本发明涉及gm-csf变体、编码该变体的合成多核苷酸、以及制备和使用该变体和该合成多核苷酸的方法。
背景技术：
：：炎性肠病(ibd)是未知病因的失调，其特征通常在于腹泻、痉挛、腹痛、体重减轻和直肠出血、疲倦、贫血、瘘、穿孔、肠梗阻以及经常需要外科手术。根据美国疾病控制和预防中心，在美国约140万人患有ibd，这使其成为美国最普遍的胃肠疾病之一。估计在美国，ibd的整体保健费用每年超过17亿美元。一些失调属于ibd类，其包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎、显微镜结肠炎和胶原性结肠炎。ibd的最常见形式为克罗恩病和溃疡性结肠炎。溃疡性结肠炎影响大肠(结肠)和直肠，并且涉及肠壁的内衬(例如，粘膜层和粘膜下层)。克罗恩病可影响胃肠道的任何部分(例如，口腔、食道、胃、小肠、大肠、直肠、肛门等)并且可涉及肠壁的所有层。ibd的临床症状包括直肠出血和/或肠出血、腹痛和痉挛、腹泻和体重减轻。此外，ibd是结肠癌的风险因素，结肠癌的这种风险在ibd八至十年之后显著增加。ibd尚未治愈。目前的治疗旨在减少炎症过程和减少与该疾病相关的炎症过程的有害影响，并且包括施用抗炎药物(例如，(美沙拉嗪)、(柳氮磺胺吡啶)、(英夫利昔)、(阿达木单抗)、泼尼松、布地奈德)和免疫抑制药物(例如，6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、环胞素)。此类治疗可与不良副作用相关联，诸如，恶心、呕吐、厌食、消化不良、不适、头痛、腹痛、发热、皮疹、胰腺炎、骨髓抑制、抗体形成、输液反应和机会性感染增加。因此，需要针对ibd的附加治疗。技术实现要素：本发明提供了一种分离的gm-csf变体，当与seqidno：1的野生型gm-csf相比时，其包含置换s29c和置换s69c，任选地还包含在对应于seqidno：1的残基r23、l49或k107的氨基酸残基位置处的至少一个置换。本发明还提供包含seqidno：33的氨基酸序列的分离的gm-csf变体。本发明还提供了一种分离的gm-csf变体，所述gm-csf变体包含seqidno:2、3、4、6、7、8或9所述的氨基酸序列。本发明还提供了一种分离的gm-csf变体，当与seqidno：1的野生型gm-csf相比时，其包含置换s29c和置换s69c，任选地还包含在对应于seqidno：1的残基r23、l49或k107的氨基酸残基位置处的至少一个置换，其中所述gm-csf变体缀合至半衰期延长部分。本发明还提供编码本发明的gm-csf变体的分离的多核苷酸。本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的表达载体。本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。本发明还提供一种包含本发明的表达载体的宿主细胞。本发明还提供一种制备本发明的gm-csf变体的方法，所述方法包括在表达所述gm-csf变体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且纯化所述gm-csf变体。本发明还提供一种包含本发明的gm-csf变体的试剂盒。本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的gm-csf变体以及药学上可接受的赋形剂。本发明还提供了一种治疗对其有需要的受试者的炎性肠病(ibd)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的gm-csf变体并持续足以治疗ibd的时间。附图说明图1示出了人gm-csf(pdb:2gmf(rozwarski等人，1996))的结构，其示出了考虑工程化以改善gm-csf的稳定性的残基。图2a示出各种gm-csf变体之间从残基1-60的氨基酸序列比对。行开始处的数字指示氨基酸序列的seqidno：。图2b示出各种gm-csf变体之间从残基61-127的氨基酸序列比对。行开始处的数字指示氨基酸序列的seqidno：。图3示出了在具有3mg/ml胰酶的空腹状态模拟肠液(fassif)中，s29c/s69c、l49p、s29c/s69c/k107i和s29c/s69c/r23l/l49p/k107igm-csf变体随时间推移(如图中所示的，1分钟、10分钟和30分钟)的稳定性。c：对照图4a示出在与补充有3mg/ml胰酶的fassif一起温育30分钟之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留，然而野生型gm-csf的生物活性被完全消除。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图4b示出在与不具有fassif+胰酶的野生型gm-csf相当的含量下，在与补充有3mg/ml胰酶的fassif一起温育1小时之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图4c示出在与不具有fassif+胰酶的野生型gm-csf相当的含量下，在与补充有3mg/ml胰酶的fassif一起温育4小时之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留，并且示出变体s29c/l49p/s69c/k107i在该时间点处展示出一些活性。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图4d示出了在与补充有3mg/ml胰酶的fassif一起温育6小时后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图5a示出在与食蟹猴的结肠内容物(cc)一起温育30分钟之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留，然而野生型gm-csf的生物活性几乎完全消除。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图5b示出在与食蟹猴的结肠内容物(cc)一起温育2小时之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图5c示出在与食蟹猴的结肠内容物(cc)一起温育6小时之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留。与未处理的变体细胞因子相比，gm-csf的r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体表现出5倍活性损失，然而野生型gm-csf的活性完全消除。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图5d示出在与食蟹猴的结肠内容物(cc)一起温育24小时之后，gm-csf及其变体s29c/l49p/s69c/k107i和r23l/s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性消除。pp1a7：野生型gm-csf，gsfd96：r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体；gsfd97：s29c/l49p/s69c/k107i变体。通过评估stat5的tyr694的磷酸化百分比(％)并根据测定中所用的gm-csf浓度作图，测量tf-1细胞中的生物活性。图6示出gm-csf变体的共有序列，其具有s29c和s69c突变。具体实施方式本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然本文描述了示例性的组合物和方法，但类似或等同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明的实践或测试。“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链dna和单链dna以及双链rna和单链rna是多核苷酸的典型示例。“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。“肽”是指长度多至30个氨基酸的短多肽。“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有元件诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记物，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统，例如细胞、病毒、动物、植物、以及利用能够复制载体的生物组分的重组生物系统中的复制或保持。载体多核苷酸可为单链或双链dna或rna分子或这些分子的杂合分子。“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。“互补序列”是指反向平行于第一分离多核苷酸序列并包含与第一多核苷酸序列中的核苷酸互补的核苷酸的第二分离多核苷酸序列。“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿剌或手术切除的组织。“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受治疗者。“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另外指出，术语“患者”和“受试者”可互换使用。“变体”是指因一处或多处修饰(例如，一个或多个置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。例如，所述变体与seqidno：1的野生型成熟gm-csf多肽或编码具有seqidno：18序列的野生型成熟gm-csf的多核苷酸的不同之处在于一个或多个修饰，例如核苷酸或氨基酸的置换、插入或缺失。“分离的”是指已经与分子产生于其中的系统(诸如重组细胞)中的其它组分基本上分离和/或从其中纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或合成多肽)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的gm-csf变体”是指基本上不含其它细胞材料和/或化学物质的gm-csf变体，并且涵盖分离至更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的变体。“炎性肠病(ibd)”是指特征在于胃肠道中的炎性活性的失调或疾病。ibd包括但不限于，克罗恩病、溃疡性结肠炎、约内氏病、贝赫切特综合征、胶原性结肠炎、改道性结肠炎、未定型结肠炎、显微镜结肠炎、感染性结肠炎、缺血性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、小肠和/或近侧小肠的特发性炎症、ibd-相关的腹泻和胃肠道的密切相关疾病和失调。在整个说明书中，gm-csf变体中被置换的残基的编号对应于其在seqidno:1的野生型gm-csf中的位置。例如，说明书中的“s29c”是指对应于seqidno:1的野生型gm-csf中位置29的残基位置处的丝氨酸被半胱氨酸置换。如本文所用，天然氨基酸的缩写示于表1中。表1：氨基酸三字母代码单字母代码丙氨酸alaa精氨酸argr天冬酰胺asnn天冬氨酸aspd半胱氨酸cysc谷氨酸glue谷氨酰胺glnq甘氨酸glyg组氨酸hish异亮氨酸ilei亮氨酸leul赖氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop丝氨酸sers苏氨酸thrt色氨酸trpw酪氨酸tyry缬氨酸valv物质的组成本发明提供了与野生型gm-csf相比时，具有增强的稳定性和/或生物活性的粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(gm-csf)变体。