制备磷酸二酰胺吗啉代寡聚物的方法与流程

本专利申请要求2017年5月18日提交的美国临时专利申请no.62/508,256、2016年5月24日提交的美国临时专利申请no.62/341,049、2016年5月24日提交的美国临时专利申请no.62/340,953、2016年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/357,134、以及2016年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/357,166的权益，其上述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
：反义技术提供了调节一种或多种特定基因产物(包括选择性剪接产物)表达的手段，并且在许多治疗、诊断和研究应用中是独特有用的。反义技术背后的原理是与靶核酸杂交的反义化合物，例如寡核苷酸，通过许多反义机制中的任何一种调节基因表达活性，例如转录、剪接或翻译。反义化合物的序列特异性使它们作为靶标验证和基因功能化的工具以及选择性调节参与疾病的基因表达的治疗剂具有吸引力。杜氏肌营养不良症(dmd)由蛋白质肌营养不良蛋白表达缺陷引起。编码该蛋白质的基因含有79个外显子，分布在超过200万个dna核苷酸上。任何外显子突变，其改变外显子的阅读框架，或引入终止密码子，或以删除整个框外一个或数个外显子、或一个或多个外显子的重复为特征，有可能破坏功能性肌营养不良蛋白的产生，导致dmd。测试用于治疗dmd的剪接转换寡核苷酸(ssos)的安全性和有效性的最近的临床试验基于sso技术，通过剪接体的空间阻断诱导前mrna的可变剪接(cirak等,2011；goemans等,2011；kinali等,2009；vandeutekom等,2007)。然而，尽管取得了这些成功，但可用于治疗dmd的药理学选择是有限的。golodirsen是一种磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(pmo)，设计用于跳过dmd患者中人肌营养不良蛋白基因的外显子53，该患者可修正至外显子53跳跃以恢复阅读框架并产生功能性较短形式的肌营养不良蛋白。尽管在反义
技术领域：
已经取得了重大进展，但本领域仍需要制备具有改善的反义或抗原性能的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物的方法。技术实现要素：本文提供了制备磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholinooligomers，pmo)的方法。本文所述的合成方法可以按比例放大pmo合成，同时保持合成的pmo的总产率和纯度。因此，在一个方面，本文提供了制备式(a)的寡聚化合物的方法：在某些实施方案中，本文提供了制备式(g)的寡聚化合物的方法：在其他实施方案中，本公开的寡聚化合物包括例如，式(g)的寡聚化合物的一些实施方案，为式(xii)的寡聚化合物：为清楚起见，包括例如式(c)的寡聚化合物和式(xii)所示的golodirsen的结构式是5'至3'的连续结构式，并且为了在上述结构式中方便以紧凑形式描述整个式子，申请人已经将各种示意性裂解标记为“breaka”和“breakb”。如本领域技术人员所理解的，例如，每个示意性的“breaka”表示在这些点处结构式继续的示意。本领域技术人员理解，对于在包括golodirsen的上述结构式中的“breakb”的每个实例，情况也是如此。无论如何，没有一个示意性裂解旨在表明同时技术人员也不会认为其意味着上述包括golodirsen的结构式的现实裂解。附图说明图1和图2显示了合成和去保护的golodirsen(srp-4053)原料药物物质代表性分析型高效液相色谱(hplc)色谱图(参见实施例4)。图3和图4显示了纯化的golodirsen药物溶液的代表性分析型hplc色谱图(参见实施例5)。图5和图6显示脱盐和冻干的golodirsen药物的代表性分析型hplc色谱图(参见实施例5)。具体实施方式本文提供了制备吗啉代寡聚物的方法。相对于天然或未修饰的寡核苷酸，本文所描述的吗啉代寡聚物对dna和rna显示出更强的亲和力而不损害序列选择性。在一些实施方案中，本公开内容的吗啉代寡聚物最小化或防止rna酶h的切割。在一些实施方案中，本公开内容的吗啉代寡聚物不激活rna酶h。本文所描述的方法在工业规模的方法中是有优势的，并且可以应用于以高产率和规模制备一定量的吗啉代寡聚物(例如，约1kg，约1-10kg，约2-10kg，约5-20千克，约10-20千克，或约10-50千克)。定义下面列出的是用于描述本公开的各种术语的定义。这些定义适用于整个说明书和权利要求书中使用的术语，除非在特定情况下单独地或作为较大组的一部分另外限定。“碱基保护的”或“碱基保护”是指在吗啉代亚基上保护碱基配对基团，例如嘌呤或嘧啶碱基，其中保护基团适于在逐步合成寡聚体期间防止碱基配对基团的反应或干扰。(碱基保护的吗啉代亚基的实例是活化的c亚基化合物(c)，其在下文描述的胞嘧啶氨基上具有cbz保护基团。“活化的磷酰胺酯基团”通常是氯代磷酰胺酯基团，具有氮上的取代，这是寡聚物中最终的磷酰胺酯连接所需的。一个例子是(二甲基氨基)氯代磷酰胺酯，即–o-p(＝o)(nme2)cl。术语“载体结合”是指与载体介质共价连接的化学实体。术语“载体介质”是指寡聚物可以在其上附着或合成，或者可以被修饰以用于连接或合成寡聚物的任何材料，包括例如任何颗粒、珠子或表面。代表性基材包括但不限于无机载体和有机载体，例如玻璃和改性或官能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟龙等)、多糖、尼龙或硝化纤维、陶瓷、树脂、二氧化硅或二氧化硅基材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束和各种其他聚合物。对于一些实施方案，特别有用的载体介质和固体表面位于流动池装置内。在本文所描述方法的一些实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在一些实施方案中，代表性的载体介质包含至少一个用于连接或合成寡聚物的反应性位点。例如，在一些实施方案中，本公开的载体介质包含一个或多个末端氨基或羟基，其能够与进入的亚基或其他活化基团形成化学键，用于连接或合成寡聚物。