包含两亲化合物、新抗原和疏水载体的疫苗组合物及其使用方法与流程
本申请涉及包含两亲化合物、新抗原(neoantigen)和疏水载体的疫苗组合物以及在癌症治疗中使用这种组合物的方法。
背景技术：
在免疫疗法——并且具体地癌症免疫疗法——中，产生足够有效的免疫应答是主要障碍。对癌症疫苗抗原的免疫应答经常受到免疫耐受机制的阻碍，其作为免疫逃避的机制起源于肿瘤内(kim2007)。而且，高度纯化和合成的抗原，如肽，经常具有不良的免疫原性，并因此需要免疫刺激剂诸如佐剂来促进强健的免疫应答(irvine2013)。
新抗原正作为促进个性化癌症医学的非常强力的选择而出现，因为其对实现提供真正个性化的免疫疗法的癌症治疗具有巨大潜力；然而，仍需要适合的递送平台(mullard2016)。
新抗原是肿瘤体细胞dna中的突变的结果，并因此代表个性化疗法的形式。与在多个个体的肿瘤中选择性表达或过表达(但仍可在正常细胞中表达)的共有肿瘤抗原形成对比，新抗原含有肿瘤特异性和/或患者特异性突变并具有这样的潜力：独特标记肿瘤从而摧毁，同时避免自身耐受。
由于这些和其它突变或修饰，新抗原含有对于每一个患者来说都是独特的预测表位(b细胞和t细胞)。新抗原及其中包含的新表位在作为疫苗被注射时可具有或可不具有免疫原性，因此选择适当的免疫制剂对于确保最优免疫原性是关键的。另外，由于每一个肽池对每一个患者都是独特的，因此在合理的时间框架内识别并且然后将新抗原和/或新表位配制成适当的疫苗制剂的过程关于其最终用于患者疗法是重大的考虑。每一个肽池将含有具有可能需要优化的不同性质的不同肽，特别是在疫苗制剂不足以操纵(处理，handle)弱免疫原性抗原的情况。
对于开发最优疫苗组合物用于针对新抗原诱导强的体液和/或细胞介导的免疫应答仍然存在需求。在本公开中，我们描述了用于增强针对新抗原——包括具有弱免疫原性的新抗原——的免疫原性的新型疫苗组合物。
发明概述
在一个实施方式中，本发明涉及包含(a)两亲化合物；(b)新抗原；和(c)疏水载体的疫苗组合物。
在另一实施方式中，本文所述的疫苗组合物不含水或基本上不含水。
在另一实施方式中，本发明涉及疫苗组合物，其包含(a)1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-二油酰基卵磷脂，1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(dopc)和胆固醇的脂质分子混合物；(b)新抗原；(c)疏水载体
在另一实施方式中，本发明涉及包括向需要其的受试者施用本文所述的疫苗组合物的方法。在该实施方式的一个方面，方法用于在受试者中诱导针对新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。在该实施方式的另一个方面，方法用于治疗和/或预防癌症。
在另一实施方式中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用干扰dna复制的剂，诸如例如环磷酰胺。
在另一实施方式中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用免疫应答检查点抑制剂(免疫应答限制点抑制剂，immuneresponsecheckpointinhibitor)，诸如例如以下的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡1(pd-1)、ctla-4、pd-l2、lag3、tim3、41bb、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、可诱导的t细胞共刺激(icos)、kir、lair1、light、具有胶原结构的巨噬细胞受体(marco)、磷脂酰丝氨酸(ps)、ox-40、slam、tigit、vista、vtcn1、或其任意组合。
在另一实施方式中，本发明涉及本文所述的用于在受试者中诱导针对所述新抗原的抗体免疫应答的组合物的用途。
在另一实施方式中，本发明涉及本文所述的用于在受试者中诱导针对所述新抗原的细胞介导的免疫应答的组合物的用途。
在另一实施方式中，本发明涉及本文所述的用于治疗和/或预防癌症的组合物的用途。
在另一实施方式中，本发明涉及试剂盒，其包括：包含两亲化合物和新抗原的第一容器；和包含疏水载体的第二容器。
附图简述
在仅通过实例的方式示例本发明的实施方式的附图中：
图1示例了接种有在油基制剂或水性制剂中制备的mut30抗原的c57bl/6vaf/
图2示例了接种有在油基制剂中以不同剂量制备的mut30新抗原的c57bl/6vaf/
图3示例了接种有在油基制剂或水性缓冲制剂中用基于rna或dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)分子制备的mut30新抗原的c57bl/6ncrl小鼠的ifn-γelispot应答。在通过在ifn-γelispot板中用未装载或装载有无关肽或mut30新抗原的同源树突细胞刺激脾细胞进行接种之后八天测量免疫应答。通过用邦弗朗尼事后检验法双因素anova进行统计分析，比较针对mut30肽的群组应答，*p<0.05，***p<0.001。
发明详述
在发现针对不断突变的癌细胞和表位的有效治疗中的关键阻碍之一是不能够快速识别新抗原(或其突变表位)、将其合成为肽和以适合的制剂制造这些肽从而作为个性化疫苗递送给患者。理想地，对于个性化用药，该整个过程可能在约6至8周内完成。
一些障碍包括，例如，(i)缺乏快速识别新抗原和/或其新表位的技术，(ii)识别能够以用于小至一名患者的生产规模(例如用于个性化用药)的快速且有成本效益的方式生产的疫苗组合物，(iii)识别产生针对新抗原的足够强且特异性免疫应答的适合的疫苗组合物(例如递送平台)，优选地在单一施用之后并且用低剂量的新抗原从而避免交叉反应，(iv)疫苗组合物有效递送长肽抗原(例如，长度大于25个氨基酸)的能力，(v)识别适于针对多个肽新抗原产生靶向横跨宽范围表位的多个表位的免疫应答(例如ctl免疫应答)的疫苗组合物，以及(vi)疫苗组合物诱导针对新抗原或新表位的有效力的免疫应答的能力，所述新抗原或新表位未关于其已证实能够具有强力免疫原性而被选择并且易于具有弱免疫原性。
鉴于这些障碍，具有提高新抗原的免疫原性的能力的疫苗组合物的重要性显著大于传统疫苗表位选择。而且，期望疫苗组合物能够在使用肽新抗原的同时诱导针对多个表位的有效免疫应答。还期望疫苗组合物能够在仅单一施用后诱导针对低剂量新抗原的免疫应答，目的在于在受试者中避免针对野生型肽的交叉反应。
本申请中描述了能够诱导有效力的免疫应答——甚至关于弱免疫原性新抗原——的疫苗组合物。而且，本文公开的疫苗组合物应当是相容的并且具有符合成本效益(amenabletocosteffective)的可扩展(scalable)制造能力。
与同等(相当的，equivalent)水基制剂相比，本发明的包含两亲化合物；新抗原；和疏水载体的油基组合物令人惊奇地能够在单一施用后产生针对新抗原肽的统计学显著的增强的免疫应答。
作为示例性新抗原，我们使用了由castle2012识别的mut30新抗原。castle2012旨在使用水基组合物使mut30新抗原能够在小鼠中产生强的突变特异性免疫应答。然而，castle2012未研究仅以单一施用低剂量施用mut30，其可能表现成功的新抗原疫苗的重要特征，尤其是关于弱免疫原性新抗原——其中高剂量或重复施用可能导致与自身肽的交叉反应。
如本文所示，我们不能用包含mut30新抗原的水基制剂在单一施用后产生强的免疫应答。相比之下，当mut30新抗原被配制在本发明的油基组合物中时，免疫应答显著增强。图1和3中显示了这些结果。本发明的油基组合物能够在单一施用后产生针对27个氨基酸的mut30新抗原肽的细胞介导的免疫应答，免疫应答水平始终是比使用水基制剂大至少约3倍的水平。考虑到新抗原经常是弱免疫原性肽，这是令人惊奇的结果。
而且，本发明的油基制剂能够用显著较低剂量的新抗原产生这些增强的免疫应答。如图2中所示，本发明的油基组合物能够分别在高剂量和低剂量——100微克和50微克——产生针对mut30新抗原的相当的免疫应答。考虑到新抗原与自身肽(例如单一氨基酸突变)之间的相似性，减少递送的新抗原的量同时仍提供有效的免疫应答的能力表示本发明的重要优势。
从本文所述的实例中明确的是，本发明的组合物能够在单一施用后以低剂量诱导针对新抗原的不寻常的强免疫应答。
疫苗组合物
在一个实施方式中，本公开涉及包含两亲化合物、新抗原和疏水载体的疫苗组合物。这些组分中的每一种的更多细节单独描述在本文中。在一个实施方式中，本文所述的疫苗组合物不含水或基本上不含水。
如本文使用的，术语“疫苗”、“疫苗组合物”或“组合物”可根据上下文的需要而交换使用。
本文公开的疫苗组合物可以以治疗有效量施用给受试者。如本文使用的，“治疗有效量”意为在受试者中有效刺激、诱导、维持、促进(boost)或增强免疫应答的疫苗或活性成分(例如，一种或多种新抗原)的量。在一些实施方式中，疫苗的治疗有效量是能够在具体疾病或病症治疗中在受试者中诱导临床应答的量。疫苗的治疗有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力之内，尤其根据本文提供的公开内容。治疗有效量可根据多种因素诸如受试者的情况、体重、性别和年龄而变化。
新抗原
本文公开的疫苗组合物包含一种或多种新抗原。
如本文使用的，术语“新抗原”指代源于所表达蛋白质中肿瘤特异性突变的一类肿瘤抗原。新抗原可源自任意癌症、肿瘤或其细胞。术语包括新抗原肽和编码新抗原肽的多核苷酸。因此，尽管术语“新抗原肽”特指代肽新抗原，但是术语“新抗原”更宽泛地包括编码新抗原肽的多核苷酸。
如本文使用的，术语“源自”不限制地包括：直接从起始来源(例如受试者)分离或获得的新抗原；与来自起始来源的新抗原在序列上相同的合成的或重组产生的新抗原；或由起始来源的新抗原或其片段制成的新抗原。
所表达蛋白质中的、产生新抗原的突变可以是患者特异性的。以“患者特异性”为例，其意为对于个体受试者来说是独特的突变(一个或多个)。然而，多于一个受试者将共有相同突变(一个或多个)是可能的。因此，“患者特异性”突变可由小的或大的受试者亚群共有。
在某些实施方式中，新抗原肽的尺寸可以是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或更多个氨基酸残基，以及可在其中得出的任意范围。在一些实施方式中，新抗原肽的长度大于25个氨基酸。在一些实施方式中，新抗原肽的长度是5至50个氨基酸。在一些实施方式中，新抗原肽的长度是27个氨基酸。
新抗原肽可包含一个或多个新表位。如本文使用的，术语“表位”指代能够被免疫系统，特别是被抗体、b细胞或t细胞识别的肽序列。“新表位”是相比于天然氨基酸序列，包含肿瘤特异性突变的新抗原肽的表位。总体上，新表位可通过筛选关于具有结合患者hla的潜力的锚定残基的新抗原来识别。通常使用能够预测结合hla的肽的算法诸如netmhc来排名(ranked)新表位。
“t细胞新表位”将理解为这样的含义：可由以肽呈递mhc分子或mhc复合物形式的i类或ii类mhc分子结合的突变的肽序列。t细胞新表位一般应该是适于(amenableto)由t细胞受体识别以便细胞介导的免疫应答能够发生的t细胞新表位。由mhci类分子呈递的t细胞表位一般是长度在8与15个氨基酸之间的肽，并且更经常地长度在9与11个氨基酸之间。由mhcii类分子呈递的t细胞表位一般是长度在5与24个氨基酸之间的肽，并且更经常地长度在13与17个氨基酸之间。如果新抗原比这些尺寸大，免疫系统会将其加工成更适于与mhci类或ii类分子相互作用的尺寸的片段。因此，t细胞新表位可以是比上述肽更大的肽的部分。
“b细胞新表位”将理解为这样的含义：可由b细胞和/或由抗体识别的突变的肽序列。b细胞表位的长度一般是至少五个氨基酸，更经常地至少六个氨基酸，还更经常地至少七个或八个氨基酸，并且可以是连续的(“线性的”)或不连续的(“构象的”)；后者通过例如将蛋白质折叠以将初级氨基酸序列的非连续部分变成物理邻近(物理接近，physicalproximity)而形成。线性b细胞表位的长度一般在5至20个氨基酸之间变化。
在一些实施方式中，新抗原肽的新表位中至少一个是患者特异性新表位。如本文使用的，以“患者特异性新表位”为例，其意为新表位中对于个体受试者来说是独特的突变(一个或多个)。然而，多于一名受试者将共有相同的突变(一个或多个)是可能的。因此，“患者特异性新表位”可由小的或大的受试者亚群共有。
在一个实施方式中，疫苗组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、或任意更多数目的不同新抗原。在一些实施方式中，疫苗组合物包含一种、两种、三种、四种、或五种不同的新抗原。以“不同的新抗原”为例，其宽泛地意为新抗原不共有完全相同的序列。新抗原肽可来自不同的蛋白质、不同的肿瘤特异性抗原，包括重叠但不相同的肿瘤特异性抗原、或相同抗原的不同突变。在一个实施方式中，每一种不同的新抗原包含来自相同患者的至少一个患者特异性新表位。
在一个实施方式中，疫苗组合物仅包含一种新抗原(即单一新抗原序列)。疫苗组合物可含有该相同新抗原的多个拷贝。
从上文显而易见的是，新抗原肽可包含对于个体来说是独特的多组肽。这些肽可具有不同的溶解性质——其会使它们难以配制在常规类型的疫苗制剂中，如水性缓冲液或乳化剂类制剂。另外，这些肽所来源的宿主中可存在对这些肽的已有耐受。这些方面等可引起新抗原肽具有弱免疫原性。因此，以能够产生如本文公开的强健免疫应答的疫苗制剂将其递送是重要的。
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物包含具有弱免疫原性的新抗原。出于多种原因，如其序列缺乏异质性；尺寸小；欠缺用于被免疫系统识别的外来性；对抗原加工和呈递的易感性减少、降解性或不溶性增加、和新抗原加工和呈递受限——由于其只通过肿瘤细胞表达，新抗原可以具有弱免疫原性。总体上，新抗原比常规(regular)抗原更易受到这些因素的影响。
如本文使用的，以“弱免疫原性”为例，其意为在常规疫苗(例如水性疫苗、乳剂等)中，新抗原几乎不能或不能诱导、维持和/或促进(boost)新抗原特异性免疫应答。在一个实施方式中，弱免疫原性新抗原是在单一施用新抗原后几乎不能或不能诱导、维持和/或促进新抗原特异性免疫应答的免疫原性新抗原。
例如，在一个实施方式中，弱免疫原性新抗原是当被配制在水性疫苗中时不能充分诱导免疫应答的抗原。在更具体的实施方式中，弱免疫原性新抗原是当被配制在水性疫苗中时在单一施用后疫苗组合物后不能充分诱导免疫应答的抗原。这些实施方式与当相同的新抗原以本文公开的相当的疫苗组成(即具有相同组分，除了用两亲化合物在疏水载体中配制之外)配制时相反，由此新抗原现能够充分诱导免疫应答。在上文中，“充分诱导免疫应答”意为新抗原能够诱导免疫应答达到其可例如在癌症治疗中提供治疗效果的程度。
在一个实施方式中，弱免疫原性新抗原是这样的抗原：其在以水性疫苗暴露于受试者时，不诱导免疫应答或诱导的免疫应答与本文所述的疫苗组合物暴露于受试者时所诱导的免疫应答相比效力低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在一个实施方式中，在单一施用新抗原后测量免疫应答。免疫应答可通过例如酶联免疫斑点测定法(elispot)测量。
在一个实施方式中，弱免疫原性新抗原是当以水性疫苗施用时不能提供给受试者可测量的治疗益处的免疫原性新抗原；然而可测量的治疗益处可在新抗原以本文公开的组合物施用时而实现。在一个实施方式中，可测量的治疗益处可以是，例如肿瘤尺寸减小或癌症存活预后增加。在一个实施方式中，可测量的治疗益处是肿瘤尺寸减少至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一个实施方式中，可测量的治疗益处可以是在仅单一施用后用本发明的疫苗可检测的。
在一个实施方式中，弱免疫原性新抗原是这样的抗原：当以高剂量以水性疫苗施用时产生的免疫应答的效力比当以低剂量以本发明的组合物施用时低。在一个实施方式中，高剂量(如小鼠中测量的)是至少100微克、200微克、300微克、400微克、500微克或更多。在一个实施方式中，低剂量(如小鼠中测量的)是约10微克、20微克、30微克、40微克、50微克、60微克或75微克或更少。技术人员将容易理解人类中的相当或适当剂量。在一个实施方式中，低剂量是高剂量的约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％或约25％。在一个实施方式中，在单一施用新抗原后测量免疫应答。
不限制地，弱免疫原性新抗原可包括例如源自癌症相关抗原的纯化的和合成的肽新抗原。
假定弱抗原性是为什么免疫系统一般不能控制肿瘤生长的根本原因。多种癌症抗原刺激弱的，并因此缓慢的免疫应答，其提供给肿瘤细胞发展免疫逃避机制的机会和时间，从而最终占优势。在一些实施方式中，新抗原也可展现出这种弱抗原性。
出于这些原因等，弱免疫原性新抗原可代表用于本文公开的组合物和方法中的尤其合适的类型的新抗原。在实施方式中，本文公开的疫苗组合物包含具有弱免疫原性的肿瘤特异性新抗原。
用于实践本发明的新抗原肽可以是从天然来源分离的、是合成的、或是重组产生的多肽。新抗原肽可在体外或体内重组表达。可利用本领域已知的任何方法制备和分离用于实践本发明的新抗原肽。还可以利用本领域熟知的化学方法整体地或部分地合成用于实践本发明的新抗原肽。参见例如，caruthers1980；horn1980；和banga1995。例如，可利用各种固相技术进行肽合成(参见例如，roberge1995；merrifield1997)；以及可利用例如abi431肽合成仪(perkinelmer)根据生产商提供的说明书来实现自动合成。
在一个实施方式中，新抗原可利用选择算法诸如netmhc——其寻找预测结合mhci类和/或mhcii类蛋白质的基序(参见例如实施例1)——从癌症的突变体细胞蛋白质中选择。
在一个实施方式中，新抗原可源自先前与癌症表型相关的突变基因或蛋白质，诸如例如肿瘤抑制基因(例如p53)；dna修复途径蛋白质(例如brca2)和癌基因。例如在castle2012中描述了经常含有引起癌症表型的突变的基因的示例性实施方式。技术人员将非常了解与癌症相关的其它突变基因和/或蛋白质，并且这些可从其它文献资源中获取。
在一些实施方式中，新抗原可包含或由castle2012公开的新抗原组成。castle2012未提供新抗原的实际序列，而提供了基因id和突变肽的位置，实际序列可从该位置被识别——利用例如可从美国国家生物技术信息中心(ncbi)在线获取的pubmed数据库。