本发明还提供了gm-csf变体，其在模拟胃肠道的环境中具有改善的稳定性。因此，本发明的gm-csf变体可适用于口服给药。本发明的gm-csf变体可用于治疗处理患有炎性肠病(ibd)或其它疾病或病症的受试者，其中期望增强gm-csf活性。本发明的多核苷酸、载体和细胞系可用于产生本发明的gm-csf变体。gm-csf是肠道先天性免疫的关键调节子(2014)，并且在维持肠道屏障完整性方面起作用。最近的证据展示出肠道gm-csf还参与维持粘膜耐受性(mortha等人，2014)。在一些克罗恩病(cd)患者中，已假设病因是先天免疫系统的失调，具体地，中性粒细胞功能不全和其它gm-csf反应性免疫细胞不全(korzenik&dieckgraefe，2000)。已经在临床中测试了全身gm-csf给药在cd患者中诱导缓解的能力(dieckgraefe&korzenik，2002；kelsen等人，2010；korzenik，2005；vaughan&drumm，1999)。尽管存在一些有希望的早期临床结果，但在第ii阶段cd试验中，发现了gm-csf治疗组中的一些不利的事件(valentine等人，2009)。另外，ibd患者中血栓和肺部失调的有记录的增加的风险(bernstein，blanchard，houston,&wajda，2001；bernstein，wajda,&blanchard，2008)也可由全身gm-csf治疗而加剧。用于局部gi递送的口服给药的gm-csf可由患者依从性，以及通过最小化全身暴露的安全角度来证明是更理想的。然而，由于苛刻的ph、蛋白水解以及生物药物将暴露于其中的微生物环境，向下胃肠道口服递送蛋白质具有挑战性(amidon，brown,&dave，2015)。实际上，已经证明类似于gm-csf的四螺旋束生长因子在体外被消化蛋白酶快速降解(jensen-pippo，whitcomb，deprince，ralph,&habberfield，1996)。本发明还提供了一种分离的gm-csf变体，当与seqidno：1的野生型gm-csf相比时，其包含置换s29c和置换s69c，任选地还包含在对应于seqidno：1的残基r23、l49或k107的氨基酸残基位置处的至少一个置换。本发明还提供包含seqidno：33的氨基酸序列的分离的gm-csf变体。seqidno:33是gm-csf变体的共有序列，其具有s29c和s69c置换和在残基位置r23、l49或k107处的任选的置换。seqidno:33aparspspstqpwehvnaiqeax1rllnlcrdtaaemnetvevisemfdx2qeptclqtrlelykqglrgcltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfx3enlkdfllvipfdcwepvqe；其中x1为r或l；x2为l或p；并且x3为k或i。与野生型gm-csf相比，包含s29c置换和s69c置换的gm-csf变体更稳定且更有效。置换产生了连接gm-csf环ab和环bc的新型二硫键。具有s29c置换和s69c置换的示例性gm-csf变体是具有seqidno:2、6、7、8和9的氨基酸序列的变体。本发明还提供了一种分离的gm-csf变体，当与seqidno:1的野生型gm-csf相比时，所述变体包含置换s29c和置换s69c，任选地还包含在对应于seqidno:1的残基r23、l49或k107的氨基酸残基位置处的至少一个置换，其中所述变体表现出与野生型gm-csf相比，至少高约5℃的解链温度(tm)，其中所述tm使用实施例1中所描述的方案使用差示扫描量热法测量。预期具有较高tm(例如，增加的热稳定性)的gm-csf变体具有改善的抗蛋白水解性，因为已经充分确定了增加的热稳定性通常转化为改善的抗蛋白水解性(akasako，haruki，oobatake,&kanaya，1995；daniel，cowan，morgan，&curran，1982；mclendon&radany，1978；parsell&sauer，1989)。本发明还提供了一种分离的gm-csf变体，当与seqidno：1的野生型gm-csf相比时，其包含置换s29c和置换s69c，任选地还包含在对应于seqidno：1的残基r23、l49或k107的氨基酸残基位置处的至少一个置换，其中所述变体以一定ec50值刺激tf-1crl2003tm细胞的增殖，当使用实施例1中所描述的方案与用野生型gm-csf刺激tf-1crl2003tm细胞增殖的ec50值相比时，所述ec50值小至少约1.5倍。当与野生型gm-csf相比时，就其在诱导tf-1细胞增殖方面的效应而言，具有较低ec50值的gm-csf变体是gm-csf信号传导途径的更有效的激活因子。在一些实施方案中，在对应于seqidno:1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23a置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno:1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23d置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno:1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23e置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno:1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23f置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno:1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23g置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23h置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23i置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23k置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23l置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23m置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23n置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23p置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23q置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23s置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23t置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23v置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23w置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换为r23y置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49a置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49d置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49e置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49f置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49g置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49h置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49i置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49k置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49m置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49n置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49p置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49q置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49r置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49s置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49t置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49v置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49w置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换为l49y置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107a置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107d置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107e置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107f置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107g置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107h置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107i置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107l置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107m置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107n置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107p置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107q置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107r置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107s置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107t置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107v置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107w置换。