用于治疗眼部疾病的含CAS9蛋白和向导RNA的药物组合物的制作方法

本发明提供用于治疗或预防眼病的含cas9蛋白和靶向vegf-a的向导rna的药物组合物，以及含cas9蛋白和靶向vegf-a的向导rna的核糖核蛋白。
背景技术：
：：使用crispr-cas9核酸酶进行rna向导的基因组手术或rna向导的基因组编辑预期有助于各种遗传疾病的治疗，而crispr-cas9核酸酶对于非遗传性疾病的治疗效果却知之甚少。代表非遗传性疾病的一个实例是黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(amd))。amd是发达国家老年人失明的主要原因。脉络膜新生血管形成(cnv)是新生血管性amd的主要病理特征，并且其主要由血管生成细胞因子(诸如血管内皮生长因子a(vegfa))引起。到目前为止，进展主要集中在作为amd的治疗剂的单克隆抗体或靶向vegf-a的适体。然而，这种抗vegf-a的问题在于它们必须每年施用七次或更多次，这是因为vegf-a在视网膜细胞中连续表达和分泌。因此，需要开发用于眼病的更基础和持久的治疗技术。[参考文献]韩国专利no.10-2015-0101446a(公开于2015年09月03日)技术实现要素：[技术问题]本说明书提出了一种技术，其使得能够通过vegf-a的基本失活或通过将vegf-a的水平降低至低于病理阈值来持久或永久地治疗眼病。一方面提供用于预防和/或治疗眼病的药物组合物，其包括vegf-a基因失活剂。vegf-a基因失活剂可以是选自由蛋白质、核酸分子(dna和/或rna)和化学药物组成的组中的至少一种，所有这些都能够使vegf-a基因失活。在一个实施方案中，vegf-a基因失活剂可包括cas9蛋白和靶向vegf-a基因的向导rna。另一方面提供预防和/或治疗眼病的方法，其包括失活vegf-a基因的步骤。失活vegf-a基因的步骤可以通过将vegf-a基因失活剂施用于需要预防和/或治疗眼病的受试者的步骤来进行。vegf-a基因失活可以通过rna向导的基因组手术或rna向导的基因组编辑来进行。在这方面，失活vegf-a基因的步骤通过将cas9蛋白和靶向vegf-a基因的向导rna施用于需要预防和/或治疗眼病的受试者的步骤来进行。另一方面提供vegf-a基因失活剂在预防和/或治疗眼病或制备眼病治疗剂中的用途。另一方面提供了用于靶向vegfa基因的特定靶位点或靶区域的向导dna。另一方面提供了vegfa基因特异性核糖核蛋白(rnp)，其包括cas9蛋白和具有vegfa基因特异性靶向序列的向导rna。另一方面提供了包含向导rna或vegfa基因特异性rnp的药物组合物。另一方面提供了治疗或预防眼病的方法，其包括将vegfa基因特异性rnp施用于需要治疗和/或预防眼病的受试者的步骤。详细说明本发明提供了使用基因编辑方法治疗眼病，例如与vegf-a过表达相关的眼病的技术。一方面提供用于预防和/或治疗眼病的组合物，包括vegf-a基因失活剂。vegf-a基因失活剂可以是选自由蛋白质、核酸分子(dna和/或rna)和化学药物组成的组中的至少一种，所有这些都可以使vegf-a基因失活。在一个实施方案中，vegf-a基因失活剂可包括cas9蛋白和靶向vegf-a基因的向导rna。另一方面提供预防和/或治疗眼病的方法，包括失活vegf-a基因的步骤。失活vegf-a基因的步骤可以通过将vegf-a基因失活剂施用于需要预防和/或治疗眼病的受试者的步骤来进行。vegf-a基因失活可以通过rna向导的基因组手术或rna向导的基因组编辑来进行。在这方面，失活vegf-a基因的步骤可以通过将cas9蛋白和靶向vegf-a基因的向导rna施用于需要预防和/或治疗眼病的受试者来进行。该方法可以进一步包括在施用步骤之前鉴定需要预防和/或治疗眼病的受试者的步骤。vegf-a基因失活剂可以以药学有效量施用。vegf-a基因失活剂可以通过各种途径施用，例如，局部施用于眼部病变处或通过视网膜下注射。另一方面提供vegf-a基因失活剂在预防和/或治疗眼病或制备眼病治疗剂中的用途。用于失活的待靶向的vegf-a基因可位于眼睛中，例如，具有新生血管性眼病的眼睛，特别是在新生血管性眼病的病变部位。vegf-a基因失活可以是选自由下项组成的组中至少一种：(1)缺失vegf-a基因的完整序列或者1-50bp或1-40bp长的连续或不连续的部分序列；(2)用不同于野生型vegf-a基因的核苷酸取代vegf-a基因中的1-20、1-15或1-10个连续或不连续的核苷酸；(3)将1-20、1-15或1-10个核苷酸插入(添加)到vegf-a基因中，待插入的核苷酸各自独立地选自a、t、c和g；和(4)它们的组合。vegf-a基因失活剂可以是选自由蛋白质、核酸分子(dna和/或rna)和化学药物组成的组中的至少一种，所有这些都可以使vegf-a基因失活。根据一个实施方案，vegf-a基因失活剂可包括cas9蛋白和靶向vegf-a基因的向导rna。在这方面，vegf-a基因失活可以通过rna向导的基因组手术或rna向导的基因组编辑来进行。当使用cas9蛋白进行时，vegf-a基因失活可以是选自由下项组成的组中至少一种：(1)位于vegf基因中1-50bp或1-40bp长连续或不连续区域中的至少一个核苷酸的缺失，该区域与cas9蛋白的原始间隔区相邻基序(pam)序列相邻；(2)将位于vegf-a基因中1-50bp或1-40bp长连续或不连续区域的1-20、1-15或1-10个连续或不连续的核苷酸取代为那些不同于野生型vegf-a基因的核苷酸，该区域与cas9蛋白的pam序列相邻；(3)将1-20、1-15或1-10个核苷酸插入(添加)到在vegf-a基因中1-50bp或1-40bp长的连续或不连续区域，该区域与cas9蛋白的pam序列相邻，待插入的核苷酸各自独立地选自a、t、c和g；和(4)它们的组合。vegf-a基因失活剂可包括cas蛋白或其编码基因(dna或mrna)；和vegf-a基因特异性向导rna或其编码dna，该向导rna含有与vegf-a基因的靶标大小特异性结合的靶向序列。cas9蛋白和vegf-a基因特异性向导rna可以是以下形式：(a)复合物，其中在施用于体内(或病变处)或细胞(即，在施用前已经组合)之前，cas9蛋白与vegf-a基因特异性向导rna相结合，即，以核糖核蛋白(rnp)的形式(在这方面，以rnp的形式通过细胞膜转运到细胞或体内)；(b)复合物，其中通过携带分别编码cas9蛋白和vegf-a基因特异性向导rna的dna的载体或携带两种dna的一个载体施用(递送)进入细胞或体内后，cas9蛋白与vegf-a基因特异性向导rna相结合；(c)包含编码cas9蛋白的rna(mrna)和vegf-a基因特异性向导rna的rna混合物；或者(d)携带编码cas9蛋白的基因(dna)和vegf-a基因特异性向导rna(例如，通过体外转录获得)的重组载体的混合物。在一个实施方案中，rna混合物可以包含在用于递送到细胞或体内的典型的rna载体中。因此，vegf-a基因失活剂可包括：(a)复合物，其中在施用于体内(或病变)或细胞(即，在施用前已经组合)之前，cas9蛋白与vegf-a基因特异性向导rna相结合，即，以核糖核蛋白(rnp)的形式(在这方面，以rnp的形式通过细胞膜转运到细胞或体内)；(b)一同携带分别编码cas蛋白和vegf-a基因特异性向导rna的基因(dna)的重组载体，或分别携带这些基因的单独的重组载体(即携带编码cas蛋白的基因的重组载体和携带编码vegf-a基因特异性向导rna的dna的重组载体)，或锚定该重组体的重组细胞；(c)包含编码cas9蛋白的rna(mrna)和vegf-a基因特异性向导rna的rna混合物；(d)携带编码cas9蛋白的基因(dna)的重组载体和vegf-a基因特异性向导rna(例如，通过体外转录获得)的混合物；或者(e)它们的组合。vegf-a基因失活剂的施用可以通过同时或不考虑顺序依次施用携带编码cas9蛋白的基因(dna)的重组载体和携带编码vegf-a基因特异性向导rna的dna的重组载体；编码cas9蛋白的rna(mrna)和vegf-a基因特异性向导rna；或者携带编码cas9蛋白的基因(dna)和vegf-a基因特异性向导rna的重组体来执行。另一方面提供了用于靶向预定靶位点或区域的向导rna。在一个实施方案中，向导rna可以包括与vegfa基因中预定靶区域的一条链上的核酸序列(例如，与pam序列上的链互补的链)杂交的靶序列(即，具有与之互补的核酸序列的靶序列)。另一方面提供了vegfa基因特异性核糖核蛋白(rnp)，其包括cas9蛋白和具有vegfa基因特异性靶向序列的向导rna。另一方面提供了包含向导rna或vegfa基因特异性核糖核蛋白(rnp)的药物组合物。该药物组合物可用于治疗和/或预防眼病，诸如黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(amd))、视网膜病(例如，糖尿病性视网膜病)等。另一方面提供治疗或预防眼病的方法，其包括将vegfa基因特异性核糖核蛋白(rnp)施用于需要治疗和/或预防眼病的受试者的步骤。vegfa基因特异性核糖核蛋白(rnp)可以以药学有效量施用，例如，通过局部途径到眼病变处或通过视网膜下注射。眼病可以是与血管内皮生长因子(vegf)(例如，新生血管性眼病所示例的vegf-a)的过表达相关的眼病，。新生血管性眼病可以是由眼部新血管形成(例如脉络膜新生血管形成(cnv))引起的任何眼病，并且可以选自由黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(amd))、近视脉络膜新生血管形成、视网膜病(例如，糖尿病性视网膜病)、缺血性视网膜病、视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞和早产儿视网膜病组成的组。vegf-a(血管内皮生长因子a)可以源自哺乳动物，其包括灵长类动物(诸如人、猿等)，以及啮齿动物(诸如大鼠、小鼠)等。例如，它可以是人vegf-a(例如，ncbi登录号np_001020537、np_001020538、np_001020539、np_001020540、np_001020541、np_001028928、np_001165093、np_001165094、np_001165095、np_001165096、np_001165097、np_001165098、np_001165099、np_001165100、np_001165101、np_001191313、np_001191314、np_001273973、np_001303939、np_003367等)、小鼠vegf-a(ncbi登记号np_001020421、np_001020428、np_001103736、np_001103737、np_001103738、np_001273985、np_001273986、np_001273987、np_001303970、np_033531等)。cas9蛋白可以源(分离)自，例如化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)。如本文所用，术语“靶基因”是指基因编辑靶向的基因(vegf-a基因)；术语“靶位点”或“靶区域”是指cas9进行基因编辑(核苷酸的切割、缺失、添加和/或取代)的靶基因(vegf-a基因)中的基因位点，指定最大长度为约50bp或40bp，邻近靶基因(vegf-a基因)内cas9蛋白识别的pam序列的5'和/或3'末端的基因位点；术语“靶序列”是指可以与向导rna杂交的靶基因(vegf-a基因)的基因位点，指定17-23bp，例如20bp长，邻近靶基因内cas9蛋白识别的pam序列的5'和/或3'末端的核酸序列；和术语“靶向序列”是可与靶基因中的靶序列杂交的向导rna区，并且可以是包括17-23，例如20个核苷酸的向导rna区。在本说明书中，靶序列由靶基因(vegf-a基因)的相关基因区域中的两条dna链的pam序列保留链上的核酸序列表示。实际上，因为向导rna结合的dna链是pam序列所在链的互补链，所以向导rna中的靶向序列与靶基因(vegf-a基因)中的靶序列具有相同的核酸序列，除了考虑到rna特性，将t变为u。因此，在本文中，向导rna的测序序列和靶基因的靶序列(vegf-a基因)由相同的核酸序列表示，除了t和u互换。当cas9蛋白源自化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)时，pam序列是5'-ngg-3'(其中n是a、t、g或c)，并且靶区域是与靶基因(vegf-a基因)中5'-ngg-3'序列的5'末端和/或3'末端相邻的基因区域，并且可以是，例如，约50bp或约40bp长的基因区域。在这方面，可以通过以下方法在vegf-a基因中诱导vegf-a基因失活：a)从核酸序列(靶区域)中缺失至少一个核苷酸，所述核酸序列长度为至多50bp或至多40bp，并且与5'-ngg-3'序列的5'和/或3'末端相邻(其中n是a、t、c或g)，b)用不同于野生型基因中的相应核苷酸取代核酸序列(靶位点)中至少一个核苷酸(例如，1-20、1-5或1-10个核苷酸)，所述核酸序列长度为至多50bp或至多40bp并且与5'-ngg-3'序列的5'和/或3'末端相邻，c)在核酸序列(靶位点)中插入至少一个核苷酸(例如，1-20、1-5或1-10个核苷酸)，所述核酸序列长度为最多50bp或最多40bp并且与5'-ngg-3'序列的5'和/或3'末端相邻(为此，待插入的核苷酸各自独立地选自a、t、c和g)，或d)a)到c)的两种或更多种的组合。向导rna可以是选自由crisprrna(crrna)、反式激活crrna(tracrrna)和单一向导rna(sgrna)组成的组中的至少一种。详细地，向导dna可以是双crrna:tracrrna复合物，其中crrna和tracrrna彼此组合，或单个向导rna(sgrna)，其中crrna或其部分通过寡核苷酸接头连接至tracrrna或其部分。向导rna的具体序列可以根据cas9蛋白的种类(即，向导rna来源的微生物)适当选择，并且是本领域技术人员可以容易地确立的事项。当使用来自化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9蛋白时，crrna可以由以下通式1表示：5'-(ncas9)l-(guuuuagagcua)-(xcas9)m-3'(通式1)其中，ncas9是靶向序列，其根据靶基因(vegf-a基因)中的靶序列确定，l表示靶向序列中包含的核苷酸的数目并且可以是17至23，或18至22，例如20的整数；包含与靶序列的3'末端相邻的12个连续核苷酸(guuuuagagcua)(seqidno:359)的区域是crrna的必不可少的部分，xcas9是包含位于crrna的3'末端的m个核苷酸的区域(即，与crrna的必不可少部分的3'末端相邻)，并且m可以是8至12，例如11的整数，并且可以相同或不同的m个核苷酸，可以各自独立地选自由a、u、c和g组成的组。在一个实施方案中，xcas9可包括但不限于ugcuguuuug(seqidno:360)。进一步地，tracrrna可以由以下通式2表示：5'-(ycas9)p-(uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc)-3'(通式2)其中，由60个核苷酸组成的区域(uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc)(seqidno:361)是tracrrna必不可少的部分，ycas9是包含与tracrrna必不可少的部分的5'末端相邻的p个核苷酸的区域，p可以是6至20，例如8至19的整数，并且p个核苷酸(可以是相同或不同的)可各自独立地选自由a、u、c和g组成的组。sgrna可以是发卡(茎-环结构)的形式，其中包含靶向序列和crrna必不可少的部分的crrna部分和包含tracrrna必不可少的部分(60个核苷酸)的tracrrna部分通过寡核苷酸接头(就此而言，寡核苷酸接头解释了环结构)连接。