在一个实施方式中，新抗原可以是castle2012的表1中公开的一种或多种mut1-50新抗原，或是相同或相关蛋白质(例如人同系物)的新抗原。在具体实施方式中，新抗原可以是具有氨基酸序列pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl(seqidno：2)的mut30，或是相同或相关蛋白质的新抗原(例如,人同系物)。mut30表示从b16f10鼠黑素瘤细胞中的体细胞点突变识别的kif18b基因的新抗原。如castle2012报道的，kif18b(驱动蛋白家族成员18b)是具有微管运动活性和涉及细胞分裂调控的atp与核苷酸结合的驱动蛋白。新抗原具有k739n突变。castle2012发现当以水性制剂施用时mut30诱导优先针对突变肽的强免疫反应。
如上所述，术语“新抗原”还包含括编码新抗原肽的多核苷酸。基于核酸的接种策略是已知的，其中含有多核苷酸的疫苗组合物施用给受试者。多核苷酸编码的新抗原肽在受试者中表达，使得新抗原肽最终在受试者中出现，就好像疫苗组合物自身已经包含了新抗原肽。出于本公开的目的，术语“新抗原”，其中上下文指示，包括这种编码起新抗原作用的新抗原肽的多核苷酸。
术语“多核苷酸”包括任意长度(例如9、12、18、24、30、60、150、300、600、1500个或更多个核苷酸)或链的数目(例如单链或双链)的核苷酸链。多核苷酸可以是dna(例如，基因组dna或cdna)或rna(例如，mrna)或其组合。其可以是天然存在的或合成的(例如，化学合成的)。考虑多核苷酸可含有核苷酸链中的一个或多个含氮碱基(nitrogenousbase)、戊糖或磷酸基团的修饰。这种修饰是本领域熟知的，并可用于例如提高多核苷酸的稳定性。
多核苷酸可以以多种形式递送。在一些实施方式中，可使用裸多核苷酸，或是线性形式，或插入质粒诸如表达质粒中。在其它实施方式中，可使用活载体如病毒或细菌载体。
协助dna转录成rna和/或rna翻译成多肽的一个或多个调控序列可以存在。在一些情况下，如在多核苷酸是信使rna(mrna)分子的情况下，不需要与转录过程有关的调控序列(例如启动子)，而蛋白质表达在缺少启动子的情况下可以实现。技术人员按照环境需要可包括适当的调控序列。
在一些实施方式中，多核苷酸存在于表达盒中，其在表达盒中可操作地连接到调控序列，调控序列将允许多核苷酸在本发明的组合物所施用的受试者中表达。表达盒的选择取决于组合物所施用的受试者以及被表达多肽所期望的特征。
一般地，表达盒包括启动子，其在受试者中具有功能性并可以是组成性的(constitutive)或可诱导的；核糖体结合位点；起始密码子(atg)，如果需要的话；编码新抗原肽的多核苷酸；终止密码子；和任选地3'端区域(翻译和/或转录终止子)。可包括另外的序列诸如编码单一肽的区域。编码新抗原肽的多核苷酸对于表达盒中任意其它调控序列可以是同源或异源的。将与新抗原肽一起表达的序列诸如单一肽编码区的位置一般与编码待表达的蛋白质的多核苷酸相邻并处于适当的阅读框中。由编码将独自地或与待表达的任意其它序列(例如单一肽)一起表达的新抗原肽的多核苷酸构成的开放阅读框处于启动子的控制下，以便在组合物所施用的受试者中发生转录和翻译。
在一些实施方式中，新抗原可以是纯化的新抗原，例如，约25％至50％的纯度、约50％至约75％的纯度、约75％至约85％的纯度、约85％至约90％的纯度、约90％至约95％的纯度、约95％至约98％的纯度、约98％至约99％的纯度、或大于99％的纯度。
用于用本文所述的组合物单一治疗中的新抗原的量可根据新抗原的类型和受试者的特性而变化(例如尺寸、体重、年龄、性别等)。本领域技术人员将能够确定(无需过度实验)用于具体应用的新抗原的有效量。本文使用的术语“有效量”意为以实现期望结果必需的剂量和所需时间段的有效的量。
在一个实施方式中，用于本文所述的单一剂量组合物的新抗原的量可以是组合物的0.001至5mg/单位剂量。在某些实施方式中，新抗原的量将是组合物的约0.250mg/单位剂量。在某些实施方式中，新抗原的量将是组合物的约1mg/ml。
在一些实施方式中，用于本文所述的单一剂量组合物的新抗原的量可以是约100微克。
在一些实施方式中，用于本文所述的单一剂量组合物的新抗原的量可以是约50微克。
如本文公开的，令人惊奇地发现以低剂量(低剂量的量，lowdoseamount)(例如50微克)和高剂量(高剂量的量，highdoseamount)(例如100微克)单一施用后，本发明的油基组合物能够产生针对新抗原肽的相当的免疫应答。
在一个实施方式中，本发明的组合物用于递送低剂量的新抗原。如本文使用的，术语“低剂量(低剂量的量，lowdoseamount)”指代本发明的组合物中新抗原的较低剂量，其保持能够提供与本发明的组合物和/或常规类型疫苗制剂诸如水性缓冲液或乳化剂类制剂中较高剂量的相同新抗原相当的免疫应答。
在一个实施方式中，术语“低剂量(低剂量的量，lowdoseamount)”包括新抗原的任意剂量(剂量的量，doseamount)，其少于使用水基制剂产生免疫应答的最小需要剂量，但使用本发明的组合物足以诱导免疫应答。
在一个实施方式中，如在小鼠中测量的，低剂量是约10微克、20微克、30微克、40微克、50微克、60微克或75微克或更少。在一个实施方式中，低剂量是高剂量的约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％或约25％。高剂量可以是一般用于水基制剂中的剂量。在一个实施方式中，如在小鼠中测量的，新抗原的高剂量至少是100微克、200微克、300微克、400微克、500微克或更多。技术人员将容易理解基于小鼠中剂量的人中的相当或适当的剂量。
两亲化合物
“两亲化合物”是具有亲水和疏水(亲脂)部分或特性的化合物。术语“两亲化合物”可与“两亲物”或“两亲”交换使用。在一些实施方式中，适合的两亲化合物也可包括乳化剂，如本文以下所述的那些。在本文以术语“两亲化合物”包括的乳化剂的示例性实施方式不限制地包括聚山梨醇酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)、二缩甘露醇油酸酯(arlaceltma)、卵磷脂、吐温tm80、和司盘(spanstm)20、80、83和85。两亲化合物可在不存在水的情况下促进具有亲水亲合性的疫苗组分并入疏水载体诸如油中。疫苗组分可不限制地包括可促进产生免疫应答的新抗原和/或佐剂和/或其它成分(例如t辅助表位)。
不限制地，两亲化合物的疏水部分一般是大的烃部分，如ch3(ch2)n形式的长链，其中n>4。两亲化合物的亲水部分通常是带电基团或极性不带电基团。带电基团包括阴离子和阳离子基团。阴离子带电基团的实例包括以下(其中分子的疏水部分由“r”表示)：羧化物：rco2-；硫酸盐：rso4-；磺酸盐：rso3-；和磷酸盐(磷脂中的带电官能性)。阳离子带电基团包括例如胺类：rnh3+(“r”再次表示分子的疏水部分)。不带电极性基团包括例如具有大r基团的醇，如二酰基甘油(dag)。两亲化合物可具有若干疏水部分、若干亲水部分、或若干两者。蛋白质和一些嵌段共聚物就是实例。类固醇、胆固醇、脂肪酸、胆汁酸、和皂苷也是两亲物。
存在可以使用的多种两亲化合物，并且本文公开的疫苗组合物可含有单一类型的两亲化合物或不同类型的两亲化合物的混合物。
在一个实施方式中，两亲化合物是脂质。虽然可以使用任意两亲脂质，但是特别适合的脂质可包括具有含有至少4个碳，并且长度一般约4至28个碳的至少一条脂肪酸链的那些。脂肪酸链可含有任意数目的饱和和/或不饱和键。脂质可以是天然脂质或合成脂质。两亲脂质的非限制性实例可包括磷脂、鞘脂、鞘磷脂、脑苷脂(cerobrocides)、神经节苷脂、醚脂质、固醇、心磷脂、阳离子脂质和用聚(乙二醇)修饰的脂质以及其它聚合物。合成脂质可不限制地包括，以下脂肪酸成分：月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰、花生四烯酰(arachidoyl)、油酰、亚油酰、二十二碳烯基(erucoyl)、或这些脂肪酸的组合。
在一个实施方式中，两亲化合物是磷脂或磷脂的混合物。宽泛定义，“磷脂”是一经水解就产生磷酸、醇、脂肪酸、和含氮碱基的一组脂质化合物中的成员。
可使用的磷脂包括例如，并且无限制地，具有选自以下的至少一个头部基团的那些：磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸胆碱(例如dopc；1,2二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和磷酸肌醇。在一些实施方式中，可以使用dopc与未酯化的胆固醇的混合物。在其它实施方式中，可以使用类脂s100卵磷脂与未酯化的胆固醇的混合物。当使用未酯化的胆固醇时，可以以等于磷脂重量的约10％的量使用胆固醇(例如以10:1w/w的dopc：胆固醇比或10:1w/w的s100卵磷脂(lecitin)：胆固醇比)。使用胆固醇稳定磷脂囊泡的形成。如果使用除胆固醇外的化合物，本领域技术人员能够容易确定所需量。
在一些实施方式中，本文公开的组合物可包含约120毫克dopc和约12毫克胆固醇。
另一种常用磷脂是鞘磷脂。鞘磷脂含有鞘氨醇——具有长不饱和烃链的氨基醇。脂肪酰侧链通过酰胺键连接到鞘氨醇的氨基基团以形成神经酰胺。鞘氨醇的羟基被酯化成磷酸胆碱。类似于磷酸甘油酯，鞘磷脂是两亲性的。
还可以使用的卵磷脂是一般源自鸡蛋或羊毛的磷脂的天然混合物。
所有这些和其它磷脂可用于本发明的实践中。可从例如avanti脂质(alabastar,al,美国)，和类脂llc(newark,nj,美国)购买磷脂。
在一个实施方式中，两亲化合物可以基本上均匀地分散在疏水载体中，由此两亲化合物的单独存在足以促进具有亲水亲合性的疫苗组分(例如新抗原)并入疏水载体。
在另一个实施方式中，两亲化合物可与新抗原紧密结合(紧密缔合，closelyassociated)，以便使新抗原易混合到疏水载体中。以“紧密结合”为例，其意为两亲化合物这样与新抗原邻近使得新抗原以易混合到疏水载体中的形式存在。紧密结合可以或可以不涉及新抗原与两亲物之间的物理相互作用。一般地，两亲化合物的亲水部分朝向新抗原上的亲水部分定向。两亲化合物可基本上保持相互分离或其可形成多种不同类型的结构、装配或排列。
两亲化合物可形成的结构、装配或排列类型的示例性实施方式不限制地包括：单层片、双层片、多层片、单层囊状结构(例如胶团)、双层囊状结构(例如单层或多层囊泡)、或其多种组合。以“单层”为例，其意为两亲化合物不形成双层，但却保留在层中——其中疏水部分定向在一侧，而亲水部分定向在相对侧。以“双层”为例，其意为两亲化合物形成双层片，一般地，其中每一层的疏水部分在内部朝向双层的中心定向，而亲水部分在外部定向。然而，相对的构型(相反的结构，oppositeconfiguration)也是可能的。术语“多层”意为包括单层和双层结构的任意组合。所采纳的形式可取决于使用的特异性新抗原、特异性两亲化合物、和/或特异性疏水载体。
在一个实施方式中，由两亲化合物形成的结构、装配或排列可部分或完全地围绕新抗原。作为实例，两亲化合物可形成围绕新抗原的闭合囊状结构。
在一个实施方式中，囊状结构是单层囊状结构。这种结构的实例是胶团。水溶液中的一般性胶团形成聚集体(aggregate)，其中亲水部分与周围的水溶液接触，将疏水部分隔离在胶团中心。相比之下，疏水载体中，逆/反胶团形成，其中疏水部分与周围的水溶液接触，将亲水部分隔离在胶团中心。球形反胶团可包装在其核心内具有亲水亲合性的新抗原。
在一个实施方式中，囊状结构是胶团或逆/反胶团。不限制地，胶团或逆/反胶团的直径尺寸范围在2nm(20a)至20nm(200a)。在具体实施方式中，胶团或逆/反胶团的直径尺寸为约10nm。
在另一个实施方式中，囊状结构是双层囊状结构，诸如，例如脂质体。脂质体是含有包载(包入entrapped)水体积的完全闭合的脂质双层膜。脂质体可以是单层囊泡(具有单一双层膜)或以多膜双层为特征的多层囊泡，每一个双层可以或可以不通过水层与旁邻双层分离。对脂质体的总体讨论可见于gregoriadis1990；和frezard1999。脂质体可吸收实质上任何类型的细胞，然后释放并入的剂(例如新抗原)。可选地，脂质体能够与靶细胞融合，由此脂质体的内容物注入(emptyinto)到靶细胞中。可选地，脂质体可被吞噬性细胞内吞。
脂质体已用于制备组合物，其包含疏水载体作为囊泡以包封抗原，以及乳化剂以稳定制剂(参见例如wo2002/038175、wo2007/041832、wo2009/039628、wo2009/146523和wo2013/049941)。亲水抗原一般包载在水性内部，同时疏水抗原可插入脂质双层或分散在油相中。在另一个实施方式中，预制造的脂质体可用于本文公开的疫苗组合物中。
在组合物不含水的实施方式中，组合物的一种或多种组分(例如新抗原、佐剂、和/或t辅助表位)可包封在水相的脂质体中、或混合在水相的脂质体中或用脂质体悬浮在水相中；冻干；然后在疏水载体中重构。在这种实施方式中，脂质体可识别，以在疏水载体中形成交替结构。
双层和多层囊状结构的其它实施方式不限制地包括：泡囊(niosomes)、传递体(transfersomes)、病毒颗粒、多层囊泡(mlv)、寡层囊泡(olv)、单层囊泡(uv)、小单层囊泡(suv)、中型单层囊泡(muv)、大单层囊泡(luv)、巨大单层囊泡(guv)、多囊囊泡(mvv)、通过反相蒸发方法制成的单层或寡层囊泡(rev)、通过反相蒸发方法制成的多层囊泡(mlv-rev)、稳定的多层囊泡(splv)、冻结和解冻的mlv(fatmlv)、通过挤出法制备的囊泡(vet)、通过弗氏压碎器制备的囊泡(fpv)、通过融合制备的囊泡(fuv)、脱水-再水合囊泡(drv)、以及泡体(bubblesomes)(bsv)。技术人员将认识到用于制备这些囊状结构的技术是本领域公知的(参见例如kreuter1994)。
疏水载体
本文公开的组合物包含疏水载体，优选地液体疏水物质。这些组合物在本文可以交换地被称为“油基制剂”、“油基疫苗”、“油基储库(储剂，depot)疫苗”、“形成油基储库的疫苗”、“疏水疫苗”、“疏水组合物”或“疏水疫苗组合物”。
疏水载体可以是基本上纯的疏水物质或疏水物质的混合物。用于本文所述的组合物的疏水物质是药学和/或免疫学可接受的那些。载体一般是液体，但在大气温度下不是液体的某些疏水物质可被液化，例如通过加温，并且也可以是有用的。
油或油的混合物是特别适合用于本文公开的组合物的载体。油应当是药学和/或免疫学可接受的。适合的油包括，例如，矿物油(尤其是轻或低粘度矿物油，如
在一些实施方式中，疏水载体可以是，或包括，弗氏不完全佐剂(ifa)、矿物油基模型疏水载体。在另一个实施方式中，疏水载体可以是，或包括，矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯，如作为
免疫疫苗公司已开发了疫苗递送平台，被称为
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物可包括免疫疫苗公司的递送平台depovaxtm。
其它组分
本文公开的组合物可进一步包含一种或多种本领域已知的另外组分(参见例如remington的pharmaceuticalsciences,mack出版公司，easton,pa.,美国1985；和美国药典：1999出版的thenationalformulary(usp24nf19))。
在一些实施方式中，疫苗组合物可另外包含佐剂、t辅助表位、乳化剂和/或赋形剂。
佐剂
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物可包含一种或多种佐剂。
已描述了多种佐剂并且所述多种佐剂是本领域技术人员已知的。示例性佐剂不限制地包括，明矾、铝的其它化合物、卡介苗(bcg)、titermaxtm、ribitm、弗氏完全佐剂(fca)、含有cpg的寡脱氧核苷酸(cpgodn)、脂质a模拟物或类似物、脂肽和多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸。
示例性cpgodn是5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'(seqidno：3)。在靶种类(targetspecies)和效力的基础上，技术人员能够容易地选择其它适当的cpgodn。
示例性脂肽不限制地包括，pam3cys-skkkk(emcmicrocollections,德国；seqidno：4)或其变体、同系物和类似物。已显示脂肽的pam2家族是脂肽的pam3家族的有效替代物。
在一些实施方式中，药物组合物或疫苗组合物可包含多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸作为佐剂。
多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸是多核苷酸分子(rna或dna或dna与rna的组合)，含有肌苷酸残基(i)和胞苷酸残基(c)，并且其诱导炎性细胞因子诸如干扰素的生成。在一些实施方式中，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸是双链的。在这种实施方式中，它们一般由一条完全由含有胞嘧啶的核苷酸组成的链和一条完全由含有肌苷的核苷酸组成的链组成，虽然其它配置是可能的。例如，每条链可都包含既含有胞嘧啶又含有肌苷的核苷酸。在一些情况下，两条链之一或两条链可另外含有一种或多种非胞嘧啶或非肌苷核苷酸。
在另一个实施方式中，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸可以是含有肌苷酸残基(i)和胞苷酸残基(c)的单链分子。作为实例，并且无限制地，单链多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)可以是重复didc的序列。在具体实施方式中，单链多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)的序列可以是(ic)13的26-聚物(26-mer)序列，即icicicicicicicicicicicicic(seqidno：5)。如技术人员将理解的，由于其属性(例如互补性)，预期重复didc的这些单链分子会自然形成同型二聚体，因此它们从概念上与聚肌苷酸核苷酸(polyi)/聚胞苷酸核苷酸(polyc)二聚体相似。
已报道多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)可以每16个残基进行分段而不影响其干扰素激活潜力(bobst1981)。另外，通过每12个重复胞苷酸残基引入尿苷残基而错配的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子的干扰素诱导潜力(hendrix1993)表明12个残基的最小双链多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子足以促进干扰素生成。其它人也表明小至6-12个残基的区域——其对应于双链多核苷酸的0.5-1个螺旋转角(螺旋回转，helicalturn)——能够触发诱导过程(greene1978)。如果合成制得，则多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸的长度一般约20或更多个残基(长度通常为22、24、26、28或30个残基)。如果半合成制得(例如，使用酶)，则链的长度可以是500、1000或更多个残基。