在一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换为k107y置换。在一些实施方案中，所述gm-csf变体包含r23l置换、l49p置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换和r23l置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换和l49p置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换、r23l置换和l49p置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换、r23l置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换、l49p置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含s29c置换、s69c置换、r23l置换、l49p置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含在对应于seqidno：1的残基r23的氨基酸残基位置处的置换。在一些实施方案中，gm-csf变体包含在对应于seqidno：1的残基l49的氨基酸残基位置处的置换。在一些实施方案中，gm-csf变体包含在对应于seqidno：1的残基k107的氨基酸残基位置处的置换。在一些实施方案中，gm-csf的变体包含r23l置换。所述置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。在一些实施方案中，gm-csf的变体包含l49p置换。所述置换改善了gm-csf变体的热稳定性，并且移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf的变体包含k107i置换。所述置换改善了gm-csf变体的热稳定性。在一些实施方案中，所述gm-csf变体包含r23l置换和l49p置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，所述gm-csf变体包含r23l置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。在一些实施方案中，所述gm-csf变体包含l49p置换和k107i置换。这些置换改善了gm-csf变体的热稳定性和效力。此外，l49p置换移除了潜在的mhcii类表位，从而具有l49p置换的gm-csf变体可具有较低的免疫原性。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：10的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：11的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：12的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：13的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：14的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：15的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：16的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，gm-csf变体包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gm-csf变体由包含seqidno：17的多核苷酸序列的多核苷酸编码。另选地，本发明的gm-csf变体可通过使用无细胞表达系统(诸如基于网织红细胞裂解物的表达系统)或通过标准重组表达系统由编码gm-csf变体的多核苷酸获得。例如，编码gm-csf变体的多核苷酸可根据美国专利us6521427和us6670127中所述的方法，利用简并寡核苷酸产生期望的变体，或通过标准pcr克隆和诱变，使用化学基因合成来合成。可将编码gm-csf变体的多核苷酸克隆到表达载体中，并使用标准程序表达。经表达的gm-csf可使用例如captoq阴离子交换、captophenylhic树脂和deae阴离子交换来纯化。可使用例如实施例1中所描述的测定对生成的gm-csf变体的改善的热稳定性和效力进行测试。同源gm-csf分子可对本发明的gm-csf变体进行附加置换，只要所得的变体在与seqidno：1的野生型gm-csf比较时包含置换s29c和置换s69c，并且在与亲本gm-csf变体相比时保持或具有增强的热稳定性和/或效力即可。可使用实施例1中所描述的方案来评估热稳定性和效力。可进行的附加置换是先前所述的那些：美国专利5391485中所述的r24l；美国专利5405952中所述的r23l/n27d/t39e/e123k；国际专利公布wo1989/010403中所述的q20a和/或e21a；表2和表3中所示并且如美国专利7208147中所示的置换。还可对本发明的gm-csf变体进行保守修饰，只要所得的变体在与seqidno:1的野生型gm-csf相比时，包含置换s29c和置换s69c，并且与亲本gm-csf变体相比时保持或具有增强的热稳定性和/或效力即可。“保守修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的分子的特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。保守置换是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可用丙氨酸来置换，如先前对于丙氨酸扫描诱变所述(maclennan等人，(1988)actaphysiolscandsuppl643:55-67；sasaki等人，(1988)advbiophys35:1-24)。置换可使用已知的方法单独或组合制备。例如，对本发明的gm-csf变体的氨基酸置换可通过已知的方法进行，例如通过pcr诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可例如使用随机(nnk)或非随机密码子(例如dvk密码子，其编码11个氨基酸(ala、cys、asp、glu、gly、lys、asn、arg、ser、tyr、trp))来产生变体文库。可使用实施例1中所描述的方案测试所得的gm-csf变体的热稳定性和效力。表2：表3：半衰期延长部分本发明还提供了缀合至半衰期延长部分的gm-csf变体。在一些实施方案中，半衰期延长部分是人血清白蛋白(has)、人血清白蛋白的变体，诸如c34s变体、转甲状腺素蛋白(ttr)、甲状腺素结合球蛋白(tgb)、白蛋白结合结构域、或fc或其片段。所述半衰期延长部可缀合至gm-csf变体的n末端或c末端。在一些实施方案中，半衰期延长部分缀合至gm-csf的n末端。在一些实施方案中，fc为igg1、igg2、igg3或igg4同种型。在一些实施方案中，半衰期延长部分是缀合至gm-csf的n末端的hsa的c34s变体。在一些实施方案中，半衰期延长部分是经由seqidno:23的接头缀合至gm-csf的n末端的hsa的c34s变体。在一些实施方案中，半衰期延长部分是经由seqidno:27的接头缀合至gm-csf的n末端的hsa的c34s变体。在一些实施方案中，半衰期延长部分是缀合至gm-csf的n末端的fc。在一些实施方案中，半衰期延长部分是经由seqidno:23的接头缀合至gm-csf的n末端的fc。在一些实施方案中，半衰期延长部分是经由seqidno:27的接头缀合至gm-csf的n末端的fc。在一些实施方案中，接头包含seqidno:20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc包含至少一个置换。可对fc进行fc置换以调节缀合到fc的gm-csf变体的效应子功能和药代动力学特性。可被置换以调节含fc分子半衰期的fc位置是描述于例如dall’acqua等人，(2006)jbiolchem281:23514–240；zalevsky等人，(2010)natbiotechnol28:157-159；hinton等人，(2004)jbiolchem279(8):6213-6216；hinton等人，(2006)jimmunol176:346-356；shields等人.(2001)jbiolchem276:6591-6607；petkova等人，(2006)intimmunol18:1759-1769；datta-mannan等人，(2007)drugmetabdispos,35:86-94,2007；vaccaro等人，(2005)natbiotechnol23:1283-1288；yeung等人，(2010)cancerres,70:3269-3277和kim等人，(1999)eurjimmunol29:2819中的那些，并且包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合进行的示例性置换为置换t250q、m252y、i253a、s254t、t256e、p257i、t307a、d376v、e380a、m428l、h433k、n434s、n434a、n434h、n434f、h435a和h435r。可用于增加含fc分子半衰期的示例性单独或组合置换为置换m428l/n434s、m252y/s254t/t256e、t250q/m428l、n434a和t307a/e380a/n434a。可用于减小含fc分子半衰期的示例性单独或组合置换为置换h435a、p257i/n434h、d376v/n434h、m252y/s254t/t256e/h433k/n434f、t308p/n434a和h435r。在一些实施方案中，fc包含至少一个置换，所述置换减少含fc分子与活化fcγ受体(fcγr)的结合和/或减少fc介导的效应子功能。可被置换以降低含fc分子与活化fcγr的结合并随后降低效应子功能的fc位置是描述于例如shields等人，(2001)jbiolchem276:6591-6604；国际专利公开wo2011/066501；美国专利6,737,056和5,624,821；xu等人，(2000)cellimmunol,200:16-26；alegre等人，(1994)transplantation57:1537-1543；bolt等人，(1993)eurjimmunol23:403-411；cole等人，(1999)transplantation,68:563-571；rother等人，(2007)natbiotechnol25:1256-1264；ghevaert等人，(2008)jclininvest118:2929-2938；an等人，(2009)mabs,1:572-579)中的那些，并且包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合进行的示例性置换为igg1、igg2、igg3或igg4中的置换k214t、e233p、l234v、l234a、g236缺失、v234a、f234a、l235a、g237a、p238a、p238s、d265a、s267e、h268a、h268q、q268a、n297a、a327q、p329a、d270a、q295a、v309l、a327s、l328f、a330s和p331s。