图表((a)～(d))；误差线表示标准偏差(n＝3)。图13是表示实施例13记载的各组各脏器、血液和肿瘤中平均荧光强度的图表((a)～(d))；误差线表示标准偏差(n＝3)。图14是表示实施例14的体外血脑屏障(bbb)模型的示意图。图15是表示实施例15记载的体外血脑屏障模型的评价结果的图表((a)和(b))；误差线表示标准偏差(n＝3)。图16是表示实施例16记载的各纳米颗粒从顶端侧向基底侧的通透性分析结果的图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图17是表示实施例17记载的各纳米颗粒从顶端侧向基底侧的通透性分析结果的图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图18是表示实施例18记载的各纳米颗粒从顶端侧向基底侧的通透性分析结果的图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图19是表示用facs仪器分析实施例19记载的各纳米颗粒靶向胶质母细胞瘤细胞的结果图表((a)～(e))。图20是表示用facs仪器分析实施例19记载的各纳米颗粒靶向胶质母细胞瘤细胞的结果图表((a)～(d))。图21是表示用facs仪器分析实施例19记载的各纳米颗粒靶向胶质母细胞瘤细胞的结果图表((a)～(g))。图22是表示实施例20记载的进一步的药物担载效率图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。图23是表示实施例20记载的进一步的药物释放曲线图表；误差线表示标准偏差(n＝3)。具体实施方式[纳米颗粒组合物]本发明涉及一种纳米颗粒组合物。本说明书中，纳米颗粒是指直径约为1μm以下(优选1nm以上且低于1μm)的颗粒。本发明中，纳米颗粒是由膜形成的，该膜所含的主要成分为脂质，且该纳米颗粒可以具有外层和由该外层包裹的囊泡。在一个实施方式中，纳米颗粒可以含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂作为膜成分(外层和囊泡的膜成分)。纳米颗粒也可以含有其他成分。本发明中，纳米颗粒也可以不含有胆固醇作为膜成分。本说明书中，“peg化磷脂”是指与聚乙二醇(peg)结合的磷脂。作为peg化磷脂，可举出但不限于：与peg结合的磷脂酰乙醇胺(1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。peg也可以与磷脂酰乙醇胺中的氨基结合。磷脂酰乙醇胺中的两个脂肪酸可以彼此独立地为碳原子数10～25或16～20的饱和脂肪酸。peg也可以是mpeg(甲氧基peg)。磷脂酰乙醇胺例如可以是：dspe(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dppe(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)或dmpe(1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。peg化磷脂中的聚乙二醇(peg)链的平均分子量(mw)可以是500～10000，优选为1000～5000或1000～3000，例如为2000。特别是在peg链的游离末端，peg化磷脂也可以用官能团修饰。官能团例如可以是氨基、羧基或酰胺基。氨基修饰的peg化磷脂可以是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000]，该物质例如dspe-peg(2000)胺可以从avantipolarlipid公司获得。羧基修饰的peg化磷脂可以是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[羧基(聚乙二醇)-2000]，该物质例如dspe-peg(2000)羧酸可以从avantipolarlipid公司获得。在一个实施方式中，peg化磷脂也可以使用式(1)所示的化合物以用于制造纳米颗粒组合物。[化2][式(1)中，m1～m2彼此独立地为10～25的整数；n为20～60的整数；m3为0～10的整数；r为羧基、氨基或含有氨基的基团；x+为阳离子。]式(1)中的m1和m2优选独立地为与室温下为固体的脂肪酸的碳原子数相对应的数，例如可以是15～25，例如也可以是15～20或16～18，具体也可以是17。此外，式(1)中的n例如可以是25～55，例如也可以是30～50。另外，式(1)中的m3是0～10的整数，例如可以是0～6，例如也可以是0、1或2。式(1)中的x+是阳离子，例如可举出：铵阳离子、锍阳离子、碘鎓阳离子、鏻阳离子、氢离子等。另外，可以利用式(1)中的r的羧基或氨基，将药物递送的对靶细胞有特异性的物质例如通过酰胺键结合，使纳米颗粒聚集于靶细胞。此外，也可以通过利用化学交联剂的交联反应等使其进行共价结合。本说明书中，作为熔点为30℃以上的脂肪酸，可以使用在室温下为固体的脂肪酸。例如，熔点为30℃以上的脂肪酸可以是选自碳原子数为10～25的饱和脂肪酸的一种以上的脂肪酸，更具体地，例如可举出：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸等。另外，本说明书中，作为非peg化磷脂，可举出：卵磷脂(磷脂酰胆碱)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇等以磷脂酰甘油酯(phosphatidylglyceride)为代表的甘油磷脂，以及鞘磷脂等鞘氨醇磷脂。在一个实施方式中，非peg化磷脂也可以是选自由以下物质所组成的组的一种以上的磷脂酰甘油酯(phosphatidylglyceride)：磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇。所含膜成分是熔点为30℃以上的脂肪酸和磷脂的纳米颗粒，具有稳定性高的优点。peg化磷脂(例如上述式(1)所示的化合物)具有脂质部分和聚合物部分，因此本发明的纳米颗粒可以称为固体脂质纳米颗粒(solid-lipidnanoparticle)和聚合物颗粒的混合体。固体脂质纳米颗粒是指脂质核心在室温下为固体的固体脂质颗粒。本发明的纳米颗粒也可以称为混合固体脂质纳米颗粒(hybridsolid-lipidnanoparticle)。纳米颗粒中作为膜成分而含有的peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸、非peg化磷脂的比例，只要是形成纳米颗粒的范围就没有特别限制，例如质量比可以是1～10:1～10:1～10。纳米颗粒中作为膜成分而含有的peg化磷脂和非peg化磷脂的合计与熔点为30℃以上的脂肪酸的比例，例如其摩尔比可以是1:1～1:5、1:1.3～1:4或1:1.5～1:3。纳米颗粒中作为膜成分而含有的peg化磷脂和熔点为30℃以上的脂肪酸的比例，其摩尔比可以是1:50～1:3、1:30～1:5、1:20～1:6或1:15～1:8。本实施方式的组合物中所含的纳米颗粒平均直径可以是500nm以下、400nm以下、300nm以下或200nm以下。纳米颗粒的平均直径也可以是130nm以上、140nm以上、150nm以上、160nm以上、170nm以上、180nm以上、190nm以上。纳米颗粒的平均直径例如也可以是140nm～500nm、150nm～300nm或160nm～200nm的范围。颗粒的直径可以通过本
技术领域：
公知的方法进行测定，特别是可以通过动态光散射法进行测定。通过动态光散射法的测定可以使用市售的分析仪器，例如zetasizernano-zs(马尔文仪器有限公司)进行测定。此外，颗粒的直径例如也可以通过测量颗粒在透射式电子显微镜图像中的直径进行测定。当颗粒图像不是圆形时，则可以将具有与颗粒图像相同面积的圆的直径视为直径。本发明的纳米颗粒可以具有外层和由该外层包裹的囊泡，但将外层的直径作为颗粒的直径。颗粒的直径可以是平均值(例如当测量透射式电子显微镜图像中的直径时，其是100个颗粒的平均值)。本发明中，纳米颗粒优选为不凝集。此外，纳米颗粒优选具有负值的ζ电位。更优选地，纳米颗粒的ζ电位例如可以是-100mv～-1mv、-80mv～-2mv或-50mv～-3mv或-30mv～-5mv。负值的ζ电位表示颗粒为亲水性。颗粒的ζ电位可以通过电泳光散射法进行测定。通过电泳光散射法的ζ电位测定可以通过本
技术领域：
公知的方法，例如使用市售的分析仪器，例如zetasizernano-zs(马尔文仪器有限公司)进行测定。现有的固体脂质纳米颗粒的制造方法，有时包括需要使用表面活性剂的乳化-分散工序。使用表面活性剂可能导致成本增加，乳化-分散工序趋向于繁杂且耗时。此外，得到的固体脂质纳米颗粒有时出现药物担载量低、药物泄漏的问题。与此相对，如下文的实施例所述，本发明可以形成药物担载量多，且长时间保持药物释放的纳米颗粒。这是因为，由于是通过聚合物和脂质这两层膜来包封药物，因此药物只有穿过脂质/聚合物层才能释放，从而实现持续而迟缓的药物释放。另外，例如，如图1所示，本发明的纳米颗粒可以具有外层和由该外层包裹的囊泡。通过这种结构，可以长时间释放包载的药物。本发明中，在纳米颗粒表面，也可以结合有对靶细胞有特异性的物质。本说明书中，对靶细胞有特异性的物质，是指与其他细胞相比，具有与靶细胞更易结合性质的物质。对靶细胞有特异性的物质也可以与纳米颗粒中作为膜成分而含有的至少一部分peg化磷脂(特别是修饰peg链的官能团)结合。结合优选为共价结合。结合可以通过本