多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)充当病毒基因组的模拟物并且尤其用于体内调节免疫系统。例如，已报道当通过静脉内或肌内注射以全身地体内递送时，合成的聚肌胞(polyi:polyc)同聚物(均聚物，homopolymer)通过非特异性诱导干扰素γ增强先天性免疫(krown1985,zhu2007)。这些年已经描述了聚肌苷酸和胞苷酸聚合物的若干变体(declercq1978,bobst1981,declercq1975,guschlbauer1977,fukui1977,johnston1975,美国专利号3,906,092,kamath2008,ichinohe2007)，其中的一些包括使用共价修饰残基、使用核糖肌苷酸和胞苷酸残基与脱氧核糖肌苷酸和胞苷酸残基、使用含有肌苷酸和胞苷酸残基的同聚物与交替共聚物、以及引入特定残基以创建错配聚合物。
已报道使用含有肌苷酸和胞苷酸的双链多核苷酸用于治疗多种病毒疾病(kende1987,poast2002,美国专利号6,468,558,sarma1969,stephen1977,levy1978)、癌症(durie1985,salazar1996,theriault1986,nakamura1982,talmadge1985,droller1987)、自身免疫疾病如多发性硬化症(bever1986)、和其它传染病如疟疾(awasthi1997,puri1996)。在一些情况下通过将分子与带正电的聚赖氨酸和羧甲基纤维素复合，有效地防止多核苷酸被核酸酶在体内降解(stephen1977，levy1985)、或通过将多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)与带正电的合成肽复合(schellack2006)，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子的效力已被进一步增强。
除了其用作先天性免疫的非特异性增强剂之外，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)还在疫苗组合物中用作佐剂。先天性免疫的增强可导致增强的抗原特异性适应性免疫，可能通过涉及，至少部分地涉及nk细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的机制(chirigos1985,salem2006,alexopoulou2001,trumpfheller2008)。在此背景下，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子的使用证据源自用于控制传染病的多种疫苗研究(houston1976,stephen1977,ichinohe2007,sloat2008,agger2006,padalko2004)和通过多种疫苗形式预防或治疗癌症(zhu2007,cui2006,salem2005,fujimura2006,llopiz2008)。这些研究证明多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)增强体液应答，如从针对特异性传染病抗原的增强的抗体应答明显显示的。多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)也是抗原特异性细胞应答的增效剂(zhu2007,zaks2006,cui2006,riedl2008)。相信多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子的辅助(adjuvanting)效果发生——至少部分地通过诱导干扰素-γ、通过其与toll样受体(tlr)如tlr3、tlr4、tlr7、tlr8和tlr9相互作用(alexopoulou2001,trumpfheller2008,schellack2006,riedl2008)，其中对于大多数多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子，tlr3尤其相关。证据还表明多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子可发挥其作用——至少部分地通过与除了tlr之外的受体相互作用，受体诸如rna解旋酶视黄酸诱导的蛋白质i(rig-i)/黑素瘤分化相关基因5(mda5)(alexopoulou2001,yoneyama2004,gowen2007,dong2008)。多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)分子的作用机制保持充分了解。
因此，如本文使用的，“多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)”、“多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸”或“多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸佐剂”是双链或单链多核苷酸分子(rna或dna或dna与rna的组合)，其每一条链都含有至少6个连续肌苷酸或胞苷酸残基，或以任意顺序的选自肌苷酸和胞苷酸的6个连续残基(例如iiciic或icicic)，并且其能够在哺乳动物受试者中诱导或增强至少一种炎性细胞因子诸如干扰素的生成。多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸的长度一般为约8、10、12、14、16、18、20、22、24、25、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、500、1000或更多个残基。优选的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸可具有约6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30个核苷酸的最小长度，以及约1000、500、300、200、100、90、80、70、60、50、45或40个核苷酸的最大长度。
双链多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸的每一条链可以是肌苷酸或胞苷酸残基的同聚物，或每一条链可以是含有肌苷酸和胞苷酸残基两者的杂聚物。在任一情况下，聚合物可被一个或多个非肌苷酸或非胞苷酸残基(例如尿苷)中断，条件是存在如上所述至少一个6个i、6个c或6个i/c残基的连续区域。一般地，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸的每一条链每6个i/c残基将含有不多于1个非i/c残基，更优选地，每8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个i/c残基不多于1个非i/c残基。
多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸中的肌苷酸或胞苷酸(或其它)残基可以如本领域已知是衍生的或修饰的，条件是多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸促进炎性细胞因子诸如干扰素生成的能力得到保留。衍生(衍生物，derivatives)或修饰的非限制性实例包括例如叠氮修饰、氟代修饰、或使用硫酯(或类似的)键代替天然磷酸二酯键以增强体内稳定性。多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸还可被修饰以例如增强其对体内降解的抵抗，通过例如将分子与带正电的聚赖氨酸和羧甲基纤维素复合，或与带正电的合成肽复合。
在一些实施方式中，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸佐剂是多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)的传统形式，具有大约989,486道尔顿的分子量，含有数百个碱基对的变化链长的聚肌苷酸核苷酸和聚胞苷酸核苷酸的混合物(赛默飞科技；美国)。
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物可包括激活或提高tlr2的活性的佐剂。如本文使用的，“激活”或“提高”tlr2的活性的佐剂包括任何佐剂，在一些实施方式中是脂质基佐剂，其充当tlr2拮抗剂。另外，激活或提高tlr2的活性包括以任意单体的、同型二聚体或异源二聚体形式的激活，并且尤其包括将tlr2激活为与tlr1或tlr6的异源二聚体(即tlr1/2或tlr2/6)。激活或提高tlr2的活性的佐剂的示例性实施方式包括脂质基佐剂，如wo2013/049941中描述的那些。
因此，在一个实施方式中，本文公开的疫苗组合物可包含脂质基佐剂，诸如例如wo2013/049941中公开的。在一个实施方式中，脂质基佐剂是pam2cys-ser-(lys)4(seqidno：4)或pam3cys-ser-(lys)4(seqidno：4)。
在另一个实施方式中，本文公开的疫苗组合物可包含脂质a模拟物或类似物佐剂，诸如例如国际专利申请号pct/ca2015/051309和其中引用的文献中公开的那些，。在具体实施方式中，佐剂可以是pct/ca2015/051309中公开的jl-265或jl-266。
可以使用的佐剂的进一步实例不限制地包括，趋化因子、集落(colony)刺激因子、细胞因子、1018iss、铝盐、amplivax、as04、as15、abm2、adjumer、algammulin、as01b、as02(sbasa)、aso2a、bcg、骨化三醇、壳聚糖、霍乱毒素、cp-870、893、cpg、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)、cyaa、detox(ribi免疫化学品)、二甲基双二十八烷基溴化铵(dda)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、dslim、γ菊粉、gm-csf、gmdp、甘油、ic30、ic31、咪喹莫特(imiquimod)、imufactimp321、ispatch、iscom、iscomatrix、juvimmune、lipovac、lps、脂质核心蛋白质、mf59、单磷酰基脂质a及其类似物或模拟物、
因此，本文的组合物可包括一种或多种药学可接受的佐剂。在一些实施方式中，至少一种新抗原可偶联到至少一种佐剂。
在一些实施方式中，本文的组合物可包含多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸佐剂、脂质基佐剂、脂质a模拟物或类似物、或其任意组合。在具体实施方式中，组合物可包含多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)多核苷酸佐剂与脂质基佐剂的组合，如2015年11月18日提交的美国临时专利申请号62/256,875中公开的佐剂系统中描述的。
所用佐剂的量取决于新抗原的类型和量以及取决于佐剂的类型。本领域技术人员通过经验试验能够容易地确定具体应用中所需佐剂的量。
t辅助表位
在一些实施方式中，本文公开的组合物可还包含至少一种t辅助表位或t辅助抗原。
t辅助表位是具有t辅助活性的氨基酸(天然或非天然氨基酸)序列。t辅助表位被t辅助淋巴细胞识别，其在建立并最大化免疫系统的能力中起到重要作用，并涉及激活和指引其它免疫细胞，诸如例如细胞毒性t淋巴细胞。
t辅助表位可由连续或不连续表位组成。因而并非每个t辅助氨基酸都是表位的必要部分。因此，t辅助表位，包括t辅助表位的类似物和区段，能够增强或刺激免疫应答。免疫显性t辅助表位在动物和人群体中具有与广泛不同的(分歧的，divergent)mhc类型的广泛反应性(celis1988,demotz1989,chong1992)。受试者肽的t辅助结构域可具有约10至约50个氨基酸，并且更具体地约10至约30个氨基酸。当多个t辅助表位存在时，每一个t辅助表位然后独自起作用(acts)。
在一些实施方式中，t辅助表位可形成本文所述的新抗原的部分。具体地，如果新抗原的尺寸足够，则其可含有起t辅助表位作用的表位。在其它实施方式中，t辅助表位是独立于新抗原的分子。在其它实施方式中，t辅助表位可与新抗原融合。
在另一个实施方式中，t辅助表位类似物可包括在t辅助表位中取代、缺失和插入1至约10个氨基酸残基。t辅助区段是足以增强或刺激免疫应答的t辅助表位的连续部分。t辅助区段的实例是一系列源自单一较长肽的重叠肽。
在具体实施方式中，本文公开的组合物可包括作为t辅助表位或抗原的修饰的破伤风毒素肽a16l(830至844；aqyikanskfigitel(seqidno：1)，其中丙氨酸残基添加到其氨基末端以增强稳定性(slingluff2001)。
可用于本组合物的t辅助表位的其它来源包括，例如，乙型肝炎表面抗原t辅助细胞表位、百日咳毒素t辅助细胞表位、麻疹病毒f蛋白t辅助细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白质t辅助细胞表位、白喉毒素t辅助细胞表位、镰状疟原虫环子孢子(子孢子，circumsporozoite)t辅助细胞表位、曼氏裂体吸虫磷酸丙糖异构酶t辅助细胞表位、大肠杆菌tratt辅助细胞表位和免疫增强类似物及任意这些t辅助表位的区段。
在一些实施方式中，t辅助表位可以是通用t辅助表位。本文使用的通用t辅助表位指代肽或其它免疫原性分子、或其片段，其通过以ii类(cd4+t细胞)限制方式激活t细胞功能的方式结合多种mhcii类分子。通用t辅助表位的实例是包含肽序列akxvaawtlkaaa(seqidno：6)的padre(泛dr表位)，其中x可以是环己基丙氨酰基。padre具体地具有cd4+t辅助表位，即，其刺激padre特异性cd4+t辅助应答的诱导。
除了早前提及的修饰的破伤风毒素肽a16l之外，破伤风类毒素具有以与padre类似方式工作的其它t辅助表位。破伤风毒素和白喉毒素具有人cd4+细胞的通用表位(diethelm-okita2000)。在另一个实施方式中，t辅助表位可以是破伤风类毒素肽如f21e，包含肽序列fnnftvsfwlrvpkvsashle(氨基酸947-967；seqidno：7)。
在某些实施方式中，t辅助表位与本文公开的组合物中一种或多种新抗原中的至少一种融合(例如融合肽)。
乳化剂
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物可包含一种或多种乳化剂。乳化剂可以是纯乳化剂或乳化剂的混合物。乳化剂(一种或多种)应当是药学和/或免疫学可接受的。
乳化剂的使用可以与制备不含水或基本上不含水的组合物尤其相关。例如，在一些实施方式中，乳化剂可用于在两亲化合物或混合物重悬于疏水载体中时协助稳定两亲化合物、两亲化合物与新抗原的混合物、或两亲化合物、新抗原和其它疫苗组分(例如多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)和/或脂质基佐剂、t辅助表位等)的混合物。乳化剂的使用可以，例如，促进两亲化合物或混合物在疏水载体中更均匀地分布。
乳化剂可以是两亲性的，并因此乳化剂可包括宽范围的化合物。在一些实施方式中，乳化剂可以是表面活性剂，诸如例如，非离子型表面活性剂。可以使用的乳化剂的实例包括聚山梨醇酯，其为源自聚乙二醇化山梨醇、和山梨醇酯的油状液体。聚山梨醇酯可包括，例如，脱水山梨糖醇单油酸酯。典型乳化剂是本领域熟知的，并且不限制地包括，二缩甘露醇油酸酯(arlaceltma)、卵磷脂、吐温tm80、司盘(spanstm)20、80、83和85。在一个实施方式中，用于疫苗组合物的乳化剂是二缩甘露醇油酸酯。
乳化剂总体上与疏水载体预先混合。在一些实施方式中，可以使用已经含有乳化剂的疏水载体。例如，疏水载体——这种montanidetmisa51已经含有乳化剂二缩甘露醇油酸酯。在其它实施方式中，疏水载体可在与两亲化合物、两亲化合物与新抗原的混合物、或两亲化合物、新抗原和其它疫苗组分(例如多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)和/或脂质基佐剂，t辅助表位等)的混合物组合前与乳化剂混合。
以有效促进两亲化合物在疏水载体均匀分布和/或协助形成本文所述的结构、装配或排列的量来使用乳化剂。一般地，疏水载体与乳化剂的体积比(v/v)的范围在约5：1至约15：1，更具体地10：1。
组合物的不含水实施方式
在一个实施方式中，本文公开的疫苗组合物不含水或基本上不含水，即疫苗组合物不是乳剂。
以“不含水”为例，其意为组合物根本不含水。在另一个实施方式中，组合物可以基本上不含水。术语“基本上不含水”意图包括其中疏水载体仍可以含有少量水的实施方式，条件是水存在于载体的非连续相中。例如，组合物的单独组分可具有少量结合水，结合水不能通过过程如冻干或蒸发而完全去除，并且某些疏水载体可含有在其中溶解的少量水。总体上，本文公开的“基本上不含水”的组合物包含，例如，基于组合物载体组分总重量的重量/重量少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的水。仍含有少量水的组合物不含有足以会形成乳剂的水量。
考虑本文公开的不含水疫苗组合物可以用较低剂量的一种或多种组分，例如新抗原、佐剂(一种或多种)、t辅助表位等能够产生显著较高的抗体效价和更具效力的细胞介导的免疫应答。这是基于depovaxtm迫使主动摄取疫苗组分的行为的独特机制。
不受任何特定作用理论的约束(held)，认为当使用本公开的不含水组合物时，制剂产生这样的强力储库(储剂，depot)：持续数周，允许延长清除新抗原并延长疫苗与免疫系统的相互作用。对此，已报道油包脂质基制剂在免疫三周内实现峰值清除，并且清除在六个月内以较慢速率持续(brewer等人，2014)。这与在数小时至一周内快速释放抗原的水性疫苗制剂；或形成短暂(shortlived)储库(depot)的乳剂形成对比。
试剂盒与试剂