导致具有降低的效应子功能的含fc分子的示例性组合置换为igg1上的置换l234a/l235a、igg2上的v234a,/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s、igg4上的f234a/l235a、igg4上的s228p/f234a/l235a、所有ig同种型上的n297a、igg2上的v234a/g237a、igg1上的k214t/e233p/l234v/l235a/g236-缺失/a327g/p331a/d365e/l358m、igg2上的h268q/v309l/a330s/p331s、igg1上的s267e/l328f、igg1上的l234f/l235e/d265a、igg1上的l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s、igg4上的s228p/f234a/l235a/g237a/p238s、以及igg4上的s228p/f234a/l235a/g236-缺失/g237a/p238s。还可使用杂合igg2/4fc域，例如具有来自igg2的残基117-260和来自igg4的残基261-447的fc。在一些实施方案中，半衰期延长部分经由多肽接头缀合至gm-csf变体。合适的接头是例如表4中所示的接头。表4：在一些实施方案中，半衰期延长部分为乙二醇、聚乙二醇(peg)分子，诸如peg5000或peg20000、葡聚糖、聚赖氨酸；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸脂、花生酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等；聚赖氨酸、辛烷或碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与gm-csf变体直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术生成。另选地，熟知的化学偶联方法可用于将所述部分连接至本发明的gm-csf变体。多核苷酸、载体和宿主细胞本发明还提供编码本发明的gm-csf变体的多核苷酸。多核苷酸可为互补脱氧核酸(cdna)，并且可经密码子优化以在合适的宿主中表达。密码子优化是公知的技术。在一些实施方案中，编码gm-csf变体的多核苷酸包含seqidno:10、11、12、14、15、16或17的多核苷酸序列。编码本发明的gm-csf变体的多核苷酸序列可操作地连接至一种或多种调节元件，诸如允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达的启动子或增强子。多核苷酸可以为cdna。本发明还提供了一种载体，其包含编码本发明的gm-csf变体的多核苷酸。本发明还提供了一种表达载体，其包含编码本发明的gm-csf变体的多核苷酸。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:10的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:11的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:12的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:13的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:14的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:15的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:16的多核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其包含seqidno:17的多核苷酸序列。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其它适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将任选地缀合至半衰期延长部分的编码本发明的gm-csf变体的多核苷酸插入表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的dna片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。对此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体dna的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需dna序列的细胞进行检测。合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于真核细胞中的表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件、细胞巨化病毒极早期启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、存在于逆转录酶病毒长末端重复序列中的启动子、小鼠金属硫蛋白-i启动子、四环素诱导型启动子以及各种本领域已知的组织特异性启动子。合适的载体和启动子的选择是熟知的。可使用的示例性启动子包含seqidno:31的氨基酸序列，并且可由包含seqidno:32的多核苷酸序列的多核苷酸编码。seqidno:31mawvwtllflmaaaqsiqaseqidno:32atggcctgggtgtggaccctgctgttcctgatggccgccgcccagagcatccaggcc已知大量合适的载体和启动子。许多可商购获得以用于产生重组构建体。示例性载体为细菌载体pbs、phagescript、psix174、pbluescriptsk、pbsks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene，lajolla，calif.，usa)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(pharmacia，uppsala，sweden)，和真核载体pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)、pee6.4(lonza)和pee12.4(lonza)。示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件、细胞巨化病毒极早期启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、存在于逆转录酶病毒长末端重复序列中的启动子、小鼠金属硫蛋白-i启动子、四环素诱导型启动子、以及各种本领域已知的组织特异性启动子。合适的载体和启动子的选择是熟知的。本发明还提供包含本发明的一个或多个载体的宿主细胞。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此这种子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(escherichiacoli)、杆菌属(bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如沙门氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)以及各种假单胞菌属(pseudomonas)物种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(saccharomyces)(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如sp2/0(美国典型培养物保藏中心(atcc),manassas,va,crl-1581)、ns0(欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc),salisbury,wiltshire,uk,ecaccno.85110503)、fo(atcccrl-1646)和ag653(atcccrl-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是u266(attccrl-tib-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(cho)细胞的那些细胞系，诸如cho-k1sv(lonzabiologics，walkersville，md)、cho-k1(atcccrl-61)或dg44。本发明还提供一种制备本发明的gm-csf变体的方法，所述方法包括在表达所述gm-csf变体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由所述宿主细胞产生的gm-csf变体。一旦被合成(以化学方式或重组方式)后，可根据标准程序纯化gm-csf变体，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(hplc)纯化、凝胶电泳等等(一般参见scopes，proteinpurification(springer-verlag,n.y.,(1982))。本发明的gm-csf变体可以是基本上纯的，例如，至少约80％至85％纯、至少约85％至90％纯、至少约90％至95％纯、或者至少约98％至99％纯，或者更加纯，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除本发明的gm-csf变体之外的大分子等。可使用标准分子生物方法将编码本发明的gm-csf变体的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。使用方法本发明的gm-csf变体具有体外和体内的治疗和预防用途。例如，本发明的gm-csf变体可被施用于体外或离体培养的细胞，或者待治疗的受试者，预防和/或诊断各种失调，诸如炎性肠病(ibd)。本发明提供了一种治疗对其有需要的受试者的炎性肠病(ibd)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的gm-csf变体并持续足以治疗ibd的时间。在一些实施方案中，ibd为克罗恩病。在一些实施方案中，ibd为溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，ibd为约内氏病、贝赫切特综合征、胶原性结肠炎、改道性结肠炎、未定型结肠炎、显微镜结肠炎、感染性结肠炎、缺血性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、小肠和/或近侧小肠的特发性炎症、ibd-相关的腹泻和胃肠道的密切相关疾病和失调。在一些实施方案中，受试者处于缓解期。在一些实施方案中，受试者对用治疗剂、氨基水杨酸酯、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素或生物制剂中的至少一种治疗具有抗性。本发明的方法可用于治疗属于任何动物分类的受试者。可治疗的受试者的示例包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。本发明的gm-csf变体可用于制备用于此类治疗的药物，其中制备所述药物以按照本文定义的剂量施用。在一些实施方案中，将gm-csf变体作为诱导疗法施用。在一些实施方案中，将gm-csf变体作为维持疗法施用。有效治疗ibd的本发明gm-csf变体的“治疗有效量”可通过标准研究技术来确定。