适用于本文所述方法的一些代表性载体介质包括但不限于以下：可控多孔玻璃(cpg)；草酰控制多孔玻璃(参见，例如，alul等,nucleicacidsresearch1991,19,1527)；含二氧化硅的颗粒(例如多孔玻璃珠)和硅胶，例如通过三氯-[3-(4-氯甲基)苯基]丙基硅烷和多孔玻璃珠的反应形成的颗粒(参见parr和grohmann,angew.chem.internal.ed.1972,11,314,由watersassociates以“porasile”商标出售，framingham,mass.,usa)；1,4-二羟基甲基苯和二氧化硅的单酯(参见bayer和jung,tetrahedronlett.,1970,4503,由watersassociates以“biopak”商标出售)；tentagel(参见，例如，wright等，tetrahedronletters1993,34,3373)；交联的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物珠状基质，或聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物poros(可从perceptivebiosystems获得)；可溶性载体介质如聚乙二醇peg(参见bonora等，organicprocessresearch&development，2000,4,225-231)；peps载体，其为具有悬垂长链聚苯乙烯(ps)接枝的聚乙烯(pe)膜(参见berg等，j.am.chem.soc.,1989,111,8024和国际专利申请wo1990/02749)；二甲基丙烯酰胺与n,n'-双丙烯酰基乙二胺交联的共聚物，包括已知量的n-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰-n'-丙烯酰基六亚甲基二胺(参见atherton等,j.am.chem.soc,1975,97,6584,bioorg.chem.1979,8,351，和j.c.s.perkini538(1981))；涂有疏水性交联苯乙烯聚合物的玻璃颗粒(参见scott等，j.chrom.sci.，1971,9,577)；已经接枝聚苯乙烯的氟化乙烯聚合物(参见kent和merrifield，israelchem.1978,17,243和vanrietschoten在peptides1974，y.wolman,ed.,wileyandsons,newyork,1975,pp.113-116)；羟丙基丙烯酸酯涂覆的聚丙烯膜(daniels等，tetrahedronlett.1989,4345)；丙烯酸接枝的聚乙烯杆(geysen等,proc.natl.acad.sci.usa,1984,81,3998)；含有传统使用的聚合物珠的“茶包”(houghten,proc.natl.acad.sci.usa,1985,82,5131)；及其组合。术语“流动池装置”是指包括表面(例如，固体表面)的腔室，一种或多种流体试剂(例如液体或气体)可以流经该表面。术语“去封闭剂”是指包含化学酸或化学酸组合的组合物(例如溶液)，用于除去保护基团。用于去封闭剂的示例性化学酸包括卤代酸，例如氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在一些实施方案中，去封闭剂从例如寡聚物、载体结合的寡聚物、载体结合的亚基或其他受保护的氮或氧部分除去一个或多个三苯甲基。术语“卤素”和“卤代”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。术语“封端剂”是指包含酸酐(例如，苯甲酸酐、乙酸酐、苯氧基乙酸酐等)的组合物(例如溶液)，其可用于阻断例如载体介质的反应性位点与进入的亚基或其他活化基团形成化学键。术语“裂解剂”是指包含化学碱的组合物(例如，氨或1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯)或化学碱的组合(例如，液体溶液或气体混合物)，其用于裂解例如来自载体介质的载体结合的寡聚物。术语“脱保护剂”是指包含化学碱的组合物(例如，氨、1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯或碳酸钾)或化学碱的组合(例如，液体溶液或气体混合物)，可用于移除保护基团。例如，在一些实施方案中，脱保护剂可以从例如吗啉代亚单元、吗啉代寡聚物的吗啉代亚单元或其载体结合形式中除去碱基保护基团。术语“溶剂”是指其中溶解有溶质的溶液或混合物的组分。溶剂可以是无机或有机的(例如，乙酸、丙酮、乙腈、乙酰丙酮、2-氨基乙醇、苯胺、苯甲醚、苯、苄腈、苯甲醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2-丁酮、叔丁醇、二硫化碳、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、环己醇、环己酮、邻苯二甲酸二正丁酯、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、二乙胺、二乙二醇、二甘醇二甲醚、二甲氧基乙烷(甘醇二甲醚)、n、n-二甲基苯胺、二甲基甲酰胺、邻苯二甲酸二甲酯、二甲基亚砜、二恶烷、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙酯乙酰乙酸酯、苯甲酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、1-庚醇、己烷、1-己醇、甲醇、乙酸甲酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1-辛醇、戊烷、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氢呋喃、甲苯、水、对二甲苯)。短语“吗啉代寡聚物”和“磷酸二酰胺吗啉代寡聚物”或“pmo”是指具有通过磷酸二酰胺连接在一起的吗啉代亚单元的寡聚物，将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5'-环外碳连接。每个吗啉代亚基包含核碱基配对部分，其通过核碱基特异性氢键有效结合靶中的核碱基。术语“eg3尾”是指与寡聚物缀合的三甘醇部分，例如在其3'或5'末端。例如，在一些实施方案中，与寡聚体的3'末端缀合的“eg3尾”可具有以下结构：术语“约”或“近似”通常由相关主题领域中的技术人员理解，但在某些情况下可表示给定值或范围的±10％或±5％以内。制备吗啉代寡聚物的方法如本文所述，通常在载体介质上制备合成。通常，首先将第一合成子(例如单体，例如吗啉代亚基)连接到载体载体介质上，然后通过将亚基依次偶联到载体结合的合成子上来合成寡聚物。该迭代延伸最终产生最终的寡聚化合物。合适的载体介质可以是可溶的或不溶的，或者可以在不同的溶剂中具有可变的溶解度，以使生长的载体结合的聚合物根据需要在溶液中或溶液外。传统的载体介质大部分是不溶的，并且常规地置于反应容器中，同时试剂和溶剂与生长链反应和/或洗涤，直至寡聚物达到目标长度，之后它从载体上裂解，并且，如果需要，进一步后处理以生产最终的聚合化合物。最近的方法引入了可溶性载体，包括可溶性聚合物载体，以允许在合成中的所需点沉淀和溶解反复合成的产物(gravert等，chem.rev.,1997,97,489-510)。本文提供了制备吗啉代寡聚物的方法。因此，在一个方面，本文提供了制备式(ii)化合物的方法：其中r1为载体介质；其中该方法包括用去封闭剂接触式(a1)化合物：其中r1为载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以形成式(ii)化合物。