含有REIC/Dkk-3蛋白作为有效成分的TGFβ抑制剂的制作方法

本发明涉及在组织、器官中减弱转化生长因子β(tgfβ)的活性的tgfβ抑制剂，其能够通过抑制tgfβ而改善tgfβ相关疾病的病情。

背景技术：

在人的多数正常组织中普遍表达的分泌蛋白reic在多数癌细胞中表达丧失，根据其发现经过，在2000年被命名为永生化细胞中表达下调(reducedexpressioninimmortalizedcell)(reic)蛋白。进一步，根据结构特征，其属于dickkopf(dkk)家族，通用名被称为reic/dkk-3。使强制表达该reic/dkk-3蛋白的腺病毒载体(ad-reic)感染癌细胞时，在癌细胞内会诱导伴随内质网应激的凋亡。该凋亡诱导是癌细胞特异性的、在正常细胞中确认不到的现象，因而开始了针对癌症的基因治疗的临床研究，目前的状况是正在对有效性和安全性进行确认。另一方面，关于分泌到细胞外的reic蛋白的功能，仍有许多未阐明的方面。在2008年发现该reic蛋白从血液中的单核细胞诱导树突细胞样的分化，并明确该活性提高了抗癌免疫活性(参见专利文献1)。另外，在2010年发现这些抗癌免疫活性的诱导集中在reic蛋白中的分子量17kda的富含半胱氨酸的结构域(参见专利文献2)，发现了reic蛋白的药效成分的最小结构域。

近年来，肿瘤免疫学研究得以进展，在2010年以后出现的抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、抗ccr4抗体等“免疫检查点抑制剂”可解除肿瘤局部的免疫抑制状态，在针对黑色素瘤和肺癌的临床试验中实现了大幅高于化学疗法的生命延长效果。

解除肿瘤局部的免疫抑制状态、使肿瘤免疫应答再激活的治疗作为qol高的癌症治疗的备选项必定会成为今后的支柱。在一部分的预测中，预见在今后10年内将向60％的晚期癌症患者施用免疫检查点抑制剂(参见非专利文献1)。但是，现有的免疫检查点抑制剂(抗pd-1抗体)的有效率为20～30％，在有多种免疫抑制分子参与的肿瘤局部，期待通过同时阻断多个作用点的生物药品的合用来进一步改善有效率。

作为分泌蛋白的tgfβ表现出多种多样的生理活性，已知在肿瘤局部通过由癌细胞等分泌的tgfβ诱导出调节性t细胞(treg细胞)，从而诱导免疫抑制状态。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：wo2009/119874

专利文献2：wo2012/002582

非专利文献

非专利文献1：ledfordh.nature508,7494,24-26(2014)

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供一种通过抑制tgfβ的信号转导而预防或治疗tgfβ相关疾病的药物。本发明的目的特别是在于提供一种能够通过与tgfβ受体结合、抑制基于tgfβ的treg诱导活性而恢复/激活抗癌免疫活性的药物。

用于解决课题的手段

本发明人研究了reic/dkk-3蛋白在细胞外相互作用的物质。其结果，作为reic/dkk-3蛋白相互作用的分子，确定了tgfβ受体。分泌到细胞外的reic/dkk-3蛋白的相互作用分子的鉴定、作用机理的阐明是一项长期的课题。本发明人大量生产了重组蛋白，构建出一种即使在低亲和性的相互作用下也可检测出的评价系统，由此成功进行了目标分子的鉴定和验证。本发明人根据tgfβ的功能发现，reic/dkk-3蛋白抑制tgfβ与tgfβ受体的结合、抑制tgfβ的信号转导。该发现表明，reic/dkk-3可作为解除肿瘤局部的免疫抑制状态、恢复/激活肿瘤免疫应答癌症免疫治疗药使用。即，reic/dkk-3蛋白与tgfβ受体结合，抑制基于tgfβ的调节性t细胞(treg)诱导活性，由此能够恢复/激活抗癌免疫活性。这样的reic蛋白所显示出的抗癌免疫活性的激活与免疫检查点抑制剂为同样的作用，reic/dkk-3作为可用于癌症的预防或治疗的蛋白制剂也是一种非常有前途的分子。

另外，本发明人发现，reic/dkk-3可通过抑制tgfβ的信号转导而用于tgfβ相关疾病的预防或治疗。

作为基于本发明的reic蛋白的用途，可以举出以下用途。

(1)解除肿瘤局部的免疫抑制状态的免疫调节剂。通过与现有的免疫检查点抑制剂合用，改善癌症免疫治疗。

(2)在ad-reic治疗(使用腺病毒载体的reic/dkk-3基因治疗)中成功的作用机理为下述的“致敏效应”与“加强效应”的协同效应，该致敏效应是伴随由ad-reic所致的凋亡诱导使癌抗原露出的效应，该加强效应是利用分泌出的reic蛋白在肿瘤局部激活树突细胞等而激活肿瘤免疫应答的效应。在后者的加强效应的表达中通过抑制tgfβ的信号转导而抑制调节性t细胞(treg)诱导的相关机理已得到阐明，因而可以将使癌抗原露出的致敏作用替换成现有的抗癌剂或放射线治疗等、并且将后者的加强效应用reic蛋白制剂进行替换，扩展了癌症治疗的选择范围。