本文公开的疫苗组合物作为试剂盒任选地向用户提供。例如，本公开的试剂盒含有本文公开的组合物的一种或多种组分。试剂盒可进一步包含一种或多种另外的试剂、包装材料、用于保持试剂盒组分的容器、和详述使用试剂盒组分的优选方法的使用说明组(指令组，instructionset)或用户手册。在一个实施方式中，容器是小瓶。
在一个实施方式中，试剂盒含有以即用型(readytouse)形式在独立容器中的预先配制的疫苗。作为实例，在一个实施方式中，试剂盒包括至少一个容器，该容器包含两亲化合物、新抗原和疏水载体。每个独立容器中预先配制的疫苗可以相同或不同。
在试剂盒的可选实施方式中，在一个容器中疫苗可提供有全部组分，除了疏水载体(例如作为干饼)，以备在疏水载体中重构，或在独立容器中作为单独组分用于在疏水载体中配制、冻干和重构。
在一个实施方式中，试剂盒可包括第一容器，第一容器包含两亲化合物和新抗原；和第二容器，第二容器包含疏水载体。在该实施方式中，第一容器中的疫苗组分可以是干饼的形式，以备在疏水载体中重悬。
上述试剂盒实施方式的多个方面中，除了新抗原、两亲化合物和疏水载体外，疫苗可任选地进一步包括t辅助表位、佐剂、和乳化剂中的一个或多个。这些组分可单独提供在独立容器中或可作为其任意组合一起提供在容器中，如与新抗原和两亲化合物一起在容器中。
在试剂盒的一个实施方式中，t辅助表位是包含氨基酸序列fnnftvsfwlrvpkvsashle(seqidno：7)的肽。
在试剂盒的一个实施方式中，t辅助表位是包含氨基酸序列aqyikanskfigitel(seqidno：1)的肽。
在试剂盒的一个实施方式中，佐剂是多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)多核苷酸。
在试剂盒的一个实施方式中，两亲化合物是一种或多种脂质，如磷脂。在一个实施方式中，脂质是1,2二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)和胆固醇。
在一个实施方式中，试剂盒可另外含有干扰dna复制的剂。干扰dna复制的剂可包含在试剂盒中的独立容器中，或剂可与其它组分一起被包含。在具体实施方式中，包含在试剂盒中的干扰dna复制的剂是烷化剂，诸如，例如环磷酰胺。
在一个实施方式中，试剂盒可另外含有免疫应答检查点抑制剂。免疫应答检查点抑制剂可包含在试剂盒中的独立容器中，或其可与其它组分一起被包含。免疫应答检查点抑制剂可以是如下的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡1(pd-1)、ctla-4、pd-l2、lag3、tim3、41bb、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、可诱导的t细胞共刺激(icos)、kir、lair1、light、具有胶原结构的巨噬细胞受体(marco)、磷脂酰丝氨酸(ps)、ox-40、slam、tigit、vista、vtcn1、或其任意组合。
技术人员将理解试剂盒的交替布置是可能的，并且包括在本公开中。
本文公开的试剂盒可用于实践本文公开的方法。在一个实施方式中，试剂盒用于诱导针对受试者中的新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。在一个可能是尤其适合的实施方式中，试剂盒用于制备不含水或基本上不含水的疫苗组合物。
免疫应答及使用方法
可在期望向受试者施用新抗原的任何情况中发现本文公开的组合物的应用。受试者可以是脊椎动物，如鱼、鸟或哺乳动物，优选人。
如本文指代的，“免疫应答”可以是细胞介导的免疫应答或抗体(体液)免疫应答。
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物可用于诱导针对新抗原的细胞介导的免疫应答。
如本文使用的，“诱导”免疫应答是为了引出和/或增强免疫应答。诱导免疫应答包括这样的情况：免疫应答被增强、提升、改善或强化到相对于先前的免疫应答状态——例如在施用本文公开的组合物之前——宿主获益的情况。
如本文使用的，术语“细胞介导的免疫应答”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或“细胞毒性t淋巴细胞(ctl)免疫应答”(在本文可交换使用)指代以激活巨噬细胞和天然杀伤细胞、生成新抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞和/或响应于新抗原释放多种细胞因子为特征的免疫应答。细胞毒性t淋巴细胞是t淋巴细胞的亚群(一种类型的白细胞)，其能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞的死亡；它们杀死被病毒(或其它病原体)感染或以其它方式被损伤或功能失调的细胞。
大多数细胞毒性t细胞表达能够识别结合i类mhc分子的特异性肽抗原的t细胞受体。一般地，细胞毒性t细胞还表达cd8(即cd8+t细胞)，其被吸引到i类mhc分子的部分。这种亲合性在抗原特异性激活期间保持细胞毒性t细胞与靶细胞紧密结合在一起。
细胞免疫通过以下来保护身体：例如激活抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(例如抗原特异性cd8+t细胞)，抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞能够裂解显示其表面上的外来或突变抗原表位的体细胞(bodycell)，如显示肿瘤特异性新抗原的癌细胞；激活巨噬细胞和天然杀伤细胞，使它们能够消灭胞内病原体；以及刺激细胞分泌影响涉及适应性免疫应答和先天性免疫应答的其它细胞的功能的多种细胞因子。
细胞免疫是适应性免疫应答的重要组分(组成，component)，并且遵循通过经由其与新抗原呈递细胞如树突细胞、b淋巴细胞相互作用的细胞来识别新抗原，并且在较小程度上，巨噬细胞通过如下多种机制来保护身体：
1.激活抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞，抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞能够诱导显示其表面上的外来或突变抗原表位的体细胞的凋亡，如显示肿瘤特异性新抗原的癌细胞；
2.激活巨噬细胞和天然杀伤细胞，使它们能够消灭胞内病原体；以及
3.刺激细胞分泌多种细胞因子，所述细胞因子影响涉及适应性免疫应答和先天性免疫应答的其它细胞的功能。
细胞介导的免疫在去除病毒感染的细胞方面是最有效的，而且参与防御真菌、原生动物、癌症、和胞内细菌。其还在移植排斥中起主要作用。
由于细胞介导的免疫涉及多种细胞类型的参与，并且由不同机制介导，因此可使用若干方法证明在接种后免疫力的诱导。这些方法可被宽泛地分类为检测：i)特异性抗原呈递细胞；ii)特异性效应细胞及其功能，以及iii)释放可溶性介体如细胞因子。
i)抗原呈递细胞：树突细胞和b细胞(和较小程度下的巨噬细胞)装备有允许增强激活t细胞的特殊免疫刺激受体，并被称作专职抗原呈递细胞(apc)。这些免疫刺激分子(还被称作共刺激分子)在这些细胞感染或接种后在抗原呈递到效应细胞如cd4和cd8细胞毒性t细胞的过程中被上调。这种共刺激分子(如cd40、cd80、cd86、mhci类或mhcii类)可例如通过利用流式细胞术用针对这些分子的荧光染料缀合抗体连同特异性识别apc(如树突细胞的cd11c)的抗体被检测。
ii)细胞毒性t细胞：(还被称为tc、杀伤t细胞、或细胞毒性t淋巴细胞(ctl))是诱导被病毒(和其它病原体)感染或表达肿瘤抗原或新抗原的细胞死亡的t细胞亚群。这些ctl直接攻击其表面上携带某些外来或异常分子的其它细胞。这种细胞的细胞毒性的能力可利用体外溶细胞试验(铬释放试验)来检测。因此，可通过这种细胞毒性t细胞的存在来证明适应性细胞免疫的诱导，其中，当装载新抗原的靶细胞在接种或感染后被体内产生的特异性ctl裂解时。
幼稚(naive)细胞毒性t细胞在其t细胞受体(tcr)与肽-结合mhci类分子强力相互作用时被激活。这种亲合性取决于抗原/mhc复合物的种类和定向，并且是保持ctl与被感染的细胞结合在一起的原因。一旦被激活，ctl就经历被称为克隆扩张的过程，在此过程中ctl获得功能性，并迅速分裂(divides)生成“武装的”-效应细胞的军队。被激活的ctl然后将行进遍及身体各处，搜寻携带独特的mhci类+肽的细胞。这可用于通过利用流式细胞术试验中的肽-mhci类四聚物在体外识别这种ctl。
当暴露于这些被感染或功能失调的体细胞时，效应ctl释放穿孔蛋白和粒溶素(granulysin)：细胞毒素，其在靶细胞的质膜中形成孔，允许离子和水流入感染细胞并使其爆裂(burst)或裂解。ctl释放粒酶——丝氨酸蛋白酶，其通过孔进入细胞从而诱导凋亡(细胞死亡)。这些分子从ctl释放可被用作在接种后成功诱导细胞介导的免疫应答的测量。这可通过酶联免疫吸附测定法(elisa)或酶联免疫斑点测定法(elispot)达成，其中ctl可被定量地测量。由于ctl也能够产生重要的细胞因子如ifn-γ，因此对产生ifn-γ的cd8细胞的定量测量可通过elispot并通过流式细胞术测量这些细胞中的胞内ifn-γ来实现。
cd4+“辅助”t细胞：cd4+淋巴细胞或t辅助细胞是免疫应答介体，并在建立和最大化适应性免疫应答的能力中发挥重要作用。这些细胞不具有细胞毒性或吞噬活性；以及不能杀死被感染的细胞或清除病原体，但是，在本质上通过引导其它细胞执行这些任务来“管理”免疫应答。两种类型的效应cd4+t辅助细胞应答可通过专职apc——指定th1和th2，每一个都被设计以消除不同类型的病原体——诱导。
t辅助细胞表达识别结合至ii类mhc分子的抗原的t细胞受体(tcr)。幼稚t辅助细胞的激活使其释放细胞因子，影响多种细胞类型——包括激活幼稚t辅助细胞的apc——的活性。t辅助细胞需要比细胞毒性t细胞温和得多的激活刺激。t辅助细胞能够提供“帮助”激活细胞毒性细胞的额外信号。两种类型的效应cd4+t辅助细胞应答可被专职apc——特指th1和th2，每一个都被设计以消除不同类型的病原体——诱导。两种th细胞群体的不同之处在于产生的效应蛋白质(细胞因子)的模式。总体上，th1细胞通过激活巨噬细胞和细胞毒性t细胞来协助细胞介导的免疫应答；而th2细胞通过刺激b细胞转化成浆细胞并通过形成抗体来促进体液免疫应答。例如，由th1细胞调节的应答可在小鼠中诱导igg2a和igg2b(在人中igg1和igg3)并有利于针对新抗原的细胞介导的免疫应答。如果针对抗原的igg应答由th2型细胞调节，则该应答可显著增强小鼠中igg1的生成(在人中igg2)。与th1或th2应答有关的细胞因子测量将给予成功接种的测量。这可通过针对th1-细胞因子如ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α和其它，或th2-细胞因子如il-4、il-5、il10等设计的特异性elisa来实现。
iii)细胞因子的测量：其从局部淋巴结释放，良好指示了成功免疫。由于新抗原呈递和apc与免疫效应细胞如cd4与cd8t细胞的成熟，若干细胞因子被淋巴结细胞释放。通过在新抗原存在的情况下在体外培养这些lnc，新抗原-特异性免疫应答可通过测量是否释放某些重要的细胞因子如ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α和gm-csf来检测。这可通过利用标准的培养上清物和重组细胞因子的elisa来达成。
可以以技术人员已知的多种方式确定成功免疫，包括但不限于血凝反应抑制(hemagglutinationinhibition)(haij)和血清中和抑制试验来检测功能性抗体；攻击研究(challengestudy)，其中接种受试者用相关病原体攻击以确定接种效力；以及利用荧光激活细胞分类术(facs)来确定表达特异性细胞表面标记物的细胞群，例如在激活的或记忆性淋巴细胞的识别中。技术人员还可利用其它已知方法来确定用本文公开的组合物进行的免疫是否引发抗体和/或细胞介导的免疫应答。参见，例如coligan等人编辑的currentprotocolsinimmunology,wileyinterscience,2007。
在一个实施方式中，本文公开的组合物能够产生增强的细胞介导的免疫应答，所述免疫应答大于当以水基疫苗制剂配制新抗原时的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。以“水基疫苗”为例，其意为包含与本文所述的油基制剂相同组分的疫苗，除了疏水载体用水性载体替换而水基疫苗不包含两亲化合物。
在一个实施方式中，本文公开的组合物能够通过仅单一施用组合物产生增强的细胞介导的免疫应答。因此，在一个实施方式中，本文公开的组合物用于通过单一施用递送新抗原。
在一个实施方式中，本文公开的组合物能够通过低剂量新抗原产生增强的细胞介导的免疫应答，其中低剂量约为水基疫苗制剂中的剂量的约50％。
在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物可用于诱导针对新抗原的抗体免疫应答。
与细胞介导的免疫不同，“抗体免疫应答”或“体液免疫应答”(在本文可交换使用)由分泌的抗体介导，分泌的抗体在b淋巴细胞谱系的细胞(b细胞)中产生。这种分泌的抗体结合抗原，诸如例如外来物质、病原体(例如病毒、细菌等)和/或癌细胞表面上的那些，并将其标记用于毁坏。
如本文使用的，“体液免疫应答”指代抗体生成，并且可还另外地或可选地包括伴随抗体生成的附属过程，诸如例如产生和/或激活t辅助2(th2)或t辅助17(th17)细胞、细胞因子生成、同型转换、亲合力成熟和记忆细胞激活。“体液免疫应答”也可包括抗体的效应功能，诸如例如毒素中和、经典补体激活、和促进吞噬和病原体消除。体液免疫应答通常由cd4+th2细胞协助，并因此这种细胞类型的激活或产生还可以指示体液免疫应答。术语“体液免疫应答”在本文可与“抗体应答”或“抗体免疫应答”交换使用。
“抗体”是包含基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ、或ε，其反过来定义了免疫球蛋白的种类，分别为igg、igm、iga、igd和ige。一般性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括含有四个多肽的蛋白质。每一个抗体结构单元由相同的两对多肽链构成，每一对多肽链都具有一条“轻”链和一条“重”链。每一条链的n端限定了主要负责抗原识别的可变区。抗体结构单元(例如，iga和igm类别)还可相互和与另外的多肽链组装成低聚形式，例如作为与j-链多肽关联的igm五聚体。
抗体是被称为b淋巴细胞(b细胞)的白血细胞的亚类(subset)的抗原特异性糖蛋白产物。新抗原与b细胞表面上表达的抗体接合(engagement)能够诱导抗体应答(抗体反应，antibodyresponse)，抗体应答包括刺激b细胞变为激活、经历有丝分裂并最终分化成浆细胞，这专门用于合成并分泌抗原特异性抗体。
b细胞是免疫应答期间抗体的唯一制造者，并因而是有效体液免疫力的关键要素。除了产生大量抗体，b细胞还充当抗原呈递细胞并能够呈递新抗原肽到t细胞，如t辅助cd4或细胞毒性cd8+t细胞，因而扩大(扩散，propagating)免疫应答。b细胞以及t细胞是适应性免疫应答的部分。在主动免疫应答期间，例如通过接种或自然感染诱导，抗原特异性b细胞被激活，并克隆扩张。扩张期间，b细胞进化以具有针对表位的更高的亲合力。b细胞的增殖可通过被激活的t辅助细胞间接诱导，并且还可直接通过刺激受体诸如tlr来诱导。
抗原呈递细胞如树突细胞和b细胞被吸引(drawn)到接种部位，并可与疫苗组合物中包含的新抗原和佐剂相互作用。一般地，佐剂刺激细胞变得激活而新抗原为靶标提供蓝图(蓝本，blueprint)。不同类型的佐剂可提供给细胞不同刺激信号。例如，多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)(tlr3拮抗剂)能够激活树突细胞，而非b细胞。佐剂如pam3cys、pam2cys和fsl-1尤其擅长激活并起始b细胞的增殖，其预期有利于抗体应答的产生(moyle2008；so2012)。
体液免疫应答是有效传染病疫苗的常见机制中的一种(例如防御病毒或细菌入侵者)。然而，体液免疫应答还可用于对抗癌症。尽管癌症疫苗一般被设计产生能够识别并毁坏癌细胞的细胞介导的免疫应答，但是b细胞介导的应答可通过其它机制靶向癌细胞，其它机制可在一些情况下与细胞毒性t细胞合作以获得最大益处。b细胞介导的(例如体液免疫应答介导的)抗肿瘤应答的实例不限制地包括：1)由b细胞产生的抗体，其结合肿瘤细胞或影响肿瘤发生的其它细胞上发现的表面抗原(例如新抗原)。这种抗体能够例如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体固定来诱导杀死靶细胞，潜在地导致释放可被免疫系统识别的另外的抗原；2)结合肿瘤细胞上的受体以阻断其刺激并有效地中和其效果的抗体；3)结合由肿瘤或与肿瘤相关细胞释放、或和肿瘤或与肿瘤相关细胞有关的因子以调节支持癌症的信号转导或细胞途径的抗体；以及4)通过目前未知机制结合胞内靶标并介导抗肿瘤活性的抗体。
评价抗体应答的一种方法是测量与特定抗原反应的抗体的效价(titers)。这可利用本领域已知的多种方法如获自动物的含抗体物质的酶联免疫吸附测定法(elisa)执行。例如，可既在暴露于新抗原之前又在暴露于新抗原之后来确定受试者中结合特定新抗原的血清抗体的效价。暴露于新抗原之后新抗原特异性抗体效价的统计学显著的增加将指示受试者已产生(mounted)对新抗原的抗体应答。
不限制地，可用于检测新抗原特异性抗体存在的其它试验包括免疫学试验(例如放射免疫测定法(ria))、免疫共沉淀试验、和蛋白质印迹(例如western印迹)试验；以及中和试验(例如，体外或体内试验中病毒感染性的中和)。
本文公开的疫苗组合物可用于治疗或预防通过细胞介导的免疫应答或体液免疫应答改善的疾病和/或病症。在其中期望向受试者施用新抗原以诱导细胞介导的免疫应答或体液免疫应答的任何情况中发现疫苗的应用。在一个实施方式中，可发现疫苗用于递送个性化疫苗的应用。
在一个实施方式中，本公开涉及包括向对其需要的受试者施用本文所述的组合物的方法。在一些实施方式中，方法用于在所述受试者中诱导针对新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，方法用于治疗和/或预防癌症。
本文使用的“治疗(treating)”或“……的治疗(treatmentof)”、或“预防(preventing)”或“……的预防(preventionof)”指代用于获得有益结果或期望结果的方法。有益结果或期望结果可包括，但不限于，缓解或改善一种或多种症状或状况、减小疾病的程度、稳定疾病状态、预防疾病发展、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展(例如抑制)、延迟或减缓疾病发生、赋予针对疾病引发剂的保护性免疫以及改善或减轻疾病状态。“治疗”或“预防”还可意为延长患者存活，超出在缺乏治疗的情况下所预期的存活，并还可意为暂时抑制疾病进展或预防疾病发生，如通过预防受试者感染。“治疗”或“预防”还可指代减小肿瘤质量的大小、减小肿瘤侵略性等。