另一方面，本文提供了制备式(a3)化合物的方法：其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；其中该方法包括使式(ii)化合物：其中r1是载体介质，接触式(a2)的化合物：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以形成式(a3)的化合物。在另一方面，本文提供了制备式(iv)化合物的方法：其中r1是载体介质；其中该方法包括用去封闭剂接触式(a3)化合物：其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；以形成式(iv)化合物。在另一方面，本文提供了制备式(a5)化合物的方法：其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以及r4选自：其中该方法包括使式(iv)化合物：其中r1是载体介质，接触式(a4)化合物：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，r4选自：以形成式(a5)化合物。另一方面，本文提供了制备式(a9)化合物的方法：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基戊基，并且r4每次出现独立地选自：其中该方法包括如下顺序步骤：(a)使式(iv)化合物：其中r1是载体介质；接触式(a4)化合物：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，r4选自：以形成式(a5)化合物：其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以及r4选自：(b)进行以下顺序步骤的n-1次迭代：(b1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；并且(b2)使前一步骤形成的化合物接触式(a8)化合物：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且对于式(a8)的每个化合物，r4独立地选自：以形成式(a9)的化合物。在另一方面，本文提供了制备式(a10)化合物的方法：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r4每次出现独立地选自：其中该方法包括使去封闭剂接触式(a9)化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基戊基，并且r4每次出现独立地选自：以形成式(a10)化合物。在另一方面，本文提供了制备式(a11)的化合物的方法：其中n是10至40的整数，r4每次出现独立地选自：其中该方法包括使式(a10)化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r4每次出现独立地选自：与裂解剂接触以形成式(a11)化合物。另一方面，本文提供了制备式(a)的寡聚化合物的方法：其中n是10-40的整数，每个r2在每次出现时独立地选自：其中该方法包括用脱保护剂接触式(a11)的化合物：其中n是10至40的整数，r4每次出现独立地选自：以形成式(a)寡聚化合物。另一方面，本文提供了制备式(a)的寡聚化合物的方法：其中n是10-40的整数，每个r2在每次出现时独立地选自：其中该方法包括以下顺序步骤：(a)用去封闭剂接触式(a1)化合物：其中r1为载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以形成式(ii)化合物：其中r1是载体介质；(b)使式(ii)化合物接触式(a2)化合物：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以形成式(a3)化合物：其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；(c)用一种去封闭剂接触式(a3)化合物以形成式(iv)化合物：其中r1是载体介质；(d)使式(iv)化合物与式(a4)化合物接触：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，r4选自：以形成式(a5)化合物：其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以及r4选自：(e)进行以下顺序步骤的n-1次迭代：(e1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；并且(e2)使前一步骤形成的化合物接触式(a8)化合物：其中r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且对于式(a8)的每个化合物，r4独立地选自：以形成式(a9)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基戊基，并且r4每次出现独立地选自：(f)使式(a9)化合物与去封闭剂接触以形成式(a10)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r4每次出现独立地选自：(g)使式(a10)化合物接触裂解剂以形成式(a11)的化合物：其中n是10至40的整数，r4每次出现独立地选自：(h)使式(a11)化合物与脱保护剂接触，以形成式(a)的寡聚化合物。在一个实施方案中，步骤(d)或步骤(e2)还包括分别使式(iv)化合物或前一步骤形成的化合物与封端剂接触。在另一个实施方案中，每个步骤在至少一种溶剂的存在下进行。在另一个实施方案中，在每个步骤中使用的去封闭剂是包含卤代酸的溶液。在另一个实施方案中，每个步骤中使用的去封闭剂是氰基乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸选自氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸是三氟乙酸。在另一个实施方案中，步骤(a)、(c)、(e)和(g1)中的至少一步还包括使每个步骤的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在又另一个实施方案中，步骤(a)、(c)、(e)和(g1)中的每一步还包括使每个步骤的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，中和剂在包含二氯甲烷和异丙醇的溶液中。在另一个实施方案中，中和剂是单烷基、二烷基或三烷基胺。在另一个实施方案中，中和剂是n,n-二异丙基乙胺。在另一个实施方案中，在每个步骤中使用的去封闭剂是包含4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇和水的溶液。在另一个实施方案中，封端剂处于包含乙基吗啉和甲基吡咯烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，封端剂是酸酐。在另一个实施方案中，酸酐是苯甲酸酐。在另一个实施方案中，式(a4)和式(a8)的化合物各自独立地为包含乙基吗啉和二甲基咪唑烷酮的溶液。