(3)tgfβ的多种多样的功能不仅与癌症相关，而且还与器官或组织的纤维化等各种疾病相关。温和地抑制tgfβ活性的reic的效果具有能够带来各种病情的改善的可能性，是重要的创新药物靶标。

即，本发明如下所述。

[1]一种tgfβ抑制剂，其含有reic/dkk-3蛋白或包含其富含半胱氨酸的结构域的部分蛋白、或者编码它们的dna作为有效成分。

[2]如[1]所述的tgfβ抑制剂，其含有reic/dkk-3蛋白或包含其富含半胱氨酸的结构域的部分蛋白作为有效成分，其中，上述tgfβ抑制剂在作用用量为50nm以上的浓度区域浓度依赖性地抑制tgfβ与其受体的反应。

[3]如[1]或[2]所述的tgfβ抑制剂，其中，即使作用用量为高用量，也不会完全抑制tgfβ与其受体的反应。

[4]如[3]所述的tgfβ抑制剂，其中，即使作用用量为375nm以上，也不会完全抑制tgfβ与其受体的反应。

[5]一种抗肿瘤免疫激活剂，其包含[1]～[4]中任一项所述的tgfβ抑制剂。

[6]一种tgfβ相关疾病的预防或治疗剂，其包含[1]～[4]中任一项所述的tgfβ抑制剂。

[7]如[6]所述的tgfβ相关疾病的预防或治疗剂，其中，上述预防或治疗剂作用于免疫系统细胞，抑制免疫系统细胞中的tgfβ与其受体的反应。

[8]如[6]或[7]所述的tgfβ相关疾病的预防或治疗剂，其中，上述预防或治疗剂通过不完全地抑制tgfβ与其受体的反应，能够降低因tgfβ的抑制所致的副作用。

[9]如[6]～[8]中任一项所述的tgfβ相关疾病的预防或治疗剂，其中，上述预防或治疗剂在作用用量为50nm以上的浓度下浓度依赖性地抑制tgfβ与其受体的反应，并且，即使在375nm以上的高浓度下也不会完全抑制tgfβ与其受体的反应。

[10]如[6]～[9]中任一项所述的预防或治疗剂，其中，tgfβ相关疾病为癌症，上述预防或治疗剂激活抗肿瘤免疫。

[11]如[10]所述的预防或治疗剂，其中，上述预防或治疗剂解除由癌细胞分泌的tgfβ所诱导的调节性t细胞介导的免疫抑制状态，恢复并激活免疫细胞对癌细胞的攻击。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2016-121187号的公开内容。

发明的效果

得出了下述机理可以起作用的结论：reic/dkk-3蛋白与tgfβ受体i和ii的细胞外结构域以低亲和性结合，并且竞争性地抑制tgfβ的生理活性。再次确认了已经在基因疗法(ad-reic)中进行了临床开发的reic创新药物的合理性，此外还明确了抗癌免疫作用的全貌，能够作为蛋白制剂使用。通过与现有的免疫检查点抑制剂合用或者与现有的抗癌剂、放射线治疗等组合来恢复/激活肿瘤免疫应答，能够实现更为有效的癌症免疫治疗。

附图说明

图1是示出reic/dkk-3蛋白的结构示意图的图。

图2是示出tgfβri-ecd的碱基序列和氨基酸序列的图。图中，由斜体字表示的部分表示分泌信号序列，下划线部表示tgfβri-ecd的序列。在c末端侧附加有his标签。

图3是示出利用tgfβri与fl-reic、reic-c结构域或富含半胱氨酸的结构域蛋白(reic-17kda)的共表达系统进行的结合实验的结果的图。图3a表示结合方式，图3b表示sds-page的结果。