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。“治疗”或“诊疗”是指治疗剂治疗，其中治疗对象将减慢(减轻)非期望的生理改变或疾病，或者用于在治疗期间提供有益或期望的临床结果。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些受治疗者包括已经患有非期望的生理改变或疾病的那些受治疗者、以及倾向于患有生理改变或疾病的那些受治疗者。示例性有利临床结果是实现对ibd的缓解，这可通过胃肠道的临床和视觉检查来评估(例如通过内窥镜)。本发明的gm-csf变体也可施用于受试者以治疗、预防和/或诊断自身免疫性肺泡蛋白沉积症(apap)。apapa是一种罕见的肺病，其由表面活性蛋白的积聚产生。表面活性物质体内稳态通常以gm-csf依赖性方式由肺泡巨噬细胞维持(tazawa等人，(2014).chest，145(4)，729–737)。apap的原因已被归因于肺中高含量的gm-csf自身抗体，其限制了肺泡巨噬细胞功能。虽然全肺灌洗是apap的标准护理，但gm-csf的全身或吸入给药已展示出对pap患者的临床有益效果(seymour等人，(2001)americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine，163，524–531)。药物组合物和给药本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含本发明的gm-csf变体和药学上可接受的载体。就治疗性用途而言，可以药物组合物形式制备本发明的gm-csf变体，所述药物组合物包含有效量的抗体作为药学上可接受的载体中的活性成分。“载体”是指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的gm-csf变体的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15或20％改变，且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第21版，troy,d.b.编辑，lipincottwilliamsandwilkins,philadelphia,pa2006，第5部分，pharmaceuticalmanufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。用于本发明的gm-csf变体的治疗性用途的给药模式可以是将变体递送至宿主的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部，经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。本发明的gm-csf变体可通过任何合适的途径施用给受试者，例如通过静脉内(i.v.)输注或弹丸式注射以非胃肠道方式、以肌肉内方式或皮下方式或腹膜内方式。可在例如15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟或240分钟内，或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时内给予静脉内输注。向受试者给予的剂量足以缓解或至少部分地遏止正在治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且有时可为0.005mg/kg至约100mg/kg，例如约0.05mg/kg至约30mg/kg，或约5mg/kg至约25mg/kg，或约4mg/kg，约8mg/kg，约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg，但可甚至更高，例如约15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。也可以给予固定的单位剂量，例如50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500mg/m2、400mg/m2、300mg/m2、250mg/m2、200mg/m2或100mg/m2。通常可施用介于1和8次之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8次)的剂量来治疗患者，但可给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的剂量。可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本发明gm-csf变体。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。例如，本发明的gm-csf变体可通过静脉内输注以8mg/kg或以16mg/kg按一周的时间间隔施用8周，接着以8mg/kg或以16mg/kg按每两周一次的方式再施用16周，然后以8mg/kg或以16mg/kg按每四周一次的方式施用。例如，本发明的gm-csf变体可在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者另选地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或其任何组合，使用单次剂量或者每24、12、8、6、4或2小时一次的分次剂量或其任何组合，以约0.1-100mg/kg的量作为日剂量提供，诸如0.5mg/kg/天、0.9mg/kg/天、1.0mg/kg/天、1.1mg/kg/天、1.5mg/kg/天、2mg/kg/天、3mg/kg/天、4mg/kg/天、5mg/kg/天、6mg/kg/天、7mg/kg/天、8mg/kg/天、9mg/kg/天、10mg/kg/天、11mg/kg/天、12mg/kg/天、13mg/kg/天、14mg/kg/天、15mg/kg/天、16mg/kg/天、17mg/kg/天、18mg/kg/天、19mg/kg/天、20mg/kg/天、21mg/kg/天、22mg/kg/天、23mg/kg/天、24mg/kg/天、25mg/kg/天、26mg/kg/天、27mg/kg/天、28mg/kg/天、29mg/kg/天、30mg/kg/天、40mg/kg/天、45mg/kg/天、50mg/kg/天、60mg/kg/天、70mg/kg/天、80mg/kg/天、90mg/kg/天或100mg/kg/天。还可以预防性地施用本发明的gm-csf变体，以便降低罹患ibd的风险、延迟ibd进展中事件的发作和/或在ibd缓解后降低复发的风险。可将gm-csf变体冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中重构。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。口服给药本发明的gm-csf变体可配制用于口服给药。gm-csf变体在具有或不具有通常用于配制固体剂型诸如片剂和胶囊剂的那些载体的情况下进行配制。例如，胶囊可被设计成当使生物利用度最大化并且使首过降解最小化时，在胃肠道中的点处释放制剂的活性部分。可包含附加试剂以有利于gm-csf变体的吸收。还可使用稀释剂、风味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。用于口服给药的药物组合物也可以适用于口服给药的剂量，使用本领域熟知的药学上可接受的载体配制。此类载体使得药物组合物能够以片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等形式配制，以被患者摄取。用于口服使用的药物制剂可通过将活性化合物与固体赋形剂混合并加工所得的颗粒混合物(任选地在研磨之后)以获得片剂或糖衣丸核来获得。如果需要，可添加适宜助剂。适宜赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填料，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯、或其它植物的淀粉；纤维素，诸如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质，诸如明胶和胶原。如果需要，可添加崩解剂或增溶剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、和海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。糖衣丸核可与合适的包衣结合使用，所述包衣例如浓糖溶液，其还可包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或糖衣丸包衣中以用于产品鉴定或表征活性化合物的数量，即，剂量。可口服使用的药物制剂还包括由明胶制成的压配式胶囊，以及由明胶和包衣(诸如甘油或山梨醇)制成的软质密封胶囊。压配式胶囊可包含与填料或粘结剂(诸如乳糖或淀粉)、润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软质胶囊中，活性化合物可在具有或不具有稳定剂的情况下溶于或悬浮于合适的液体，诸如脂肪油、液体或液体聚乙二醇中。gm-csf变体药物组合物也可设置于肠溶性包衣中，所述肠溶性包衣被设计成以受控方式在受试者的下胃肠道系统中保护并释放药物组合物，并避免全身性副作用。除了肠溶性包衣之外，本发明的gm-csf变体还可封装、涂覆、接合或以其它方式缔合在任何相容的口服药物递送体系或组分中。例如，本发明的gm-csf变体可设置在脂质载体体系中，所述脂质载体体系包含下列中的至少一种：聚合物水凝胶、纳米粒子、微球、胶束和其它脂质体系。为克服小肠中的降解，本发明的gm-csf变体可包含于水凝胶聚合物载体中。本发明的gm-csf变体可进一步配制成与载体体系相容使用，所述载体体系被设计成增加溶解动力学并增强gm-csf变体的肠吸收。例如，可将gm-csf变体配制成脂质体、胶束和纳米粒子以增加gm-csf变体的胃肠道渗透。各种生物相容性体系也可与本发明的gm-csf变体混合以提供用于口服递送的药剂。在一些实施方案中，gm-csf变体与生物反应性体系组合使用，诸如水凝胶和具有氢键基团的粘膜粘附聚合物(例如，peg、聚(甲基丙烯酸)[pmaa]、纤维素、壳聚糖和藻酸盐)，以提供用于口服给药的治疗剂。本发明的gm-csf变体可与渗透增强剂组合施用，所述渗透增强剂通过增加细胞旁路渗透或跨细胞渗透来促进gm-csf变体的跨肠粘膜转运。示例性渗透增强子包括长链脂肪酸、胆汁盐、两亲性表面活性剂和螯合剂。联合治疗本发明还提供了一种治疗ibd的方法，所述包括向对其有需要的受试者施用本发明的gm-csf变体与第二治疗剂的联合。“与...联合”是指将本文所述的本发明gm-csf变体与第二治疗剂作为单一试剂同时或作为单一试剂以任何次序依次施用。一般来讲，每种药剂将按针对该药剂确定的剂量和/或时间计划表进行施用。第二治疗剂可以为ibd的任何已知治疗物，其包括已知可用于治疗ibd或已经用于或目前正用于治疗ibd的任何试剂或试剂的组合。此类治疗物和治疗剂包括氨基水杨酸酯、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素或生物制剂。氨基水杨酸酯有效治疗轻度至中度ibd病例，以及预防复发和维持缓解。其通常口服给药或直肠给药。柳氮磺胺吡啶(广泛用于ibd的第一氨基水杨酸酯)可有效实现和维持患有轻度至中度疾病的人的缓解。其向肠道递送5-氨基水杨酸(5-asa)，但在一些患者中出现令人不快的副作用，诸如头痛、恶心、食欲不振、呕吐、皮疹、发烧和白细胞计数减少。柳氮磺胺吡啶可在男子服用药物时，减少精子生产和功能。在极少数情况下，它与胰腺炎有关。认为头疼、恶心和皮疹是由于向肠道递送5-asa所必要的磺胺吡啶部分的释放。还合成了5-asa的其它衍生物。