更详细地，sgrna具有发卡结构，其中包含靶向序列和crrna必不可少的部分的crrna部分和包含tracrrna必不可少的部分的tracrrna部分在crrna部分的3'末端和tracrrna部分的5'末端之间通过寡核苷酸接头连接而彼此组合。在一个实施方案中，sgrna可以由以下通式3表示：5'-(ncas9)l-(guuuuagagcua)-(寡核苷酸接头)-(uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc)-3'(通式3)其中(ncas9)l是如通式1中定义的靶序列。包含在sgrna中的寡核苷酸接头可以是由三至五个，例如，四个核苷酸组成的序列，其可以是相同或不同的，并且各自独立地选自由a、u、c和g组成的组。crrna或sgrna可以在5'末端(即，crrna中靶向序列的5'末端)进一步包括一至三个鸟嘌呤(g)。tracrrna或sgrna可以进一步包括在tracrrna必不可少的部分(60nt)的3'末端包含五至七个尿嘧啶残基的末端区域。在一个实施方案中，靶基因(vegf-a基因)中的靶序列可以选自由下项组成的组：vegfa-1：5'-ctcctggaagatgtccacca-3'(seqidno:1)(pam序列：ggg)；vegfa-2：5'-agctcatctctcctatgtgc-3'(seqidno:2)(pam序列：tgg)；vegfa-3：5'-gaccctggtggacatcttcc-3'(seqidno:3)(pam序列：agg)；vegfa-4：5'-actcctggaagatgtccacc-3'(seqidno:4)(pam序列：agg)；vegfa-5：5'-cgcttaccttggcatggtgg-3'(seqidno:5)(pam序列：agg)；vegfa-6：5'-gaccgcttaccttggcatgg-3'(seqidno:6)(pam序列：tgg)；vegfa-7：5'-cacgaccgcttaccttggca-3'(seqidno:7)(pam序列：tgg)；和vegfa-8：5'-ggtgcagcctgggaccactg-3'(seqidno:8)(pam序列：agg)。这些靶序列在物种间是非常保守的，并且存在于例如人和啮齿动物(例如小鼠)中。举例来说，靶序列可包括seqidno:1或seqidno:2的核苷酸序列。靶序列在哺乳动物间是非常保守的(例如，在人vegf-a基因和小鼠vegf-a基因之间)，并且对于靶标位点表现出高度优异的基因编辑效率(例如，插入缺失频率(％))，并且在靶标位点以外的位点(脱靶位点)中具有3个或更少，2个或更少，1个或没有错配核苷酸。因此，在靶标位点以外的位点很少或没有基因编辑的可能性，并且靶序列具有极好的安全性(非常低或几乎没有脱靶效应)。基于优异的编辑效率和低脱靶效应，本发明的一个方面提供了用于编辑vegf-a基因的组合物，其包括向导rna或编码向导rna的dna，以及cas9蛋白或编码cas9蛋白的基因(dna或mrna)。用于编辑vegf-a基因的组合物可包括含有向导rna和cas9蛋白的核糖核蛋白。在这方面，核糖核蛋白可以在施用于体内或细胞之前组装。本文中，与靶基因的靶区域杂交的向导rna的靶向序列是指与一条链的核苷酸序列的序列互补性为50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、99％或更高，或100％的核苷酸序列，所述链与靶序列所在的dna链(即，存在pam序列的dna链)互补，并因此可以互补地结合互补链上的核苷酸序列。例如，crrna或sgrna的靶向序列(ncas9)1可以具有与seqidno:1至4的靶序列之一相同的序列(前提是u变为t)。即，crrna或sgrna中的(ncas9)l可包括选自seqidno:9至16的序列中的靶向序列：vegfa-1:5'-cuccuggaagauguccacca-3'(seqidno:9)；vegfa-2:5'-agcucaucucuccuaugugc-3'(seqidno:10)；vegfa-3:5'-gacccugguggacaucuucc-3'(seqidno:11)；vegfa-4:5'-acuccuggaagauguccacc-3'(seqidno:12)；vegfa-5:5'-cgcuuaccuuggcauggugg-3'(seqidno:13)；vegfa-6:5'-gaccgcuuaccuuggcaugg-3'(seqidno:14)；vegfa-7:5'-cacgaccgcuuaccuuggca-3'(seqidno:15)；和vegfa-8:5'-ggugcagccugggaccacug-3'(seqidno:16)。例如，crrna或sgrna可以包括作为靶向序列的seqidno:9或10。在一个实施方案中，可以使用经修饰的rna以解决在rna递送至体内或细胞时降低细胞活力的问题。举例来说，经修饰以在其5末端不保留磷酸-磷酸键的rna(例如，没有5'-末端三磷酸或二磷酸)可用作向导rna。另一个实例是sgrna(例如，化学合成的sgrna)，其在其5'和/或3'末端含有一个或更多个(例如，一至五个，或两到四个)修饰的核糖核酸。在这方面，修饰可以表达为硫代磷酸酯，或者可以包括核糖部分2'位置的修饰(例如，2'-乙酰化、2'-甲基化等)。在一个实施方案中，经修饰的sgrna可以包括在5'末端和3'末端的每个的三个核苷酸处的核糖部分的2'-o位置处的甲基化(甲基添加)和/或硫代磷酸酯主链修饰。另一方面提供了向导rna，其包括选自seqidno:1至4的序列的靶序列。在该方法中，可以通过在进入免疫细胞的常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染等)的帮助下通过将向导rna和cas9蛋白的预装配复合物(核糖核蛋白)直接导入细胞中或者通过mrna递送将携带编码向导rna的dna分子和cas9蛋白编码基因(dna或mrna)(或具有序列同源性为80％或更高、85％或更高、90％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的基因)的一种载体(例如，质粒、病毒载体等)或分别携带dna分子或基因的载体导入细胞来进行向导rna和cas9蛋白向细胞的转导。在一个实施方案中，载体可以是病毒载体。病毒载体可以选自由下项组成的组：负义单链病毒(例如流感病毒)，诸如逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒(aav))、冠状病毒和正粘病毒；正义单链rna病毒，诸如杆状病毒(例如狂犬病病毒和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹病毒和仙台病毒)、甲病毒和小核糖核酸病毒；和双链dna病毒，诸如疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、epstein-barr病毒、巨细胞病毒)和腺病毒、痘病毒(例如，牛痘、鸡痘、和金丝雀痘)。携带cas9蛋白、向导rna的载体、含有它们的核糖核蛋白或其至少一种可以使用合适的一种公知技术(诸如电穿孔、脂质转染、病毒载体、纳米颗粒和ptd(蛋白质易位结构域)融合蛋白)，递送到体内或细胞中。cas9蛋白和/或向导rna可以进一步包括通常用于cas9蛋白、向导rna或含有它们两者的核糖核蛋白的核内移位的有用的核定位信号(nls)。在vegf-a基因特异性核糖核蛋白中，cas9蛋白可以从微生物中分离，或者以重组或化学合成方式非天然发生，而向导rna可以以重组方式或化学方式产生。包括cas9蛋白和编码该蛋白的基因(dna或mrna)，以及含有特异性结合vegf-a基因靶区域的靶向序列或编码rna的dna的基因特异性向导rna的vegf-a基因失活剂或vegf-a基因特异性核糖核蛋白，可以通过各种途径施用于体内，包括但不限于至眼病(与vegf-a基因过表达相关)的病变处的局部途径和视网膜下途径。施用vegf-a基因失活剂或vegf-a基因特异性核糖核蛋白的受试者的实例包括选自哺乳动物的所有动物(诸如人、猿等灵长类动物和诸如小鼠、大鼠等啮齿动物等，其患有或有vegf-a基因过表达相关的眼病的风险)、从动物分离的细胞(如视网膜色素上皮细胞(rpe)、rpe/脉络膜/巩膜复合体等)和组织(眼组织)，以及该细胞或组织的培养物。vegf-a基因失活剂或vegf-a基因特异性核糖核蛋白可以“药学有效量”施用或以“药学有效量”包含在药物组合物中。如本文所用，术语“药学有效量”是指可以引起期望效果的量，即在应用区域中的vegf-a基因编辑效果，并且可以根据包括患者的年龄、身重、性别和健康状况、施用的时间和途径、排泄率和对药物的敏感性在内的各种因素来确定。发明效果本文建议的vegf-a基因编辑技术不仅可以确保高基因编辑效率，还可以确保非常低的脱靶效应，可以有效、安全地进行基因编辑，从而可以将vegf-a蛋白水平降低到低于病理阈值，并随后长期或永久性治疗vegf-a过度表达相关的眼病。附图说明通过以下结合附图的详细描述，本发明的上述和其他方面、特征和优点将更加明显，其中：图1a显示了小鼠nih3t3和人arpe-19细胞的vegfa/vegfa基因座中的靶序列，其中pam和sgrna靶序列分别以红色和蓝色显示；图1b显示了通过t7核酸内切酶i(t7e1)试验检测到的，通过递送含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp或携带其编码序列的质粒在nih3t3中诱导的突变；图1c显示了通过递送含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp或携带其编码序列的质粒在nih3t3和arpe-19细胞中诱导的插入缺失频率图；图1d显示了通过含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp在nih3t3和arpe-19细胞中的vegfa/vegfa基因座处诱导的突变dna序列；图1e是通过递送含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp显示在汇合的arpe-19细胞中诱导的插入缺失频率的图；图1f是显示用含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp转染的融合arpe-19细胞中vegfamrna水平的图；图1g是显示用含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp转染的融合arpe-19细胞中vegfa蛋白水平的图；图1h是显示通过递送含有四种sgrna(vegfa-1sgrna、vegfa-2sgrna、vegfa-3sgrna和vegfa-4sgrna)的vegfa特异性cas9rnp或携带其编码序列的质粒诱导的插入缺失频率的图；图2a显示用cy3标记的cas9rnp(cy3标记的cas9和vegfa-1sgrna的复合物)转染或cy3标记的cas9单独(作为对照)转染后24小时的nih3t3细胞的共聚焦微观图像；图2b是显示在用cy3标记的cas9rnp转染或cy3标记的cas9单独转染后24小时，在总dapi阳性细胞核中cy3阳性细胞核的比例(100*[cy3阳性细胞核数目]/[dapi阳性细胞核总数])的图；图2c显示通过t7核酸内切酶1(t7e1)试验所检测的转染后24小时在nih3t3细胞中诱导的突变；图2d是显示转染后24小时在nih3t3细胞中诱导的插入缺失频率的图；图2e是在荧光显微镜下观察到cy3标记的cas9rnp注射到小鼠眼中后第3天的rpe平铺的荧光图像；图2f是显示在注射cy3标记的cas9rnp后第3天从视网膜色素上皮(rpe)/脉络膜/巩膜复合物分离的基因组dna中诱导的体内插入缺失频率的图；图2g显示通过western印迹分析测量的注射后24和72小时rpe/脉络膜/巩膜复合物中的cas9蛋白水平；图2h是显示在荧光显微镜下观察到的rpe/脉络膜/巩膜复合体中视网膜色素上皮(rpe)的分布的荧光图像；图2i显示通过western印迹分析测量的注射后24和72小时rpe/脉络膜/巩膜复合物中的cas9蛋白水平；图3a是说明实施例3的实验步骤的示意图；图3b显示在注射后第7天注射rosa26特异性cas9rnp(作为对照)或vegfa特异性cas9rnp的c57bl/6j小鼠中用异凝集素b4(ib4)染色的激光诱导的cnv的可视化图像；图3c是显示用vegfa特异性cas9rnp注射和用rosa26特异性cas9rnp对照注射的c57bl/6j小鼠的cnv区域的比较的图；图3d是显示cnv区域中vegfa蛋白质水平的图；图3e是rpe复合物中vegfa靶位点的插入缺失频率(％)的图；图3f是rpe复合物中rosa26靶位点的插入缺失频率(％)的图；图3g是通过苏木精和伊红染色可视化的横截面样品中激光诱导的cnv结构的图像；图3h显示通过靶向深度测序用于突变分析的cnv样品；图3i显示激光处理后第7天激光诱导的cnv的图像；图4a是显示体外切割位点的全基因组circos图；图4b显示使用包括41个digenome捕获位点和一个中靶序列的42个序列获得的序列标志；图4c显示在人arpe-19细胞中验证的脱靶位点和插入缺失频率；图5显示了在小鼠rpe中由vegfa特异性cas9rnp(含有vegfa-1sgrna)诱导的突变dna序列，包括(a)注射后第3天由vegfa特异性cas9rnp在rpe中诱导的代表性突变序列；和(b)注射后第7天在含有激光诱导的脉络膜新生血管(cnv)的rpe中的突变dna序列；图6显示了小鼠rpe的20个潜在脱靶位点中的插入缺失频率(％)；图7a显示了在注射vegfa特异性cas9rnp的正常小鼠和没有注射vegfa特异性cas9rnp的正常对照小鼠在注射vegfa特异性cas9rnp后7天分别获得的视网膜的荧光横截面图像；图7b是显示视蛋白阳性区域(％)的图；图8是pet28-nls-cas9载体的切割图，和图9是prg2载体的切割图。具体实施方式实施例以下，将通过实施例详细描述本发明。以下实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明。[参考实施例]1、cas9rnp的制备纯化的cas9蛋白购自韩国的toolgeninc。根据制造商的方案，使用t7聚合酶(newenglandbiolabs)通过体外转录产生sgrna。简而言之，通过退火和延伸两个互补寡核苷酸组来制备sgrna的模板(参见表1)。表1编码sgrna的体外转录模板(靶序列：下划线；crrna必不可少的部分：粗体；核苷酸接头：斜体)将每种制备的sgrna模板与t7rna聚合酶一起加入到包括ntp(jenabioscience)和rnase抑制剂(newenglandbiolabs)的反应缓冲液(40mmtris-hcl、20mmmgcl2、2mm亚精胺、1mmdtt，ph7.9)中，在37℃下孵育16小时进行转录。将sgrna转录物与dna酶i(newenglandbiolabs)在37℃下孵育30分钟。使用rneasyminelutecleanupkit(qiagen)纯化sgrna，并使用nanodrop(thermofisherscientific)定量。将经纯化的sgrna(65μg)与cip(小牛肠；1000单位；碱性磷酸酶，newenglandbiolabs)一起在37℃孵育1小时以除去3-磷酸基团。使用rneasyminelutecleanupkit(qiagen)再次纯化得到的sgrna，并使用nanodrop(thermofisherscientific)定量。分析所有cas9蛋白和sgrna原种的细胞活力和基因编辑(插入缺失)效率。基于该试验，选择在体内眼睛注射中表现出高效率的cas9蛋白和sgrna原种。2、cas9蛋白纯化将pet28-nls-cas9载体(图8；cas9：源自化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)(seqidno:358))转化到大肠杆菌菌株bl21(de3)中，然后在18℃下用0.5mm异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)处理12小时以诱导cas9蛋白的表达。