在另一个实施方案中，裂解剂包含二硫苏糖醇和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在另一个实施方案中，裂解剂在包含n-甲基-2-吡咯烷酮的溶液中。在又一个实施方案中，脱保护剂包含nh3。在另一个实施方案中，脱保护剂在水溶液中。在另一个实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在另一个实施方案中，式(a4)化合物具有式(a4a)：其中，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，和r4选自：在另一个实施方案中，式(a5)化合物具有式(a5a)：其中：r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，和r4选自：在另一个实施方案中，式(a8)化合物具有式(a8a)：其中：r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，和r4每次出现于式(a8a)，独立地选自：在另一个实施方案中，式(a9)化合物具有式(a9a)：其中：n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，和r4每次出现独立地选自：在另一个实施方案中，式(a10)化合物具有式(a10a)：其中，n是10至40的整数，r1是载体介质，和r4每次出现独立地选自：在另一个实施方案中，式(a11)化合物具有式(a11a)：其中：n是10至40的整数，和r4每次出现独立地选自：在另一个实施方案中，其中对于式(a)寡聚化合物，n为30，并且r2从1至25和5'至3'的每个位置为：其中，所述式(a)寡聚化合物为式(g)化合物：或其药学上可接受的盐golodirsen，先前代号为“spr-4053”，是具有碱基序列5’-gttgcctccggttctgaaggtgttc-3’(seqidno:1)的pmo。golodirsen的cas登记号注册为1422959-91-8。化学名称包括：全-p-ambo-[p,2',3'-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-开环](2'a→5')(g-t-t-g-c-c-t-c-c-g-g-t-t-c-t-g-a-a-g-g-t-g-t-t-c)5'-[4-({2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}羰基)-n,n-二甲基哌嗪-1-亚膦酰胺酯]golodirsen具有以下结构：也可以通过以下化学结构式来描述：golodirsen也可以通过式(xii)的结构来描述：因此，在上述方法的一个实施方案中，式(a)寡聚化合物是式(g)化合物：或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，式(g)寡聚化合物是式(xii)寡聚化合物：或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，r3在每次出现时为三苯甲基。golodirsen的制备工艺本文提供了制备golodirsen的方法。在一个方面，本文提供了制备式(g)的寡聚化合物的方法：其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)用去封闭剂接触式(i)化合物：其中r1为载体介质，以形成式(ii)化合物：其中r1是载体介质；(b)使式(ii)化合物接触化合物(b)：以形成式(iii)化合物：其中r1为载体介质；(c)使式(iii)化合物接触去封闭剂以形成式(iv)化合物：其中r1为载体介质；(d)使式(iv)化合物接触式(dpg)化合物：以形成式(v)化合物：其中r1为载体介质；(e)使式(v)化合物接触去封闭剂以形成式(vi)化合物：其中r1为载体介质；(f)使式(vi)化合物接触式(t)化合物：以形成式(vii)化合物：其中r1为载体介质；(g)执行以下顺序步骤的23次迭代：(g1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；并且(g2)使前一步骤形成的化合物接触式(viii)化合物：其中r2对于每个式(viii)化合物，独立地选自：其中，对于1至23次迭代，r2为：以形成式(ix)化合物：其中r1是载体介质，其中r2对于每次出现，独立地为选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg(h)使式(ix)化合物接触去封闭剂以形成式(x)化合物：其中r1是载体介质，其中r2对于每次出现，独立地为选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：。(i)使式(x)化合物接触裂解剂以形成式(xi)化合物：其中r2对于每次出现，独立地为选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg以及(j)使式(xi)化合物和脱保护剂接触以形成式(g)寡聚化合物。在一个实施方案中，步骤(d)、步骤(f)、步骤(g2)或其组合还包括使式(iv)化合物、式(vi)化合物或由前一步骤形成的化合物分别与封端剂接触。在某些实施方案中，步骤(d)、步骤(f)、步骤(g2)中的每一个还包括使式(iv)化合物，式(vi)或由前一步骤形成的化合物分别与封端剂接触。在另一个实施方案中，每个步骤在至少一种溶剂的存在下进行。在另一个实施方案中，在每个步骤中使用的去封闭剂是包含卤代酸的溶液。在另一个实施方案中，每个步骤中使用的去封闭剂是氰基乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸选自氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸是三氟乙酸。在另一个实施方案中，步骤(c)、(e)和(g1)中的至少一个还包括使每个步骤的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，步骤(c)、(e)和(g1)中的每一个还包括使每个步骤的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，中和剂在包含二氯甲烷和异丙醇的溶液中。在另一个实施方案中，中和剂是单烷基、二烷基或三烷基胺。在另一个实施方案中，中和剂是n,n-二异丙基乙胺。在另一个实施方案中，在每个步骤中使用的去封闭剂是包含4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇和水的溶液。在又一个实施方案中，封端剂在包含乙基吗啉和甲基吡咯烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，封端剂是酸酐。在另一个实施方案中，酸酐是苯甲酸酐。在另一个实施方案中，式(viii)化合物，式(dpg)化合物和化合物(f)各自独立地为包含乙基吗啉和二甲基咪唑烷酮的溶液。