图4是示出利用reic/dkk-3蛋白与tgfβri-fc或tgfβrii-fc的共表达系统进行的结合实验的结果的图。

图5是示出利用elisa进行的reic蛋白与tgfβri-fc或tgfβrii-fc的结合实验的结果的图。

图6是示出由reic/dkk-3蛋白所致的针对el4细胞的tgfβ信号的竞争抑制实验的结果的图。

图7是示出确认reic/dkk-3蛋白对免疫调节因子tgfβ的竞争抑制的生物检测的结果的图。

图8是示出以重组蛋白形式使用富含半胱氨酸的结构域蛋白时所使用的dna序列及其氨基酸序列的图。

图9是示出由reic/dkk-3蛋白所致的针对el-4细胞和人成纤维细胞的tgfβ信号的竞争抑制实验的结果的图。

图10是示出reic蛋白对tgfβ通路的抑制效果(基于报告基因的效果)的图。

图11是示出各添加浓度的reic蛋白对tgfβ通路的抑制效果(基于报告基因的效果)的图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明为一种含有reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白、或者编码它们的dna作为有效成分的tgfβ(转化生长因子)抑制剂。tgfβ抑制剂也称为tgfβ信号转导抑制剂。

reic/dkk-3dna(reic基因)的全长碱基序列和该基因所编码的蛋白的氨基酸序列分别如序列号1和序列号2所示。在序列号2表示的氨基酸序列中，由第1位到第21位氨基酸构成的序列被预测为信号序列。

如图1所示，reic/dkk-3蛋白具有n末端结构域、富含半胱氨酸的结构域和c末端结构域。

本发明的reic/dkk-3蛋白(reic蛋白)可以为全长蛋白，可以为由reic/dkk-3蛋白的部分区域构成的部分蛋白，也可以为至少包含reic/dkk-3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的部分蛋白。富含半胱氨酸的结构域是分子量为17kd的结构域，是承担reic/dkk-3蛋白的免疫活性的最小结构域。作为这样的部分蛋白，可以举出富含半胱氨酸的结构域蛋白(reic-17kda(sge-reic-17kda))、从全长reic/dkk-3蛋白中使n末端的120个氨基酸缺失而成的部分蛋白((reicc结构域(sge-reic-c))。富含半胱氨酸的结构域蛋白是由序列号2表示的reic/dkk-3蛋白的氨基酸序列的第135位到第288位的氨基酸序列构成的区域。编码富含半胱氨酸的结构域蛋白的dna的碱基序列由序列号3表示、氨基酸序列由序列号4表示。另外，从全长reic/dkk-3蛋白中使n末端的120个氨基酸缺失而成的部分蛋白为由序列号2表示的reic/dkk-3蛋白的氨基酸序列的第142位到第350位的氨基酸序列构成的区域。编码从全长reic/dkk-3蛋白中使n末端的120个氨基酸缺失而成的部分蛋白的dna的碱基序列由序列号5表示、氨基酸序列由序列号6表示。

在实际以重组蛋白形式制作部分蛋白时，在连接有reic/dkk-3的n末端的信号序列的状态下合成蛋白，使其从宿主细胞中分泌出。此时，按照在通过加工产生的分泌信号的切割位点的下游残留几个氨基酸来进行设计，因而在所制作的部分蛋白的n末端侧附加有由序列号2表示的reic/dkk-3全长蛋白的信号肽的c末端侧的氨基酸。作为所附加的蛋白，可以举出例如apaptats(序列号7)。例如，在图8中示出了以重组蛋白形式制作富含半胱氨酸的结构域蛋白时使用的dna序列(序列号8)及其氨基酸序列(序列号9)。图8中，由斜体字表示的部分为信号序列，其后的加下划线的apaptats为上述的附加的序列。

本发明的reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白是具有上述的氨基酸序列(即，由序列号2、序列号4或序列号6表示的氨基酸序列)或者与该氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具有tgfβ抑制作用的蛋白。此处，作为实质上相同的氨基酸序列，可以举出：相对于该氨基酸序列，有1个或多个或者几个(1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1个或2个)氨基酸发生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列；或者相对于该氨基酸序列，在使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation(美国国家生物技术信息中心的基本局部比对检索工具))等(例如使用默认值即初期设定参数)进行计算时具有至少85％以上、优选为90％以上、进一步优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上的相同性的氨基酸序列。

另外，编码本发明的reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白的dna为下述的dna：在使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation(美国国家生物技术信息中心的基本局部比对检索工具))等(例如使用默认值即初期设定参数)进行计算时，与序列号1、序列号3或序列号5所表示的碱基序列具有至少85％以上、优选为90％以上、进一步优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上的相同性的dna；或者编码由相对于上述dna所编码的蛋白的氨基酸序列有1个或多个或者几个(1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1个或2个)氨基酸发生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白的dna、且编码具有tgfβ抑制作用的蛋白的dna。

reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白可以基于上述序列信息通过化学合成而得到。另外，可以利用基因工程方法以重组蛋白的形式得到。即，将编码本发明的reic/dkk-3蛋白的部分蛋白的dna导入到适当的载体中，将该载体插入到宿主中，对该宿主进行培养，由培养物得到多肽即可。用于插入本发明的dna的载体只要能够在宿主中复制就没有特别限定，可以举出例如质粒dna、噬菌体dna等，可以使用公知的载体。此时，作为宿主，可以使用真核细胞或原核细胞系。作为真核细胞，可以举出例如已建立的人、啮齿类等哺乳类细胞系、昆虫细胞系、真丝状菌细胞和酵母细胞等动物细胞等，作为原核细胞，可以举出例如大肠杆菌细胞等细菌细胞。可以在体外或体内对包含编码本发明的reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白的dna的宿主细胞进行培养，通过利用公知的方法对该宿主进行培养，能够由培养物得到reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白。此处，“培养物”是指培养上清、或者培养细胞或培养菌体、或者细胞或菌体的破碎物中的任一种。经表达产生的蛋白可由上述培养物中进行提纯。提纯使用通常在蛋白中使用的提纯方法即可，例如可以通过适当地选择并组合离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤、超滤、盐析、透析等来进行提纯。此外，本发明的reic/dkk-3蛋白的部分蛋白也可以按照wo01/038528号公报的记载来得到。

reic/dkk-3dna可以基于序列号1、3或5的序列信息由人细胞、人组织等得到。另外，还可以按照wo01/038528号公报的记载得到。

此外，本发明还包括包含reic/dkk-3dna的载体。通过将该载体导入到受试体中，reic/dkk-3蛋白在受试体体内表达，作为tgfβ抑制剂起作用。

基因治疗中的目的基因(dna)向受试体中的导入可以通过公知的方法进行。作为将基因导入到受试体中的方法，有使用病毒载体的方法和使用非病毒载体的方法，各种方法是公知的(实验医学别册，基因治疗的基础技术，羊土社，1996；实验医学别册，基因导入&表达分析实验法，羊土社，1997；日本基因治疗学会编，基因治疗开发研究手册，nts，1999)。

使用腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒等病毒载体作为用于基因导入的病毒载体的方法是代表性的方法。可以在去毒逆转录病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒、仙台病毒、sv40、免疫缺陷病毒(hiv)等dna病毒或rna病毒中导入目的基因，使细胞感染重组病毒，由此向细胞内导入基因。

将本发明的基因用于使用病毒的基因治疗时，优选使用腺病毒载体。作为腺病毒载体的特征，可以举出以下几点：(1)能够在多种细胞中进行基因导入；(2)即使对增殖停止期的细胞也能够高效地进行基因导入；(3)能够通过离心进行浓缩，得到高滴度(10¹⁰～10¹¹pfu/ml以上)的病毒；(4)适于向体内的组织细胞中直接进行基因导入。作为基因治疗用的腺病毒，由e1/e3区域缺失的第1代腺病毒载体(miyake,s.,etal.,proc.natl.acad.sci.usa.,93,1320,1996)开发出了除了e1/e3区域以外e2或e4区域也缺失的第2代腺病毒载体(lieber,a.,etal.,j.virol.,70,8944,1996；mizuguchi,h.&kay,m.a.,hum.genether.,10,2013,1999)、腺病毒基因组基本完全缺失的(gutless)第3代腺病毒载体(steinwaerder,d.s.,etal.,j.virol.,73,9303,1999)，在导入本发明的基因时没有特别限定，任一种腺病毒载体均可以使用。此外，如果利用赋予了向aav的染色体中整合的能力的adeno-aav杂化载体(recchia,a.,etal.,proc.natl.acad.sci.usa.,96,2615,1999)、或通过使用转座子基因而具有向染色体中整合的能力的腺病毒载体等，则也能够用于长期的基因表达。另外，也可以通过在腺病毒纤维的h1环中插入显示出组织特异性的转移性的肽序列而对腺病毒载体赋予组织特异性(mizuguchi,h.&hayakawa,t.,nipponrinsho,7,1544,2000)。

在本发明中，将包含reic/dkk-3dna的腺病毒载体称为ad-reic。

另外，也可以不使用上述病毒而使用并入有质粒载体等基因表达载体的重组表达载体，将目的基因导入到细胞或组织中。例如，可以通过脂质体转染法、磷酸钙共沉法、deae-葡聚糖法、使用微小玻璃管的dna直接注入法等将基因导入到细胞内。另外，还可以通过利用内含型脂质体(internalliposome)的基因导入法、利用静电型脂质体(electorostatictypeliposome)的基因导入法、hvj-脂质体法、改良型hvj-脂质体法(hvj-ave脂质体法)、使用hvj-e(envelope，包膜)载体的方法、受体介导性基因导入法、利用粒子枪将载体(金属粒子)与dna分子一同移入到细胞中的方法、裸dna的直接导入法、利用各种聚合物的导入法等将重组表达载体并入到细胞内。作为这种情况下所用的表达载体，只要是能够在生物体内表达目的基因的载体，则任何表达载体均可以使用，可以举出例如pcaggs(gene108,193-200(1991))、pbk-cmv、pcdna3、1、pzeosv(invitrogen公司、stratagene公司)、pvax1等表达载体。