技术领域：
公知的技术进行。例如，结合可以是与peg化磷脂结合的氨基和对靶细胞有特异性的物质所具有的羧基之间的酰胺键。靶细胞可以是脑细胞。靶细胞可以是肿瘤细胞，特别是胶质母细胞瘤(glioblastoma)。在一个实施方式中，在纳米颗粒表面，也可以结合有对靶细胞有特异性的第一物质和第二物质，其中，第二物质是与第一物质不同的物质。此时，本实施方式的组合物由于具有双重靶向信号，因此可以更有效地使纳米颗粒聚集于靶细胞。在一个实施方式中，也可以上述式(1)所示的化合物的至少一部分结合有对靶细胞有特异性的物质。更具体地，关于上述式(1)所示的化合物的至少一部分，式(1)中的r也可以是对靶细胞有特异性的第一物质。此时，对靶细胞有特异性的第一物质由于是通过酰胺键结合，因此r包含酰胺基。另外，作为对靶细胞有特异性的物质，也可以含有与第一物质不同的第二物质。作为对靶细胞有特异性的物质，没有特别限制，可以根据靶细胞而使用任何物质。例如可举出：针对存在于靶细胞表面蛋白质的抗体、抗体片段、适配体；针对存在于靶细胞表面受体的配体等。作为对靶细胞有特异性的物质，例如可举出：与存在于细胞表面的整合素结合，且具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)的氨基酸序列(rgd序列)的肽。具有rgd序列的肽特别对血管内皮癌细胞有特异性。作为具有rgd序列的肽，可以使用含有rgd序列的肽。本说明书中，肽是指两个以上的氨基酸通过肽键结合而形成的氨基酸聚合物。肽所含的氨基酸数量没有特别限制，例如可以是2～100个或3～50个。具有rgd序列的肽例如可以是3、4、5或6个氨基酸残基长度。作为含有rgd序列的肽，可举出：rgd三肽、具有grgds(seqidno:1)氨基酸序列的五肽、具有grgdnp(seqidno:2)氨基酸序列的六肽，或去整合素类等。具有rgd序列的肽例如可以使用市售的肽合成仪通过化学合成来制备，或者也可以通过基因工程技术来制备。或者，例如也可以使用西格玛奥德里奇公司市售的具有rgd序列的肽。作为对靶细胞有特异性物质的其他示例，可举出铁结合性蛋白。铁结合性蛋白是指具有与铁结合性质的任意蛋白质。作为铁结合性蛋白，没有限制，例如可举出：转铁蛋白、乳铁蛋白、卵铁传递蛋白，以及它们的变异体。变异体可以包括在天然存在的蛋白质中具有氨基酸置换、缺失和/或插入(例如1～10个氨基酸)的变异体。变异体可以保持对靶细胞的特异性。铁结合性蛋白优选为针对在癌细胞表面多数存在的转铁蛋白受体的配体，即转铁蛋白。转铁蛋白是约79kda的蛋白质。铁结合性蛋白没有特别限制，例如可以来自人或牛等哺乳动物。铁结合性蛋白可以通过本
技术领域：
公知的方法，例如使用基因工程技术来制备。或者，例如也可以使用西格玛奥德里奇公司市售的铁结合性蛋白。如下文的实施例所述，结合有rgd三肽和转铁蛋白这两者的纳米颗粒能够通过血脑屏障，非常高效地将药物递送至脑肿瘤。因此，本实施方式的纳米颗粒组合物也可以用于治疗脑肿瘤。另外，作为对靶细胞有特异性的物质，可举出：叶酸、低密度脂蛋白、氨基葡萄糖、表皮生长因子等。当在纳米颗粒表面结合有对靶细胞有特异性的第一物质和第二物质时，则纳米颗粒组合物可以按任意比例含有第一物质和第二物质。例如，当对靶细胞有特异性的第一物质是具有rgd序列的肽，对靶细胞有特异性的第二物质是铁结合性蛋白时，则纳米颗粒组合物中所含的第一物质与第二物质的质量比可以是1:20～20:1、1:10～10:1、2:8～8:2、3:7～7:3或4:6～6:4，或者更具体地，可以是35:65～45:55。此外，当对靶细胞有特异性的第一物质是具有rgd序列的肽，对靶细胞有特异性的第二物质是铁结合性蛋白时，则纳米颗粒组合物中所含的第一物质与第二物质的摩尔比可以是10:1～2000:1、50:1～1000:1、80:1～500:1、100:1～400:1、120:1～300:1或130:1～200:1。第一物质和第二物质可以按照这些质量比或摩尔比与纳米颗粒表面结合。在一个实施方式中，纳米颗粒还可以含有药物。含有药物的纳米颗粒可以用于药物递送系统。药物根据其性质，可以包载于纳米颗粒的膜内，也可以整合到膜成分中。作为药物，例如可举出抗癌剂等，没有特别限制，可以将具有各种性质和活性的药物用于本发明。作为抗癌剂，没有特别限制，例如可举出：氟尿嘧啶、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤等dna合成抑制剂；伊立替康、长春碱、紫杉醇等细胞分裂抑制剂；顺铂、氮芥等dna损伤剂；阿霉素、博来霉素等抗肿瘤抗生素；麻疯树毒蛋白等具有细胞杀伤活性的化合物等。此外，众所周知，麻疯树毒蛋白是一种植物麻疯树(jatrophacurcas)种子所含的有毒蛋白(疏水性且分子量为28kda的i型核糖体失活糖蛋白)，对癌细胞有较强的杀伤活性。药物也可以是核酸、蛋白质、肽、小分子化合物(例如分子量1000以下)等。药物的分子量没有限制，可以是200da～50kda或400da～30kda。药物例如也可以是分子量为10kda～40kda或20kda～30kda的蛋白质。药物可以是紫杉烷类化合物(例如，紫杉醇、多西紫杉醇等)或蒽环类化合物(例如，阿霉素、吡柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表阿霉素、氨柔比星、米托蒽醌等)。药物既可以是亲水性，也可以是疏水性。而且，这些药物可以单独使用，也可以两种以上组合使用。此外，在本说明书中，化合物除了游离形态以外，也可以包括其盐、水合物等。含有本发明药物的纳米颗粒，可以有效地递送至肿瘤，特别是脑肿瘤，稳定性高，能够长时间释放药物。在一个实施方式中，纳米颗粒还可以含有显影剂。含有显影剂的纳米颗粒可以用于靶细胞成像。在一个实施方式中，通过肿瘤成像，例如可以监测肿瘤的检测和诊断，以及监测肿瘤的治疗效果。显影剂根据其性质，可以包载于纳米颗粒膜内的水相，也可以整合到膜成分中。显影剂也可以结合到纳米颗粒表面。纳米颗粒也可以同时包含药物和显影剂。作为显影剂，可举出：荧光物质、发光物质、量子点、放射性物质、磁共振成像(mri)造影剂、x射线造影剂、顺磁性离子等。本发明的含有显影剂的纳米颗粒可以有效地递送至肿瘤，特别是脑肿瘤，并用于肿瘤成像。本实施方式的纳米颗粒组合物也可以通过本
技术领域：
公知的任何方法来制作，特别是可以通过后述的“纳米颗粒组合物的制造方法”来制造。例如，如图1所示，本发明的纳米颗粒可以具有外层和由该外层包裹的囊泡。通过这种结构，可以长时间释放包载的药物。此外，本发明的纳米颗粒也具有稳定性高、分散性优异的优点。在表面结合有对靶细胞(特别是脑肿瘤细胞)有特异性物质的纳米颗粒，具有以下优点：能够通过血脑屏障，高特异性地将药物或显影剂等递送至脑肿瘤，同时在非特异性的组织聚集较少。另外，本发明的纳米颗粒长时间在血液中循环，从而可以长时间递送至靶细胞。[纳米颗粒组合物的制造方法]本发明提供一种本发明的纳米颗粒组合物的制造方法。本方法可以包括以下步骤：步骤(i)，从在挥发性有机溶剂中含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液中除去挥发性有机溶剂，以形成膜；以及步骤(ii)，在缓冲液中对在步骤(i)中得到的膜进行超声波处理，生成纳米颗粒(非靶向纳米颗粒)。本方法可进一步包括以下步骤：步骤(iii)，使对靶细胞有特异性的物质与纳米颗粒(非靶向纳米颗粒)的表面结合。本方法还可以包括：将药物或显影剂导入到纳米颗粒中。本说明书中，非靶向纳米颗粒是指对靶细胞有特异性的物质未与表面结合的纳米颗粒。在本方法的步骤(i)中，含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液，例如可以通过使这些物质溶于本领域的普通挥发性有机溶剂，例如氯仿、甲苯、乙醇、丙酮、甲醇、二甲基亚砜等中来制备。本方法也可以包括制备在挥发性有机溶剂中含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液的步骤。溶液中的peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸、非peg化磷脂的比例，只要是形成纳米颗粒的范围就没有特别限制，例如质量比可以是1～10:1～10:1～10。溶液中的peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸、非peg化磷脂的浓度例如可以分别为0.1～200mg/ml、1～100mg/ml或10～50mg/ml。溶液中的peg化磷脂和非peg化磷脂的合计与熔点为30℃以上的脂肪酸的比例，例如其摩尔比可以是1:1～1:5、1:1.3～1:4或1:1.5～1:3。溶液中的peg化磷脂和熔点为30℃以上的脂肪酸的比例，其摩尔比可以是1:50～1:3、1:30～1:5、1:20～1:6或1:15～1:8。在一个实施方式中，含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液，还可以含有药物或显影剂。由此，制造的纳米颗粒膜中可以含有药物或显影剂。在本方法的步骤(i)中，从在挥发性有机溶剂中含有peg化磷脂、熔点为30℃以上的脂肪酸和非peg化磷脂的溶液中除去挥发性有机溶剂，从而可以形成膜。挥发性有机溶剂可以通过本