这些衍生物包括或(美沙拉嗪)、(奥沙拉秦)和colazaltm(巴柳氮)。局部美沙拉嗪制剂绕过胃以避免过早消化，并且然后靠近肠道的发炎部分释放。口服的延迟释放制剂诸如和(美沙拉嗪)可将5-asa分别直接释放到小肠和结肠中，或释放到回肠和/或结肠中。(美沙拉嗪的灌肠剂)允许将药物直接施用到左结肠。对80％的轻度至中度结肠炎患者有效，其仅影响结肠左侧。将药物从直肠直接递送直至乙状结肠的美沙拉嗪栓剂对大部分uc患者有效，其仅限于直肠和结肠下端。(奥沙拉嗪的口服、延迟释放制剂仅将5-asa直接递送至结肠)。作为速效抗炎和免疫抑剂，皮质类固醇已被用于治疗ibd的急性发作并超过50年。自那时起，这些强效药剂一直是疾病治疗的支柱。大多数患者注意到开始用皮质类固醇几天内症状的改善。该药物组可以口服、直肠、和静脉(iv)形式使用。皮质类固醇不有效预防突然发作，从而在ibd的维持疗法中很少使用。因为长期使用导致副作用，因此建议这些药剂仅用于短期使用以便实现缓解，但在后一种情况下它们不频繁使用。对于患有中度至重度活动性疾病的人而言，口服皮质类固醇包括(强的松)、(甲基泼尼松)和氢化可的松。氨基水杨酸酯通常与皮质类固醇一起服用。(布地奈德)(口服皮质类固醇)用于治疗轻度至中度克罗恩病，其涉及小肠末端和/或大肠的第一部分。这种非全身性类固醇靶向肠而不是全身。皮质类固醇也可作为灌肠剂(氢化可的松、甲基强的松、)、泡沫(乙酸氢化可的松、)和栓剂进行直肠给药。此类制剂用于轻度至中度溃疡性结肠炎，其限于直肠或结肠的下部。当与其它疗法联合使用时，这些药剂还有效抵抗在直肠处开始的更广泛的疾病。甲基强的松和氢化可的松通常通过静脉输注给予患有严重和广泛疾病的患者。在20-30％的病例中，急性ibd对皮质类固醇治疗不反应，在30-40％患有中度至重度疾病的病例中，皮质类固醇不能突然停药而不发生疾病突然发作。因为ibd看起来由过度活性的免疫系统引起，所以免疫调节剂在治疗该疾病方面起到重要作用。这些药物用于具有以下特征中一者的人：(a)利用皮质类固醇治疗具有副作用，(b)类固醇依赖性疾病，(c)对氨基水杨酸酯、抗生素或皮质类固醇不反应，(d)对抗生素不反应的会阴部疾病，以及(e)需要维持缓解。这些药物可与皮质类固醇联合以加速疾病活跃期间的反应。(硫唑嘌呤)、和(6-巯嘌呤，6-mp)是用于维持克罗恩病和uc的缓解的口服免疫调节剂。因为这些药剂起效缓慢，所以它们通常连同另一种速效药物(例如，皮质类固醇)一起给药。用于ibd的其它免疫调节剂为(环胞素a)和(他克莫司)。在这些药剂中，环胞素a起效最快。当以高剂量给予iv时，环胞素a可用于抵抗活动性克罗恩病。该药物有效抵抗严重uc，如他克莫司一样。后一药剂可在皮质类固醇无效或在形成瘘的情况下用于抵抗克罗恩病。他克莫司可局部施用以治疗口腔或会阴区的克罗恩病。对其它治疗不反应并且不能耐受其它免疫抑制剂的患有克罗恩病的人的选择是经静脉注射给药的或(甲氨蝶呤(mtx))。虽然尚未将特定致病因子鉴定为ibd的原因，但抗生素经常被用作主要治疗剂。抗生素在克罗恩病患者的长期治疗时是有效的，所述患者患有瘘(肠道的环之间或肠和相邻器官(例如皮肤)之间)或肛门附近的复发性脓肿。其活动性疾病用抗生素成功治疗的患者可以维持治疗形式继续这些治疗。通常，认为抗生素不可用于患有uc的那些患者；例外是毒性巨结肠。用于ibd的最常规定的广谱抗生素是(甲硝唑)和(环丙沙星)。甲硝唑是用于活动性克罗恩病的主要治疗物并已示出在回肠切除手术后前三个月减少克罗恩病的复发。在超过50％的病例中，该药物在管理会阴克罗恩病方面是有效的。比甲硝唑更安全的环丙沙星通常用于治疗活动性克罗恩病。口服和静脉注射的甲硝唑和环丙沙星均用于ibd治疗。生物制剂可通过其干扰ibd中的身体炎症反应的可能的靶包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素、粘附分子、菌落刺激因子等。由于其机制是靶向的，生物治疗物在ibd治疗中提供明显的优势。与趋于抑制整个免疫系统从而产生主要副作用的皮质类固醇不同，生物药剂可选择性地作用。生物制剂靶向特定的酶和蛋白质，这些酶和蛋白质已被证实在患有ibd的人中或结肠炎动物模型中是缺陷的、缺乏的或过量的。抗-tnf剂已用于克罗恩病和uc两者中，诸如(英夫利昔单抗)、(戈利木单抗)和(阿达木单抗)。尽管对于ibd具有上述药物选择，但66-75％的克罗恩病患者和25-40％的患有uc的那些患者最终将接受外科手术。克罗恩病的手术取决于疾病的位置。如果它在小肠中，则患病肠道区域可与正常肠道区域交替。活动性疾病的区域可能变窄，从而形成狭窄，这可阻断经消化食物通过。如果病灶是分离的，则通常使用狭窄整形术。在此，狭窄区域变宽，并且小肠得以保留。如果狭窄是长的，或者如果存在多个狭窄，则可能需要切除和吻合术。虽然切除可提供多年的缓解，但疾病可在吻合部位处或附近复发。在患有结肠的严重克罗恩病的患者中，可进行结肠切除术。如果直肠未受影响，则可将回肠的末端重新接合到直肠；因此，粪便可正常通过。如果涉及结肠和直肠两者，可进行直肠结肠切除术与随后的回肠造口术。约25％的克罗恩病患者最终形成瘘和/或脓肿。如果瘘对药物未反应，则通过切除受影响的肠将其移除，之后进行吻合术。脓肿必须排出；在一些情况下，这需要切除。多年来，uc的标准手术一直是用直肠结肠切除术与回肠造口术。现在最常见的手术是恢复性直肠结肠切除术；这使得患者继续通过肛门排便。与可在手术后复发的克罗恩病不同，一旦移除结肠，uc就“治愈”。试剂盒本发明的一个实施方案是一种包含本发明的gm-csf变体的试剂盒。试剂盒可用于治疗用途。在一些实施方案中，试剂盒包含本发明的gm-csf变体和用于检测gm-csf变体的试剂。试剂盒可包含一个或多个其它元件，包含：使用说明；其它试剂，例如，用于制备gm-csf变体以用于给药的设备或其它材料；药学上可接受的载体；以及向受试者施用的装置或其它材料。在一些实施方案中，试剂盒包含容器中的本发明的gm-csf变体。在一些实施方案中，试剂盒包含seqidno:2的gm-csf变体。在一些实施方案中，试剂盒包含seqidno:6的gm-csf变体。在一些实施方案中，试剂盒包含seqidno:7的gm-csf变体。在一些实施方案中，试剂盒包含seqidno:8的gm-csf变体。在一些实施方案中，试剂盒包含seqidno:9的gm-csf变体。本发明现在将用具体的、非限制性实施例进行描述。实施例1：材料和方法制备人gm-csf变体：合成制备编码各种his6标记的gm-csf变体的dna和表达载体，并用于瞬时转染expi293(hek细胞，thermoscientific)。通过固相金属亲和色谱从细胞上清液中纯化分泌的蛋白质，并且然后使用标准方法缓冲液更换到1xpbs中并用于进一步表征。所用的信号序列为mawvwtllflmaaaqsiqa(seqidno:19)。tf-1增殖测定将5×103个tf-1细胞(crl2003tm)/孔接种到96孔板(costar3603)中的测定培养基(rpmi1640-gibco，包含10％fbs-gibco的11875，16140，1％penstrep-gibco，10378)中。在测定培养基中制备人gm-csf变体以及可商购获得的重组蛋白(r&d体系：目录号215-gm/cf作为阳性对照)的系列稀释液，并将50μl/孔的gm-csf滴定剂加入细胞中。在5％co2气氛下，在潮湿培养箱中将细胞在37℃下温育72小时。通过根据制造商的方案添加promegacelltiter含水单溶液(20μl/孔)并在37℃下将细胞温育另外4小时来测量细胞增殖。将板在室温下摇动10分钟，并在读板器上读取490nm处的吸光度。使用graphpadprism6.02将原始od490nm值针对重组人gm-csf(rhgm-csf)的浓度作图，以确定e50值。通过差示扫描量热法(dsc)的热稳定性分析差示扫描量热法用于评估纯化的gm-csf变体的热稳定性。简而言之，在1xpbs中将纯化的蛋白质稀释至1mg/ml，并使用microcalvp-dsc仪以1℃/min的扫描速率从25–120℃加热。使用origin7(originlabcorporation)分析量热数据。将原始量热数据归一化为样品浓度，减去基线，并最终使用origin7软件拟合成非二态展开模型，以获得tm值(展开中点处的温度)和其它热力学参数。实施例2：gm-csf变体的设计设计gm-csf变体并随后对其改善的稳定性(加热时的构象稳定性)进行表征，同时保持和/或改善其诱导靶细胞增殖的能力。通过分析人gm-csf晶体结构，pdb编码2gmf来设计突变(rozwarski,diederichs,hecht,boone,&karplus,1996)。根据gm-csf：受体复合物，pdb编码3cxe的晶体结构，将突变位置选择成不干扰受体结合(hansen等人，2008)。另外，l49p和r23l置换的选择通过由来自五十种不同物种的成熟gm-csf多肽的一级氨基酸序列的比对产生的共有gm-csf序列支持。先前已经描述了用于工程化蛋白质中热稳定性的共识设计(m.lehmann,pasamontes,lassen,&wyss,2000；m.lehmann,kostrewa等人，2000；martinlehmann&wyss,2001)。图1示出了野生型gm-csf的晶体结构和考虑用于置换的残基的位置。表5示出了形成的置换和每个置换的原理。残基编号根据seqidno：1的成熟人gm-csf。制备具有单独置换以及它们的组合的gm-csf变体，并使用实施例1中所描述的方法表征它们的细胞效力和稳定性。seqidno:1aparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqeseqidno:18编码成熟wtgm-csf的cdnagcccccgcccgctccccctccccatcgacccaaccctgggaacacgtgaacgccattcaggaggctaggagactgctgaacctgtcccgggataccgcagccgagatgaacgaaaccgtggaggtcatctccgaaatgtttgacttgcaagaacctacttgtctgcaaactcgcctcgagctgtacaaacagggactccggggaagcctcactaagctgaaggggcctctgaccatgatggcctcccactacaagcagcactgcccgccgacgccggaaaccagctgcgcgacccagatcattaccttcgaatcgttcaaggaaaacctgaaggacttcctgcttgtgatcccgttcgactgctgggagcctgtgcaggagtaa表5：r23l变体已由hercus等人报道(hercus等人，1994)，其使原代cml细胞的gm-csf依赖性增殖的活性增加两倍。然而，置换与所得的改善的构象稳定性无关。包括k107i置换以通过与相邻残基l70和f103的疏水相互作用来稳定环ab。疏水性氨基酸的该组合l70/f103/i107在自然界中存在先例，其存在于大鼠gm-csf中。表6示出所生成的变体的氨基酸序列，并且表7示出编码所生成的gm-csf变体的cdna序列。表2示出了所生成的变体的氨基酸序列比对。表6：表7：表8示出对人gm-csf变体的热稳定性的概述，所述热稳定性使用实施例1中所描述的方法测量，并表示为解链温度tm，和与野生型gm-csf蛋白质相比时的tm迁移。当与野生型gm-csf蛋白质相比时，所有变体均表现出明显改善的热稳定性。由单独的置换来看，当与仅有l49p、k107i和r23l置换相比时，将s29c/s69c中的二硫桥引入野生型gm-csf中导致最增强的稳定性。以近似加成的方式组合引入变体进一步改善了所得变体的热稳定性。包含上述所有五个氨基酸置换的变体，s29c/s69c/r23l/l49p/k107i，具有比野生型蛋白质的tm值大28℃以上的tm值。表8：测试所得变体在tf-1细胞增殖测定中的效力。表9示出了每个变体的ec50值，其表示为两个单独测量值的平均值，以及与野生型gm-csf相比时的倍数变化。当与野生型gm-csf相比时，s29c/s69c展示出约2.6倍改善。