在另一个实施方案中，裂解剂包含二硫苏糖醇和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在另一个实施方案中，裂解剂在包含n-甲基-2-吡咯烷酮的溶液中。在又一个实施方案中，去保护剂包含nh3。在另一个实施方案中，脱保护剂在水溶液中。在另一个实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在另一个实施方案中，式(dpg)的化合物具有式(dpg1)：在另一个实施方案中，式(v)的化合物具有式(va)：其中r1是载体介质。在另一个实施方案中，式(t)化合物具有式(t1)：在另一个实施方案中，式(vii)的化合物具有式(viia)：其中r1是载体介质。在另一个实施方案中，式(viii)化合物具有式(viiia)：其中r2对于每个式(viiia)化合物，独立地为选自：在另一个实施方案中，式(ix)的化合物具有式(ixa)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，和r2在每次出现时独立地选自其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在另一个实施方案中，式(x)的化合物具有式(xa)：或其药学上可接受的盐，其中，r1是载体介质，和r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在另一个实施方案中，式(xi)的化合物具有式(xia)：或其药学上可接受的盐，其中：r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在另一个实施方案中，式(vi)的化合物具有式(via)：其中r1是载体介质。在又一个实施方案中，式(g)的寡聚化合物是式(xii)的寡聚化合物：另一方面，本文提供了式(a5)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，以及r4选自：在一些实施方案中，式(a5)的化合物是式(a5a)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，r4选自：另一方面，本文提供了式(v)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质。在一些实施方案中，式(v)的化合物是式(va)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质。另一方面，本文提供了式(vi)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质。在一些实施方案中，式(vi)的化合物是式(via)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质。另一方面，本文提供了式(vii)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质。在一些实施方案中，式(vii)的化合物是式(viia)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质。另一方面，本文提供了式(ix)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，且r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在一个实施方案中，式(ix)化合物具有式(ixa)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在另一方面，本文提供了式(a9)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，和r4每次出现独立地选自：在一个实施方案中，式(a9)的化合物具有式(a9a)：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，和r4每次出现独立地选自：另一方面，本文提供了式(x)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在一个实施方案中，式(x)的化合物具有式(xa)：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg在另一个方面，提供了式(a10)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数，r1是载体介质，和r4每次出现独立地选自：在一个实施方案中，式(a10)化合物具有式(a10a)：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数，r1是载体介质，和r4每次出现独立地选自：在这些化合物的另一个实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在另一个方面，提供了是式(xi)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：。在一个实施方案中，式(xi)的化合物具有式(xia)：或其药学上可接受的盐，其中r2在每次出现时独立地选自：其中r2在从1至25和5’至3’的每个位置为：位置序号5’至3’r2位置序号5’至3’r2位置序号5’至3”r21dpg11dpg21t2t12t22dpg3t13t23t4dpg14pc24t5pc15t25pc6pc16dpg7t17pa8pc18pa9pc19dpg10dpg20dpg另一方面，本文提供式(a11)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数，和r4每次出现独立地选自：在一个实施方案中，式(a11)化合物具有式(a11a)：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数，和r4每次出现独立地选自：寡聚物基于吗啉代的亚基的重要性质包括：1)通过稳定的，不带电的或带正电的主链连接以寡聚形式连接的能力；2)支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、尿嘧啶、5-甲基-胞嘧啶和次黄嘌呤)的能力，使得形成的聚合物可以与互补碱基靶核酸杂交，包括靶rna；3)寡聚体被主动或被动转运到哺乳动物细胞中的能力；4)寡聚体和oligomenrna异源双链体分别抵抗rna酶和rna酶h降解的能力。在一些实施方案中，反义寡聚体含有碱基修饰或取代。例如，可以选择某些核碱以增加本文所述的反义寡聚体的结合亲和力。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，并且可以掺入本文所述的反义寡聚体中。在一个实施方案中，寡聚物的至少一个嘧啶碱基包含5-取代的嘧啶碱基，其中嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在一个实施方案中，5-取代的嘧啶碱是5-甲基胞嘧啶。在另一个实施方案中，寡聚物的至少一个嘌呤碱基包含次黄嘌呤。