在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物可用于治疗和/或预防对其需要的受试者中的癌症。受试者可具有癌症或可处于发展癌症的风险。
如本文使用的，术语“癌症”、“癌细胞”、“肿瘤”和“肿瘤细胞”，(可交换使用)指代展现出异常生长、以显著失去对细胞增殖或已经是无限增殖细胞的控制为特征的细胞。术语“癌症”或“肿瘤”包括转移性以及非转移性癌症或肿瘤。癌症可利用本领域通常接受的标准来诊断，包括恶性肿瘤的存在。
不限制地，能够通过使用或施用本文公开的组合物来治疗和/或预防的癌症包括癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤、和生殖细胞瘤。不限制地，特别适合的实施方式可包括恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、前列腺癌或腹膜癌。在一个实施方式中，癌症可由病原体诸如病毒引起。与癌症发展有关的病毒是技术人员已知的，并且包括但不限于，人乳头瘤病毒(hpv)，johncunningham病毒(jcv)、人疱疹病毒8、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)、美克尔细胞多瘤病毒、丙型肝炎病毒和人t细胞白血病病毒-1。癌症是表达一种或多种肿瘤特异性新抗原的癌症。
在具体实施方式中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、输卵管癌、腹膜癌、恶性胶质瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
本文公开的方法和组合物可用于治疗或预防癌症；例如，减小癌症的严重性(例如肿瘤尺寸、侵略性和/或侵袭性、恶性等)或预防癌症复发。
在一个实施方式中，用于治疗和/或预防癌症的方法首先包括识别患者肿瘤细胞中的一个或多个新抗原或新表位。技术人员将理解本领域已知可用于识别一种或多种新抗原的方法(参见，例如srivastava2015，和其中引用的文献)。在示例性实施方式中，全基因组/外显子组测序可用于识别个体患者肿瘤中独特存在的突变的新抗原。可分析被识别的新抗原的集合从而选择(例如基于算法)新抗原和/或新表位的特异性、优化性子组用作个性化癌症疫苗。
经识别和选择一种或多种新抗原，本领域技术人员将理解存在体外或体内产生这种新抗原的多种方式。新抗原肽可通过本领域已知的任意方法生产，然后可配制成本文所述的疫苗组合物或试剂盒并施用给受试者。
在一个实施方式中，一经施用给受试者，疫苗组合物诱导肿瘤特异性免疫应答从而治疗癌症。以此为例，其意为免疫应答特异性靶向肿瘤细胞而不显著影响不表达新抗原的身体的正常细胞。进一步，在一个实施方式中，组合物可包含至少一个患者特异性新表位使得肿瘤特异性免疫应答对受试者或受试者的子组是患者特异性的，即为个性化免疫疗法。
可通过任何适合的途径施用本文公开的疫苗组合物。在一个实施方式中，施用途径是皮下注射。
干扰dna复制的剂
本文公开的方法可还包括施用干扰dna复制的剂。在具体实施方式中，当本文公开的方法用于治疗或预防癌症时施用干扰dna复制的剂。
这种剂及其使用方法的示例性实施方式在例如wo2014/153636中被描述。
如本文使用的，表述“干扰dna复制”意图包括防止、抑制或延迟细胞dna拷贝(即，复制)的生物学过程的任何行为。技术人员将理解存在用于预防、抑制或延迟dna复制的多种机制，诸如例如dna交联、dna甲基化、碱基取代(替换，substitution)等。根据本发明的方法包括通过本领域已知的任何方式使用干扰dna复制的任何剂。在示例性实施方式中，并且不限制地，干扰dna复制的剂是药物。
在一个实施方式中，干扰dna复制的剂是这样的剂：当以非化疗性剂量使用时其能够选择性影响免疫系统细胞中的dna复制，意图在于调节免疫系统以增强疫苗应答。以“非化疗性”为例，其意为剂的剂量是低于将用于直接和选择性毁坏恶性或癌性细胞和组织的剂量的剂量。
干扰dna复制的剂的其它实施方式包括干扰dna复制以引起程序性细胞死亡的剂，具有选择性靶向免疫系统的快速分裂的细胞的能力。这种剂的目的在于调节免疫系统细胞以增强疫苗应答。这种剂一般以预期不具有化疗性并被认为可用于人接受的剂量使用。选择性靶向免疫细胞的目的可以是减少免疫抑制细胞的数目，和/或出于一经去除靶向dna复制的药物就诱导快速增殖的目的耗尽参与介导免疫应答的有用免疫细胞。
导致细胞死亡的干扰dna复制可通过多种机制引起，包括但不限于dna交联的形成(例如，通过烷化剂、铂化合物等)、dna甲基化(即通过甲基化剂)、碱基取代(即通过核苷类似物)。示例性剂及其机制描述在cancerchemotherapyandbiotherapy:principlesandpractice(cabnerb.a.,第五版，lippincottwilliams&wilkins,pa,美国2011)中。
在一个实施方式中，干扰dna复制的剂是烷化剂。烷化剂包括，但不限于，环磷酰胺、替莫唑胺、异环磷酰胺、马磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、白消安、苯达莫司汀、尿嘧啶芥、亚硝基脲氮芥或双氯乙基亚硝基脲(bcnu)、苯丁酸氮芥、丝裂霉素c、及其衍生物、活性代谢物或代谢中间物。适合的衍生物可以是，例如，并且不限制地，帕利伐米(palifosfamide)(例如异环磷酰胺的衍生物)。
在另一个实施方式中，干扰dna复制的剂是铂化合物。铂化合物包括，但不限于，卡铂、顺铂、奥沙利铂及其衍生物。
在另一个实施方式中，干扰dna复制的剂是甲基化剂。甲基化剂包括，但不限于，替莫唑胺(temzolomide)、甲基苄肼和氮烯唑胺(dacarbazine)及其衍生物。
在另一个实施方式中，干扰dna复制的剂是核苷类似物。核苷类似物的非限制性实例包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(ara-c)及其衍生物。
在另一个实施方式中，也可以使用通过抑制对dna复制关键的酶来间接抑制dna复制的任何药物，如拓扑异构酶i、拓扑异构酶ii或dna聚合酶。这样的药物包括，例如，并且不限制地，阿霉素、盐酸柔红霉素、米托蒽醌、依托泊甙、替尼泊甙、拓扑替康、喜树碱、伊立替康、阿昔洛韦和更昔洛韦。
干扰dna复制并且可用于本发明方法的示例性剂不限制地包括下表1中列举的那些。如技术人员将理解，这些是可使用的剂的实例。另外的剂包括，例如，通过类似机制和/或具有类似官能团来干扰dna复制的任何药物或化合物。
表1：
在具体实施方式中，干扰dna复制的剂是氮芥烷化剂，或其任何中间物或活性代谢物。氮芥是非特异性dna烷化剂。氮芥通过胺氮经氯化物的分子内位移而形成环铵(cyclicaminium)离子(吖丙啶鎓环)。该吖丙啶鎓基团然后能够通过攻击鸟嘌呤碱基上的n-7亲核中心而烷基化dna。一经使第二氯位移，第二烷基化步骤就发生，导致形成链间交联(icl)。这些损伤具有高度细胞毒性，因为其阻断基本的代谢过程如dna复制和转录。
本发明的方法包括任何这种非特异性氮芥dna烷化剂的用途。特别适合的氮芥烷化剂可不限制地包括例如，环磷酰胺、帕利伐米、苯达莫司汀、和异环磷酰胺。
异环磷酰胺是氮芥烷化剂。异环磷酰胺的iupac名称是n-3-双(2-氯乙基)-1,3,2-氧氮杂磷杂环己烷-2-酰胺-2-氧化物(n-3-bis(2-chloroethyl)-1,3,2-oxazaphosphinan-2-amide-2-oxide)。异环磷酰胺常被称为
帕利伐米(palifosfamide)是异环磷酰胺的活性代谢物，其共价连接到氨基酸赖氨酸用于稳定性。帕利伐米通过gc碱基对不可逆地烷基化并交联dna，导致不能修复的7-原子链间交联；dna复制的抑制和/或细胞死亡。帕利伐米还被称为
苯达莫司汀是另一种氮芥烷化剂。苯达莫司汀的iupac名称是4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸，并且其常被称为
本发明的方法还包括dna烷化剂的中间物和/或活性代谢物——并且尤其是本文所述的氮芥dna烷化剂的中间物和/或活性代谢物——的用途。这种代谢物不限制地包括，醛磷酰胺、4-羟基环磷酰胺、4-羟基异环磷酰胺、氯乙醛和磷酰胺芥。
在进一步的实施方式中，干扰dna复制的剂可以是本文所述的任何适合的药学上可接受的盐、酯、互变异构体、立体异构体、外消旋混合物、溶剂化物、水合物或烷化剂的前体药物、铂化合物、甲基化剂、或核苷类似物。
在具体实施方式中，用于本发明的方法的干扰dna复制的剂是环磷酰胺。环磷酰胺(n,n-双(2-氯乙基)-1,3,2-氧氮杂磷杂环己烷-2-胺2-氧化物)——还被称为环磷酰胺(cytophosphane)——是一种氮芥烷化剂。环磷酰胺(cyclophosphamide)的化学结构为：
环磷酰胺还被称为和指代商标
环磷酰胺(cpa)是一般经静脉内输注施用的前体药物，但也可以以几乎没有差异的生物利用度(juma1979)而被肠胃外和口服施用(dejonge2005)。cpa在肝脏中通过p450酶经氧化转化为其活性代谢物，4羟基-cpa和醛磷酰胺(emmenegger2007,emmenegger2011)。cpa的活性代谢物是脂溶性的并通过被动扩散进入细胞。胞内4-oh-cpa自发地分解成磷酰胺芥——其是最终的活性代谢物。磷酰胺芥催化抑制dna复制的链内和链间dna交联以及dna-蛋白质交联，导致细胞死亡(dejonge2005)。磷酰胺芥通过细胞质醛脱氢酶(aldh)经酶促转化为羧基磷酰胺(carboxyphoshphmide)而被消除(emmenegger2007,emmenegger2011)。
具有低水平aldh的细胞趋于累积cpa代谢物并对其效果更敏感，并且确实aldh的肿瘤上调是cpa抗性的一种机制(zhang2005)。除了aldh之外，低的胞内atp水平也与cpa对特定细胞类型的选择性相关(zhao2010)。高剂量下，一般在1-5g/m2的范围内，cpa的效果对于快速分裂细胞——不分细胞类型——最具细胞毒性，并且cpa具有骨髓抑制性，因为大多数造血细胞是快速分裂的(bruce1996；smith1985)。
cpa及其代谢物的总全身清除率在5-9小时之间变化，并且亲本的峰值血浆水平也在患者之间非常变化巨大(3-11小时)，反映了人与人之间在代谢上的遗传差异(cohen1971；mouridsen1974)。据报道通过提高参与代谢的酶的活性重复施用cpa来缩短消除半衰期(d'incalci1979)，但这是否导致活性代谢物的代谢提高还是未知的(dejonge、huitema等人2005)，尤其在低剂量下(emmenegger2007)。
从人到鼠研究的剂量转换(translation)利用以下等式计算：
人剂量(mg/kg)＝动物km
动物剂量(mg/kg)＝人km
在恒定的小鼠km值为3的情况下，人km值为37(reagan-shaw、nihal等人2008)。
在近二十年间，已经意识到低剂量cpa的其免疫调节和抗血管生成效果。相比于高剂量cpa，低剂量cpa(一般在100-300mg/m2)缺乏广泛的细胞毒性活性，却显示通过选择性调节免疫系统细胞以及还通过减少肿瘤微环境内的血管生成而确实增强免疫介导的肿瘤消除。低剂量cpa的作用机制和用途在例如wo2014/153636中被进一步描述。
在一个实施方式中，本文公开的方法包括施用干扰dna复制的剂。
干扰dna复制的剂一般以足以提供免疫调节效果的量来施用。如本文使用的，表述“免疫调节效果”指代干扰dna复制的剂改变(调节)免疫系统和/或免疫系统细胞的一个或多个方面的能力。在一个实施方式中，“足以提供免疫调节效果的量”是能够选择性影响免疫系统细胞中dna复制的剂的量。例如，剂的量可以是足以选择性靶向免疫系统的快速分裂的细胞从而引起程序性细胞死亡的量。
“足以提供免疫调节效果的量”在本文可交换地被称为“低剂量”的量。如涉及本发明的具体实施方式，其中干扰dna复制的剂是烷化剂环磷酰胺，表述“低剂量”一般指代小于或等于300mg/m2的环磷酰胺的剂量，诸如例如25-300mg/m2和更具体地100-300mg/m2。在一个实施方式中，环磷酰胺的低剂量是10、25、50、75或100mgbid(每日两次)。在具体实施方式中，环磷酰胺的低剂量是50mgbid。干扰dna复制的其它剂的“低剂量”的量，如本文包括的，对本领域技术人员将是已知的，或可通过常规技术来确定。
在具体实施方式中，本文公开的方法包括低剂量节律式(节拍式，metronomic)环磷酰胺周期(cycle)。出于本公开的目的，“节律式”意图指代低于正常剂量的干扰dna复制的剂(例如环磷酰胺)的频繁施用。如本文使用的，术语“正常剂量”可以不限制地指代，例如：(i)通过常规剂量时间表建立的最大耐受剂量(mtd)或标准剂量，或(ii)这样的情况：其中对于干扰dna复制的特定剂已经建立的低剂量单一快速灌注剂(singlebolus)的量，低于所述低剂量。
在节律式给药(节律式剂量，metronomicdosing)中，在某个时间段内与将通过常规剂量时间表施用相同、较低、或较高的累积剂量可最终被施用。在特别适合的实施方式中，这是通过延长其间执行剂量的时间框和/或提高施用频率，同时相比正常剂量降低所施用的量来实现的。例如，在一般施用(例如通过单一快速灌注(singlebolus)注射)300mg/m2的低剂量干扰dna复制的剂的情况下，节律式方案可包括在若干天时间段内通过频繁施用低剂量来施用相同的量。
在本文公开的方法的一个实施方式中，使用干扰dna复制的剂(例如环磷酰胺)的节律式治疗意图包括某时间段，诸如例如连续2、3、4、5、6或7、或更多连续天的时段内每日低剂量施用剂。在节律式给药的这些天内，可以以频繁的规律性间隔或变化性间隔提供干扰dna复制的剂。例如，在一个实施方式中，可以每1、2、3、4、6、8、12或24小时施用干扰dna复制的剂的剂量。在另一个实施方式中，可以每2、3、或4天一次施用干扰dna复制的剂的剂量。在特定实施方式中，可以每天两次施用干扰dna复制的剂的剂量。
在一些实施方式中，在使用干扰dna复制的剂进行节律式治疗的时段内可能有中断或间隙。以此方式，节律式治疗可以以周期模式(cyclicfasion)发生，在施用时段开始与结束(onandoff)之间交替。特别适合的间隔是干扰dna复制的剂以交替的周间隔每天施用给受试者。例如，施用干扰dna复制的剂一周时段，接着一周暂停治疗，并且重复周期。
因此，在一个实施方式中，本文公开的方法包括每天给受试者施用干扰dna复制的剂以连续7天的时段，每隔一周开始。在该实施方式的具体方面中，施用干扰dna复制的剂在首次施用形成储库的疫苗之前约7天开始。在该实施方式的进一步方面中，可在施用的每天以50mgbid(每日两次)的剂量施用干扰dna复制的剂。
在本文公开的方法的一个实施方式中，干扰dna复制的剂可作为初次剂(先导剂，primingagent)在每次施用形成储库的疫苗和/或非形成储库的疫苗之间的间歇时段被施用。
如技术人员将理解的，干扰dna复制的剂的施用的频率和持续时间，以及形成储库和非形成储库的疫苗施用的频率和持续时间，可在上述参数内按照任意给定受试者的需要来调整。可被考虑到的因素包括，例如：疫苗中一种或多种新抗原的属性；疾病或病症的类型；受试者的年龄、身体条件、体重、性别和饮食；及其它因素。
可通过任何适合的递送方式和任意适合的施用途径施用干扰dna复制的剂。在一个实施方式中，口服施用干扰dna复制的剂，如以丸剂、片剂或囊剂形式。在可选实施方式中，通过注射(例如静脉内)施用剂。在本文公开的方法的具体实施方式中，剂是环磷酰胺并且其口服施用。
在本文公开的方法的具体实施方式中，干扰dna复制的剂是环磷酰胺。
检查点抑制剂
本文公开的方法也可包括施用免疫应答检查点抑制剂。
如本文使用的，“免疫应答检查点抑制剂”指代完全或部分地减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的任何化合物或分子。检查点蛋白调控t细胞激活或功能。已知多种检查点蛋白，诸如例如ctla-4及其配体cd80和cd86；和pd-1及其配体pd-l1和pd-l2。检查点蛋白负责t细胞应答的共刺激性或抑制性相互作用。检查点蛋白调控并维持自身耐受和生理免疫应答的持续时间及幅度。在本文中，术语“免疫应答检查点抑制剂”可与“检查点抑制剂”交换使用。
在一些实施方式中，免疫应答检查点抑制剂是如下的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1，还被称为b7-h1、cd274)、程序性死亡1(pd-1、cd279)、ctla-4(cd154)、pd-l2(b7-dc、cd273)、lag3(cd223)、tim3(havcr2、cd366)、41bb(cd137)、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、icos(可诱导的t细胞共刺激分子)、kir、lair1、light、marco(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、ps(磷脂酰丝氨酸)、ox-40、slam、tigit、vista、vtcn1、或其任意组合。
在一些实施方式中，免疫应答检查点抑制剂是pd-l1、pd-1、ctla-4或其任意组合的抑制剂。
在一些实施方式中，免疫应答检查点抑制剂是pd-l1或pd-1的抑制剂。在一个实施方式中，pd-l1或pd-1的抑制剂可以是抗pd-1或抗pd-l1抗体，诸如例如并且不限制地，wo2015/103602中公开的那些。例如，在一个实施方式中，抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体可选自：nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab、bms-936559(参见clinicaltrials.gov；识别符nct02028403)、mpdl3280a(roche,参见clinicaltrials.gov；识别符nct02008227)、mdx1105-01(bristolmyerssquibb，参见clinicaltrials.gov；识别符nct00729664)、medi4736(medimmune,参见clinicaltrials.gov；识别符nct01693562)、和mk-3475(merck,参见clinicaltrials.gov；识别符nct02129556)。在一个实施方式中，抗pd-1抗体可以是rmp1-4或j43(bioxcell)或是其人或人源化配对物(counterpart)。