包含reic/dkk-3dna的载体可以适当包含用于基因转录的启动子或增强子、polya信号、用于导入有基因的细胞的标记和/或筛选的标记基因等。作为此时的启动子，可以使用公知的启动子。

为了将包含本发明的reic/dkk-3dna的载体导入到受试体中，可以使用将基因治疗剂直接导入到体内的体内法；以及从人体内取出某种细胞、在体外向该细胞中导入基因治疗剂、再将该细胞送回到体内的离体(exvivo)法等(nikkeiscience,1994年4月号,20-45页；月刊药事,36(1),23-48(1994)；实验医学增刊,12(15),1994；日本基因治疗学会编,基因治疗开发研究手册,nts,1999)。

上述的reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白与tgfβ受体结合，抑制tgfβ与tgfβ受体结合。其结果，抑制起于tgfβ的信号转导。

tgfβ是与细胞的增殖或分化、凋亡、造血、骨的发育、细胞外基质形成、免疫反应、炎症反应、器官或组织的纤维化等有关的多功能性的细胞因子。tgfβ藉由其功能参与癌症、纤维化、神经疾病、类风湿、过敏疾病、动脉硬化等各种疾病的病态形成。另外，在肿瘤局部，由癌细胞分泌tgfβ，诱导出调节性t细胞(treg细胞)，从而诱导免疫抑制状态。其结果，免疫细胞对癌细胞的攻击受到抑制。reic/dkk-3蛋白抑制tgfβ与tgfβ受体结合，其结果，通过抑制起于诱导免疫抑制状态的tgfβ的信号通路而减少肿瘤局部的抑制性免疫细胞，恢复肿瘤免疫应答，解除免疫抑制状态，从而恢复、激活免疫细胞对癌细胞的攻击。即，reic/dkk-3蛋白主要作用于免疫系统细胞，抑制免疫系统细胞中的tgfβ与其受体的反应。

reic/dkk-3蛋白在t淋巴细胞样细胞等免疫系统的细胞中起作用，在成纤维细胞等其他细胞中不起作用。

reic/dkk-3蛋白即使在高浓度区域也不会完全阻断tgfβ的活性，对免疫系统显示出选择性的抑制效果。即，reic蛋白能够选择性地减弱tgfβ对免疫系统的活性，可用作温和地激活肿瘤局部的抗肿瘤免疫活性的免疫调节剂。对于强烈地抑制参与多种多样的生理功能的tgfβ的药剂，担心其具有副作用，但由于reic能够低亲和性地且免疫系统特异性地减弱tgfβ活性，因而能够在降低因抑制tgfβ所致的副作用的同时诱导出对于癌症治疗理想的肿瘤免疫应答的激活状态。

reic/dkk-3蛋白所结合的tgfβ受体包含i型受体(tgfβri)和ii型受体(tgfβrii)这两者。

含有reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白或者编码它们的dna作为有效成分的tgfβ抑制剂可用于tgfβ相关疾病的预防或治疗。此处，tgfβ相关疾病是指由于tgfβ信号转导的异常而引起的疾病，含有reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白或者编码它们的dna作为有效成分的tgfβ抑制剂通过抑制tgfβ与tgfβ受体的结合，能够使tgfβ信号转导变为正常，从而能够预防或治疗tgfβ相关疾病。

作为tgfβ相关疾病，可以举出癌症。

作为成为本发明的tgfβ抑制剂的预防或治疗对象的癌症，可以举出脑/神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门/直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨/骨肉瘤、多发性骨髓肿瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤等实体癌、血液癌。

本发明的预防或治疗剂包含reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白或者编码它们的dna、以及药理学可容许的载体、稀释剂或赋形剂。tgfβ相关疾病的预防或治疗剂可以以各种形态给药，可以举出利用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的口服给药；或者利用注射剂(皮下注射、静注、肌注、腹腔内注射等)、点滴剂、栓剂、喷雾剂、滴眼剂、经鼻给药剂、经皮给药剂、经粘膜给药剂、经肺给药剂、贴剂等的非口服给药。

本发明的预防或治疗剂可以通过注射等进行全身给药，另外也可以进行局部给药。例如，通过经注射给药到癌部位，可发挥出其效果。

本发明的预防或治疗剂包含制剂领域中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液，使用生理盐水、含有葡萄糖或其他辅助药的等渗液等，也可以与适当的助溶剂(例如醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等)合用。作为油性液，使用芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。

其给药量根据症状、年龄、体重等而有所不同，可以每隔数日或数周或数月通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射每一次给药0.001mg～100mg。另外，在使用包含reic/dkk-3dna的载体的情况下，可以给予例如10⁷～10⁹pfu(plaqueformingunit，空斑形成单位)的载体。