基于吗啉代的寡聚物(包括反义寡聚体)详细描述于例如美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,521,063、5,506,337、8,299,206和8,076,476中。国际专利申请公开号wo/2009/064471和wo/2012/043730，以及summerton等人(1997,antisense和nucleicaciddrugdevelopment,7,187-195)，其中每一篇通过引用整体并入本文。本公开的寡聚化合物可具有不对称中心、手性轴和手性面(例如，描述于：e.l.eliel和s.h.wilen,stereo-chemistryofcarboncompounds,johnwiley&sons,newyork,1994,第1119-1190页,以及march,j.,advancedorganicchemistry,3d.ed.,第4章,johnwiley&sons,newyork(1985))，可以以外消旋体、外消旋混合物和单独的非对映体形式存在，具有所有可能的异构体及其混合物，包括光学异构体。本文具体提及的本发明的寡聚化合物，没有任何其立体化学的指示，旨在代表所有可能的异构体及其混合物。具体地，不希望受任何特定理论的束缚，如本文所讨论的，本发明的寡聚化合物由活化的吗啉代亚单元制备，包括诸如式(viii)的化合物之类的非限制性实例：其中r2独立地对于每个式(viii)化合物，选自下组：上述式(viii)化合物中的每一种可以例如由相应的β-d-呋喃核糖基制备，如下所示：参见summerton等，antisense&nucleicaciddrugdev.7:187-195(1997)。不受任何特定理论的束缚，两种手性碳的立体化学在合成条件下保留，使得可以基于例如α-l-呋喃核糖基、α-d-呋喃核糖基、β-l-呋喃核糖基或β-d-呋喃核糖基原料的选择，产生每个吗啉代亚基的许多可能的立体异构体。例如，在一些实施方案中，本公开的式(viii)化合物可以是式(viiia)：其中r2独立地为每个式(viiia)化合物，选自下组：不受任何特定理论的束缚，例如，将10至40种式(viii)化合物掺入本公开的寡聚化合物中可产生许多可能的立体异构体。不希望受任何特定理论的束缚，本发明的寡聚化合物包含一个或多个含磷的亚基，其在每个磷处产生手性中心，其中每个被指定为如本领域所理解的“sp”或“rp”结构。不希望受任何特定理论的束缚，这种手性产生立体异构体，其具有相同的化学组成但其原子的三维排列不同。不希望受任何特定理论的束缚，每个磷亚基间连接的构型在合成例如本公开的寡聚化合物期间随机发生。不希望受任何特定理论的束缚，合成方法以指数方式产生大量的本公开的寡聚化合物的立体异构体，因为本公开的寡聚化合物由许多磷亚基间连接组成，每个磷亚基间连接具有随机手性构型。具体地，不希望受任何特定理论的束缚，另外的吗啉代亚基的每个亚基间连接使产物的立体异构体的数量加倍，使得本公开的寡聚化合物的常规制备实际上是2n个立体异构体的高度异质混合物，其中n代表磷亚基间连接的数目。因此，除非另有说明，否则包括所有这些异构体，包括非对映异构体和对映异构体混合物，以及纯对映异构体和非对映异构体，例如，当来自一个或多个立体中心的一个或多个键由“-”或“～～”表示，或者如本领域所理解的等同物时。表1描述了本文所述方法中提供的吗啉代亚单元的各种实施方案。表1：吗啉代亚基的各种实施方案。实施例为了说明和描述本公开的某些具体实施方案，下面列出了实施例。然而，权利要求的范围不以任何方式受本文阐述的实施例的限制。对所公开的实施方案的各种改变和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在不脱离本公开的化学结构、取代基、衍生物、制剂或方法的情况下进行这些改变和修饰，包括但不限于涉及本公开的化学结构、取代本公开的精神和所附权利要求的范围。本文方案中结构中变量的定义与本文提供的化学式中相应位置的定义相当。实施例1：ncp2锚定合成1.4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯的制备(1)向100l烧瓶中加入12.7kg4-氟-3-硝基苯甲酸，加入40kg甲醇和2.82kg浓硫酸。将混合物在回流(65℃)下搅拌36小时。将反应混合物冷却至0℃。在38℃下形成晶体。将混合物在0℃保持4小时，然后在氮气下过滤。用10kg已冷却至0℃的甲醇洗涤100l烧瓶，并洗涤滤饼。将固体滤饼在漏斗上干燥1小时，转移至托盘，并在室温下在真空烘箱中干燥至恒重13.695kg4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(100％收率；hplc99％)。2.3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸的制备a.(z)-4-(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸甲酯(2)向100l烧瓶中加入3.98kg来自前一步骤的4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(1)，9.8kgdmf，2.81kg乙酰乙酸甲酯。将混合物搅拌并冷却至0℃。在约4小时内向其中加入3.66kgdbu，同时将温度保持在5℃或低于5℃。将混合物再搅拌1小时。向反应烧瓶中加入8.15kg柠檬酸溶于37.5kg纯水中的溶液，同时将反应温度保持在15℃或低于15℃。加入后，将反应混合物搅拌另外30分钟，然后在氮气下过滤。将湿滤饼与14.8kg纯净水一起放回100l烧瓶中。将浆液搅拌10分钟，然后过滤。将湿滤饼再次放回100l烧瓶中，用14.8kg纯净水浆化10分钟，并过滤成粗制(z)-4-(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丁-2-烯-甲酯)吡啶-2-基)-3-硝基苯甲酸甲酯。b.3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸在氮气下，将粗(z)-4-(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸酯加入100l反应烧瓶中。向其中加入14.2kg1,4-二恶烷并搅拌。在2小时内向混合物中加入16.655kg浓hcl和13.33kg纯净水(6mhcl)的溶液，同时将反应混合物的温度保持在15℃以下。加完后，将反应混合物加热回流(80℃)至24小时，冷却至室温，并在氮气下过滤。将固体滤饼与14.8kg纯净水一起研磨，过滤，再次用14.8kg纯净水研磨，并过滤。将固体返回到具有39.9kgdcm的100l烧瓶中并在搅拌下回流1小时。加入1.5千克纯净水以溶解剩余的固体。将底部有机层分离至预热的72l烧瓶，然后返回洁净干燥的100l烧瓶中。将溶液冷却至0℃，保持1小时，然后过滤。将固体滤饼各用9.8kgdcm和5kg庚烷的溶液洗涤两次，然后在漏斗上干燥。将固体转移到托盘中并干燥至恒重1.855kg得到3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸。化合物1的总收率为42％。hplc99.45％。3.n-三苯甲基哌嗪琥珀酸盐(ntp)的制备在氮气下，向72l夹套烧瓶中加入1.805kg三苯甲基氯和8.3kg甲苯(tpc溶液)。搅拌混合物直至固体溶解。在氮气下向100l夹套的反应烧瓶中加入5.61kg哌嗪，19.9kg甲苯和3.72kg甲醇。将混合物搅拌并冷却至0℃。在4小时内将tpc溶液分批缓慢加入，同时将反应温度保持在10℃或低于10℃。将混合物在10℃下搅拌1.5小时，然后温热至14℃。将32.6kg纯净水加入72l烧瓶中，然后转移至100l烧瓶中，同时将内部批料温度保持在20+/-5℃。使各层分开，分离并储存底部水层。用32kg纯水分别萃取有机层三次，分离水层并与储存的水溶液合并。将剩余的有机层冷却至18℃，并将847g琥珀酸在10.87kg纯净水中的溶液分批缓慢加入有机层中。将混合物在20+/-5℃下搅拌1.75小时。过滤混合物，用2kgtbme和2kg丙酮洗涤固体，然后在漏斗上干燥。将滤饼用各5.7kg丙酮研磨两次，过滤并在研磨之间用1kg丙酮洗涤。将固体在漏斗上干燥，然后转移到托盘中并在室温下在真空烘箱中干燥至恒重2.32kg的ntp。收率80％。4.(4-(2-羟基丙基)-3-硝基苯基)(4-三苯甲基哌嗪-1-基)甲酮的制备a.制备1-(2-硝基-4-(4-三苯甲基哌嗪-1-羰基)苯基)丙-2-酮在氮气下向100l夹套烧瓶中加入2kg3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸(3)，18.3kgdcm，1.845kgn-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)。搅拌溶液直至形成均匀混合物。在室温下在30分钟内加入3.048kgntp并搅拌8小时。向反应混合物中加入5.44kg纯净水并搅拌30分钟。使各层分离，将含有产物的底部有机层排干并储存。用5.65kgdcm萃取水层两次。将合并的有机层用1.08kg氯化钠溶于4.08kg纯净水中的溶液洗涤。将有机层用1.068kg硫酸钠干燥并过滤。用1.3kgdcm洗涤硫酸钠。将合并的有机层用252g硅胶浆化，并通过含252g硅胶床的过滤漏斗过滤。用2kgdcm洗涤硅胶床。将合并的有机层在旋转蒸发器上蒸发。向残余物中加入4.8kgthf，然后在旋转蒸发器上蒸发，直至达到2.5体积的thf中的1-(2-硝基-4-(4-三苯甲基哌嗪-1-羰基)苯基)丙-2-酮粗品。b.制备(4-(2-羟基丙基)-3-硝基苯基)(4-三苯甲基哌嗪-1-基)甲酮(5)向100l带夹套的烧瓶中加入3600g来自前一步骤的化合物4和9800gthf。将搅拌的溶液冷却至≤5℃。将溶液用11525g乙醇稀释，并在≤5℃下在约2小时内加入194g硼氢化钠。将反应混合物在<5℃下再搅拌2小时。通过缓慢加入约1.1kg氯化铵在约3kg水中的溶液淬灭反应，以将温度保持在≤10℃。将反应混合物再搅拌30分钟，过滤除去无机物，再装入100l夹套烧瓶中，用23kgdcm萃取。分离有机层，再用4.7kgdcm各自萃取水相两次。将合并的有机层用约800g氯化钠在约3kg水中的溶液洗涤，然后用2.7kg硫酸钠干燥。过滤悬浮液，滤饼用2kgdcm洗涤。将合并的滤液浓缩至2.0体积，用约360g乙酸乙酯稀释，并蒸发。将粗产物加载到4kg二氧化硅的硅胶柱上，该二氧化硅在氮气下用dcm填充，并用2.3kg乙酸乙酯在7.2kgdcm中洗脱。蒸发合并的级分，将残余物溶于11.7kg甲苯中。过滤甲苯溶液，滤饼用2kg甲苯洗涤两次。将滤饼干燥至恒重2.275kg得到化合物5(从化合物3得到的产率为46％)hplc96.99％。5.2,5-二氧代吡咯烷-1-基(1-(2-硝基-4-(4-三苯基甲基哌嗪-1-羰基)苯基)丙-2-基)碳酸酯(ncp2锚)的制备在氮气下向100l夹套烧瓶中加入4.3kg化合物5(通过hnmr基于残余甲苯调节重量；此后所有试剂均相应地缩放)和12.7kg吡啶。向其中加入3.160kgdsc(78.91重量％，通过hnmr)，同时将内部温度保持在≤35℃。将反应混合物在环境下老化约22小时，然后过滤。滤饼用200g吡啶洗涤。在每批包含1/2滤液体积的两批中，将滤液缓慢加入到100l夹套烧瓶中，该烧瓶含有约11kg柠檬酸溶于约50kg水中的溶液并搅拌30分钟以进行固体沉淀。用过滤漏斗收集固体，每次洗涤用4.3kg水洗涤两次，并在真空下在过滤漏斗上干燥。将合并的固体装入100l夹套烧瓶中并溶于28kgdcm中，并用900g碳酸钾在4.3kg水中的溶液洗涤。1小时后，使各层分离，除去水层。用10kg水洗涤有机层，分离，用3.5kg硫酸钠干燥。将dcm过滤，蒸发，并在真空下干燥至6.16kg得到ncp2锚(产率114％)。实施例2：锚定树脂合成向75l固相合成反应器中加入约52lnmp和2600g氨基乙基聚苯乙烯树脂。将树脂在nmp中搅拌以溶胀约2小时，然后排干。每次洗涤用约39ldcm洗涤树脂两次，然后每次洗涤用39l中和溶液洗涤两次，然后每次洗涤用39ldcm洗涤两次。将ncp2锚定溶液缓慢加入搅拌的树脂溶液中，在室温下搅拌24小时，并排干。每次洗涤用39lnmp洗涤树脂四次，每次洗涤用39ldcm洗涤六次。处理树脂并用1/2dedc封盖溶液搅拌30分钟，排干，并用第二1/2dedc封盖溶液处理并搅拌30分钟并排干。每次用39ldcm洗涤树脂六次，然后在烘箱中干燥至恒重3573.71g得到锚定树脂。实施例3：活化的eg3尾的制备1.制备三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯(35)向冷却的ntp在二氯甲烷(6ml/gntp)中的悬浮液中加入碳酸钾(3.2当量)在水(4ml/g碳酸钾)中的溶液。向该两相混合物中缓慢加入氯甲酸苯酯(1.03当量)在二氯甲烷(2g/g氯甲酸苯酯)的溶液。将反应混合物温热至20℃。反应完成(1-2小时)后，分离各层。用水洗涤有机层，并用无水碳酸钾干燥。通过从乙腈中结晶分离产物35。产率＝80％。2.制备氨基甲酸酯(36)将氢化钠(1.2当量)悬浮在1-甲基-2-吡咯烷酮中(32ml/g氢化钠)。向该悬浮液中加入三甘醇(10.0当量)和化合物35(1.0当量)。将所得浆液加热至95℃。反应完成(1-2小时)后，将混合物冷却至20℃。向该混合物中加入30％二氯甲烷/甲基叔丁基醚(v:v)和水。依次用naoh水溶液，琥珀酸水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤含产物的有机层。通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷中结晶分离产物36。产率＝90％。3.制备eg3尾酸(37)向化合物36的四氢呋喃(7ml/g36)溶液中加入琥珀酸酐(2.0当量)和dmap(0.5当量)。将混合物加热至50℃。反应完成(5小时)后，将混合物冷却至20℃并用nahco3水溶液调节至ph8.5。加入甲基叔丁基醚，将产物萃取到水层中。加入二氯甲烷，用柠檬酸水溶液将混合物调节至ph3。含有产物的有机层用ph＝3的柠檬酸盐缓冲液和饱和氯化钠水溶液的混合物洗涤。