技术领域：
公知的方法，例如通过真空干燥法来除去。接着，在本方法的步骤(ii)中，在缓冲液中对在步骤(i)中得到的膜进行超声波处理，可以生成纳米颗粒。缓冲液可以是生理缓冲液，例如磷酸缓冲生理盐水(pbs)。缓冲液的ph值没有限制，例如可以是6.8～8.0、7.0～7.8或7.2～7.6。在一个实施方式中，缓冲液还可以含有药物或显影剂。由此，可以在制造的纳米颗粒膜内包载药物或显影剂。缓冲液中的药物或显影剂的浓度，可以由本领域技术人员根据目的适当调整，例如可以是0.01mg/ml～100mg/ml、0.1mg/ml～20mg/ml或1mg/ml～10mg/ml。超声波处理可以通过本
技术领域：
公知的方法，例如使用市售的超声波处理器进行处理。超声波处理也可以进行至得到澄清且稳定的悬浮液。超声波处理例如可以在10～200khz或20～100khz的频率下进行处理。生成的纳米颗粒例如可以通过离心分离(例如通过在30,000～70,000rpm下离心分离20分钟～1小时)进行颗粒化并纯化。离心分离可以进行多次。接着，在本方法的步骤(iii)中，可以使对靶细胞有特异性的物质与在步骤(ii)中得到的纳米颗粒(非靶向纳米颗粒)表面结合。结合可以通过本
技术领域：
的任何公知技术进行，特别是可以使用化学交联剂进行。作为化学交联剂，例如可举出：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)等。在一个实施方式中，通过化学交联剂活化对靶细胞有特异性的物质，使活化的该物质与在步骤(ii)中得到的纳米颗粒(特别是与纳米颗粒的膜成分中的peg化磷脂结合的氨基)反应，可以使该物质与纳米颗粒表面结合。活化且对靶细胞有特异性的物质与纳米颗粒的反应条件，可以由本领域技术人员适当设定，例如可以在0℃～10℃下设为3小时～24小时。相对于反应的纳米颗粒，对靶细胞有特异性物质的量(当使用两种以上的物质时为总量)例如可以是5％～40％(质量)或10％～30％(质量)。当peg化磷脂为上述式(1)所示的化合物时，对靶细胞有特异性的物质可以与式(1)中的r结合。当使两种以上的对靶细胞有特异性的物质结合时，该两种以上的物质与纳米颗粒的结合既可以分别进行，也可以同时进行。通过使该两种以上的物质同时与纳米颗粒结合，可以更简单地制造纳米颗粒。对靶细胞有特异性的物质与表面结合的纳米颗粒，例如可以通过离心分离(例如通过在30,000～70,000rpm下离心分离20分钟～1小时)进行颗粒化并纯化。离心分离可以进行多次。在一个实施方式中，本发明提供通过上述制造方法制造的纳米颗粒组合物。[脑肿瘤的治疗和成像方法]本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有纳米颗粒，所述纳米颗粒含有本发明一个实施方式的抗癌剂。癌症优选为脑肿瘤。本说明书中，脑肿瘤是指在颅内产生的任意肿瘤。作为脑肿瘤，可举出但不限于：神经胶质瘤(胶质瘤)、星形细胞肿瘤、少突胶质细胞瘤、间变性星形细胞肿瘤、间变性少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤(glioblastoma)等。胶质母细胞瘤是恶性程度最高的神经胶质瘤。本说明书中，“治疗”是指在患有脑肿瘤的受试对象中，使肿瘤缩小或消除。患有脑肿瘤的受试对象例如可以通过电子计算机断层扫描(ct)和磁共振成像(mri)等图像诊断来确定。药物组合物还可以含有制剂领域中常用的任意制剂辅助剂。本说明书中，作为制剂辅助剂，可使用：载体(固体或液体载体)、赋形剂、稳定剂、崩解剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂、乳化剂、抗氧化剂、矫臭剂、填充剂、助溶剂、悬浮剂、包衣剂、着色剂、矫味剂、防腐剂、缓冲剂等制药学上允许的各种载体或添加剂。具体地，作为制剂辅助剂，可举出：水、生理盐水、其他水性溶剂、制药学上允许的有机溶剂、甘露醇、乳糖、淀粉、微晶纤维素、葡萄糖、钙、聚乙烯醇、胶原蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、海藻酸钠、水溶性右旋糖苷、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、阿拉伯树胶、黄原胶、酪蛋白、明胶、琼脂、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、甘油、硬脂醇、硬脂酸、山梨糖醇等。制剂辅助剂可根据制剂的剂型适当或组合选择。药物组合物可通过口服或静脉内等非口服形式给予受试对象。药物组合物可以作为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、液剂等口服剂或者注射剂、点滴剂、涂布剂等非口服剂的制剂。本领域技术人员可以通过常规方法来制造这些制剂。医药组合物可以按照在治疗上有效量来给予。医药组合物的具体给药量按照各个受试对象，例如由医生根据病情的发展程度或重症程度、全身的健康状态、年龄、性别、体重和对治疗的耐受性等判断确定。例如，可以按照纳米颗粒所含的抗癌剂为0.000001mg/体重kg/天～1000mg/体重kg/天，或0.001mg/体重kg/天～1mg/体重kg/天，或0.005mg/体重kg/天～0.5mg/体重kg/天，或0.01mg/体重kg/天～0.1mg/体重kg/天的量给予药物组合物。药物组合物可以单次给予或多次给予，例如可以按照一定的时间间隔，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月等间隔，几次或几十次给予受试对象。药物组合物也可以和其他抗癌剂治疗、手术(外科治疗)或放射治疗联合使用。给予药物组合物的受试对象可以是哺乳动物，例如灵长类、各种家畜、家禽、宠物、实验动物等，优选为人。受试对象可以是患有癌症的受试对象，优选为患有脑肿瘤的受试对象。本发明还提供一种癌症的治疗方法，包括向患有癌症的受试对象给予本发明一个实施方式的含有抗癌剂的纳米颗粒或药物组合物。癌症可以是脑肿瘤。本发明还提供本发明一个实施方式的纳米颗粒在制造癌症治疗药中的用途。通过给予药物组合物，与未被给予药物组合物的受试对象相比，还可以延长患有癌症，特别是患有脑肿瘤的受试对象的存活时间。本发明还提供一种用于对肿瘤细胞成像的组合物，其含有本发明一个实施方式的纳米颗粒，所述纳米颗粒含有显影剂。本组合物还可以含有上述制剂辅助剂。此外，作为本组合物的给予途径、剂型、给予量、给予次数以及给予间隔，可以适当使用上述药物组合物或本
技术领域：
公知的药物组合物。本发明还提供一种检测脑肿瘤的方法，其包括以下步骤：向有此需要的受试对象给予含有本发明一个实施方式的含有显影剂的纳米颗粒或组合物，以及检测显影剂在脑内的定位。受试对象可以是患有脑肿瘤或疑似患有脑肿瘤的受试对象。本方法还可进一步包括在检测或诊断出脑肿瘤后治疗脑肿瘤的步骤。本发明还提供一种用于监测脑肿瘤治疗效果的方法，其包括以下步骤：向有此需要的受试对象给予含有本发明一个实施方式的含有显影剂的纳米颗粒或组合物，以及检测显影剂在脑内的定位。受试对象可以是被施与了脑肿瘤治疗的受试对象。本方法中的给予和检测一般可以按照适当的时间间隔进行多次。实施例下面通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限于以下实施例。[材料和方法](纳米颗粒的分析)纳米颗粒的形态通过透射式电子显微镜(tem，型号“jem-2200-fs”，jeol公司)来观察。加速电压设定为200kv。将纳米颗粒滴加到tem样品架上并风干，制作样品。另外，使用分析仪器(型号“nano-zs”，马尔文仪器有限公司)，通过动态光散射法分析纳米颗粒的流体力学直径。此外，通过ζ电位来确定表面的电荷。此外，使用紫外-可见分光光度计(型号“uv-2100pc/3100pc”，岛津制作所)，对纳米颗粒的药物担载和释放进行定量。(动物实验)体内实验使用balb/cnu/nu小鼠。实验使用48只小鼠。在实验前将这些小鼠驯化一周后，将人胶质母细胞瘤细胞株gi-1(日本理化学研究所)移植到小鼠颅内(前囱下1mm)。移植后，将小鼠随机分成6组，每组8只。在移植96小时后，向每只小鼠静脉给予后述的各组合物。给予各组合物每48小时进行一次。给予药物的量固定为每次给予16μg。每5天测定一次各小鼠的体重，直至被处死。第10次给予组合物48小时后，对每组中的4只小鼠实施安乐死，进行灌流并取出全脑。剩余各组的4只小鼠用于测定存活率。取出的大脑立即用4％多聚甲醛固定。固定24小时后，将脑样品移至蔗糖溶液中并静置过夜。然后用树脂(oct复合物)包埋脑样品并冷冻。随后，使用低温恒温器，制作厚度为30μm的脑样品切片。将切片风干并用苏木素-伊红染色。此外，测定并记录肿瘤的容积。[实施例1][制造例1](非靶向麻疯树毒蛋白纳米颗粒的制备)纳米颗粒通过修改的脂质凝聚法来制备。