根据体外研究，reic/dkk-3蛋白在40nm以上、优选50nm以上的浓度区域中浓度依赖性地抑制tgfβ与其受体的反应。因此，按照给药时的血药浓度为40nm以上、优选为50nm以上的量进行给药即可。需要说明的是，由于reic/dkk-3蛋白即使为高用量、例如为375nm以上也不会完全抑制tgfβ与其受体的反应，因而能够降低因强烈抑制tgfβ所致的副作用。

reic/dkk-3蛋白未观察到毒性等副作用，reic/dkk-3蛋白的大量给药可期待高安全性。

本发明的预防或治疗剂即使单一药物给药也可发挥出tgfβ相关疾病、特别是癌症的预防和治疗效果。此外，在用于癌症的预防或治疗时，可以作为免疫检查点抑制剂以单一药物进行使用、或者可以与其他免疫检查点抑制剂合用。通过本药物与免疫检查点抑制剂的合用，可双重诱导抗癌作用，可期待较强的预防或治疗效果。特别是与现有的免疫检查点抑制剂合用时，能够解除肿瘤局部的牢固的免疫检查点的可能性提高，大幅改善qol高的癌症免疫治疗的奏效率的可能性提高。给药方法可以是使reic蛋白强制表达的基因治疗、或者给药reic蛋白制剂中的任一种方法。作为免疫检查点抑制剂，可以举出抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、抗ccr4抗体等。

[实施例]

通过以下的实施例具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。

1.结合在reic蛋白上的蛋白的研究

利用以freestyle^tm293细胞作为宿主的分泌表达系统生产全长reic蛋白并使用离子交换层析进行高纯度分离提纯。将该样品与nhsmag琼脂糖凝胶(gehealthcare)混合，制备固定有reic的磁珠。接着，在市售的cd14阳性人外周血单核细胞(lonza)中同时添加gm-csf(10ng/ml)和il-4(10ng/ml)，分化诱导成树突细胞样细胞，培养6天。将该培养上清与固定有reic的磁珠在常温下混合，收集结合在珠上的分子。将结合在磁珠上的分子用甘氨酸/盐酸(ph2.9)洗脱，回收包含reic结合蛋白的级分。使该回收样品与蛋白分解酶：胰蛋白酶反应，通过hplc/qtof质谱分析对其消化片段进行分析，利用mascot数据库鉴定包含在样品中的蛋白。确认到：在其列表内不包含显示出显著结合的成分，但在检测出部分片段的候选分子列表中包含tgfβ的i型受体的细胞外结构域(tgfβri-ecd)。

2.结合在reic蛋白上的蛋白的研究

为了通过实验证明reic蛋白与tgfβri-ecd结合，准备两者的分泌蛋白的表达质粒dna。作为reic蛋白，使用分泌表达全长reic的fl-reic(sge-reic)、n末端120个氨基酸缺失的reicc结构域(sge-reic-c)、以及仅为富含半胱氨酸的结构域的reic-17kda(sge-reic-17kda)这3种。另一方面，tgfβri-ecd蛋白使用tgfβri-ecd(sge-tgfβri-ecd)、期待表达量提高而附加有reic的分泌信号的sigreic-tgfβri-ecd(sge-sigreic-tgfβri-ecd)这两种。图2中示出了tgfβri-ecd蛋白的合成中使用的人tgfβri-ecd(uniprot：p36897)的人工基因的dna序列(序列号10)和编码其的氨基酸序列(信号序列以后、序列号11)。氨基酸序列中，由斜体字表示的部分为分泌信号，加下划线的部分为tgfβri-ecd部分。在c末端侧附加有his标签(hhhhhh)。

3.利用reic蛋白与tgfβ-ri的共表达系统进行的结合实验

使用各种reic和tgfβ-ri表达质粒dna，使用基因导入试剂：293fectin利用脂质体转染法对freestyle^tm293f细胞进行瞬时性的基因导入，在37℃进行3天的振荡培养，回收其培养上清。在各培养上清1ml中分别加入50μl用×1pbs清洗后的hismag琼脂糖凝胶ni(gehealthcare：磁珠)，在室温下温和地混合1小时。然后，使用磁铁将珠回收，用×1pbs分别清洗3次，分别加入40μl的×1sds样品缓冲液(加有还原剂)，由此提取出与磁珠特异性结合的蛋白，通过sds-page分析与tgfβri-ecd相互作用的蛋白(图3)。其结果确认到，使tgfβri-ecd与各种reic共表达时，在ni²⁺亲和磁珠上浓缩了条带强度大约为1:1的强度的复合体，确认到两者形成了复合体。另外确认到，此时reic蛋白可以是作为承担免疫活性的最小结构域的reic17kda。