通过超声处理裂解大肠杆菌细胞，并以20,000g离心30分钟。将由此获得的可溶性裂解物与ni-nta珠(qiagen)混合，并以1:10的比例(cas9蛋白：cy3染料分子)添加cy3染料(gehealthcare)。将混合物在4℃，黑暗条件下孵育过夜(12小时或更长时间)。用洗脱缓冲液(50mmtris-hcl[ph7.6]、150-500mmnacl、10-25％(w/v)甘油、0.2m咪唑)洗脱cy3标记的cas9，并用透析缓冲液(20mmhepesph7.5、150mmkcl、1mmdtt、10％(w/v)甘油)透析。使用ultracel100k纤维素柱(millipore)浓缩经纯化的cy3标记的cas9蛋白。通过sds-page测量cy3标记的cas9蛋白的纯度。通过比较cas9蛋白(280nm)和缀合的cy3染料分子的吸收光谱确定cy3标记效率。3、细胞培养和转染小鼠nih3t3(crl-1658tm)和arpe-19(人视网膜色素内皮细胞；crl-2302tm)细胞系在补充有10％(v/v)bcs或者fbs的dulbecco改良eagle培养基(dmem)在37℃，湿润的5％co2气氛下培养(nih3t3和arpe-19细胞未经过鉴定或测试支原体污染)。转染前一天，将nih3t3和arpe-19细胞以2×104个细胞/孔的细胞密度接种到24孔板中，每个孔含有250μl无抗生素的生长培养基。对于质粒递送，根据制造商的方案，使用lipofectamine2000(thermofisherscientific)将cas9(1μg；来自酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)；编码序列(4107bp)：seqidno:358)表达质粒(使用的pet载体(addgene))和sgrna(1μg；实施例1)表达质粒(使用的prg2载体(参见图9))转染24孔板中的细胞。对于rnp递送，将cas9蛋白(4μg；实施例2)与sgrna(2.25μg；实施例1)在室温下孵育5分钟，然后加入50μl的opti-mem(thermofisherscientific)和1μl的lipofectamine2000(thermofisherscientific)。10分钟后，将rnp混合物加入24孔板中并转染到细胞中。转染后48小时收获细胞，并进行t7e1试验、靶向深度测序和qpcr。对于汇合的rpe(人视网膜色素上皮细胞)细胞中的vegf-a表达，使制备的arpe-19细胞生长至汇合，然后保持在1％(v/v)fbs补充的dmem/f12中以使得能够形成用于实验的极化上皮层。将arpe-19细胞加入到12孔板中，并用8μg的cas9蛋白、4.5μg的sgrna和3μl的lipofectamine2000转染。转染后两天，转染生长培养基(dmem+1％(v/v)fbs)用0.5ml新鲜无血清培养基替换。16小时后，收获细胞和培养基并使用靶向深度测序、qpcr和elisa分析。4、cy3标记的cas9rnp成像和计数转染后一天，将细胞在室温下用4％(w/v)pfa(多聚甲醛)固定10分钟，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，1μg/ml，sigmaaldrich)在室温下染色15分钟。用共聚焦显微镜(lsm510，carlzeiss)在x630的放大倍数下观察细胞。扫描参数如下：缩放(x＝0.14μm/像素，y＝0.14μm/像素，z＝1μm/像素)、尺寸(x＝1024，y＝1024，z＝6，通道：3，12-比特)(用物镜c-apochromat63x/1.20wkorruv-vis-ir)。使用zen2软件(黑版，ver10.0，carlzeiss)计数cy3阳性细胞核。为了量化cy3阳性细胞核的频率，在x630的放大倍数的视野中计数细胞总数和细胞核具有cy染色的细胞数并且计算四个视野的cy3阳性细胞核的平均百分比(n＝3)。5、t7e1试验根据制造商的方案，使用dneasy组织试剂盒(qiagen)从细胞和组织中分离基因组dna。在使用pcr扩增靶位点后，使用热循环仪使产物变性并退火。使用的引物总结于下表2中。表2用于t7e1试验的引物的列表将退火的pcr产物与t7核酸内切酶i(toolgen，inc。)在37℃孵育25分钟，并通过琼脂糖凝胶电泳分析。6、靶向深度测序使用phusion聚合酶(thermofisherscientific)，从基因组dna扩增靶标和潜在的脱靶区域。使用illuminamiseq(lasinc.korea)对pcr扩增子进行配对末端测序。使用的引物列于表3至5中：表3用于靶向深度测序的引物的列表表4用于在潜在脱靶位点的靶向深度测序的引物的列表表5用于由digenome-seq捕获的潜在脱靶位点处的靶向深度测序的引物的列表在pam序列上游3bp的位点周围的插入缺失被认为是由cas9rnp活性引起的突变。7、rna提取和qpcr根据制造商的方案，使用easy-spintm总rna提取试剂盒(intron，korea)从nih3t3和arpe-19细胞中分离总rna。然后，使用superscriptii(enzynomics)逆转录250ngrna。使用sybrgreen(kapa)用以下引物进行定量pcr(qpcr)：小鼠vegfa：5'-acgtcagagagcaacatcac-3'(正向；seqidno:283)，5'-ctgtctttctttggtctgcattc-3'(反向；seqidno:284)；小鼠gapdh：5'-gctgagtatgtcgtggagtcta-3'(正向；seqidno:285)，5'-gtggttcacacccatcacaa-3'(反向；seqidno:286)；人vegfa-1：5'-cgagtacatcttcaagccatcc-3'(正向；seqidno:287)，5'-ggtgaggtttgatccgcataat-3'(反向；seqidno:288)；人vegfa-2：5'-agaaggaggagggcagaat-3'(正向；seqidno:289)，5'-cacaggatggcttgaagatgta-3'(反向；seqidno:290)；人gapdh：5'-caatgaccccttcattgacc-3'(正向；seqidno:291)，5'-ttgattttggagggatctcg-3'(反向；seqidno:292)。8、使用汇合的arpe-19细胞的vegfaelisa对于人vegfaelisa，将经vegfa特异性cas9rnp处理的汇合arpe-19细胞在无血清培养基中孵育16小时，之后从细胞培养物中收集无血清上清液。根据制造商的说明书，使用人vegfquantikineelisa试剂盒(dve00，r&dsystems)测量分泌的vegfa蛋白水平。9、体外切割基因组dna和digenome测序使用dneasytissuekit(qiagen)从arpe-19细胞(atcc)分离基因组dna。如下所述进行用于digenome测序的基因组dna的体外切割。简而言之，将基因组dna(20μg)与cas9蛋白(16.7μg)和sgrna(12.5μg)在反应缓冲液(100mmnacl、50mmtris-hcl、10mmmgcl2、100μg/mlbas，ph7.9)中在37℃下孵育3小时以诱导cas9切割基因组dna。将经切割的基因组dna用rnasea(50μg/ml，sigmaaldrich)在37℃处理30分钟，并用dneasy组织试剂盒(qiagen)纯化。如前所述进行全基因组和digenome(kim,d.,kim,s.,kim,s.,park,j.&kim,j.s.genome-widetargetspecificitiesofcrispr-cas9nucleasesrevealedbymultiplexdigenome-seq.genomeresearch26,406-415(2016))。10、通过视网膜下注射施用rnp的动物的制备本研究中对所有动物的护理、使用和处理严格遵守首尔国立大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和“arvo眼科和视力研究中动物使用声明”。在该研究中使用成年(6周龄)雄性spfc57bl/6j小鼠。将小鼠维持在12小时的黑暗-光照循环下。如下对制备的小鼠进行视网膜下注射rnp。首先，将由cas9蛋白(8μg)、sgrna(4.5μg)和lipofectamine2000(20％v/v)组成的rnp以2μl或3μl注射体积混合。使用具有33g钝针的nanofil注射器(worldprecisioninstruments，inc。)在手术显微镜(leicamicrosystems，ltd。)下将rnp(2或3μl)注射到视网膜下空间。患有视网膜出血的受试者被排除在研究之外。11、激光诱导的脉络膜新生血管(cnv)动物模型的构建通过以2.25mg/kg(体重)的剂量腹膜内注射含有重量比为1:1的谷氨酰胺和唑拉西泮的混合物麻醉小鼠。用含有苯肾上腺素(0.5％(w/v))和托吡卡胺(0.5％(w/v))的滴眼剂扩张瞳孔。使用间接头套装递送系统(iridex)和激光系统(ilooda)进行激光光凝固。激光波长为810nm。激光参数如下：光斑尺寸：200μm；功率：1w；和曝光时间：100毫秒。通过修改在视盘周围的12(右眼)或6(左眼)点钟位置处诱发激光烧伤。实验中仅包括产生没有玻璃体出血的气泡的烧伤。视网膜下rnp注射在激光烧伤的象限中进行。将cas9rnp(sgrosa26(含有rosa26靶向sgrna)或sgvegfa(含有vegfa靶向sgrna))随机分配到每只小鼠的左眼或右眼。视网膜下注射cas9rnps产生气泡。确认气泡与激光烧伤部位重叠。其中气泡与激光烧伤部位重叠的受试者用于进一步研究。激光处理后7天，将眼睛在4％pfa中在室温下固定1小时。将rpe(视网膜色素上皮细胞)复合物(rpe/脉络膜/巩膜)在4℃下用异凝集素-b4(thermofisherscientific，目录号i21413，1:100)处理过夜以进行免疫染色。将经染色的rpe复合物平铺并用荧光显微镜(eclipse90i，nikon)以x40的放大倍数观察。盲视观察者使用imagej软件(1.47v，nih)测量cnv面积。12、免疫荧光染色和成像通过在高功率视野区域(100μm×100μm，n＝8)中对石蜡包埋的横截面样品(4μm)中的dapi染色的核计数来计算rpe复合物中的rpe细胞的数量。在注射后第7天获得的横截面样品(n＝4)用抗视蛋白抗体(millipore，ab5405，1:1000)和alexafluor488抗体(thermofisherscientific，1:500)进行免疫染色。使用imagej软件(1.47v，nih)由盲视观察者测量视蛋白阳性区域。使用共聚焦显微镜(lsm710，carlzeiss)对平铺的rpe中cy3-cas9蛋白的细胞内分布进行成像。扫描参数如下：缩放(x＝0.042μm/像素，y＝0.042μm/像素，z＝0.603μm/像素)，尺寸(x＝1024，y＝1024，z＝12，通道：2，8比特)，并使用物镜c-apochromat40×/1.20wkorrm27进行变焦(5.0)。zen2软件用于处理图像。13、从cnv区域和rpe复合物中提取基因组dna在rnp注射后第3天从复合的rpe中分离基因组dna，并测量cnv面积。在rnp注射后第7天，从cnv样品中分离基因组dna。使用nucleospin组织试剂盒(macherey-nagel)进行基因组dna分离。为了评估rnp功效，将每个rpe复合物分成四象限，并且处理注射rnp的象限以分离基因组dna。为了评估rpe复合物的cnv区域中的插入缺失频率，对平铺的rpe进行成像并用pbs洗涤。从以下区域分离基因组dna：(i)包括注射rnp的cnv区域的象限(代表注射区域)；(ii)相反象限(代表非注入区域)。14、小鼠vegf-aelisa对于小鼠vegf-aelisa，在眼中诱导总共30处激光烧伤，然后将rnp(3μl)注射到视网膜下空间。在注射后第3天，从视网膜分离整个rpe复合物并冷冻用于进一步分析。用ripa缓冲液(50mmtris-hcl(ph8.0)、150mmnacl、1％lgepalca-630、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％sds)裂解细胞，并根据制造商的说明，使用小鼠vegfquantikineelisa试剂盒(mmv00，r&d系统)测量vegfa水平。15、蛋白质印迹为了分析体内rnp递送后rnp水平随时间的变化，进行注射后1和3天获得的rpe复合物的western印迹。分析各自含有等量蛋白质(20μg)的样品；分别用抗ha高亲和力抗体(roche，3f10，1:1000)和抗-β-肌动蛋白抗体(sigmaaldrich，a2066，1:1000)检测cas9和β-肌动蛋白。imagequantlas4000(gehealthcare)用于数字成像。16、统计数据用spss软件版本18.0(spss，inc.)分析数据。p值通过不配对的双侧学生t检验或单因素方差分析和tukey事后检验(多组)确定。数据表示为具有s.e.m(平均值的标准误差)的平均值。实施例1：通过cas9核糖核蛋白(rnp)的vegfa/vegfa基因靶向突变测试四种单链向导rna(sgrna)(标记为vegfa-1、2、3和4)，其靶向小鼠nih3t3细胞系和人rpe细胞系(arpe-19)中分别编码vegf受体1和2的结合位点的外显子3和4中的靶位点。参考参考实施例1构建四种sgrna(vegfa-1、2、3和4)。人和小鼠基因组中vegfa/vefga基因中crispr-cas9靶序列的sgrna靶向序列和同源位点的数目总结在下表6中：表6(*使用cas-offinder确定(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)；下划线：pam序列)将上面制备的含sgrna的vegfa特异性cas9rnp转染到小鼠nih3t3和人arpe-19细胞中，并用于以下实验。如参考实施例3中所述，借助于质粒将rnp递送到细胞中，所述质粒被引入细胞并使得核酸分子能够在细胞中表达sgrna和cas9蛋白(在图中以质粒表示)或以这样的方式，使用阳离子脂质(lipofectamine)将sgrna和重组cas9蛋白的复合物(或混合物)递送到细胞中(在图中表示为rnp)。小鼠nih3t3和人arpe-19细胞的vegfa/vegfa基因座中的靶序列描绘于图1a中(pam序列为红色；sgrna靶序列为蓝色)。在转染后第2天，使用深度测序测量通过递送含有四种sgrna(vegfa-1sgrna、vegfa-2sgrna、vegfa-3sgrna和vegfa-4sgrna)的vegfa特异性cas9rnp或携带其编码序列的质粒而诱导的突变频率(参见参考实施例2)。结果如图1h所示(误差柱表示s.e.m.(n＝3)，单因素方差分析和tukey事后检验，***p<0.001)。此外，通过t7核酸内切酶i(t7e1)试验检测递送由含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp或携带其编码序列的质粒而诱导的在nih3t3和arpe-19细胞中的突变，并显示于图1b中。在图1b中，箭头表示被t7e1切割的dna条带的预期位置。在转染第2天后使用靶向深度测序测量由递送含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp或携带其编码序列的质粒而诱导的在nih3t3和arpe-19细胞中的插入缺失频率(参见参考实施例6)。结果如图1c所示(误差柱：s.e.m(n＝3)；单因素方差分析和tukey事后检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。