将25mg/ml(约9.0×10-3mol/l)的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](dspe-peg(2000)胺，avantipolarlipid公司)、25mg/ml(约8.8×10-2mol/l)的硬脂酸(sigma-aldrich公司)，以及25mg/ml(约3.3×10-2mol/l)的卵磷脂(磷脂酰胆碱)(sigma-aldrich公司)溶于氯仿，干燥过夜，形成薄膜。然后，向薄膜加入麻疯树毒蛋白的磷酸缓冲液(pbs)溶液(ph值7.4、5.33mg/ml)，使用超声波处理器(日本asone株式会社)平稳地(43khz)进行几分钟(1～2分钟)超声波处理，得到澄清且稳定的悬浮液。接着，在50000rpm下对悬浮液离心30分钟，使纳米颗粒颗粒化(洗涤步骤)。重复进行该洗涤步骤，得到制造例1的纳米颗粒(非特异性非靶向麻疯树毒蛋白纳米颗粒)。[制造例2](rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒的制备)在缓冲液中，向2mg由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的氨基酸序列组成的三肽(rgd三肽，sigma-aldrich公司)中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)(sigma-aldrich公司)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(sigma-aldrich公司)，使用试管混匀器(tuberotator)并在4℃下反应过夜，进行活化。然后，将活化的rgd三肽加入到制造例1的纳米颗粒(10mg)中，在4℃下反应4小时以上(过夜)。接着，在50000rpm下对悬浮液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到制造例2的纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)。[制造例3](转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒的制备)在缓冲液中，向2mg转铁蛋白(sigma-aldrich公司)加入edc和nhs，使用试管混匀器(tuberotator)并在4℃下反应过夜，进行活化。然后，将活化的转铁蛋白加入到制造例1的纳米颗粒(10mg)中，在4℃下反应4小时以上(过夜)。接着，在50000rpm下对悬浮液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到制造例3的纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)。[制造例4](rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒的制备)将按照制造例2的记载所制备的活化rgd三肽(相当于1mg的rgd三肽)，以及按照制造例3的记载所制备的活化转铁蛋白(相当于1mg的转铁蛋白)加入到制造例1的纳米颗粒(10mg)中，在4℃下反应4小时以上(过夜)。接着，在50000rpm下对悬浮液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)。[制造例5](非担载药物纳米颗粒的制备)使用pbs缓冲液来代替麻疯树毒蛋白的磷酸缓冲液(pbs)溶液，除此以外，按照与制造例1相同的方法制备非担载药物纳米颗粒。[实施例2](纳米颗粒的分析)通过透射式电子显微镜和动态光散射法分析制造例1～4的纳米颗粒形状。纳米颗粒的形态通过透射式电子显微镜(tem，型号“jem-2200-fs”，jeol公司)来观察。加速电压设定为200kv。将纳米颗粒滴加到tem样品架上并风干，制作样品。图1是制造例1～4的纳米颗粒代表性的透射式电子显微镜图像。如图1所示，制造例1～4的纳米颗粒是卵状球形纳米颗粒。制造例1的纳米颗粒(非靶向麻疯树毒蛋白纳米颗粒)的直径约为150nm(100个纳米颗粒的平均值)。图中显示出纳米颗粒具有外层和由该外层包裹的囊泡。另外，使用分析仪器(型号“zetasizernano-zs”，马尔文仪器有限公司)，通过动态光散射法分析纳米颗粒的流体力学直径。通过动态光散射法测定的这些纳米颗粒的流体力学直径约为200nm，多分散指数(polydispersityindex、pdi)约为0.2。这些结果与透射式电子显微镜图像的结果一致。pdi低，表示这些纳米颗粒是高度分散且不凝集的颗粒。颗粒不凝集，表示这些纳米颗粒非常稳定，这是将纳米材料用于治疗用途时的必要条件。另外，作为表面的电荷，使用分析仪器(型号“zetasizernano-zs”，马尔文仪器有限公司)测定ζ电位。制造例1～4的纳米颗粒均有负值的ζ电位。这表示这些纳米颗粒是亲水性的。制造例2～4的纳米颗粒与制造例1的纳米颗粒相比，有少量转变为正值的ζ电位。这是因为纳米颗粒表面结合有rgd三肽或转铁蛋白。制造例1～4的纳米颗粒通过动态光散射法测定的流体力学直径和ζ电位的结果如表1所示。[表1]纳米颗粒dls(nm)ζ电位(mv)制造例1(非靶向)147±20-20制造例2(rgd)160±20-18制造例3(tf)183±20-10制造例4(rgd-tf)192±20-8[实施例3](细胞相容性的考察)使制造例1的纳米颗粒与培养细胞接触，测定细胞的存活率。作为细胞，可以使用人脐静脉内皮细胞(huvec)、人皮质神经细胞株(hcn-1a)和胶质瘤细胞株(gi-1)。huvec细胞从gibco公司获得。hcn-1a从atcc(美国典型培养物保藏中心)获得。gi-1细胞(a172细胞)从日本理化学研究所生物资源中心细胞材料开发室获得，细胞编号为rcb2530。向各细胞的培养基加入0μg/ml(对照)、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的纳米颗粒，培养72小时。随后，通过mtt检测法测定各细胞的存活率。图2是表示实验结果的图表。结果表明，制造例1的纳米颗粒对各种细胞的细胞毒性低，具有细胞相容性。[实施例4](药物的担载和释放)使用紫外-可见分光光度计(型号“uv-2100pc/3100pc”，岛津制作所)，对纳米颗粒的药物担载和释放进行定量。制造例1～4的纳米颗粒对麻疯树毒蛋白(28kda)的担载通过以下检测得到确认：利用紫外-可见光谱测定在220nm和250nm处检测到特征性的峰；以及通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳得到28kda的条带。在纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱中可看到少量的峰位移，这认为是麻疯树毒蛋白与纳米颗粒成分之间的相互作用引起的。由此可知，麻疯树毒蛋白在纳米颗粒上的担载效率约为67％，担载有3.5mg麻疯树毒蛋白(54.6mg纳米颗粒中)。麻疯树毒蛋白从纳米颗粒中的释放通过紫外-可见光谱测定来分析。结果可知，麻疯树毒蛋白的释放是高水平持续的。更具体地可知，麻疯树毒蛋白从纳米颗粒中释放的量在24小时后、48小时后、72小时后分别为32％、51％、83％。这种高水平平稳持续的麻疯树毒蛋白的释放特性与纳米颗粒的形态直接相关。制造例1～4的纳米颗粒通过聚合物和脂质的双层膜来担载麻疯树毒蛋白。认为这种双层膜，麻疯树毒蛋白只有穿过脂质/聚合物层才能释放，结果可以实现持续而迟缓的麻疯树毒蛋白释放。[实施例5](肿瘤在体内的缩小)按照上述顺序进行了动物实验。更具体地，向每组8只的balb/cnu/nu小鼠，分别给予：仅游离麻疯树毒蛋白、制造例1的纳米颗粒(麻疯树毒蛋白纳米颗粒)、制造例2的纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)、制造例3的纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)、制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)。此外，作为对照，也准备了仅给予缓冲液组。具体地，实验使用48只小鼠。在实验前将这些小鼠驯化一周后，将人胶质母细胞瘤细胞株gi-1(日本理化学研究所)移植到小鼠颅内(前囱下1mm)。移植后，将小鼠随机分成6组，每组8只。在移植96小时后，向每组8只的balb/cnu/nu小鼠，分别静脉内给予：仅游离麻疯树毒蛋白、制造例1的纳米颗粒(麻疯树毒蛋白纳米颗粒)、制造例2的纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)、制造例3的纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)、制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)。此外，作为对照，也准备了仅给予缓冲液组。给予每48小时重复进行。给予药物的量固定为每次给予16μg。每5天测定一次各小鼠的体重，直至被处死。记录各小鼠的体重和行为。图3是表示实验开始第0天、第8天和第15天的小鼠体重变化的图表。结果表明，对照组和仅给予游离麻疯树毒蛋白组的小鼠在第8天和第15天的体重明显下降。