4.利用reic蛋白与tgfβri-fc、tfgβrii-fc的共表达系统进行的结合实验

在各种实验过程中，tgfβri-ecd存在稳定性低的问题，为了对其进行改善，构建了在人免疫球蛋白g(igg)的fc区域的n末端侧融合有tgfβri-ecd的蛋白生产系统。同时，制作了分别附加有tgfβrii-ecd(uniprot：p37173)和ha标签的fc融合蛋白的表达质粒dna载体。将这些各基因与fl-reic的表达载体组合，共转染至freestyle^tm293细胞中，使用固定有与fc区域结合的蛋白g的磁珠(蛋白g-mag琼脂糖凝胶,gehealthcare)回收fc融合蛋白，通过使用抗reic抗体的蛋白免疫印迹法来确认在培养上清中与reic蛋白形成复合体的情况(图4)。其结果，确认到reic蛋白与tgfβri-ecd结合，此外还确认到也与tgfβrii-ecd结合。另一方面，附加有ha标签的fc蛋白不与reic结合，因而确认到reic蛋白分别与tgfβri-ecd和tgfβrii-ecd特异性结合。

5.reic蛋白与tgfβri-fc、tfgβrii-fc的结合实验(elisa法)

将tgfβri-ecd-fc和tgfβrii-ecd-fc蛋白分别以重组蛋白形式进行分泌表达、提纯，在96孔elisa板上以2.5μg/ml的浓度各添加100μl，在4℃静置一晩进行固定。将孔用×1pbs100μl清洗3次，在各孔中分别添加200μl的blockingone(nacalai)，在室温静置1小时。将孔用100μl的×1pbs-t清洗3次后，分别添加100μl用×1pbs-t+0.1％bsa稀释的全长reic(从5μm起以×1/5连续稀释至0.32nm)，在4℃静置一晩。

将孔用×1pbs-t100μl清洗3次，将生物素化reic多克隆抗体1000倍稀释，在各孔中分别添加100μl，在室温静置1小时。将孔用100μl的pbs-t1清洗3次，将链霉亲和素-hrp稀释至5000倍，在各孔中分别添加100μl，在室温下静置1小时。将孔用100μl的×1pbs-t清洗3次，在各孔中分别添加100μl显色液，在适度着色的时刻向各孔中分别加入50μl终止液，使着色反应终止，在450nm波长下进行比色测定(图5)。其结果，tgfβri-ecd与reic的结合亲和性高于tgfβrii-ecd，得到了与共转染实验(图4)相同倾向的结果。但是，在该结合实验中在1μm以上时确认到结合，因而确认到结合亲和性不那么高。

6.reic蛋白对tgfβ的抑制能力的确认

小鼠t淋巴细胞来源的el4细胞在tgfβ的刺激下诱导细胞内的smad2的磷酸化。el4细胞还作为能够诱导调节性t细胞(treg)样的分化的模型系统而为人所知(nat.immunol.9,194,2007)，研究了reic蛋白对于tgfβ向el4细胞的细胞内信号转导的影响。tgfβ蛋白(和光纯药)使用按20μg/ml的浓度溶解在4mmhcl+0.1％has中的溶解液。使用6孔板在imdm培养基(gibco)+10％fbs中培养el4细胞。添加到培养el4细胞中的reic蛋白使用由freestyle^tm293细胞分泌生产的人和小鼠的fl-reic、以及经更高分子的糖链修饰的使用以人正常成纤维细胞为宿主的生产系统制备的人fl-reic这3种，添加到el4细胞的培养上清中，在37℃培养一夜。在reic处理后的各孔中添加tgfβ，在37℃静置10分钟。然后轻轻地除去上清，在各孔中添加100μl的裂解缓冲液(20mmhepesph7.5、500mmnacl、1％np-40、蛋白酶抑制剂(nacalai)、磷酸酶抑制剂(nacalai))，回收细胞。将细胞裂解物进行超声波破碎处理(使用bioruptor)后，以13,000rpm在4℃进行10分钟离心分离，回收上清。通过sds-page将其分离后，转印到硝酸纤维素膜上。以5％脱脂乳粉作为封闭剂对该膜进行处理后，使用抗smad2磷酸化抗体(cellsignaling、1000倍稀释)进行蛋白免疫印迹。进一步使用相同的膜进行再标记(reprobing)处理，使用抗smad2/3抗体(cellsignaling、2000倍稀释)对各smad2/3蛋白进行确认(图6)。图6中示出了蛋白免疫印迹图像和磷酸化smad2条带的强度(下面的图)。由本结果确认到，通过添加reic蛋白，tgfβ刺激所致的el4细胞内的信号转导减弱。