由vegfa特异性cas9rnp(含有vegfa-1sgrna)在nih3t3和arpe-19细胞中的vegfa/vegfa基因座诱导的代表性突变dna序列示于图1d中(下划线：由sgrna靶向的靶序列，蓝色：插入的核苷酸，-：缺失区域，wt：野生型；三角形：切割位置；右侧的列：插入或缺失的核苷酸的数目)。通过在转染后64小时的靶向深度测序检测通过递送含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp而在汇合的arpe-19细胞中诱导的突变(插入缺失)频率，且结果在图1e中给出。通过定量pcr(qpcr)在细胞中测量的相对vegfamrna水平描绘于图1f中，且通过如参考实施例8的vegfaelisa在细胞中测量的vegfa蛋白水平如图1g所示(误差柱：s.e.m.(n＝5)，学生t检验，**p<0.01，***p<0.001)。如图1h所示，当四个sgrna中的vegfa-1sgrna与cas9复合并以rnp形式递送到细胞中时，在nih3t3细胞中获得最高的插入缺失效率。另外，图1b和1c显示具有最高插入缺失效率的vegfa-1sgrna在nih3t3和arpe-19细胞中诱导突变，并且当以rnp形式递送时，观察到在靶位点诱导小的插入和缺失(插入缺失)，频率为82±5％(nih3t3细胞)或57±3％(arpe-19细胞)。sgrna和cas9的rnp递送使得能够比质粒转染更高的插入缺失效率(图1c)。如图1e所示，在用vegfa特异性cas9rnp处理的arpe-19细胞中检测到插入缺失频率为40±8％，且图1f和1g显示vegfa特异性cas9rnp在有丝分裂后条件下在汇合的arpe-19细胞中将vegfamrna水平降低24±4％以及vegfa蛋白水平降低52±9％。实施例2：cy3标记的cas9rnp的体外和体内递送为了监测cas9rnp在体外和体内的定位，cy3-偶联cas9蛋白(参考实施例4)。因此，将与或不与vegfa-1sgrna组合的cy3-cas9与阳离子脂质混合并递送到nih3t3细胞中。或者，通过视网膜下注射将vegfa特异性、cy3标记的或未标记的cas9rnp递送到成年小鼠眼中用于以下实验。用cy3标记的cas9rnp(cy3标记的cas9和vegfa-1sgrna的复合物)转染或cy3标记的cas9(作为对照)单独转染nih3t3细胞，并在转染后24小时在共聚焦显微镜下观察以可视化细胞中的cy3信号(参见参考实施例4)。由此获得的图像在图2a中给出。在图2a中，白色箭头表示cy3染料的核共定位。右侧的z轴图像显示cy3-cas9定位于细胞核内。此外，测量转染后24小时的总dapi阳性细胞核中cy3阳性细胞核的比例(100*[cy3阳性细胞核数]/[dapi阳性细胞核总数])，结果如图2b所示(误差柱表示sem(n＝3)。学生t检验：***p<0.001)。通过t7核酸内切酶1(t7e1)试验检测由含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp介导的在nih3t3细胞中的突变(参见参考实施例5)，并显示在图2c中。在图2c中，箭头表示被t7e1切割的dna条带的预期位置。在转染后24小时，使用靶向深度测序测量由含有vegfa-1sgrna的vegfa特异性cas9rnp驱动的在nih3t3细胞中的突变的频率(参见参考实施例6)，并显示在图2d中(误差柱：s.e.m(n＝3)；单因素方差分析和tukey事后检验，***p<0.001)。在荧光显微镜下观察cy3标记的cas9rnp注射到小鼠眼中后第3天的代表性平铺的rpe(参见参考实施例11和12)，结果在图2e中给出。在该图中，白色箭头表示cy3染料的核共定位。在荧光显微镜下观察rpe/脉络膜/巩膜复合体中视网膜色素上皮(rpe)的分布(参见参考实施例11和12)，结果示于图2h中。图2h描绘了rpe/脉络膜/巩膜复合物的代表性横截面。在高倍视野区域(100μm×100μm)中计数dapi阳性rpe细胞和其他细胞。在图2h中，黄线表示rpe和脉络膜之间的边界，白色箭头表示rpe/脉络膜/巩膜复合体中的rpe核(10.5±2.8％，n＝8)。参考实施例13，使用从视网膜色素上皮细胞(rpe)/脉络膜/巩膜复合物中分离的基因组dna确定体内诱导的插入缺失频率。在注射后第3天通过深度测序(参见实施例6)分析插入缺失。结果描绘于2f中(误差柱是s.e.m.(n＝6)，学生t检验，**p<0.01)。由vegfa特异性cas9rnp(含有vegfa-1sgrna)体内诱导的突变dna序列描绘于图5中：(a)注射后第3天，由vegfa特异性cas9rnp诱导的rpe中的代表性突变dna序列；(b)注射后第7天，含有激光诱导的脉络膜新血管形成(cnv)的rpe中的突变dna序列。pam序列以红色显示。wt表示野生型。右边的列表示插入或缺失的核苷酸的数量和频率。进行western印迹分析以在注射后24小时和72小时(n＝4)测量rpe/脉络膜/巩膜复合物中cas9蛋白的水平，结果显示在图2g和2i中。图2a至2d显示了体外结果。如图2a和2b所示，在许多细胞核中检测到cy3-cas9rnp，以及如2c和2d所示，观察到在靶位点诱导插入缺失。用cy3-cas9rnp处理后cy3阳性细胞核的比例(42±6％)(图2b)几乎等于靶位点的插入缺失频率(40±3％)(图2d)，表明通过细胞核定位的cas9在细胞中几乎完全切割靶位点，并且基因组编辑中的限速因子是cas9的核定位。当单独递送而没有sgrna时，很少在细胞核中检测到cy3-cas9并且不诱导插入缺失(图2a和2d)。cas9是带正电荷的蛋白质，pi值为9.12，并且在没有负电荷的sgrna的情况下不能与阳离子脂质形成复合物。然而，cy3-cas9rnp的活性低于以80％的频率诱导靶特异性突变的未标记的cas9rnp的活性(图2d)。图2e至2i显示体内结果。在注射cy3-cas9rnp后3天，在体内rpe的核中观察到cy3染料(体内，图2e)。因为rpe是通过视网膜注射递送rnp的主要目标，所以rpe单独使得能够理想分析突变频率。然而，实际上，将用于靶向深度测序的rpe从rpe/脉络膜/巩膜复合物分类并不容易。相反，计数dapi阳性细胞核以计算rpe的比例，其占rpe/脉络膜/巩膜复合物的11±3％(图2h)。值得注意的是，视网膜下注射cy3未标记的cas9rnp在注射后第3天产生了频率为16±2％的插入缺失，随后在体内rpe中编辑了vegfa基因的大多数靶位点(n＝6，图2f和5a)。通过western印迹分析，还发现cas9蛋白在注射后第3天完全降解(图2g和2i)，表明cas9在体内快速转变。实施例3：视网膜注射vegfa靶向cas9rnp对年龄相关性黄斑变性(amd)和激光诱导的脉络膜新生血管(cnv)的影响的测定为了研究cas9rnp是否可用于治疗amd小鼠模型中的cnv，激光诱导cnv的小鼠通过视网膜下注射vegfa特异性cas9rnp(含有vegfa-1sgrna)或rosa26特异性cas9rnp(rosa26-rnp；含有rosa26sgrna)进行治疗。由于视网膜注射本身增加了cnv的大小，因此rosa26-rnp用作阴性对照。通过视网膜注射施用预装配的vegfa特异性cas9rnp至激光诱导的cnv的小鼠。在眼睛中的视网膜色素上皮(rpe)复合物平铺后，在注射后第7天分析cnv区域。通过深度测序分析从cas9rnp注射区域或从相对的非注射区域(无rnp区域)分离的基因组dna。在注射后第3天进行vegfaelisa。该过程示意性地显示在图3a中。在注射后第7天，可视化注射rosa26特异性cas9rnp(作为对照)或vegfa-rnp的c57bl/6j小鼠中用异凝集素b4(ib4)染色的激光诱导的cnv(参见参考实施例11)。代表性图像显示在图3b中。黄线划分了cnv的区域。在注射后第3天，通过评估cnv面积评估治疗效果。参照参考实施例11，在注射vegfa特异性cas9rnp的c57bl/6j小鼠中测量cnv面积，并在图3c中描绘为注射rosa26特异性cas9rnp的对照的cnv区域(100％)的相对值(％)(误差柱表示s.e.m.(n＝15)，学生t检验，***p<0.001)。通过elisa测量cnv区域中的vegfa水平(pg/ml)(参见参考实施例14)，结果显示在图3d中(误差柱表示s.e.m.(n＝10)，学生t检验，**p<0.01)。rpe复合物中vegfa靶位点的插入缺失频率(％)显示在图3e中(误差柱表示s.e.m.(n＝7)，单因素方差分析和tukey事后检验，***p<0.001)。rpe复合物中rosa26靶位点的插入缺失频率(％)示于图3f中(误差柱表示s.e.m.(n＝7)，学生t检验，*p<0.05)。通过苏木精和伊红染色可视化横截面样品中的激光诱导的cnv结构，并显示在图3g中。在图3g中，黄线表示cnv边界，白色三角形表示rpe/脉络膜/巩膜复合体中的视网膜色素上皮(rpe)层。观察到大多数rpe细胞在cnv区域受损(ch：脉络膜，r：视网膜，s：巩膜)。通过靶向深度测序用于突变分析的代表性cnv样品显示于图3h中。在图3h中，红线表示用于突变分析的rpe/脉络膜/巩膜复合物的边界。rpe细胞主要存在于由黄线限制的cnv区域之外。激光处理后第7天激光诱导的cnv如图3i所示。用ib4标记物和dapi共染色的上皮细胞聚集到cnv区域(中间)。如图3b和3c所示，与注射rosa26-rnp的小鼠相比，发现注射vegfa-rnp的小鼠cnv面积显著减少(相对注射rosa26-rnp的小鼠为58±4％，n＝15，p<0.001，学生t检验)。另外，如图3d所示，与注射rosa26-rnp相比(440±30pg/ml，n＝10)，注射vegfa特异性cas9rnp可有效降低cnv区vegfa蛋白浓度(300±20pg/ml，n＝10)。如从图3e和3f中理解，检测了vegfa特异性cas9rnp处理的cnv和rosa26-rnp处理的cnv(参见图5b)中的rnp靶位点中的插入缺失频率分别为3.5±0.3％(vegfa插入缺失)和3.3±1.0％(rosa26插入缺失)，而在阴性对照中根本未检测到插入缺失。该结果表明视网膜下注射vegfa特异性cas9rnp可以进行局部治疗甚至在眼睛中治疗。图3g显示cnv中的大多数rpe细胞通过激光处理被杀死。cas9rnp的基因编辑在死细胞中不能实现，而仅在存活的rpe细胞中实现(图3h)。结果，在存活的rpe细胞中比在无cnv区域的细胞中检测到更低的插入缺失频率。在激光处理后第3天，上皮细胞聚集在cnv区域中以形成新血管(图3i)。由于细胞不是基因编辑的，因此cnv区域的插入缺失频率进一步降低。这些结果表明，使用cas9rnp靶向眼睛中失活的vegfa使得能够进行用于amd局部治疗的治疗性基因组手术。治疗性基因组治疗中的关键问题是crispr-cas9的靶特异性。检查了在该实验中使用的vegfa特异性cas9rnp是否在小鼠眼或人细胞中引起任何脱靶突变。首先，使用cas-offinder鉴定小鼠基因组中与cas9rnp的vegfa-sgrna的靶序列最同源的20个潜在脱靶位点，并总结于下表7中。表7小鼠基因组中vegfa-1sgrna(具有pam)的潜在脱靶位点从cas9rnp处理的小鼠眼的无cnvrpc复合物中分离的基因组dna进行靶向深度测序在20个潜在的脱靶位点中插入缺失频率(％)。结果如图6所示(误差柱表示sem(cas9空白对照的n＝3，cas9rnp的n＝5)。不匹配的核苷酸和pam序列分别以红色和蓝色显示。在cas9rnp处理的20个潜在的脱靶位点，没有检测到频率大于0.1％的cas9诱导的插入缺失，表明在测序错误率以外没有诱导脱靶突变(测序错误率；平均0.1％)。即，发现在本发明中使用的vegfa特异性cas9rnp，在rpe中没有表现出脱靶效应。实施例4：人类基因组中vegfa特异性cas9rnp的全基因组靶特异性的试验digenome-seq揭示了vegfa特异性cas9rnp在人类基因组中的全基因组靶特异性(参见参考实施例6和9)。图4a是显示体外切割位点的全基因组circos图。人基因组dna以红色显示，rgen消化的基因组dna以蓝色显示。使用包括41个digenome捕获位点和一个中靶序列的42个序列获得的序列标志在图4b中给出。通过靶向深度测序在人arpe-19细胞中验证的脱靶位点和插入缺失频率示于图4c中。错配的核苷酸以红色显示，pam序列以蓝色显示。图4a和4b中所示的vegfa特异性cas9rnp的特定靶序列在人vegfa基因中是非常保守的。使用digenome-seq(kimetal.,naturemethods12,237–243(2015))评估人类全基因组特异性，其中使用vegfa特异性cas9rnp体外处理无细胞人基因组dna，然后进行全基因组测序。计算地鉴定体外切割位点处的序列读数的一致而非随机的比对，以提供潜在的脱靶位点列表。使用vegfa特异性cas9rnp的digenome-seq显示包括中靶位点的42个体外切割位点，并且位点总结在下表8中。表8使用vegfasgrna通过digenome-seq鉴定人类基因组中的体外切割位点为了检查表8中列出的位点的有效性，使用从vegfa特异性rnp转染的arpe-19细胞分离的基因组dna进行靶向深度测序(参见图4c)。尽管这些位点在体外有效切割，但在这41个切割位点上未检测到高于测序错误率的脱靶的插入缺失(平均0.1％)。如有必要，使用具有改善的特异性的经修饰的grna(fu,y.,sander,j.d.,reyon,d.,cascio,v.m.&joung,j.k.improvingcrispr-casnucleasespecificityusingtruncatedguidernas.naturebiotechnology32,279-284(2014)；cho,s.w.etal.analysisofoff-targeteffectsofcrispr/cas-derivedrna-guidedendonucleasesandnickases.genomeresearch24,132-141(2014))或cas9变体(kleinstiver,b.p.etal.high-fidelitycrispr-cas9nucleaseswithnodetectablegenome-wideoff-targeteffects.nature529,490-495(2016)；slaymaker,i.m.etal.rationallyengineeredcas9nucleaseswithimprovedspecificity.science351,84-88(2016))，进一步减少或避免存在的尽管轻微的脱靶效应。总之，这些结果显示含有本发明提供的具有vegfa靶向序列的sgrna的vegfa特异性rnp在小鼠和人细胞中都是高度特异性的(体内和体外)。实施例5：vegfa特异性cas9rnp的副作用的试验突变vegfa基因治疗amd或糖尿病性视网膜病变的另一个主要问题是vegfa在眼睛中的营养作用。视锥功能障碍是vegfa突变后最显著的变化，并且在小鼠rpe中条件性缺失vegfa基因后3天观察到。为了检查由本发明提供的vegfa特异性cas9rnp是否引起视锥功能障碍，使用荧光显微镜观察视蛋白阳性区域并计算。结果描绘于图7a(荧光图像)和7b(视蛋白阳性区域(％)中。图7a显示了注射vegfa特异性cas9rnp7天后从注射了vegfa特异性cas9rnp(仅注射rnp而没有激光处理)的正常小鼠和没有注射vegfa特异性cas9rnp的正常对照小鼠中获得的各个视网膜的荧光横截面图像。视蛋白显示为绿色，dapi显示为蓝色。图7b是显示视蛋白阳性区域(％)的图，在正常对照(3.0±0.5％)和注射vegfa特异性cas9rnp的小鼠(3.1±0.5％)之间没有显著差异(误差柱表示sem(n＝4)；#，p>0.05(学生t检验))。如从图7a和7b中理解，注射了本发明提供的vegfa特异性cas9rnp的小鼠，即使在治疗后第7天，锥体细胞的选择阳性区域与未注射的正常对照没有差异，表明没有发生锥体功能障碍。