小鼠的行为也发生了很大变化。在对照组和仅给予游离麻疯树毒蛋白组的小鼠中观察到的主要行为有：失去平衡的动作、食物或水的摄取变得困难、移动受限、对于接触的抵抗迟缓或无抵抗。另外，在给予制造例1纳米颗粒(麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组中，状况类似，但与对照组和仅给予游离麻疯树毒蛋白组相比，得到改善。此外，在给予制造例2纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)或制造例3纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组中，可看到体重有略有下降，但没有发现异常行为。另外，给予制造例4纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组显示出恒定的体重，行为也正常，最为健康。[实施例6](脑样品的观察)实施例5记载的第10次给予48小时后，对每组中的4只小鼠实施安乐死，进行全身的灌流固定，取出全脑。分析肿瘤在取出的脑样品中的生长。图4(a)～(f)是各组小鼠的代表性的脑样品照片。图4(a)～(f)中，肿瘤部分用虚线围住表示。图4(a)是对照组的脑样品照片，图4(b)是仅给予游离麻疯树毒蛋白组的脑样品照片，图4(c)是给予制造例1纳米颗粒(麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片，图4(d)是给予制造例2纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片，图4(e)是给予制造例3纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片，图4(f)是给予制造例4纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片。结果在对照组和仅给予游离麻疯树毒蛋白组的脑样品中，几乎一个脑页全部转化为肿瘤。此外，另一个脑页也有肿瘤转移，显示出胶质瘤的高浸润性。给予制造例1纳米颗粒组中，约1/4的脑转化为肿瘤。此外，在给予制造例2和制造例3纳米颗粒组中，给予制造例3纳米颗粒组的肿瘤体积较小，给予制造例2纳米颗粒组的肿瘤体积较大。此外，给予制造例4纳米颗粒组是治疗最成功的组，在大脑表面没有发现肉眼可确认的肿瘤。该结果表示，制造例4的纳米颗粒对抑制脑肿瘤的增殖非常有效。[实施例7](脑样品的病理组织学分析)将在实施例6取出的大脑立即用4％多聚甲醛固定。固定24小时后，将脑样品移至蔗糖溶液中并静置过夜。然后用树脂(oct复合物)包埋脑样品并冷冻。随后，使用低温恒温器，制作厚度为30μm的脑样品切片。将切片风干并用苏木素-伊红染色。此外，测定并记录肿瘤的容积。图5(a)～(f)是表示各组脑样品中肿瘤中央部切片的苏木素-伊红染色结果照片。图5(a)是对照组的脑样品照片，图5(b)是仅给予游离麻疯树毒蛋白组的脑样品照片，图5(c)是给予制造例1纳米颗粒(麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片，图5(d)是给予制造例2纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片，图5(e)是给予制造例3纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片，图5(f)是给予制造例4纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的脑样品照片。结果在对照组的小鼠的脑样品中，几乎一半的大脑有肿瘤浸润。此外，大脑的大小肿胀到正常大脑的约2倍，形态学结构发生了变形。另外，在除给予制造例4纳米颗粒组以外的大脑中，可看到对存活和预后有严重威胁的肿瘤浸润。此外，与对照组和仅给予游离麻疯树毒蛋白组相比，在给予制造例4纳米颗粒组的大脑中肿瘤的体积很小。图6是表示各组脑样品中肿瘤体积测定结果的图表。统计学分析的结果是，仅给予游离麻疯树毒蛋白组的肿瘤体积约为对照组肿瘤体积的70％。此外，在给予制造例1纳米颗粒组中，没有发现肿瘤缩小。此外，给予制造例2纳米颗粒组的肿瘤体积约为对照组肿瘤体积的40％。此外，给予制造例3纳米颗粒组的肿瘤体积约为对照组肿瘤体积的25％。与此相对，给予制造例4纳米颗粒组的肿瘤体积约为对照组肿瘤体积的10％，可看到统计学上显著性差异。上述结果表示，制造例1～4的纳米颗粒能够通过血脑屏障，依赖于配置在纳米颗粒表面的配体的效率(选择性且特异性地与靶细胞结合的能力)而到达脑肿瘤。特别是显示出制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)对脑肿瘤有优异的治疗效果。[实施例8](延长存活时间的考察)将在实施例6中未实施安乐死的剩余各组的4只小鼠用于测定存活率。计测各组小鼠存活时间。计测的存活时间如表2所示。结果是对照组和仅给予游离麻疯树毒蛋白组的小鼠存活时间为癌移植后约20天。另外，与对照组相比，给予制造例2纳米颗粒组的小鼠存活时间延长了约5天。此外，与对照组相比，给予制造例3纳米颗粒组的小鼠存活时间与对照组相比，延长了约10天。与此相对，与对照组相比，给予制造例4纳米颗粒组的小鼠存活时间延长至约2倍。由脑样品的分析结果可知，在给予制造例4纳米颗粒组中，肿瘤体积明显缩小，但未消失。在肿瘤移植40天后小鼠死亡，这是认为肿瘤细胞残留导致肿瘤复发。通过延长治疗，认为有可能使残留的肿瘤细胞完全消失。[表2][实施例9](纳米颗粒的进一步分析)使用sds-page确定麻疯树毒蛋白引入到纳米颗粒中。将麻疯树毒蛋白、制造例5的纳米颗粒(非担载药物纳米颗粒)和制造例1的纳米颗粒(非靶向麻疯树毒蛋白纳米颗粒)用于sds-page，对凝胶染色，分析蛋白质。结果如图7a所示。麻疯树毒蛋白具有28kda的分子量。在制造例1的纳米颗粒中可看到28kda的条带，表示麻疯树毒蛋白被引入到制造例1的纳米颗粒中。而在制造例5的纳米颗粒(非担载药物纳米颗粒)中未看到28kda的条带。使用sds-page确定转铁蛋白与纳米颗粒的结合。将转铁蛋白、制造例3的纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)和制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)用于sds-page，对凝胶染色，分析蛋白质。结果如图7b所示。在全部泳道中看到79kda的转铁蛋白条带，表示转铁蛋白与制造例3和制造例4的纳米颗粒结合。然后，通过maldi(基质附助激光解吸电离离子源)法质量分析来确定rgd三肽与纳米颗粒表面的结合。利用maldi质量分析器(axima(注册商标)-cfr，kratosanalytical公司，岛津制作所)，对rgd三肽、制造例2的颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)和制造例4的颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)进行分析。结果如图8所示。稍微偏移于rgd三肽通常出现在568m/z处的峰，rgd三肽在588.35m/z处出现峰。制造例2的纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)和制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)在与rgd三肽相同的位置出现峰。这表示，在制造例2的纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)和制造例4的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)中存在rgd三肽。[实施例10](延长存活时间的进一步考察)将4周龄的balb/cnu/nu小鼠驯化2周后，向每只小鼠的颅内移植30,000个人胶质母细胞瘤细胞株gi-1细胞(日本理化学研究所)，制作携带颅内肿瘤的小鼠。移植后，向小鼠的尾静脉注射pbs(阴性对照)、游离麻疯树毒蛋白(每只小鼠16μg)和制造例1～4的纳米颗粒(100μl中，250μg纳米颗粒含有约16μg麻疯树毒蛋白)中的任一种。2天给予一次，共计进行18次。小鼠存活时间如图9所示。图9(a)表示对照组的存活率，图9(b)表示给予游离麻疯树毒蛋白组的存活率，图9(c)表示给予制造例1纳米颗粒(非靶向麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的存活率，图9(d)表示给予制造例2纳米颗粒(rgd结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的存活率，图9(e)表示给予制造例3纳米颗粒(转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的存活率，图9(f)表示给予制造例4纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)组的存活率。