7.reic蛋白对tgfβ诱导的细胞增殖抑制活性的竞争抑制

为了利用生物检测系统来验证reic蛋白减弱tgfβ的活性的情况，通过对人红白血病细胞株：tf-1细胞的效果进行了评价。tf-1细胞是依赖于增殖性细胞因子而进行增殖的培养细胞，已知在添加作为抑制性细胞因子的tgfβ时确认到增殖抑制活性。在本评价实验中，将tf-1细胞用rpmi培养基+10％fbs+gm-csf(2ng/ml)进行培养，将tf-1细胞用rpmi培养基+10％fbs清洗2次后，在96孔板的各孔中以1.0×10⁵细胞/ml的浓度加入100μl的tf-1细胞，按4ng/ml向其中添加il-5。进一步在各孔中添加人fl-reic蛋白和tgfβ，在37℃培养2天。对于各孔的细胞增殖，使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学)进行比色测定，计算细胞增殖活性(图7)。其结果可以确认到，由于reic蛋白的共存，免疫抑制因子的tgfβ活性减弱。在本检测中虽被确认为温和的竞争效果，但在所实施的3次实验中均成功地获得了再现性良好的同样的结果。

8.reic蛋白对tgfβ的抑制能力的确认

在6孔板中接种各细胞(el-4、人成纤维细胞)细胞，在培养基中添加重组reic蛋白，在37℃静置18小时。

在用于添加tgfβ的孔中按最终浓度为1ng/ml添加tgfβ，在37℃静置10分钟。用移液器抽吸除去6孔板的培养基后，在各孔中用包含蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)(nacalai)和磷酸酶抑制剂混合物(phosphataseinhibitorcocktail)(nacalai)的100μl细胞裂解缓冲液(20mmhepes、ph7.5、500mmnacl、1％np-40)将细胞溶解。用细胞刮铲回收细胞，移至1.5ml管中，利用bioruptor进行超声波破碎处理，制作细胞裂解物。将细胞裂解物在4℃于13,000rpm离心分离10分钟，将上清置入新管中。对于其中各20μl，使用抗smad2/3和抗smad2/3磷酸化特异性抗体(cellsignaling)作为一次抗体，通过蛋白免疫印迹法进行分析。

将结果示于图9。图9a示出el4细胞的结果、图9b示出人成纤维细胞的结果。图9中示出了蛋白免疫印迹图像和磷酸化smad2条带的强度(右面的图)。

由图9的结果可知，reic蛋白对免疫系统显示出选择性的tgfβ活性的抑制效果。

9.reic蛋白对tgfβ通路的抑制效果(基于报告基因的效果)

(1)使用el-4细胞的研究

转染pgl4.48(promega)并进行荧光素酶检测，该pgl4.48是根据tgfβ的刺激在各种细胞中表达荧光素酶报告蛋白的质粒。首先，在96孔板中培养el4细胞以使其达到～70％融合。用移液器除去加有血清的培养基，将培养基置换成opti-mem。按照基因导入试剂lipofectamine3000(invitrogen)所附的说明书在各孔中转染100ng的pgl4.48dna。在37℃在5％co2存在下培养3小时后，添加重组reic蛋白使最终浓度为50μg/ml或100μg/ml，在37℃在5％co2存在下培养18小时。然后，添加tgfβ使最终浓度为10μg/ml，在37℃在5％co2存在下培养3小时。使用steady-glo荧光素酶检测系统(promega)和化学发光仪对细胞内的报告基因的表达水平进行定量评价。

图10中示出方法的概要(图10b)以及el-4细胞的结果(图10a)。图10a的纵轴表示荧光素酶活性。

(2)reic蛋白浓度的研究

在与(1)相同的条件下，使reic蛋白的添加浓度为0～3000nm，对tgfβ通路的抑制效果进行确认。

图11中示出方法的概要以及结果。纵轴以将未添加reic蛋白的情况设为1的相对发光单位(rlu)来表示。

由图10和图11的结果可知，reic蛋白即使在高浓度区域也不能完全阻断tgfβ的活性，对免疫系统显示出选择性的抑制效果。即，可知reic蛋白对于免疫系统能够选择性地减弱tgfβ活性，能够用作温和地激活肿瘤局部的抗肿瘤免疫活性的免疫调节剂。

工业实用性

reic/dkk-3蛋白或其部分蛋白或者编码它们的dna能够用于tgfβ相关疾病的预防或治疗。

序列表自由文本

序列号7～11合成

本说明书中引用的全部的出版物、专利和专利申请通过引用直接并入到本说明书中。

序列表

<110>桃太郎源株式会社(momotaro-geneinc.)

<120>含有reic/dkk-3蛋白作为有效成分的tgfβ抑制剂(atgfbetainhibitorcomprisingreic/dkk3proteinasan

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130