单独的置换l49p和r23l具有效力的适度改善，然而k107i置换导致效力略降低的变体。一般来讲，gm-csf变体的细胞效力的增加与变体的构象稳定性相关，其中最稳定变体(s29c/s69c/r23l/l49p/k107i)在刺激tf-1细胞的增殖方面表现出最大增强(4倍)。表9：实施例3：gm-csf变体在空腹状态模拟肠液中是稳定的用于局部递送的口服给药的gm-csf可由患者依从性，以及通过最小化全身暴露的安全角度来证明是更理想的。然而，由于苛刻的ph、蛋白水解以及生物药物将暴露于其中的微生物环境，向下胃肠道口服递送蛋白质具有多种挑战性(amidon，brown,&dave，2015)。在补充有胰酶(3mg/ml；胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶和其它蛋白酶)的空腹状态模拟肠液(fassif)中测试所产生的gm-csf变体的稳定性，以便评估它们在与胃肠道部分相当的环境中的稳定性。fassif-v2(biorelevant；london，uk)根据制造商的说明书新鲜制备，并补充有来自猪胰腺的胰酶(sigma；st.louis，mo，usa)，最终浓度为3mg/ml。用fassif(包含胰酶)将在1xpbs中配制的gm-csf变体稀释至最终浓度为1mg/ml，并在37℃下温育0-30分钟。通过在95℃加热样品5分钟，之后冷冻来抑制消化。通过每个泳道加载10μg的gm-csf(基于预处理浓度)进行样品的sds-page分析。通过光密度测定法分析所得凝胶，以定量剩余的完整变体gm-csf的量，其表示为未处理对照的百分比。除了r23l变体之外(数据未示出)，所有经测试的变体在与野生型gm-csf相比时，均展示出随时间推移对蛋白水解降解的改善的稳定性。图3示出了在包含3mg/ml胰酶的fassif中，s29c/s69c、l49l、s29c/s69c/k107i和s29c/s69c/r23l/l49p/k107igm-csf变体随时间推移的稳定性。与在包含胰酶的fassif中在少于一分钟内完全降解的野生型gm-csf相比，超过一半的s29c/s69c/r23l/l49p/k107i变体蛋白在酶暴露30分钟后保持完整。实施例4：选择gm-csf变体的免疫原性风险的计算机评估对两种gm-csf变体进行计算机分析以确定是否可预测氨基酸置换(相对于野生型gm-csf)中的任一种增加任何9-mer肽对ii类mhc分子的结合亲和力，从而使用immunofiltertm技术预测t细胞表位。在测试的变体(s29c/s69c/r23l/l49p/k107i和s29c/s69c/l49p/k107i变体)中未鉴定出主要的潜在免疫原性责任。l49p氨基酸置换看起来降低了免疫原性风险。具有l49p置换的一个9-mer与hla-dr1、hla-dr3、hla-dr4和hla-dr5的预测结合分数从24-32％降低至4-8％。实施例5：gm-csf变体在空腹状态模拟肠液(fassif)中保留其功能活性在暴露于补充有胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶、核糖核酸酶和其它蛋白酶(由猪胰腺蛋白酶和核糖核酸酶的外分泌细胞产生)的fassif后，评估gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i在不同时间段下的生物活性，如下文和图4a、图4b、图4c和图4d所示。在暴露于模拟胃肠道的蛋白水解环境的30分钟(图4a)、1小时(图4b)和4小时(图4c)时，两种变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i均完全或部分地保留其活性，然而在暴露30分钟后，野生型gm-csf完全失活(图4a)。即使在暴露于蛋白水解环境6小时后，变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i也保留其大部分生物活性(图4d)。即使在非蛋白水解环境中(在不存在fassif的情况下温育)，当与野生型gm-csf相比时，两种变体在诱导stat5磷酸化方面也更有效。方法将人gm-csf的变体在模拟肠液中(由fassif-v2粉末制备；biorelevant；london，uk)稀释至1mg/ml的最终浓度，所述模拟肠液补充有猪胰酶(sigma；st.louis，mo)，最终浓度为3mg/ml。将人gm-csf的变体在该溶液中在37℃下温育0.5-6小时。通过添加完全蛋白酶抑制剂(roche)至10x来阻止蛋白水解消化。将经模拟肠液处理的gm-csf样本在rpmi1640无血清培养基(gibco)中连续稀释两倍，并施用于tf-1细胞(atcc；1e5细胞/孔)，所述细胞已经在37℃，5％co2下血清饥饿2小时。将经处理的tf-1细胞在37℃下温育15分钟。通过离心收集tf-1细胞，并用包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的tris裂解缓冲液(mesoscalediscovery)进行裂解。通过免疫测定(mesoscalediscovery)来确定stat5(tyr694)相对于总stat5a,b的磷酸化。根据gm-csf浓度，对stat5蛋白的磷酸化(相对于总stat5a,b的％)作图。实施例6：gm-csf变体在暴露于结肠内容物时保持其功能活性在暴露于来自食蟹猴的结肠内容物之后，在不同时间段下，评估gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性。图5a示出在与食蟹猴的结肠内容物一起温育30分钟之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性完全保留，然而野生型gm-csf的生物活性几乎完全消除。图5b示出在与食蟹猴的结肠内容物一起温育2小时之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i和s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留。在暴露于结肠内容物两小时后，gm-csf的r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体仅表现出两倍活性损失，并且仍然具有比不暴露于结肠内容物的野生型gm-csf大两倍的效力。与未处理的细胞因子相比，gm-csf的s29c/l49p/s69c/k107i变体示出6倍活性损失。图5c示出在与食蟹猴的结肠内容物一起温育6小时之后，gm-csf变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性保留。与未处理的变体细胞因子相比，gm-csf的r23l/s29c/l49p/s69c/k107i变体表现出5倍活性损失，然而野生型gm-csf的活性完全消除。图5d示出在与食蟹猴的结肠内容物一起温育24小时之后，gm-csf及其变体s29c/l49p/s69c/k107i和r23l/s29c/l49p/s69c/k107i的生物活性消除。表10示出变体的功能性测定中的ec50值。表10：材料和方法人gm-csf的变体在1x磷酸盐缓冲盐水中或在来自食蟹猴的结肠内容物中(bioreclamationivt；longisland，ny)稀释至1mg/ml的最终浓度，其被归一化为在1x磷酸盐缓冲盐水中3mg/ml的最终蛋白质浓度。将人gm-csf的变体在该溶液中在37℃下温育0.5-24小时。在指示的温育时间段之后，将包含gm-csf的样品在rpmi1640无血清培养基(gibco)中连续稀释两倍，并施用于tf-1细胞(atcc；1e5细胞/孔)，所述细胞已经在37℃，5％co2下血清饥饿2小时。将经处理的tf-1细胞在37℃下温育15分钟。通过离心收集tf-1细胞并用tri裂解缓冲液(mesoscalediscovery；rockville，maryland)裂解，所述tri裂解缓冲液包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(rochelifesciences)。通过免疫测定(mesoscalediscovery)来确定stat5(tyr694)相对于总stat5a,b的磷酸化。根据gm-csf浓度，对stat5的磷酸化(相对于总stat5a,b的％)作图。在实验中，野生型gm-csf和s29c/l49p/s69c/k107i变体在c-末端具有6x-his标签，其通过gs接头与gm-csf偶联。实施例7：gm-csf变体在不同犬模拟小肠液(ssif)中保留其功能活性在暴露于补充有胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶、核糖核酸以及其它蛋白酶(由猪胰腺蛋白酶和核糖核酸酶的外分泌细胞产生)的ssif两小时之后，评估野生型人gm-csf和gm-csf变体vr23l/s29c/l49p/s69c/k107i刺激tf-1细胞中的stat5磷酸化的能力，如表11中所示。在暴露于犬ssif的四种制剂中的任一种两小时之后，his标记的野生型人gm-csf的功能活性完全消失。当ssif在ph7下制备并补充有1mg/ml胰酶时(这等同于每微升200usp单位的蛋白酶活性)，在两小时暴露之后，变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i保持完全刺激活性。当在相同的时间框内在ph7.0下，暴露于十倍以上的胰酶(10mg/ml；2,000usp单位/ml)时，r23l/s29c/l49p/s69c/k107igm-csf表现出相对于未暴露于ssif的变体gm-csf，24倍效力损失。当模拟液在ph5.5下制备并补充有1mg/ml胰酶时(这等同于每微升200usp单位的蛋白酶活性)，在暴露于犬ssif两小时之后，变体r23l/s29c/l49p/s69c/k107i表现出5倍功能活性损失。当在ph5.5下，暴露于十倍以上的胰酶(10mg/ml；2,000usp单位/ml)时，r23l/s29c/l49p/s69c/k107igm-csf表现出相对于未预处理样品，47倍效力损失。即使在不存在用犬ssif预处理的情况下，在诱导tf-1细胞的stat5磷酸化时，r23l/s29c/l49p/s69c/k107igm-csf的效力也是野生型gm-csf的两倍半以上。表11：方法将人gm-csf的变体在模拟肠液中(由狗fassif/狗fassgf粉末制备，最终ph为5.5或7；biorelevant；london，uk)稀释至1mg/ml的最终浓度，所述模拟肠液补充有猪胰酶(sigma目录号p7545；st.louis，mo)，最终浓度为1或10mg/ml。将人gm-csf的变体在该溶液中在37℃下温育2小时。通过添加完全蛋白酶抑制剂(roche)至10x来阻止蛋白水解消化。将经模拟肠液处理的gm-csf样本在rpmi1640无血清培养基(gibco)中连续稀释两倍，并施用于tf-1细胞(atcc；1e5细胞/孔)，所述细胞已经在37℃，5％co2下血清饥饿2小时。将经处理的tf-1细胞在37℃下温育15分钟。通过离心收集tf-1细胞，并用包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的tris裂解缓冲液(mesoscalediscovery)进行裂解。通过免疫测定(mesoscalediscovery)来确定stat5(tyr694)相对于总stat5a,b的磷酸化。根据gm-csf浓度，对stat5蛋白的磷酸化(相对于总stat5a,b的％)作图。在prism7(graphpad)中进行曲线拟合以获得ec50值。参考文献：akasako,a.,haruki,m.,oobatake,m.,&kanaya,s.