这些结果意味着vegfa特异性cas9rnp仅特异性地突变vegfa基因的靶序列，而不会引起显著的副作用。此外，使用vegfa特异性cas9rnp甚至在治疗后7天也不产生副作用，而在常规vegfa靶向治疗中治疗后3天观察到副作用。这里，已经在此描述了本发明的一些示例性实施方案。然而，本领域技术人员应该理解，提供这些实施方案仅用于说明目的，不应以任何方式解释为限制本发明。相反，应该理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改、改变、变更和等同实施方案，本发明的精神和范围仅由所附权利要求及其等同物限定。<110>基础科学研究院；首尔大学校产学协力团；首尔大学医院<120>用于治疗眼部疾病的含cas9蛋白和向导rna的药物组合物<130>opp20174085kr<150>us62/367,674<151>2016-07-28<160>361<170>kopatentin2.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-1靶序列)<400>1ctcctggaagatgtccacca20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-2靶序列)<400>2agctcatctctcctatgtgc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-3靶序列)<400>3gaccctggtggacatcttcc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-4靶序列)<400>4actcctggaagatgtccacc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-5靶序列)<400>5cgcttaccttggcatggtgg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-6靶序列)<400>6gaccgcttaccttggcatgg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-7靶序列)<400>7cacgaccgcttaccttggca20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegf-a基因的vegfa-8靶序列)<400>8ggtgcagcctgggaccactg20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-1靶向序列)<400>9cuccuggaagauguccacca20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-2靶向序列)<400>10agcucaucucuccuaugugc20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-3靶向序列)<400>11gacccugguggacaucuucc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-4靶向序列)<400>12acuccuggaagauguccacc20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-5靶向序列)<400>13cgcuuaccuuggcauggugg20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-6靶向序列)<400>14gaccgcuuaccuuggcaugg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-7靶向序列)<400>15cacgaccgcuuaccuuggca20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(vegfa-8靶向序列)<400>16ggugcagccugggaccacug20<210>17<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(编码sgrnavegfa-1的体外转录模板（正向)）<400>17gaaattaatacgactcactatagctcctggaagatgtccaccagttttagagctagaaat60agcaag66<210>18<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(编码sgrnavegfa-2的体外转录模板（正向)）<400>18gaaattaatacgactcactatagagctcatctctcctatgtgcgttttagagctagaaat60agcaag66<210>19<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(编码sgrnavegfa-3的体外转录模板（正向)）<400>19gaaattaatacgactcactataggaccctggtggacatcttccgttttagagctagaaat60agcaag66<210>20<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(编码sgrnavegfa-4的体外转录模板（正向)）<400>20gaaattaatacgactcactatagactcctggaagatgtccaccgttttagagctagaaat60agcaag66<210>21<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(编码sgrnarosa26的体外转录模板（正向)）<400>21gaaattaatacgactcactatagggcggtcctcagaagccagggttttagagctagaaat60agcaag66<210>22<211>82<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(编码sgrna的体外转录模板(反向)(通用))<400>22aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaac60ttgctatttctagctctaaaac82<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的正向引物(小鼠vegfa-1,1stpcr))<400>23caaatctgggtggcgataga20<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的反向引物(小鼠vegfa-1,1stpcr))<400>24agatggtcaaatcgtggagag21<210>25<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的正向引物(小鼠vegfa-1,2ndpcr))<400>25acactctttccctacacgacgctcttccgatctcaaatctgggtggcgataga53<210>26<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的反向引物(小鼠vegfa-1,2ndpcr))<400>26gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccagggcttcatcgttaca53<210>27<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的正向引物(人vegfa-1,1stpcr))<400>27catcgtgtgatctctggaatgaa23<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的反向引物(人vegfa-1,1stpcr))<400>28ccacctgttcccaaagtgtta21<210>29<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的正向引物(人vegfa-1,2ndpcr))<400>29acactctttccctacacgacgctcttccgatctgtggtgaagttcatggatgtcta56<210>30<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于t7e1试验的反向引物(人vegfa-1,2ndpcr))<400>30gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaagatgcccacctgcat52<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(小鼠vegfa-2,1stpcr))<400>31acctatccctgctcagtagaa21<210>32<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(小鼠vegfa-2,1stpcr))<400>32cccaagagaggaagcaagaa20<210>33<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(小鼠vegfa-2,2ndpcr))<400>33acactctttccctacacgacgctcttccgatctatctgctccctccctctac52<210>34<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(小鼠vegfa-2,2ndpcr))<400>34gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtccatcaccatcaccaccaccac58<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(小鼠rosa26,1stpcr))<400>35ccaaagtcgctctgagttgt20<210>36<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(小鼠rosa26,1stpcr))<400>36tcgggtgagcatgtctttaatc22<210>37<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(小鼠rosa26,2ndpcr))<400>37acactctttccctacacgacgctcttccgatctccaaagtcgctctgagttgt53<210>38<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(小鼠rosa26,2ndpcr))<400>38gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctttaagcctgcccagaaga54<210>39<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot1,1stpcr))<400>39tctgtctgtctccagacatttg22<210>40<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot1,1stpcr))<400>40gtcctgcttctatcctgcttta22<210>41<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot1,2ndpcr))<400>41acactctttccctacacgacgctcttccgatctgtgatcagctgacttccagttc55<210>42<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot1,2ndpcr))<400>42gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctccacaactcaagtcccattac57<210>43<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot2,1stpcr))<400>43gacgtgagagtgagcagtttat22<210>44<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot2,1stpcr))<400>44acagcacccagattgtcttc20<210>45<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot2,2ndpcr))<400>45acactctttccctacacgacgctcttccgatctccttgtgtcctttgatgctct54<210>46<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot2,2ndpcr))<400>46gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaggtctgcaccatgaatcc54<210>47<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot3,1stpcr))<400>47gctgtgctcaagaccaacaa20<210>48<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot3,1stpcr))<400>48ccggttctgtactggtgtct20<210>49<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot3,2ndpcr))<400>49acactctttccctacacgacgctcttccgatctttgcctacctccaccttct52<210>50<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot3,2ndpcr))<400>50gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctagatgctgccctacatgaac54<210>51<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot4,1stpcr))<400>51gtaggctcaacagctctttct21<210>52<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot4,1stpcr))<400>52catagtgtgagtggtactggtg22<210>53<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot4,2ndpcr))<400>53acactctttccctacacgacgctcttccgatctcctgagcttcctctgtcctaat55<210>54<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot4,2ndpcr))<400>54gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgccactgcttctcctctctat55<210>55<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot5,1stpcr))<400>55gcccaaagtagcaggtgatta21<210>56<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot5,1stpcr))<400>56ctcaggctgtaactgacgatatg23<210>57<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot5,2ndpcr))<400>57acactctttccctacacgacgctcttccgatctacaggatgcaagtccacatc53<210>58<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot5,2ndpcr))<400>58gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcattcttcacagggccatca54<210>59<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot6,1stpcr))<400>59agaagctaaggagcccaattt21<210>60<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot6,1stpcr))<400>60tactttgccaagcccatgt19<210>61<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot6,2ndpcr))<400>61acactctttccctacacgacgctcttccgatctgccttctctcttggctgtaa53<210>62<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot6,2ndpcr))<400>62gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgaacctactctcatcgtgctac56<210>63<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot7,1stpcr))<400>63gaggagcccaagtatatcacag22<210>64<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot7,1stpcr))<400>64ggtcaccatagctacaagagag22<210>65<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot7,2ndpcr))<400>65acactctttccctacacgacgctcttccgatctaaggctccattagcctcttc53<210>66<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot7,2ndpcr))<400>66gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgtcatggtgcacatcattc55<210>67<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot8,1stpcr))<400>67ccctgcagcattctctgtat20<210>68<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot8,1stpcr))<400>68gacccagtgtattgtgggtag21<210>69<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot8,2ndpcr))<400>69acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgacaagcctgacagttcatc54<210>70<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot8,2ndpcr))<400>70gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctggctgatggtgagcagaaa53<210>71<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot9,1stpcr))<400>71ctggaaccagagtcatagatagttg25<210>72<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot9,1stpcr))<400>72tctgaagcacacaccagaag20<210>73<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot9,2ndpcr))<400>73acactctttccctacacgacgctcttccgatctcaagataccaaagcaggtgttc55<210>74<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot9,2ndpcr))<400>74gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgaagcagttcagaggtctatgt56<210>75<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot10,1stpcr))<400>75ctagaagaaggcagagggagta22<210>76<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot10,1stpcr))<400>76aggagggacagactggtataaa22<210>77<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot10,2ndpcr))<400>77acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacagcgagccagaataca52<210>78<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot10,2ndpcr))<400>78gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgtgctacctgatctactcaac57<210>79<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot11,1stpcr))<400>79gtgtgaatggaggcgaaattg21<210>80<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot11,1stpcr))<400>80gcagctgagaagctaaggaata22<210>81<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot11,2ndpcr))<400>81acactctttccctacacgacgctcttccgatcttacataaagtccctgcaacctg55<210>82<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot11,2ndpcr))<400>82gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttaccaggactctagtgagtgg56<210>83<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot12,1stpcr))<400>83tagtacctgcccaccagatag21<210>84<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot12,1stpcr))<400>84gggcacttcttcaatgctttac22<210>85<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot12,2ndpcr))<400>85acactctttccctacacgacgctcttccgatctctcctgaccagtgttctgtaat55<210>86<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot12,2ndpcr))<400>86gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaacctcgagtaggaaggga54<210>87<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot13,1stpcr))<400>87cccactgaggttgtatcagttc22<210>88<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot13,1stpcr))<400>88gatccaatggctttgcacatac22<210>89<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot13,2ndpcr))<400>89acactctttccctacacgacgctcttccgatctaaagaagaccagtgaaggactg55<210>90<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot13,2ndpcr))<400>90gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctagtctgatgacccgagttcta55<210>91<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot14,1stpcr))<400>91tctatataggcaggttatgaaagca25<210>92<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot14,1stpcr))<400>92aaccaggacatatgtggtagaaa23<210>93<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot14,2ndpcr))<400>93acactctttccctacacgacgctcttccgatctaatggccttctgggaaagt52<210>94<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot14,2ndpcr))<400>94gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgagtctgagagcttgtagtg56<210>95<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot15,1stpcr))<400>95cacagacagtcgccttcaat20<210>96<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot15,1stpcr))<400>96tggaagccttaacaggtcaataa23<210>97<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot15,2ndpcr))<400>97acactctttccctacacgacgctcttccgatctgccttcaatgaatctccctttg55<210>98<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot15,2ndpcr))<400>98gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgcttcattggcagcacttac54<210>99<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot16,1stpcr))<400>99ggaagatcagcagtctcaactaa23<210>100<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot16,1stpcr))<400>100cacattacctcaaagctgtttctt24<210>101<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot16,2ndpcr))<400>101acactctttccctacacgacgctcttccgatctctcagtgacagagactcaccta55<210>102<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot16,2ndpcr))<400>102gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtggtgacatggctgtatctt55<210>103<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot17,1stpcr))<400>103cttccaccgggtatttcctatc22<210>104<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot17,1stpcr))<400>104tcccagagagagttaggttaaga23<210>105<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot17,2ndpcr))<400>105acactctttccctacacgacgctcttccgatctagatgaatgagcaccagagaaa55<210>106<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot17,2ndpcr))<400>106gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctagacaagaaagggcagtaagaa56<210>107<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot18,1stpcr))<400>107cctgggaacaacagccataa20<210>108<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot18,1stpcr))<400>108gaacattgggtaggtgaggaag22<210>109<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot18,2ndpcr))<400>109acactctttccctacacgacgctcttccgatcttctctgttgaggtgggatttg54<210>110<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot18,2ndpcr))<400>110gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtactgcttgaggagcttgt54<210>111<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot19,1stpcr))<400>111tgagccagtccattcattcc20<210>112<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot19,1stpcr))<400>112tccctcctgttcttctcttct21<210>113<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot19,2ndpcr))<400>113acactctttccctacacgacgctcttccgatctttgggacaagtgtacagagaac55<210>114<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot19,2ndpcr))<400>114gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaccttcacctacagagaagaga56<210>115<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot20,1stpcr))<400>115cccacaaaccaagaacaacaa21<210>116<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot20,1stpcr))<400>116cagtgttaagtgcctctgtagat23<210>117<211>50<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的正向引物(ot20,2ndpcr))<400>117acactctttccctacacgacgctcttccgatctcagaagggcggcatcag50<210>118<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于靶向深度测序的反向引物(ot20,2ndpcr))<400>118gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttttagtctctggtttccacct55<210>119<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot1,1stpcr))<400>119atggagcttgcattttaaca20<210>120<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot1,1stpcr))<400>120cttttttcccgtgatcctca20<210>121<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot1,2ndpcr))<400>121acactctttccctacacgacgctcttccgatctatggagcttgcattttaaca53<210>122<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot1,2ndpcr))<400>122gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgctggcttatttcatcatttag56<210>123<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot2,1stpcr))<400>123caaactgtcagtgagccaatac22<210>124<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot2,1stpcr))<400>124gaagtgatcctcctctcaatacc23<210>125<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot2,2ndpcr))<400>125acactctttccctacacgacgctcttccgatctcaggaagtcaagcaggaaga53<210>126<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot2,2ndpcr))<400>126gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcatccatccattcataactttgga58<210>127<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot3,1stpcr))<400>127gtccaatactctaagcctcagtt23<210>128<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot3,1stpcr))<400>128accagcaccacactatctattt22<210>129<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot3,2ndpcr))<400>129acactctttccctacacgacgctcttccgatctatacctagtttgtagggttgtt55<210>130<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot3,2ndpcr))<400>130gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgcaccacactatctatttctgttat59<210>131<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot4,1stpcr))<400>131acactatgatctttccctgcaa22<210>132<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot4,1stpcr))<400>132cagaaaccctgaagtcttgaattg24<210>133<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot4,2ndpcr))<400>133acactctttccctacacgacgctcttccgatcttctttccctgcaaagaagtaaga56<210>134<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot4,2ndpcr))<400>134gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtctcattgtccagaactgtgt56<210>135<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot5,1stpcr))<400>135gggcagaaaggacagaaact20<210>136<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot5,1stpcr))<400>136ggagaaactgaaaccaggagaa22<210>137<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot5,2ndpcr))<400>137acactctttccctacacgacgctcttccgatctcgtaacagcaccttggtcat53<210>138<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot5,2ndpcr))<400>138gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgaaaccaggagaagtgtagtc57<210>139<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot6,1stpcr))<400>139agtaggtgggagggttcttat21<210>140<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot6,1stpcr))<400>140caccatctctgtgtctcatctg22<210>141<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot6,2ndpcr))<400>141acactctttccctacacgacgctcttccgatctagaaacaggcatctggagaac54<210>142<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot6,2ndpcr))<400>142gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttcagcatagtcttgctcgtc55<210>143<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot7,1stpcr))<400>143taagcctggcctgtctctt19<210>144<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot7,1stpcr))<400>144agagcaggacgtggtgag18<210>145<211>50<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot7,2ndpcr))<400>145acactctttccctacacgacgctcttccgatcttctcttcctgggaccct50<210>146<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot7,2ndpcr))<400>146gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctatacctaggaatgcagaacaag56<210>147<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot8,1stpcr))<400>147gggattgcacttaggttcttct22<210>148<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot8,1stpcr))<400>148ctatgcggtctcttgtgctaat22<210>149<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot8,2ndpcr))<400>149acactctttccctacacgacgctcttccgatctggtcaggtgggtaatgatttctg56<210>150<211>60<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot8,2ndpcr))<400>150gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctaatctgccttatgtaatgggttct6060<210>151<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot9,1stpcr))<400>151gactcctctgtggaaagagc20<210>152<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot9,1stpcr))<400>152aggactccagtgctgagcac20<210>153<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot9,2ndpcr))<400>153acactctttccctacacgacgctcttccgatcttcctctgtggaaagagcct52<210>154<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot9,2ndpcr))<400>154gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctacaccgtctctcctttgtgc54<210>155<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot10,1stpcr))<400>155agggaccgtatcagatattgttaatc26<210>156<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot10,1stpcr))<400>156tccaatgtattgcagccatct21<210>157<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot10,2ndpcr))<400>157acactctttccctacacgacgctcttccgatctaatcaatccttgtgcagcttaatg57<210>158<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot10,2ndpcr))<400>158gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagccatcttgccctttga53<210>159<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot11,1stpcr))<400>159cattgaggaacctcaccttctat23<210>160<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot11,1stpcr))<400>160atgaatgtcttggtactgtcctc23<210>161<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot11,2ndpcr))<400>161acactctttccctacacgacgctcttccgatctggaagaggtgtattaggccatt55<210>162<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot11,2ndpcr))<400>162gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctcttctctcttgcttcatctc57<210>163<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot12,1stpcr))<400>163caaagcagctcctcttcctc20<210>164<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot12,1stpcr))<400>164