图9的纵轴表示存活率(％)，图9的横轴表示将移植日作为第0天时移植后的天数。给予制造例4纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合麻疯树毒蛋白纳米颗粒)的小鼠中约60％显示出肿瘤完全退化，存活到第80天而无健康相关的异常(图9(f))(在80天后对小鼠实施安乐死)。而其他组的小鼠存活均未到30天以上。该结果表示，结合有rgd和转铁蛋白的麻疯树毒蛋白纳米颗粒对脑肿瘤起到了优异的治疗效果，大幅延长了存活时间。[实施例11][制造例6](非靶向量子点纳米颗粒的制备)按照mohamed等人(nanoscale,2016,8,7876-7888)记载的方法制备cdse量子点(qd)。具体地，在从麻疯树(jatrophacurcas)种子提取的油(jc油)1ml中在250℃下溶解0.0078g硒(se)30分钟，由此获得硒前体溶液，将该溶液冷却至室温。将氧化镉(cdo)粉末(0.1mmol)、jc油(5ml)和十八烯(10ml)的混合物搅拌，并在氩气流下加热至300℃，直至溶液变为澄清。然后，向上述混合物中快速加入硒前体溶液，在300℃下保持2分钟后立即冷却至室温。接着，使用乙醇，在9000rpm下对混合物离心分离5分钟，洗涤两次，将得到的量子纳米结晶悬浮于氯仿中。将悬浮于氯仿中的量子点(qd)加入到溶于氯仿的等浓度的dspe-peg(2000)胺、硬脂酸和卵磷脂中，干燥过夜，形成薄膜。然后，向该薄膜加入pbs缓冲液(ph值7.4)，使用超声波处理器(日本asone株式会社)平稳地(43khz)进行几分钟(1～2分钟)超声波处理(水化)，得到澄清且稳定的悬浮液。接着，在50000rpm下对悬浮液离心30分钟，使纳米颗粒颗粒化，从而得到制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)。[制造例7](rgd结合量子点纳米颗粒的制备)使用制造例6的纳米颗粒来代替制造例1的纳米颗粒，除此以外，按照与制造例2相同的方法制备制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)。[制造例8](转铁蛋白结合量子点纳米颗粒的制备)使用制造例6的纳米颗粒来代替制造例1的纳米颗粒，除此以外，按照与制造例3相同的方法制备制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)。[制造例9](rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒的制备)使用制造例6的纳米颗粒来代替制造例1的纳米颗粒，除此以外，按照与制造例4相同的方法制备制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)。[实施例12](纳米颗粒在肿瘤中的聚集)本实验使用如实施例10所述制备的携带颅内肿瘤的小鼠。向小鼠的静脉内注射pbs(阴性对照)、荧光麻疯树毒蛋白(每只小鼠100μg)和制造例6～9的纳米颗粒(每只小鼠0.5mg纳米颗粒)中的任一种。荧光麻疯树毒蛋白使用市售的icg(吲哚菁绿)染料的nhs酯来制备。将纯化麻疯树毒蛋白和nhs-icg(同仁化学研究所)在37℃下反应30分钟使其结合，按照厂商的建议，通过基于截留分子量的离心分离，从游离麻疯树毒蛋白和染料中分离来得到荧光麻疯树毒蛋白。在给予6小时、24小时和48小时后，对小鼠实施安乐死，取出大脑。使用体内成像系统(型号“clairvivoopt”，岛津制作所)，对肿瘤和正常脑组织中的量子点聚集进行成像。成像后，将肿瘤从正常脑组织中分离出，分别将肿瘤和正常脑组织均质化，使用荧光分光光度计测定量子点的荧光。量子点纳米颗粒在大脑中的聚集如图10所示。对照组如预想的一样，在肿瘤和正常大脑中未显示荧光。在给予麻疯树毒蛋白组的大脑在肿瘤和正常脑组织中均显示出麻疯树毒蛋白的非特异性聚集，但肿瘤中的荧光强度非常低。制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在给予6小时后，在肿瘤组织内显示出成像为红色的清晰荧光信号，未看到在相邻正常脑组织中的非特异性聚集。制造例7和制造例8的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在到给予6小时时也显示出肿瘤特异性聚集。在给予24小时后，量子点信号强度在很多组中减弱，但在制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)却仍然很强。到给予48小时时，大部分量子点从肿瘤中消失，只有制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)显示出可检测的荧光。对各组的肿瘤荧光进行定量，与对照组比较的结果如图11a所示。制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)、制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)、制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)和制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在给予6小时后，与对照相比，显示出纳米颗粒聚集分别增加4倍、3.5倍、4.8倍和5.8倍。在给予24小时后，在制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)、制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)和制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)中，荧光强度从6小时后开始减少。而在制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)中，荧光在24小时后进一步增加，与对照相比约为7倍。该结果表示，结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒被递送至脑肿瘤，长时间聚集在肿瘤中。正常脑组织/肿瘤的荧光比如图11b所示。如果纳米颗粒非特异性地聚集，则正常脑组织和肿瘤会显示出相同的聚集曲线，其结果是两种组织的荧光比值接近1。相反，如果纳米颗粒特异性地聚集在肿瘤中，则比值会变小。在给予6小时后，制造例6纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)的比值约为0.8，而制造例7纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)、制造例8纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)和制造例9纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)的比值分别为0.67、0.57和0.5。这表示，结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒在肿瘤特异性地聚集，而在正常脑组织中的非特异性聚集非常少。在给予24小时和48小时后，比值在很多组中增加，而在制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)即使在48小时后，比值也一直较低，约为0.6。这表示，结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒长时间特异性地聚集在肿瘤中。正常脑组织的平均荧光强度如图11c所示。该结果表示，脑组织中的非特异性荧光麻疯树毒蛋白或颗粒的聚集。对照组的脑组织几乎没有显示荧光。荧光麻疯树毒蛋白组的大脑也几乎没有显示荧光，这表示游离药物受到了血脑屏障的阻挡。制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在大脑显示出较高的非特异性聚集，其次是制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)，接着是制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)。制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在正常脑组织中的非特异性聚集非常少。这些结果表示，结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒长时间聚集在脑肿瘤中，并且在正常脑组织中的非特异性聚集较少。[实施例13](纳米颗粒的生物体内分布)本实验使用如实施例10所述制备的携带颅内肿瘤的小鼠。向小鼠的尾静脉注射制造例6～9的纳米颗粒(每只小鼠0.5mg纳米颗粒)中的任一种。在给予6小时、24小时和48小时后，对小鼠实施安乐死，取出主要脏器(大脑、肺、心脏、肾脏、脾脏和肝脏)，再将脑肿瘤从正常脑组织中分离出。此外，还从小鼠体内收集血液。