(1995).highresistanceofescherichiacoliribonucleasehivariantwithquintuplethermostabilizingmutationstothermaldenaturation,aciddenaturation,andproteolyticdegradation.biochemistry,34,8115–8122.http://doi.org/10.1021/bi00025a018amidon,s.,brown,j.e.,&dave,v.s.(2015).colon-targetedoraldrugdeliverysystems:designtrendsandapproaches.aapspharmscitech,16(4),731–41.http://doi.org/10.1208/s12249-015-0350-9bernstein,c.n.,blanchard,j.f.,houston,d.s.,&wajda,a.(2001).theincidenceofdeepvenousthrombosisandpulmonaryembolismamongpatientswithinflammatoryboweldisease:apopulation-basedcohortstudy.thrombosisandhaemostasis,85(204),430–4.bernstein,c.n.,wajda,a.,&blanchard,j.f.(2008).theincidenceofarterialthromboembolicdiseasesininflammatoryboweldisease:apopulation-basedstudy.clinicalgastroenterologyandhepatology,6(1),41–45.http://doi.org/10.1016/j.cgh.2007.09.016j.(2014).granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactorandtheintestinalinnateimmunecellhomeostasisincrohn’sdisease.americanjournalofphysiology.gastrointestinalandliverphysiology,306(6),g455–65.http://doi.org/10.1152/ajpgi.00409.2013daniel,r.m.,cowan,d.a,morgan,h.w.,&curran,m.p.(1982).acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis.thebiochemicaljournal,207(3),641–644.dieckgraefe,b.,&korzenik,j.(2002).treatmentofactivecrohn’sdiseasewithrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor.thelancet,360,1478–1480.检索自：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0140673602114371genzyme.(2014)(sargramostim)prescribinginformationrxonly.hansen,g.,hercus,t.r.,mcclure,b.j.,stomski,f.c.,dottore,m.,powell,j.,…parker,m.w.(2008).thestructureofthegm-csfreceptorcomplexrevealsadistinctmodeofcytokinereceptoractivation.cell,134(3),496–507.http://doi.org/10.1016/j.cell.2008.05.053hercus,b.t.r.,cambareri,b.,dottore,m.,woodcock,j.,bagley,c.j.,vadas,m.a.,…lopez,a.f.(1994).identificationofresiduesinthefirstandfourthhelicesofhumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorinvolvedinbiologicactivityandinbindingtothealpha-andbeta-chainsofitsreceptor.blood,83(12),3500–3508.jensen-pippo,k.e.,whitcomb,k.l.,deprince,r.b.,ralph,l.,&habberfield,a.d.(1996).enteralbioavailabilityofhumangranulocytecolonystimulatingfactorconjugatedwithpoly(ethyleneglycol).pharmaceuticalresearch,13(1),102–7.检索自：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8668656kelsen,j.r.,rosh,j.,heyman,m.,winter,h.s.,ferry,g.,cohen,s.,…baldassano,r.n.(2010).phaseitrialofsargramostiminpediatriccrohn’sdisease.inflammatoryboweldiseases,16(7),1203–8.http://doi.org/10.1002/ibd.21204korzenik,j.(2005).sargramostimforactivecrohn’sdisease.…englandjournalof…,352(21),2193–2201.检索自：http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejmoa041109korzenik,j.,&dieckgraefe,b.(2000).iscrohn’sdiseaseanimmunodeficiency？digestivediseasesandsciences,45(6),1121–1129.检索自：http://link.springer.com/article/10.1023/a:1005541700805lehmann,m.,kostrewa,d.,wyss,m.,brugger,r.,d’arcy,a.,pasamontes,l.,&vanloon,a.p.g.m.(2000).fromdnasequencetoimprovedfunctionality:usingproteinsequencecomparisonstorapidlydesignathermostableconsensusphytase.proteinengineeringdesignandselection,13(1),49–57.http://doi.org/10.1093/protein/13.1.49lehmann,m.,pasamontes,l.,lassen,s.f.,&wyss,m.(2000).theconsensusconceptforthermostabilityengineeringofproteins.biochimicaetbiophysicaacta-proteinstructureandmolecularenzymology,1543(2),408–415.http://doi.org/10.1016/s0167-4838(00)00238-7lehmann,m.,&wyss,m.(2001).engineeringproteinsforthermostability:theuseofsequencealignmentsversusrationaldesignanddirectedevolution.currentopinioninbiotechnology,12(4),371–375.http://doi.org/10.1016/s0958-1669(00)00229-9mclendon,g.,&radany,e.(1978).isproteinturnoverthermodynamicallycontrolled？journalofbiologicalchemistry,253(18),6335–6337.mortha,a.,chudnovskiy,a.,hashimoto,d.,bogunovic,m.,spencer,s.p.,belkaid,y.,&merad,m.(2014).microbiota-dependentcrosstalkbetweenmacrophagesandilc3promotesintestinalhomeostasis.science(newyork,n.y.),343,1249288–11249288–7.http://doi.org/10.1126/science.1249288parsell,d.a.,&sauer,r.t.(1989).thestructuralstabilityofaproteinisanimportantdeterminantofitsproteolyticsusceptibilityinescherichiacoli.journalofbiologicalchemistry,264(13),7590–7595.roth,l.,macdonald,j.k.,mcdonald,j.w.d.,&chande,n.(2012).sargramostim(gm-csf)forinductionofremissionincrohn’sdisease:acochraneinflammatoryboweldiseaseandfunctionalboweldisorderssystematicreviewofrandomizedtrials.inflammatoryboweldiseases,18(7),1333–9.http://doi.org/10.1002/ibd.22973rozwarski,d.a,diederichs,k.,hecht,r.,boone,t.,&karplus,p.a.(1996).refinedcrystalstructureandmutagenesisofhumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor.proteins,26(3),304–13.http://doi.org/10.1002/(sici)1097-0134(199611)26:3<304::aid-prot6>3.0.co；2-dvalentine,j.f.,fedorak,r.n.,feagan,b.,fredlund,p.,schmitt,r.,ni,p.,&humphries,t.j.(2009).steroid-sparingpropertiesofsargramostiminpatientswithcorticosteroid-dependentcrohn’sdisease:arandomised,double-blind,placebo-controlled,phase2study.gut,58(10),1354–1362.http://doi.org/10.1136/gut.2008.165738vaughan,d.,&drumm,b.(1999).treatmentoffistulaswithgranulocytecolony-stimulatingfactorinapatientwithcrohn’sdisease.newenglandjournalofmedicine,340(3),234–241.检索自：http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejm199901213400317当前第1页12当前第1页12