在一些实施方式中，免疫应答检查点抑制剂是ctla-4的抑制剂。在一个实施方式中，ctla-4的抑制剂可以是抗体，诸如例如并且不限制地，ipilimumab(伊匹单抗，易普利姆玛)(bristol-myerssquibb)或bn13(bioxcell)。在另一个实施方式中，抗ctla-4抗体可以是uc10-4f10-11、9d9或9h10(bioxcell)或是其人或人源化配对物。
可通过任何适合的途径施用一个或多个免疫应答检查点抑制剂。在一些实施方式中，一种或多种免疫应答检查点抑制剂的施用途径是肠胃外、黏膜、口、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶(aerosol)、腹膜内、肿瘤内、眼内、气管内、直肠内、胃内、阴道、通过基因枪、真皮贴剂或以滴眼剂或漱口水形式。在一个实施方式中，可通过皮下注射施用免疫应答检查点抑制剂。
如技术人员将理解的，免疫应答检查点抑制剂的施用频率和持续时间可按照任意给定受试者的需要调整。可考虑到的因素包括，例如：具体的检查点抑制剂的属性和类型；疫苗中一种或多种新抗原的属性；疾病或病症的类型；受试者的年龄、身体状况、体重、性别和饮食；及其它因素。
在一些实施方式中，可在形成储库的疫苗和/或非形成储库的疫苗之前、之后、或与形成储库的疫苗和/或非形成储库的疫苗同时施用一种或多种免疫应答检查点抑制剂。在一个实施方式中，可在首次施用形成储库的疫苗之后的时刻施用免疫应答检查点抑制剂。在此实施方式的方面中，可在首次施用非形成储库的疫苗之前或之后的时刻施用免疫应答检查点抑制剂。
在一个实施方式中，免疫应答检查点抑制剂的施用可在与首次施用形成储库的疫苗同一天开始，并可以按照其后期望的时间表(计划，schedule)被施用。在一个实施方式中，期望的时间表可以是每1、2、3、4、6、8、12或18小时；每1、2、3、4、5或6天；或每1、2、3或4周施用免疫应答检查点抑制剂。在一个实施方式中，期望的时间表可以是每3天一次。
施用免疫应答检查点抑制剂的时段中可能有中断或间隙。以此方式，可以以周期模式进行施用，在施用时段开始与结束之间交替。
用于制备疫苗组合物的方法
可通过与本公开有关的领域已知的方法制备疫苗组合物。下文不限制地描述了用于制备本文公开的疫苗组合物的示例性实施方式。
如本节中使用的，术语“新抗原”总体上用于描述可以如何将新抗原配制在本公开的疫苗组合物中。术语“新抗原”包括单数形式“新抗原”和复数“新抗原”。不必以相同方式将所有新抗原导入疫苗组合物。
在用于制备疫苗组合物的一个实施方式中，将新抗原和任选地其它疫苗组分(例如佐剂、t辅助表位等)与两亲化合物一起在适合的溶剂中重构。然后将疫苗组分干燥形成干饼，并且将干饼重悬于疏水载体中。干燥步骤可通过本领域已知的多种方式进行，如通过冷冻干燥、冻干、旋转蒸发、压力下蒸发等。也可以使用不破坏组分完整性的低热干燥。也可以使用热来协助新抗原/两亲化合物混合物重悬。
“适合的溶剂”是适于溶解新抗原、佐剂和/或两亲化合物并且可由技术人员确定的溶剂。在一个实施方式中，可以使用磷酸钠缓冲液(0.2m，ph6.0)或磷酸钠缓冲液(0.1m，ph7.0)。在一个实施方式中，可以使用醋酸盐缓冲液(0.1m，ph9.5)。在另一个实施方式中，可以使用极性质子溶剂如醇(例如叔丁醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇或甲醇)、水、醋酸盐缓冲液、甲酸或氯仿。在一些情况下，可使用相同溶剂以溶解两亲化合物、新抗原和佐剂中的每一个，然后将溶解组分混合。可选地，新抗原、佐剂和两亲化合物可在溶解前混合，然后溶解在一起。在进一步的可选方案中，两亲化合物、新抗原或佐剂中只有一种或多种被溶解，并加入非溶解(non-solubilized)组分(一种或多种)。
在具体实施方式中，为了制备疫苗组合物，用s100脂质和胆固醇(类脂，德国)在磷酸钠缓冲液中将新抗原与佐剂一起或单独重构。然后将这些疫苗组分冻干形成干饼。仅在注射前，将干饼重悬于isa51vg油(seppic，法国)中从而制备不含水的油基疫苗组合物。
在具体实施方式中，为了制备疫苗组合物，用dopc和胆固醇(类脂，德国)在醋酸盐缓冲液(0.1m，ph9.5)中将新抗原和佐剂一起或单独重构。然后将这些疫苗组分冻干形成干饼。仅在注射前，将干饼重悬于isa51vg油(seppic，法国)中从而制备不含水的油基疫苗组合物。
在另一个实施方式中，为了制备疫苗组合物，用脂质dopc和胆固醇(类脂，德国)在0.2％peg-h2o中将缀合的新抗原/t辅助表位重构。将多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi:c)和脂质基佐剂在水中重构，然后加至新抗原-脂质混合物。然后将这些疫苗组分冻干形成干饼。仅在注射前，将干饼重悬于isa51vg油(seppic，法国)中从而制备不含水的疫苗组合物。
在上述实施方式中，不被具体作用理论所限制，相信去除(干燥)溶剂使疫苗组分(包括新抗原)留于两亲化合物分子的排列(阵列，array)中，其中两亲化合物分子的亲水头部基团朝向疫苗组分定位。然后可在缺少水的情况下将疫苗组分和两亲化合物悬浮于疏水载体(如油)中，因为它们已经被制成充分疏水的。
本文所述的另外组分，如t辅助表位，可在配制过程中的任何阶段加入。例如，一种或多种这样的另外组分可在溶解前或溶解后与新抗原、佐剂和/或两亲化合物组合，或加入到溶解的混合物中。在另一个实施方式中，代替地可将另外的组分加入新抗原、佐剂和两亲化合物的干燥混合物中或与新抗原、佐剂和两亲化合物的干燥混合物组合，或在将新抗原、佐剂和两亲化合物的干燥混合物重悬于疏水载体中之前或之后与疏水载体组合。在一个实施方式中，以与新抗原相同的方式将t辅助表位加入疫苗组合物。在一个实施方式中，新抗原和t辅助表位是融合肽。
在一些实施方式中，疏水载体中包含乳化剂是适当的，从而在将疫苗组分重悬于疏水载体中时协助稳定干饼的疫苗组分。以足以将新抗原、佐剂和两亲化合物的干燥混合物重悬于疏水载体中并维持新抗原、佐剂和两亲化合物在疏水载体中悬浮的量提供乳化剂。例如，乳化剂可以以疏水载体的约5％至约15％重量/重量或重量/体积存在。
维持生物学活性或提高化学稳定性以延长任何疫苗组分的货架期的稳定剂如糖、抗氧化剂、或防腐剂都可加入这种组合物中。
实施方式
(1)疫苗组合物，包含：
(a)两亲化合物；
(b)新抗原；和
(c)疏水载体。
(2)段(1)的组合物，其中组合物不含水或基本上不含水。
(3)段(2)的组合物，其中基本上不含水的组合物包含基于载体总重量的重量/重量少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的水。
(4)段(1)至(3)中任一项的组合物，其中新抗原是新抗原肽或编码新抗原肽的多核苷酸。
(5)段(4)的组合物，其中新抗原肽的长度为5至50个氨基酸。
(6)段(4)或(5)的组合物，其中新抗原肽包含一个或多个新表位。
(7)段(6)的组合物，其中一个或多个新表位选自：长度为9至11个氨基酸的mhci类t细胞新表位；长度为13至17个氨基酸的mhcii类t细胞新表位；或长度为5至20个氨基酸的b细胞新表位。
(8)段(1)至(7)中任一项的组合物，其中新抗原包含氨基酸序列pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl(seqidno：2)。
(9)段(6)或(7)的组合物，其中一个或多个新表位中至少一个是患者特异性新表位。
(10)段(1)至(9)中任一项的组合物，其包含一种、两种、三种、四种或五种不同新抗原，任选地其中每一种不同的新抗原源自不同肿瘤特异性抗原。
(11)段(10)的组合物，其中每一种不同的新抗原包含至少一个来自相同患者的患者特异性新表位。
(12)段(1)至(11)中任一项的组合物，其中新抗原是弱免疫原性抗原。
(13)段(1)至(12)中任一项的组合物，其中组合物包含低剂量的新抗原。
(14)段(1)至(13)中任一项的组合物，其中新抗原是充分疏水的，或被制成充分疏水的，使得新抗原易混合于疏水载体中。
(15)段(14)的组合物，其中新抗原在两亲化合物的存在下被制成充分疏水的。
(16)段(15)的组合物，其中两亲化合物与新抗原紧密结合从而使新抗原易混合于疏水载体中。
(17)段(16)的组合物，其中两亲化合物形成片状或囊状结构，部分或全部地围绕新抗原。
(18)段(1)至(17)中任一项的组合物，其中两亲化合物是脂质，例如磷脂或磷脂的混合物；任选地选自二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、卵磷脂(例如类脂s100)、或其混合物。
(19)段(18)的组合物，其中脂质形成围绕新抗原的闭合囊状结构，例如单层囊状结构(例如胶团)或双层囊状结构(例如单层或多层脂质体)。
(20)段(1)至(19)中任一项的组合物，其中疏水载体是油或油的混合物，任选地选自植物油、果仁油、矿物油、或其混合物。
(21)段(20)的组合物，其中疏水载体是矿物油或是矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯，例如
(22)段(1)至(21)中任一项的组合物进一步包含佐剂。
(23)段(22)的组合物，其中佐剂是多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)多核苷酸佐剂、脂质基佐剂、脂质a模拟物或类似物、或其任意组合。
(24)段(23)的组合物，其中脂质基佐剂是pam2cys-ser-(lys)4(seqidno：4)或pam3cys-ser-(lys)4(seqidno：4)。
(25)段(1)至(24)中任一项的组合物进一步包含t辅助表位。
(26)段(25)的组合物，其中t辅助表位是包含氨基酸序列akxvaawtlkaaa(seqidno：6)的padre；包含氨基酸序列fnnftvsfwlrvpkvsashle(seqidno：7)的破伤风类毒素肽f21e；或包含氨基酸序列aqyikanskfigitel(seqidno：1)的修饰的破伤风毒素肽a16l。
(27)段(26)的组合物，其中t辅助表位任选地与新抗原缀合或融合。
(28)段(1)至(27)中任一项的组合物，其包含：
(a)1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)和胆固醇的脂质分子混合物；
(b)新抗原；
(c)疏水载体
(d)来自包含氨基酸序列aqyikanskfigitel(seqidno：1)的破伤风类毒素的通用t辅助表位；和
(e)多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)多核苷酸佐剂。
(29)段(1)至(28)中任一项的组合物，用于在受试者中诱导针对新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。
(30)段(1)至(29)中任一项的组合物，其产生的增强的细胞介导的免疫应答大于新抗原被配制在水基疫苗制剂中时的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
(31)段20的组合物，其中增强的细胞介导的免疫应答：
-仅通过用组合物进行单一免疫来提供；和/或
-通过组合物中低剂量的新抗原来提供，其中低剂量为水基疫苗制剂中剂量的约50％。
(32)方法，包括向对其需要的受试者施用段(1)至(31)中任一项的组合物。
(33)根据段(32)的方法，其是用于在受试者中诱导针对新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答的方法。
(34)段(33)的方法，其包括向受试者仅单一施用组合物。
(35)段(33)或(34)的方法，其中组合物包含低剂量新抗原。
(36)根据段(33)至(35)中任一项的方法，其是用于治疗和/或预防癌症的方法。
(37)根据段(36)的方法，其中组合物在癌症中治疗诱导肿瘤特异性免疫应答。
(38)根据段(37)的方法，其中组合物包含至少一个患者特异性新表位并且肿瘤特异性免疫应答对于受试者是患者特异性的。
(39)根据段(32)至(38)中任一项的方法，其进一步包括向受试者施用干扰dna复制的剂。
(40)根据段(39)的方法，其中干扰dna复制的剂是环磷酰胺。
(41)根据段(40)的方法，其包括低剂量节律式环磷酰胺周期，其中周期包括每日向受试者施用环磷酰胺持续连续7天的时段，每隔一周开始。
(42)根据段(32)至(41)中任一项的方法，其进一步包括向受试者施用免疫应答检查点抑制剂。
(43)根据段(42)的方法，其中免疫应答检查点抑制剂是如下的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡1(pd-1)、ctla-4、pd-l2、lag3、tim3、41bb、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、可诱导的t细胞共刺激(icos)、kir、lair1、light、具有胶原结构的巨噬细胞受体(marco)、磷脂酰丝氨酸(ps)、ox-40、slam、tigit、vista、vtcn1、或其任意组合。
(44)段(1)至(31)中任一项的组合物用于在受试者中诱导针对所述新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答的用途。
(45)根据段(44)的用途，其包括向受试者仅单一施用组合物。
(46)根据段(44)或(45)的用途，其中组合物包含低剂量新抗原。
(47)根据段(44)至(46)中任一项的用途，其中抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答是肿瘤特异性免疫应答。
(48)段(1)至(31)中任一项的组合物用于治疗和/或预防癌症的用途。
(49)根据段(48)的用途，其包括向受试者仅单一施用组合物。
(50)根据段(48)或(49)的用途，其中组合物包含低剂量新抗原。
(51)根据段(44)至(50)中任一项的用途，其进一步包括干扰dna复制的剂和/或免疫应答检查点抑制剂的用途。
(52)根据段(51)的用途，其中干扰dna复制的剂是环磷酰胺。
(53)根据段(51)或(52)的用途，其中免疫应答检查点抑制剂是如下的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡1(pd-1)、ctla-4、pd-l2、lag3、tim3、41bb、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、可诱导的t细胞共刺激(icos)、kir、lair1、light、具有胶原结构的巨噬细胞受体(marco)、磷脂酰丝氨酸(ps)、ox-40、slam、tigit、vista、vtcn1、或其任意组合。
(54)试剂盒，包括：第一容器，其包含两亲化合物和新抗原；和第二容器，其包含疏水载体。
(55)段(54)的试剂盒，其中第一容器中的两亲化合物包括1,2二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)和胆固醇。
(56)段(55)或(56)的试剂盒，其中第一容器进一步包含t辅助表位。
(57)段(56)的试剂盒，其中t辅助表位是包含氨基酸序列aqyikanskfigitel(seqidno：1)的肽。
(58)段(54)至(57)中任一项的试剂盒，其中第一容器进一步包含佐剂。
(59)段(58)的试剂盒，其中佐剂是多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)多核苷酸。
(60)段(54)至(59)中任一项的试剂盒，其中第一容器的组分经历冻干形成干饼。
(61)段(54)至(60)中任一项的试剂盒，用于在受试者中诱导针对新抗原的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。
(62)段(54)至(61)中任一项的试剂盒，其包含用于仅单一施用的足量组分。
(63)段(54)至(62)中任一项的试剂盒，其中试剂盒包含低剂量新抗原。
通过以下非限制性实施例进一步示例本发明。
实施例
实施例1
i)新抗原的鉴定与合成
为了鉴定新抗原，将肿瘤的全外显子(rna和/或基因组dna)测序并针对正常组织基因组(优选地来自相同患者)进行筛选。这是利用下一代测序执行。体细胞基因突变通过比较肿瘤序列与正常基因组序列进行鉴定。突变可产生于错义突变或插入/缺失。具有突变的基因翻译成蛋白质序列，然后利用算法(例如netmhc、netmhcpan、mhcflurry、iedb)在计算机中(在硅中，insilico)进行蛋白质序列筛选，算法能够预测可能与患者hla结合的肽序列。通过这些算法，利用计算机算法(硅上算法，insilicoalgorithm)(例如sift，polyphen)基于肽与mhc结合的亲合性、它们是否天然加工并呈现以及预测突变功能影响来选择肽。在gmp条件下通过合约制造商对肽测序。
ii)配制在depovax(dpx)中
为了制备疫苗，先将肽混合物和佐剂在适当的水性缓冲液(例如，醋酸盐缓冲液、磷酸钠、碳酸氢钠、磷酸盐缓冲盐水)中用dopc和胆固醇(类脂，德国)重构。然后将该制备物冻干形成干饼。仅在注射前，将干饼在油(例如isa51vg)中重构。准备额外的小瓶用于水分分析和重构测试。
iii)动物测试
由于新抗原疫苗对于每一名患者都是独特且单独制备的，因此它们不能够使用动物模型提前测试。相反，利用源自鼠肿瘤(例如metha、b16f10等)的新抗原进行概念验证是可能的。
iv)临床测试
利用本文所述的方法制备患者特异性新抗原疫苗并施用给用或不用以免疫调节剂如节律式环磷酰胺或检查点抑制剂进行同时治疗的患者。在整个(throughout)研究中以规律间隔用从患者分离的pbmc利用ifn-γelispot试验监测免疫原性。还可利用定制的(custom)肽-mhc多聚体试剂对细胞进行染色用于流式细胞术来监测免疫原性。
实施例2
不含病原体的c57bl/6vaf/
比较制备在油基制剂或水性制剂中的mut30肽的免疫原性。制剂包含基于dna或基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)分子作为佐剂。
为了制备油基制剂，先将mut30肽、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)佐剂(dna或rna)和t辅助表位(a16l肽)在醋酸盐缓冲液中用dopc和胆固醇(类脂，德国)重构(0.1m，ph9.5)。然后将疫苗组分冻干形成干饼。仅在注射之前，将干饼在isa51vg油(seppic，法国)中重构。