根据量子点的元素组成，使用icp-ms(电感耦合等离子体质谱仪)(赛默飞世尔科技公司)对量子点聚集进行定量。结果如图12、13所示。图12a表示各组中大脑的平均荧光强度，图12b表示各组中肺的平均荧光强度，图12c表示各组中心脏的平均荧光强度，图12d表示各组中肾脏的平均荧光强度，图13a表示各组中脾脏的平均荧光强度，图13b表示各组中肝脏的平均荧光强度，图13c表示各组中血液的平均荧光强度，图13d表示各组中肿瘤的平均荧光强度。与制造例6～8的纳米颗粒相比，制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在正常脑组织、肺、心脏、肾脏、脾脏和肝脏的聚集较少，这表示非特异性聚集少(图12a～12d、13a～13b)。制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)的非特异性聚集较高，其次是制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)，接着是制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)。而在血液和肿瘤中检测到明显多的制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)(图13c、13d)。在血液中存在较多的制造例9的纳米颗粒，表示该颗粒与其他颗粒相比，具有增加血液中半衰期的能力。此外，制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在肿瘤中存在很多，是制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)的约6～7倍，是制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)的6倍，是制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)的约2倍(图13d)，该结果表示，结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒对肿瘤的高靶向效率和高特异性。[实施例14](体外血脑屏障模型的制作)从cellsystems公司购买人脑微血管内皮细胞和人脑微血管周细胞，使用csc经典培养基套装进行培养。在37℃、加湿气氛和5％co2下，使细胞增殖。将transwell(注册商标)小室(孔径3μm，24孔，bdfalcon公司)倒置，在其上面添加周细胞，增殖24小时。随后，小心地将小室再次倒置(复原)，放入24孔板中，将内皮细胞接种于小室的上侧。培养细胞直至达到高密度的共培养，制作体外血脑屏障(bbb)模型(图14)。该体外血脑屏障模型具有在膜上侧(顶端侧)培养的人脑内皮细胞和在膜下侧(基底侧)培养的人脑周细胞。在使用体外血脑屏障模型的后续实验中，作为阴性对照，使用没有细胞的transwell(注册商标)小室。[实施例15](体外血脑屏障模型的评价)为了确认实施例14中制作的体外血脑屏障模型的血脑屏障完整性，进行培养基通透检测和从顶端侧向基底侧的通透性分析。培养基通透检测通过以下操作进行：将0.5ml的培养基加入到体外血脑屏障模型的上室中，30分钟后对通透到下室的培养基的体积进行定量。作为阴性对照，使用没有细胞的transwell(注册商标)小室。通透过的培养基的体积小，表示血脑屏障中存在更稳固的结合部。培养基通透检测的结果如图15a所示。在对照中，培养基完全流入到下室，而在体外血脑屏障模型中，培养基保留在上室中，这表示培养基的通透非常少。然后，从顶端侧向基底侧的通透性分析通过以下操作进行：将低分子量的fitc-菊糖(sigma-aldrich公司)、20kda中等程度分子量fitc-葡聚糖(sigma-aldrich公司)或70kda高分子量的fitc-葡聚糖(sigma-aldrich公司)加入到体外血脑屏障模型的上室中，在15分钟后和30分钟后测定流入到下室的荧光。据报道，菊糖和葡聚糖在体外血脑屏障模型中用于试验药物通透性(wilhelm,i.等人，mol.pharmaceutics,2014,11(7):1949-1963)。作为阴性对照，使用没有细胞的transwell(注册商标)小室。从顶端侧向基底侧的通透性分析的结果如图15b所示。与对照相比，在体外血脑屏障模型中，显示出菊糖和葡聚糖几乎没有通透。30分钟后，在体外血脑屏障模型中，低分子量的菊糖略有通透，这表示依赖于分子量的通透现象(即低分子量的物质比高分子量的物质更易通透)。这表示体外血脑屏障模型的功能与体内血脑屏障相同。另外，在体外血脑屏障模型中，经内皮电阻(teer)为382ω/cm2。当teer大于300ω/cm2时，视为良好地反映了体内条件。这些结果表示，实施例14中制作的体外血脑屏障模型良好地反映了体内血脑屏障。[实施例16](纳米颗粒的血脑屏障通过能力)与实施例15记载的从顶端侧向基底侧的通透性分析相同地考察fitc标记麻疯树毒蛋白和制造例6～9的纳米颗粒能否通过血脑屏障。通过使纯化麻疯树毒蛋白与fitc的nhs酯(fitc-nhs，同仁化学研究所)反应，并使用分子截留技术，从游离麻疯树毒蛋白和fitc中分离来制备fitc标记麻疯树毒蛋白。将fitc标记麻疯树毒蛋白或制造例6～9的纳米颗粒(浓度0.5mg/ml)加入到实施例14中制作的体外血脑屏障模型的上室中，孵育4小时。随后，测定下室内的fitc或量子点的荧光并评价通透性。结果如图16所示。制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)显示出高通透性，约为95％，其次是制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)(82％)和制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)(70％)。该结果表示，特别是结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒能够有效地通过血脑屏障。[实施例17](rgd与转铁蛋白之比对纳米颗粒血脑屏障通过能力的影响)以rgd三肽与转铁蛋白的各种比例制备结合有rgd三肽和转铁蛋白的纳米颗粒。每10mg纳米颗粒使用相当于0.4mgrgd三肽的活化rgd三肽和相当于1.6mg转铁蛋白的活化转铁蛋白，除此以外，按照与制造例9相同的方法以rgd:转铁蛋白为2:8的质量比(约57:1的摩尔比)制备结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒(rgd2:tf8)。每10mg纳米颗粒使用相当于0.8mgrgd三肽的活化rgd三肽和相当于1.2mg转铁蛋白的活化转铁蛋白，除此以外，按照与制造例9相同的方法以rgd:转铁蛋白为4:6的质量比(约152:1的摩尔比)制备结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒(rgd4:tf6)。每10mg纳米颗粒使用相当于1.2mgrgd三肽的活化rgd三肽和相当于0.8mg转铁蛋白的活化转铁蛋白，除此以外，按照与制造例9相同的方法以rgd:转铁蛋白为6:4的质量比(约342:1的摩尔比)制备结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒(rgd6:tf4)。每10mg纳米颗粒使用相当于1.6mgrgd三肽的活化rgd三肽和相当于0.4mg转铁蛋白的活化转铁蛋白，除此以外，按照与制造例9相同的方法以rgd:转铁蛋白为8:2的质量比(约913:1的摩尔比)制备结合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒(rgd8:tf2)。将纳米颗粒rgd2:tf8、rgd4:tf6、rgd6:tf4或rgd8:tf2(浓度0.5mg/ml)加入到实施例14中制作的体外血脑屏障模型的上室中，孵育4小时。随后，测定下室内的量子点的荧光并评价通透性。结果如图17所示。试验的纳米颗粒全部显示出约90％以上的高通透性。特别是rgd4:tf6显示出最高的通透性，约为96％。该结果表示，以各种比例具有rgd三肽与转铁蛋白的纳米颗粒能够有效地通过血脑屏障，特别是当rgd:转铁蛋白的质量比为4:6(摩尔比约为152:1)时，纳米颗粒能够更有效地通过血脑屏障。[实施例18](靶向剂种类对纳米颗粒血脑屏障通过能力的影响)制备单独或组合有各种靶向剂的纳米颗粒。作为靶向剂，除了上述rgd三肽和转铁蛋白以外，还使用叶酸(fa)和anginex。由于叶酸与在包括胶质母细胞瘤(glioblastoma)的很多癌细胞中过量表达的叶酸受体结合，因此将癌细胞作为靶标。由于anginex与在各种肿瘤和内皮细胞中表达的半乳糖凝集素-1(galectin-1)结合，因此将肿瘤细胞(癌细胞)以及形成新血管的内皮细胞(血管新生)作为靶标。向2mg叶酸(sigma-aldrich公司)中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)(sigma-aldrich公司)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(sigma-aldrich公司)，在4℃下反应过夜以活化叶酸。