在制备化合物38时，不经分离使用该37的二氯甲烷溶液。4.制备活化eg3尾(38)向化合物37的溶液中加入n-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酰亚胺(honb)(1.02当量)，4-二甲基氨基吡啶(dmap)(0.34当量)，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基))-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(1.1当量)。将混合物加热至55℃。反应完成(4-5小时)后，将混合物冷却至20℃并依次用1:1的0.2m柠檬酸/盐水和盐水洗涤。将二氯甲烷溶液与丙酮进行溶剂交换，然后与n,n-二甲基甲酰胺进行溶剂交换，通过从丙酮/n,n-二甲基甲酰胺中沉淀到饱和氯化钠水溶液中分离产物。将粗产物在水中再浆化几次以除去残留的n,n-二甲基甲酰胺和盐。从化合物36至活化eg3尾38的产率＝70％。实施例4：50l固相合成golodirsen[寡聚化合物(xii)]原料药物1.原料表2：起始原料原料的化学结构：a.活化的eg3尾b.活化的c亚基(用于制备，参见美国专利号8,067,571)c.活化的a亚基(用于制备，参见美国专利号8,067,571)d.活化的dpg亚基(用于制备，参见wo2009/064471)e.活化的t亚基(用于制备，参见wo2013/082551)f.锚固树脂其中r1是载体介质。表3：用于golodirsen原料药物的固相寡聚物合成的溶液的描述溶液名称溶液组成ncp2锚溶液37.5lnmp和1292gncp2锚dedc封端溶液4.16l焦碳酸二乙酯(dedc)，3.64lnem，和33.8ldcmcytfa溶液2.02kg4-氰基吡啶，158ldcm，1.42ltfa，39ltfe，和2l纯水中和溶液35.3lipa，7.5ldipea，和106.5ldcm裂解溶液1,530.04gdtt，6.96lnmp，和2.98ldbu2.golodirsen原料药的合成a.树脂膨胀将750g加载锚定树脂和10.5lnmp加入50l硅烷化反应器中并搅拌3小时。排出nmp并将锚定树脂用每次5.5l的dcm洗涤两次，并用每次5.5l30％的tfe/dcm洗涤两次。b.循环0：eg3尾耦合将锚定树脂用每次5.5l30％的tfe/dcm洗涤三次并排干，用5.5lcyfta溶液洗涤15分钟并排干，再次用5.5lcytfa溶液洗涤15分钟而不排干，向其中加入122ml1:1的nem/dcm并将悬浮液搅拌2分钟并排干。将树脂用5.5l中和溶液洗涤1次10分钟并排干，用5.5l中和溶液洗涤两次5分钟并排干，然后用每次5.5l的dcm洗涤两次并排干。将含706.2g活化eg3尾(mw765.85)和234mlnem的3ldmi溶液加入到树脂中并在室温下搅拌3小时并排干。每次洗涤将树脂用5.5l的中和溶液洗涤1次10分钟并排干，并用5.5l的中和溶液洗涤1次5分钟并排干。搅拌374.8g苯甲酸酐和195mlnem在2680mlnmp中的溶液15分钟并排干。将树脂与5.5l中和溶液一起一次10分钟，并排干，用5.5l中和溶液洗涤一次5分钟并排干，并且用5.5ldcm洗涤一次并排干，并用每次5.5l的30％tfe/dcm洗涤两次。将树脂悬浮在5.5l的30％tfe/dcm中并保持14小时。c.亚基耦合循环1-30i.预耦合处理在如图1所描述，每个耦合循环之前，将树脂：1)用30％tfe/dcm洗涤；2)a)用cytfa溶液处理15分钟并排干，和b)用cytfa溶液处理15分钟，向其中加入1:1nem/dcm，搅拌并排干；3)用中和溶液搅拌三次；4)用dcm洗涤两次。参见表4。ii.后耦合处理在如表4中所描述，排出每个亚基溶液后，将树脂：1)用dcm洗涤；2)用30％tfe/dcm洗涤三次。如果在下一个耦合循环之前将树脂保持一段时间，则不排出第三tfe/dcm洗涤液并将树脂保留在所述tfe/dcm洗涤溶液中。见表4。iii.活化亚基耦合循环如表4中所描述进行耦合循环。iv.最终的ipa洗涤在如表4所描述进行最终耦合步骤后，用每次19.5l的ipa洗涤树脂8次，并在室温下真空干燥约63.5小时，干重为4857.9g。d.裂解将上述树脂结合的eteplisen原料药物分成两批，每批如下处理：将1619.3g树脂：1)与10lnmp一起搅拌2小时，然后排出nmp；2)用每次10l的30％tfe/dcm洗涤三次；3)用10lcytfa溶液处理15分钟；4)10lcytfa溶液15分钟，然后加入130ml1:1nem/dcm搅拌2分钟并排干。将树脂每次用10l中和溶液处理三次，用10ldcm洗涤六次，并每次用10lnmp洗涤八次。将树脂用1530.4gdtt和2980dbu在6.96lnmp中的裂解溶液处理2小时，以从树脂上分离出eteplisen原料药物。将裂解溶液排出并保留在单独的容器中。用4.97lnmp洗涤反应器和树脂，将其与裂解溶液合并。表4：e.脱保护将合并的裂解溶液和nmp洗涤液转移至压力容器中，向其中加入39.8lnh4oh(nh3·h2o)，其已在冷冻机中冷却至-10℃至-25℃的温度。将压力容器密封并加热至45℃保持16小时，然后冷却至25℃。在移除溶液之前将含有golodirsen原料药物的该脱保护溶液用纯净水3:1稀释。在移除溶液期间，用2m磷酸将该脱保护溶液的ph调节至3.0，然后用nh4oh调节至ph8.03。hplc(c18)73-74％：c1877.552％(图1)和scx-1073.768％(图2)。实施例5：golodirsen原料药物的纯化将来源于实施例4的e部分的含有golodirsen原料药物物质的脱保护溶液上样到toyopearlsuper-q650s阴离子交换树脂柱(tosohbioscience)上，用17柱体积的0-35％b梯度洗脱(缓冲液a：10mm氢氧化钠；缓冲液b：在10mm氢氧化钠中的1m氯化钠)和可接受纯度的级分(c18和scxhplc)合并到纯化的药物产品溶液中。hplc:93.571％(c18；图3)88.270％(scx；图4)。将纯化的药物溶液脱盐并冻干至1959g纯化的golodirsen药物。收率54.56％；hplc:93.531％(图5；c18)88.354％(图6；scx)。表5.缩略语缩写名称dbu1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯dcm二氯甲烷dipean，n-二异丙基乙胺dmi1,3-二甲基-2-咪唑啉酮dtt二硫苏糖醇ipa异丙醇mw分子量nemn-乙基吗啉nmpn-甲基-2-吡咯烷酮rt室温tfa2,2,2-三氟乙酸tfe2,2,2-三氟乙醇通过引用并入本申请中引用的所有参考文献(包括期刊文献，授权专利，公开的专利申请和共同未决的专利申请)的内容在此明确地以其整体并入本文。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均符合本领域普通技术人员通常已知的含义。等同物本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由所述权利要求涵盖。当前第1页12