为了制备水基制剂，在ph10±1的0.05m醋酸钠缓冲液中配制mut30肽、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)佐剂(dna或rna)和t辅助表位(a16l肽)。
用ph6±1、0.05m醋酸钠缓冲液中含有100微克mut30新抗原、50微克a16l肽和40微克基于dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)的100微升水性缓冲制剂接种组1(n＝6)小鼠。
用ph6±1、0.05m醋酸钠缓冲液中含有100微克mut30新抗原、50微克a16l肽和40微克基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)的100微升水性缓冲制剂接种组2(n＝6)小鼠。
用含有100微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组3(n＝6)小鼠。
用含有100微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组4(n＝6)小鼠。
组5(n＝1)小鼠未接种。
接种后八天，将小鼠处死并收集脾脏。用未装载(背景)或装载有无关肽(rahynivtf；seqidno：8)或mut30抗原的同源树突细胞在ifn-γelispot板(bd生物科学)中刺激脾细胞。培养18小时后，将板展开并用immunospotreader(c.t.l.)计数斑点形成单位(sfu)数。结果以平均响应±sem在图1中显示。用邦弗朗尼事后检验法(bonferroniposttest)、通过双因素anova进行统计分析比较针对mut30肽的组响应：*p<0.05，***p<0.001。
结果表明与具有相同组分的水性非形成储库的疫苗制剂相比，形成油基储库的疫苗在单一免疫后产生了针对新抗原肽的统计学显著的更强免疫应答。
实施例3
不含病原体的c57bl/6vaf/
以较高(100微克)剂量和较低(50微克)剂量用mut30抗原制备油基储库疫苗制剂。
为了制备油基制剂，先将mut30肽(低或高剂量)、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)佐剂(dna或rna)和t辅助表位(a16l肽)在醋酸盐缓冲液(0.1m，ph9.5)中用dopc和胆固醇(类脂，德国)重构。然后将疫苗组分冻干形成干饼。仅在注射之前，将干饼在isa51vg油(seppic，法国)中重构。
用含有100微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组1(n＝6)小鼠。
用含有100微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组2(n＝6)小鼠。
用含有50微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组3(n＝6)小鼠。
用含有50微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组4(n＝6)小鼠。
组5(n＝1)小鼠未接种。
接种后八天，将小鼠处死并收集脾脏。用未装载(背景)或装载有无关肽(rahynivtf；seqidno：8)或mut30新抗原的同源树突细胞在ifn-γelispot板(bd生物科学)中刺激脾细胞。培养18小时后，将板展开并用immunospotreader(c.t.l.)计数斑点形成单位(sfu)数。结果以平均响应±sem在图2中显示。用邦弗朗尼事后检验法通过双因素anova进行统计分析比较针对mut30肽的组响应。比较使用基于dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)和基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)两者的高(100微克)剂量和低(50微克)剂量mut30新抗原，在组间未观察到统计学显著的差异。
结果表明形成油基储库的疫苗在单一免疫后产生了相当的针对高(100微克)剂量和较低(50微克)剂量抗原的新抗原肽的免疫应答。
实施例4
不含病原体的c57bl/6ncrl小鼠，6-8周龄，购自charlesriver实验室(st.constant,pq)并根据制度指南安置(饲养，housed)，在过滤器控制的空气循环下自由饮水和食物。由castle2012鉴定并通过genscript合成新抗原(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl；seqidno：2)。
用基于rna或dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)分子制备两种油基制剂，并将其与含有基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)的水性缓冲液疫苗进行比较。水性缓冲液疫苗被设计以模拟castle2012中描述的制剂。
为了制备油基制剂，先将mut30肽、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)佐剂(dna或rna)和t辅助表位(a16l肽)在醋酸盐缓冲液(0.1m，ph9.5)中用dopc和胆固醇(类脂，德国)重构。然后将疫苗组分冻干形成干饼。仅在注射之前，将干饼在isa51vg油(seppic，法国)中重构。
为了制备水基制剂，在ph10.0±1的0.1m磷酸盐缓冲盐水中配制mut30肽和基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)佐剂。
用ph6.0的0.05m醋酸钠缓冲液中含有100微克mut30新抗原和100微克基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)的100微升水性缓冲制剂接种组1(n＝5)小鼠。
用含有50微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于rna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组2(n＝5)小鼠。
用含有50微克mut30新抗原、50微克a16l肽、40微克基于dna的多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyi：c)、12毫克dopc和1.2毫克胆固醇的100微升油基储库疫苗接种组3(n＝4)小鼠。
组4(n＝1)小鼠未接种。
接种后八天，将小鼠处死并收集脾脏。用未装载(背景)或装载有无关肽(egprnqdwl；seqidno：9)或mut30新抗原的同源树突细胞在ifn-γelispot板(bd生物科学)中刺激脾细胞。培养18小时后，将板展开并用immunospotreader(c.t.l.)计数斑点形成单位(sfu)数。结果以平均响应±sem在图3中显示。用邦弗朗尼事后检验法通过双因素anova进行统计分析比较针对mut30肽的组响应，*p<0.05，***p<0.001。
结果表明与水性非形成储库的疫苗相比，形成油基储库的疫苗在单一免疫后产生针对新抗原肽的更强的免疫应答。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过参考并入本文，如同每一个独立的出版物或专利申请具体地并单独地表示为通过参考并入。任何出版物的引用是针对其在申请日前的公开内容并且不应被解释为承认本发明不能凭借在先发明而享有先于这样的出版物之前的资格。
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必须注意的是本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一、”“一个、”和“该”包括复数提及，除非上下文以其它方式明确规定。除非以其它方式限定，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所述领域普通技术人员常规理解的相同含义。
如在本文说明书和权利要求中使用的词组“和/或，”应当被理解意为如此连接的要素的“任一个或两者”，即，在某些情况下以连接方式存在而在其它情况下以分离方式存在的要素。以“和/或”列举的多个要素应以相同方式被理解，即，如此连接的“一个或多个”要素。除了“和/或”从句具体识别的要素之外其它要素可任选地存在，不论与具体识别的那些要素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言如“包括”一起使用时“a和/或b”的提及可在一个实施方式中仅指代a(任选地包括除b外的要素)；可在另一个实施方式中仅指代b(任选地包括除a外的要素)；在再另一个实施方式中指代a与b两者(任选地包括其它要素)；等等。
如本文说明书和权利要求中使用的，“或”应被理解为包括与上文限定的“和/或”相同的含义。例如，当在列举中区分项目时，“或”或“和/或”将被解释为以包括，即，包括至少一个，还包括多于一个、多个或一列要素以及任选地另外未列举的项目。
如本文使用的，不管在说明书还是所附权利要求中，过渡术语“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”和类似词将被理解为包括或开放式(即，意为包括但不限于)，并且它们不排除未限定的要素、材料或方法步骤。只有过渡短语“由…构成”和基本由…构成”分别是关于本文权利要求和示例性实施方式段落的闭合或半闭合过渡短语。过渡短语“由…构成”排除了未具体限定的任何要素、步骤、或成分。过渡短语“基本由…组成”将范围限定至指定要素、材料或步骤以及限定至不实质影响本文公开和/或要求保护的发明的基本特性(一个或多个)的那些。
参考文献：
1)agger,e.m.；rosenkrands,i.；olsen,a.w.；hatch,g.；williams,a.；kritsch,c.；lingnau,k.；vongabain,a.；andersen,c.s.；korsholm,k.s.；andersen,p.(2006)protectiveimmunitytotuberculosiswithag85b-esat-6inasyntheticcationicadjuvantsystemic31,vaccine24(26),5452-5460.
2)alexopoulou,l.；holt,a.c.；medzhitov,r.；flavell,r.a.(2001)recognitionofdouble-strandedrnaandactivationofnf-κbbytoll-likereceptor3,nature413(6857),732-738.
3)awasthi,a.；mehrotra,s.；bhakuni,v.；dutta,g.p.；levy,h.b.；maheshwari,r.k.(1997)polyiclcenhancestheantimalarialactivityofchloroquineagainstmultidrug-resistantplasmodiumyoeliinigeriensisinmice,j.interferoncytokineres.17(7),419-423.
4)banga,a.k.therapeuticpeptidesandproteins,formulation,processinganddeliverysystems(lancaster,pa:technomicpublishingco.,1995).
5)bever,c.t.jr.；salazar,a.m.；neely,e.；ferraraccio,b.e.；rose,j.w.；mcfarlandh.f.；levy,h.b.；mcfarlin,d.e.(1986)preliminarytrialofpolyiclcinchronicprogressivemultiplesclerosis,neurology36(4),494-498.
6)bobst,a.m.；langemeier,p.w.；torrence,p.f.；declercq,e.(1981)interferoninductionbypoly(inosinicacid)·poly(cytidylicacid)segmentedbyspin-labels,biochemistry20(16),4798-4803.
7)brewer,k.d.；lake,k.；pelot,n.；stanford,m.m.；debay,d.r.；penwell,a.；weir,g.m.；karkada,m.；mansour,m.；bowen,c.v.(2014)clearanceofdepotvaccinespio-labeledantigenandsubstratevisualizedusingmri,vaccine32(51),6956-6962.
8)bruce,w.r.；meeker,b.e.；valeriote,f.a.(1996)comparisonofthesensitivityofnormalhematopoieticandtransplantedlymphomacolony-formingcellstochemotherapeuticagentsadministeredinvivo,j.natl.cancerinst.37(2),233-245.
9)cabner,b.a.(2011)cancerchemotherapyandbiotherapy:principlesandpractice,5thedition,lippincottwilliams&wilkins,pa,usa.
10)castle,j.c.；kreiter,s.；diekmann,j.；
11)celis,e.；ou,d.；otvos,l.jr.(1988)recognitionofhepatitisbsurfaceantigenbyhumantlymphocytes.proliferativeandcytotoxicresponsestoamajorantigenicdeterminantdefinedbysyntheticpeptides,j.immunol.140,1808-1815.
12)chong,p.；zobrist,g.；sia,c.；loosmore,s.；klein,m.(1992)identificationoft-andb-cellepitopesofthes2ands3subunitsofpertussistoxinbyuseofsyntheticpeptides,infectimmun.60,4640–4647.
13)chirigos,m.a.；schlick,e.；ruffmann,r.；budzynski,w.；sinibaldi,p.；gruys,e.(1985)pharmacokineticandtherapeuticactivityofpolyinosinic-polycytidylicacidstabilizedwithpoly-l-lysineincarboxymethylcellulose[poly(i,c)-lc],j.biol.responsemod.4(6),621-627.
14)cohen,j.l.；jao,j.y.；jusko,w.j.(1971)pharmacokineticsofcyclophosphamideinman,br.j.pharmacol.43(3),677-680.
15)coliganetal.,ed.currentprotocolsinimmunology,wileyinterscience,2007.
16)cui,z.；qiu,f.(2006)syntheticdouble-strandedrnapoly(i:c)asapotentpeptidevaccineadjuvant:therapeuticactivityagainsthumancervicalcancerinarodentmodel,cancerimmunol.immunother.55(10),1267-1279.
17)d'incalci,m.；bolis,g.；facchinetti,t.；mangioni,c.；morasca,l.；morazzoni,p.；salmona,m.(1979)decreasedhalflifeofcyclophosphamideinpatientsundercontinualtreatment,eur.j.cancer15(1),7-10.
18)declercq,e.；hattori,m.；ikehara,m.(1975)antiviralactivityofpolynucleotides:copolymersofinosinicacidandn2-dimethylguanylicof2-methylthioinosinicacid,nucleicacidsres.2(1),121-129.
19)declercq,e.；torrence,p.f.；stollar,b.d.；hobbs,j.；fukui,t.；kakiuchi,n.；ikehara,m.(1978)interferoninductionbya2'-modifieddouble-helicalrna,poly(2'-azido-2'-deoxyinosinicacid).polycytidylicacid,eur.j.biochem.88(2),341-349.
20)dejonge,m.e.；huitema,a.d.r.；rodenhuis,s.；beijnen,j.h.(2005)clinicalpharmacokineticsofcyclophosphamide,clin.pharmacokinet.44(11),1135–1164.
21)demotz,s.；lanzavecchia,a.；eisel,u.；niemann,h.；widmann,c.；corradin,g.p.(1989)delineationofseveraldr-restrictedepitopesintetanustoxin,j.immunol.142,394-402.
22)diethelm-okita,b.m.；okita,d.k.；banaszak,l.；conti-fine,b.m.(2000)universalepitopesforhumancd4+cellsontetanusanddiphtheriatoxins,j.infect.dis.181,1001–1009.