使活化的叶酸与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有叶酸的纳米颗粒。向2mganginex(phoenixpeptide公司)中加入edc和nhs，在4℃下反应过夜以活化anginex。使活化的anginex与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有anginex的纳米颗粒。接着，制备具有两种靶向剂的纳米颗粒。向2mg叶酸中加入edc和nhs，在4℃下反应过夜以活化叶酸。同样地，也分别将anginex、rgd三肽和转铁蛋白活化。使活化的叶酸(相当于1mg的叶酸)和活化的anginex(相当于1mg的anginex)与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有叶酸和anginex的纳米颗粒。使活化的叶酸(相当于1mg的叶酸)和活化的转铁蛋白(相当于1mg的转铁蛋白)与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有叶酸和转铁蛋白的纳米颗粒。使活化的叶酸(相当于1mg的叶酸)和活化的rgd三肽(相当于1mg的rgd三肽)与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有叶酸和rgd三肽的纳米颗粒。使活化的anginex(相当于1mg的anginex)和活化的转铁蛋白(相当于1mg的转铁蛋白)与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有anginex和转铁蛋白的纳米颗粒。使活化的anginex(相当于1mg的anginex)和活化的rgd三肽(相当于1mg的rgd三肽)与10mg制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)在4℃下反应过夜。在50000rpm下对反应液进行离心，使纳米颗粒颗粒化，从而得到结合有anginex和rgd三肽的纳米颗粒。将上述制备的纳米颗粒和制造例7～9的纳米颗粒(浓度0.25mg/ml)加入到实施例14中制作的体外血脑屏障模型的上室中，孵育4小时。随后，测定下室内的量子点的荧光并评价通透性。图18表示以下各纳米颗粒通透性的结果：合有anginex的纳米颗粒(ang)、结合有叶酸的纳米颗粒(fa)、制造例7的rgd结合量子点纳米颗粒(rgd)、制造例8的转铁蛋白结合量子点纳米颗粒(tf)、结合有叶酸和anginex的纳米颗粒(fa-ang)、结合有叶酸和转铁蛋白的纳米颗粒(fa-tf)、结合有叶酸和rgd三肽的纳米颗粒(fa-rgd)、结合有anginex和转铁蛋白的纳米颗粒(ang-tf)、结合有anginex和rgd三肽的纳米颗粒(ang-rgd)和制造例9的rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒(rgd-tf)。具有rgd三肽与转铁蛋白组合的纳米颗粒显示出最优异的血脑屏障通过能力。[实施例19](体外靶向胶质母细胞瘤(glioblastoma))以1×105细胞/孔的密度将gi-1细胞(日本理化学研究所)接种到12孔板，培养24小时。接着，用fitc标记麻疯树毒蛋白(实施例16所述)、制造例6～9的纳米颗粒、以各种比例结合有rgd三肽和转铁蛋白的纳米颗粒(实施例17所述)、单独或组合有各种靶向剂的纳米颗粒(实施例18所述)，对细胞处理2小时。处理结束时，用pbs洗涤细胞三次，用4％多聚甲醛固定，利用facs仪器(intellicyt公司)分析细胞的摄入效率。结果如图19～21所示。图19a表示对照的分析结果，图19b表示制造例6纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)的分析结果，图19c表示制造例7纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)的分析结果，图19d表示制造例8纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)的分析结果，图19e表示制造例9纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)的分析结果，图20a表示纳米颗粒rgd2:tf8的分析结果，图20b表示纳米颗粒rgd4:tf6的分析结果，图20c表示纳米颗粒rgd6:tf4的分析结果，图20d表示纳米颗粒rgd8:tf2的分析结果，图21a表示结合anginex纳米颗粒的分析结果，图21b表示结合叶酸纳米颗粒的分析结果，图21c表示结合叶酸和anginex纳米颗粒的分析结果，图21d表示结合anginex和rgd三肽纳米颗粒的分析结果，图21e表示结合anginex和转铁蛋白纳米颗粒的分析结果，图21f表示结合叶酸和rgd三肽纳米颗粒的分析结果，图21g表示结合叶酸和转铁蛋白纳米颗粒的分析结果。与制造例6的纳米颗粒(非靶向量子点纳米颗粒)、制造例7的纳米颗粒(rgd结合量子点纳米颗粒)、制造例8的纳米颗粒(转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)相比，制造例9的纳米颗粒(rgd和转铁蛋白结合量子点纳米颗粒)在靶细胞中显示出较多的聚集(强度在103～104范围)(图19b～19e)，显示出结合rgd和转铁蛋白纳米颗粒的优异靶向效率。如果改变rgd三肽和转铁蛋白的比例，则当rgd:转铁蛋白的质量比为4:6时，在胶质母细胞瘤细胞中显示出最多的聚集(图20a～20d)。此外，试验了各种靶向剂和它们的组合(图21a～21g)，但并未显示出比rgd和转铁蛋白的组合更优异的聚集。这些结果表示，特别是组合有rgd和转铁蛋白的纳米颗粒能够有效地靶向和进入作为靶细胞的胶质母细胞瘤细胞。[实施例20](进一步的药物担载和释放)制备含有作为药物的阿霉素或紫杉醇的纳米颗粒，考察药物的担载和释放。通过修改的脂质凝聚法来制备纳米颗粒。将等浓度的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](dspe-peg(2000)胺，avantipolarlipid公司)、硬脂酸(sigma-aldrich公司)，以及卵磷脂(sigma-aldrich公司)溶于氯仿，干燥过夜，形成薄膜。接着，使用药物阿霉素(dox，sigma-aldrich公司)或紫杉醇(ptx，和光纯药工业)的溶液(在缓冲液中)使薄膜水化，进行几分钟超声波处理，得到澄清且稳定的悬浮液。然后，利用离心分离机(日立公司)，在50000rpm下对悬浮液离心分离30分钟，将担载药物的纳米颗粒颗粒化(洗涤步骤)。重复进行该洗涤步骤，由此得到药物担载纳米颗粒。阿霉素是蒽环类化合物抗癌剂，分子量约为544的亲水性化合物。紫杉醇是紫杉烷类化合物抗癌剂，分子量约为854的疏水性化合物。使用10％tritonx溶解纳米颗粒的脂质外壳，对纳米颗粒的药物担载效率进行定量。使用分光光度计(型号“uv-2100pc/3100pc”，岛津制作所)读取释放的药物吸光度(阿霉素在450nm处，紫杉醇在280nm处)。使用预先制作的表示药物浓度与吸光度关系的标准曲线，将测定的吸光度转换为药物浓度。药物担载效率(％)的计算如下：由上述脂质外壳的溶解而被释放的药物(纳米颗粒所担载的药物)相对于用于制备药物担载纳米颗粒的全部药物的比例。药物担载效率如图22所示。显示阿霉素和紫杉醇在纳米颗粒上的担载效率分别为约83％和约62％。接着，将担载药物的纳米颗粒在生理ph值(7.2)的pbs中孵育各时间(0～96小时)后，通过离心分离进行颗粒化，使用分光光度计(型号“uv-2100pc/3100pc”，岛津制作所)读取含有释放的药物的上清液吸光度。使用预先制作的表示药物浓度与吸光度关系的标准曲线，将测定的吸光度转换为药物浓度。释放率(％)的计算如下：释放的药物相对于纳米颗粒所担载的药物的比例。药物释放曲线如图23所示。药物释放在长时间内保持高水平。阿霉素从纳米颗粒中的释放为29％(6小时)、59％(24小时)和92％(72小时)。紫杉醇的释放曲线与阿霉素相似。这些结果表示，药物从纳米颗粒平稳持续地释放。工业实用性根据本发明，可以提供一种可用于能够通过血脑屏障的药物递送系统等，且细胞毒性低的纳米颗粒组合物。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过直接引用而并入本说明书。序列表<110>学校法人东洋大学<120>用于递送药物的纳米颗粒组合物<130>ph-6767-pct<150>jp2016-060520<151>2016-03-24<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>rgd肽<400>1glyargglyaspser15<210>2<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>rgd肽<400>2glyargglyaspasnpro15当前第1页12