23)dong,l.w.；kong,x.n.；yan,h.x.；yu,l.x.；chen,l.；yang,w.；liu,q.；huang,d.d.；wu,m.c.；wang,h.y.(2008)signalregulatoryproteinalphanegativelyregulatesbothtlr3andcytoplasmicpathwaysintypeiinterferoninduction,mol.immunol.45(11),3025-3035.
24)droller,m.j.(1987)immunotherapyofmetastaticrenalcellcarcinomawithpolyinosinic-polycytidylicacid,j.urol.137(2),202-206.
25)duan,f.；duitama,j.；alseesi,s.；ayres,c.m.；corcelli,s.a.；pawashe,a.p.；blanchard,t.；mcmahon,d.；sidney,j.；sette,a.；baker,b.m.；mandoiu,i.i.；srivastava,p.k.(2014)genomicandbioinformaticprofilingofmutationalneoepitopesrevealsnewrulestopredictanticancerimmunogenicity,j.exp.med.211(11),2231-48.
26)durie,b.g.；levy,h.b.；voakes,j.；jett,j.r.；levine,a.s.(1985)poly(i,c)-lcasaninterferoninducerinrefractorymultiplemyeloma,j.biol.responsemod.4(5),518-524.
27)emmenegger,u.；shaked,y.；man,s.；bocci,g.；spasojevic,i.；francia,g.；kouri,a.；coke,r.；cruz-munoz,w.；ludeman,s.m.,colvin,o.m.；kerbel,r.s.(2007)pharmacodynamicandpharmacokineticstudyofchroniclow-dosemetronomiccyclophosphamidetherapyinmice,mol.cancerther.6,2280–2289.
28)emmenegger,u.；francia,g.；chow,a.；shaked,y.；kouri,a.；man,s.；kerbel,r.s.(2011)tumorsthatacquireresistancetolow-dosemetronomiccyclophosphamideretainsensitivitytomaximumtolerateddosecyclophosphamide,neoplasia13(1),40-48.
29)frezard,f.(1999)liposomes:frombiophysicstothedesignofpeptidevaccines,braz.j.med.bio.res.32,181-189.
30)fujimura,t.；nakagawa,s.；ohtani,t.；ito,y.；aiba,s.(2006)inhibitoryeffectofthepolyinosinic-polycytidylicacid/cationicliposomeontheprogressionofmurineb16f10melanoma,eur.j.immunol.36(12),3371-3380.
31)fukui,t.；kakiuchi,n.；ikehara,m.(1977)polynucleotides.xlvsynthesisandpropertiesofpoly(2'-azido-2'-deoxyinosinicacid),nucleicacidsres.4(8),2629-2639.
32)gowen,b.b.；wong,m.h.；jung,k.h.；sanders,a.b.；mitchell,w.m.；alexopoulou,l.；flavell,r.a.；sidwell,r.w.(2007)tlr3isessentialfortheinductionofprotectiveimmunityagainstpuntatorovirusinfectionbythedouble-strandedrna(dsrna),poly(i:c12u),butnotpoly(i:c):differentialrecognitionofsyntheticdsrnamolecules,j.immunol.178(8),5200-5208.
33)greene,j.j.；alderfer,j.l.；tazawa,i.；tazawa,s.；ts'o,p.o.；o'malley,j.a.；carter,w.a.(1978)interferoninductionanditsdependenceontheprimaryandsecondarystructureofpoly(inosinicacid).poly(cytidylicacid),biochemistry17(20),4214-4220.
34)gregoriadisg.(1990)immunologicaladjuvants:aroleforliposomes,immunol.today11,89-97.
35)guschlbauer,w.；blandin,m.；drocourt,j.l.；thang,m.n.(1977)poly-2'-deoxy-2'-fluoro-cytidylicacid:enzymaticsynthesis,spectroscopiccharacterizationandinteractionwithpoly-inosinicacid,nucleicacidsres.4(6),1933-1943.
36)hendrix,c.w.；margolick,j.b.；petty,b.g.；markham,r.b.；nerhood,l.；farzadegan,h.；ts'o,p.o.；lietman,p.s.(1993)biologiceffectsafterasingledoseofpoly(i):poly(c12u)inhealthyvolunteers,antimicrob.agentschemother.37(3),429-435.
37)horn,t.；vasser,m.p.；struble,m.e.；crea,r.(1980)synthesisofoligonucleotidesoncellulose.partii:designandsyntheticstrategytothesynthesisof22oligodeoxynucleotidescodingforgastricinhibitorypolypeptide(gip),nucleicacidssymp.ser.(7),225-232.
38)houston,w.e.；crabbs,c.l.；stephen,e.l.；levy,h.b.(1976)modifiedpolyriboinosinic-polyribocytidylicacid,animmunologicaladjuvant,infect.immun.14(1),318-319.
39)ichinohe,t.；tamura,s.；kawaguchi,a.；ninomiya,a.；imai,m.；itamura,s.；odagiri,t.；tashiro,m.；takahashi,h.；sawa,h.；mitchell,w.m.；strayer,d.r.；carter,w.a.；chiba,j.；kurata,t.；sata,t.；hasegawa,h.(2007)cross-protectionagainsth5n1influenzavirusinfectionisaffordedbyintranasalinoculationwithseasonaltrivalentinactivatedinfluenzavaccine,j.infect.dis.196(9),1313-1320.
40)irvinedj,swartzma,szetogl.engineeringsyntheticvaccinesusingcuesfromnaturalimmunity.natmater.2013nov；12(11):978-90.doi:10.1038/nmat3775.
41)johnston,m.i.；stollar,b.d.；torrence,p.f.；witkop,b.(1975)structuralfeaturesofdouble-strandedpolyribonucleotidesrequiredforimmunologicalspecificityandinterferoninduction,proc.natl.acad.sci.u.s.a.72(11),4564-4568.
42)juma,f.d.,rogers,h.j.；trounce,j.r.(1979)pharmacokineticsofcyclophosphamideandalkylatingactivityinmanafterintravenousandoraladministration,br.j.clin.pharmacol.8(3),209–217.
43)kamath,a.t.；valenti,m.p.；rochat,a.f.；agger,e.m.；lingnau,k.；vongabain,a.；andersen,p.；lambert,p.h.；siegrist,c.a.(2008)protectiveanti-mycobacterialtcellresponsesthroughexquisiteinvivoactivationofvaccine-targeteddendriticcells,eur.j.immunol.38(5),1247-1256.
44)kende,m.；lupton,h.w.；rill,w.l.；gibbs,p.；levy,h.b.；canonico,p.g.(1987)rankingofprophylacticefficacyofpoly(iclc)againstriftvalleyfevervirusinfectioninmicebyincrementalrelativeriskofdeath,antimicrob.agentschemother.31(8),1194-1198.
45)kimr,emim,tanabek.cancerimmunoeditingfromimmunesurveillancetoimmuneescape.immunology.2007may；121(1):1-14.epub2007mar26.
46)kreuter,j.,ed.(1994),colloidaldrugdeliverysystems,vol.66,marceldekker,inc.
47)krown,s.e.；kerr,d.；stewart,w.e.2nd；field,a.k.；oettgen,h.f.(1985)phaseitrialsofpoly(i,c)complexesinadvancedcancer,j.biol.responsemod.4(6),640-649.
48)levy,h.b.(1985)historicaloverviewoftheuseofpolynucleotidesincancer,j.biol.responsemod.4(5),475-480.
49)levy,h.b；lvovsky,e.(1978)topicaltreatmentofvacciniavirusinfectionwithaninterferoninducerinrabbits,j.infect.dis.137(1),78-81.
50)llopiz,d.；dotor,j.；zabaleta,a.；lasarte,j.j.；prieto,j.；borrás-cuesta,f.；sarobe,p.(2008)combinedimmunizationwithadjuvantmoleculespoly(i:c)andanti-cd40plusatumorantigenhaspotentprophylacticandtherapeuticantitumoreffects,cancerimmunol.immunother.57(1),19-29.
51)merrifield,b.(1997)conceptandearlydevelopmentofsolid-phasepeptidesynthesis,methodsenzymol.289,3-13.
52)mouridsen,h.t.；faber,o.；skovsted,l.(1974)thebiotransformationofcyclophosphamideinman:analysisofthevariationinnormalsubjects,actapharmacol.toxicol.(copenh)35(2),98-106.
53)moyle,p.m.；toth.i.(2008)self-adjuvantinglipopeptidevaccines,curr.med.chem.15(5),506-516.
54)mullard,a.(2016)thecancervaccineresurgence,natrevdrugdisc15(10):663-665.
55)nakamura,o.；shitara,n.；matsutani,m.；takakura,k.；machida,h.(1982)phasei-iitrialsofpoly(iclc)inmalignantbraintumorpatients,j.interferon.res.2(1),1-4.
56)padalko,e.；nuyens,d.；depalma,a.；verbeken,e.；aerts,j.l.；declercq,e.；carmeliet,p.；neyts,j.(2004)theinterferoninducerampligen[poly(i)-poly(c12u)]markedlyprotectsmiceagainstcoxsackieb3virus-inducedmyocarditis,antimicrob.agentschemother.48(1),267-274.
57)poast,j.；seidel,h.m.；hendricks,m.d.；haslam,j.a.；levy,h.b.；baron,s.(2002)polyi:clcinductionoftheinterferonsysteminmice:aninitialstudyoffourdetectionmethods,j.interferoncytokineres.22(10),1035-1040.
58)puri,s.k.；dutta,g.p.；levy,h.b.；maheshwari,r.k.(1996)polyiclcinhibitsplasmodiumcynomolgibmalariainfectioninrhesusmonkeys,j.interferon.cytokineres.16(1),49-52.
59)reagan-shaw,s.；nihal,m.；ahmad,n.(2008)dosetranslationfromanimaltohumanstudiesrevisited,fasebj.,22(3),659-661.
60)remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easton,pa.,usa1985
61)riedl,k.；riedl,r.；vongabain,a.；nagy,e.；lingnau,k.(2008)thenoveladjuvant
62)roberge,j.y.；beebe,x.；danishefsky,s.j.(1995)astrategyforaconvergentsynthesisofn-linkedglycopeptidesonasolidsupport,science269(5221),202-204.
63)salazar,a.m.；levy,h.b.；ondra,s.；kende,m.；scherokman,b.；brown,d.；mena,h.；martin,n.；schwab,k.；donovan,d.；dougherty,d.；pulliam,m.；ippolito,m.；graves,m.；brown,h.；ommaya,a.(1996)long-termtreatmentofmalignantgliomaswithintramuscularlyadministeredpolyinosinic-polycytidylicacidstabilizedwithpolylysineandcarboxymethylcellulose:anopenpilotstudy,neurosurgery38(6),1096-1103,discussionat1103-1104.
64)salem,m.l.；kadima,a.n.；cole,d.j.；gillanders,w.e.(2005)definingtheantigen-specifict-cellresponsetovaccinationandpoly(i:c)/tlr3signaling:evidenceofenhancedprimaryandmemorycd8t-cellresponsesandantitumorimmunity,j.immunother.28(3),220-228.
65)salem,m.l.；el-naggar,s.a.；kadima,a.；gillanders,w.e.；cole,d.j.(2006)theadjuvanteffectsofthetoll-likereceptor3ligandpolyinosinic-cytidylicacidpoly(i:c)onantigen-specificcd8+tcellresponsesarepartiallydependentonnkcellswiththeinductionofabeneficialcytokinemilieu,vaccine24(24),5119-5132.
66)sarma,p.s.；shiu,g.；neubauer,r.h.；baron,s.；huebner,r.j.(1969)virus-inducedsarcomaofmice:inhibitionbyasyntheticpolyribonucleotidecomplex,proc.natl.acad.sci.u.s.a.62(4),1046-1051.
67)schellack,c.；prinz,k.；egyed,a.；fritz,j.h.；wittmann,b.；ginzler,m.；swatosch,g.；zauner,w.；kast,c.；akira,s.；vongabain,a.；buschle,m.；lingnau,k.(2006)ic31,anoveladjuvantsignalingviatlr9,inducespotentcellularandhumoralimmuneresponses,vaccine24(26),5461-5472.
68)schumacher,t.n.；schreiber,r.d.(2015)neoantigensincancerimmunotherapy,science348(6230),69-74.
69)slingluff,c.l.jr.；yamshchikov,g.；neese,p.；galavotti,h.；eastham,s.；engelhard,v.h.；kittlesen,d.；deacon,d.；hibbitts,s.；grosh,w.w.；petroni,g.；cohen,r.；wiernasz,c.；patterson,j.w.；conway,b.p.；ross,w.g.(2001)phaseitrialofamelanomavaccinewithgp100(280–288)peptideandtetanushelperpeptideinadjuvant:immunologicandclinicaloutcomes,clincancerres.7,3012–3024.
70)sloat,b.r.；shaker,d.s.；le,u.m.；cui,z.(2008)nasalimmunizationwiththemixtureofpa63,lf,andapgaconjugateinducedstrongantibodyresponsesagainstallthreeantigens,femsimmunol.med.microbiol.52(2),169-179.
71)smith,p.c.；sladek,n.e.(1985)sensitivityofmurineb-andt-lymphocytestooxazaphosphorineandnon-oxazaphosphorinenitrogenmustards,biochem.pharmacol.34(19),3459-3463.
72)so,n.s.y.；ostrowski,m.a.；gray-owen,s.d.(2012)vigorousresponseofhumaninnatefunctioningigmmemorybcellsuponinfectionbyneisseriagonorrhoeae,j.immunol.188(8),4008-4022.
73)srivastava,p.(2015)neoepitopesofcancers:lookingback,lookingahead,cancerimmunol.res.3,969-977.
74)stephen,e.l.；sammons,m.l.；pannier,w.l.；baron,s.；spertzel,r.o.；levy,h.b.(1977)effectofanuclease-resistantderivativeofpolyriboinosinic-polyribocytidylicacidcomplexonyellowfeverinrhesusmonkeys(macacamulatta),j.infect.dis.136(1),122-126.
75)talmadge,j.e.；adams,j.；phillips,h.；collins,m.；lenz,b.；schneider,m.；chirigos,m.(1985)immunotherapeuticpotentialinmurinetumormodelsofpolyinosinic-polycytidylicacidandpoly-l-lysinesolubilizedbycarboxymethylcellulose,cancerres.45(3),1066-1072.
76)theunitedstatespharmacopoeia:thenationalformulary(usp24nf19)publishedin1999
77)theriault,r.l.；hortobagyi,g.n.；buzdar,a.u.；levy,h.b.；hersh,e.m.(1986)evaluationofpolyinosinic-polycytidylicandpoly-l-lysineinmetastaticbreastcancer,cancertreat.rep.70(11),1341-1342.
78)trumpfheller,c.；caskey,m.；nchinda,g.；longhi,m.p.；mizenina,o.；huang,y.；schlesinger.s.j.；colonna,m.；steinman,r.m.(2008)themicrobialmimicpolyicinducesdurableandprotectivecd4+tcellimmunitytogetherwithadendriticcelltargetedvaccine,proc.natl.acad.sci.u.s.a.105(7),2574-2579.
79)yoneyama,m.；kikuchi,m.；natsukawa,t.；shinobu,n.；imaizumi,t.；miyagishi,m.；taira,k.；akira,s.；fujita,t.(2004)thernahelicaserig-ihasanessentialfunctionindouble-strandedrna-inducedinnateantiviralresponses,nat.immunol.5(7),730-737.
80)zaks,k.；jordan,m.；guth,a.；sellins,k.；kedl,r.；izzo,a.；bosio,c.；dow,s.(2006)efficientimmunizationandcross-primingbyvaccineadjuvantscontainingtlr3ortlr9agonistscomplexedtocationicliposomes,j.immunol.176(12),7335-7345.
81)zhang,j.；tian,q.；yungchan,s.；chuenli,s.；zhou,s.；duan,w.；zhu,y.z.(2005)metabolismandtransportofoxazaphosporinesandtheclinicalimplications,drug.metab.rev.37(4),611-703.
82)zhao,j.；cao,y.；lei,z.；yang,z.；zhang,b.；huang,b.(2010)selectivedepletionofcd4+cd25+foxp3+regulatorytcellsbylow-dosecyclophosphamideisexplainedbyreducedintracellularatplevels,cancerres.70(12),4850-4858.
83)zhu,x.；nishimura,f.；sasaki,k.；fujita,m.；dusak,j.e.；eguchi,j.；fellows-mayle,w.；storkus,w.j.；walker,p.r.；salazar,a.m.；okada,h.(2007)tolllikereceptor-3ligandpoly-iclcpromotestheefficacyofperipheralvaccinationswithtumorantigen-derivedpeptideepitopesinmurinecnstumormodels,j.transl.med.5(10),1-15.
序列表
<110>免疫疫苗技术有限公司
<120>包含两亲化合物、新抗原和疏水载体的疫苗组合物及其使用方法
<130>78961-198
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<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>连接至pam2或pam3
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<221>被修饰的碱基
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<223>肌苷
<220>
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<221>misc_特征
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<223>xaa可以是环己基丙氨酰基
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alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaala
1510
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>来自破伤风类毒素肽的t辅助表位(f21e)
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151015
alaserhisleuglu
20
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<212>prt
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<223>无关肽(r9f)
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15
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<212>prt
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gluglyproargasnglnasptrpleu
15
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