cagtgcctttcagtgaacct20<210>165<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot12,2ndpcr))<400>165acactctttccctacacgacgctcttccgatcttctgggtatagagaccatgaca55<210>166<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot12,2ndpcr))<400>166gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcacagcctgagataatgatagagag59<210>167<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot13,1stpcr))<400>167ggagtcgtaccctggtttattt22<210>168<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot13,1stpcr))<400>168gaagcattgttccaccttaacc22<210>169<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot13,2ndpcr))<400>169acactctttccctacacgacgctcttccgatctgggatagaagattaggcagagtatg58<210>170<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot13,2ndpcr))<400>170gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgcatgtttgaaaggatgagc55<210>171<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot14,1stpcr))<400>171ctctcagaccctactcacctat22<210>172<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot14,1stpcr))<400>172cactggaagtacctgtggaag21<210>173<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot14,2ndpcr))<400>173acactctttccctacacgacgctcttccgatctagaccctactcacctatatccttt57<210>174<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot14,2ndpcr))<400>174gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttacctgtggaagcaggaga53<210>175<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot15,1stpcr))<400>175ggccatcctcaaagacatgaa21<210>176<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot15,1stpcr))<400>176tctcaaactcccgacctca19<210>177<211>60<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot15,2ndpcr))<400>177acactctttccctacacgacgctcttccgatctgcatttctatttattcatctcccacag6060<210>178<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot15,2ndpcr))<400>178gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgggattacaggcgtgag53<210>179<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot16,1stpcr))<400>179agaagtttcaggatgacagatcc23<210>180<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot16,1stpcr))<400>180caatccacatctgcgtgtttc21<210>181<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot16,2ndpcr))<400>181acactctttccctacacgacgctcttccgatctagaagtttcaggatgacagatcc56<210>182<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot16,2ndpcr))<400>182gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcaatccacatctgcgtgtttc55<210>183<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot17,1stpcr))<400>183tgactcattgtgaatgcctttattc25<210>184<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot17,1stpcr))<400>184gagttgggttctctgcaact20<210>185<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot17,2ndpcr))<400>185acactctttccctacacgacgctcttccgatcttatagagtctagattagcagtagagc59<210>186<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot17,2ndpcr))<400>186gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaagtcttatctgatacatggatacc59<210>187<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot18,1stpcr))<400>187tgcagctctggacaggaa18<210>188<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot18,1stpcr))<400>188ggtgggtttcaccatcctc19<210>189<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot18,2ndpcr))<400>189acactctttccctacacgacgctcttccgatctgggtgattccctctgtgg51<210>190<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot18,2ndpcr))<400>190gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccatcctcctgccctct51<210>191<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot19,1stpcr))<400>191gacagcacttagggatgatgaa22<210>192<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot19,1stpcr))<400>192gatggagctgcccaagaaa19<210>193<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot19,2ndpcr))<400>193acactctttccctacacgacgctcttccgatctgggatgatgaatggctggat53<210>194<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot19,2ndpcr))<400>194gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcttctccatgtaggtgcctt54<210>195<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot20,1stpcr))<400>195cctgagaacaaggagtgtcaag22<210>196<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot20,1stpcr))<400>196ccatggaatgcccagatagtt21<210>197<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot20,2ndpcr))<400>197acactctttccctacacgacgctcttccgatctgttgatatcccagcttaagcaatc57<210>198<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot20,2ndpcr))<400>198gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttaaacatcatttctggcacgtc57<210>199<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot21,1stpcr))<400>199agctattgctgtcaatctcttact24<210>200<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot21,1stpcr))<400>200tacccagtctcaggtagttctt22<210>201<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot21,2ndpcr))<400>201acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgctgtcaatctcttactgtaacta58<210>202<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot21,2ndpcr))<400>202gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttagcaatgcgagaacagactaa56<210>203<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot22,1stpcr))<400>203tgccacacatcccatcatatc21<210>204<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot22,1stpcr))<400>204cagcagacacagactcacaa20<210>205<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot22,2ndpcr))<400>205acactctttccctacacgacgctcttccgatctcaacatgaaatgccagagtcaaa56<210>206<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot22,2ndpcr))<400>206gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcccattcaagttgcaatcactatc58<210>207<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot23,1stpcr))<400>207tcctgaaagaagggataaggtaag24<210>208<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot23,1stpcr))<400>208tgaggatgggtttcggtaaat21<210>209<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot23,2ndpcr))<400>209acactctttccctacacgacgctcttccgatctataaggtaagctcagcctgtc54<210>210<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot23,2ndpcr))<400>210gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtttcaacatgaaggcaaggag56<210>211<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot24,1stpcr))<400>211caagaagggtgttaggttatgaaag25<210>212<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot24,1stpcr))<400>212acagtcaacccttaaggaagag22<210>213<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot24,2ndpcr))<400>213acactctttccctacacgacgctcttccgatctgggtgttaggttatgaaagtttaagg59<210>214<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot24,2ndpcr))<400>214gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaggaagagttgtcttcactcg56<210>215<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot25,1stpcr))<400>215ctttcacagccagtcacaaataaa24<210>216<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot25,1stpcr))<400>216ctcacactctaggaaacagatgatag26<210>217<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot25,2ndpcr))<400>217acactctttccctacacgacgctcttccgatctcaatccactcagactacagagaaa57<210>218<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot25,2ndpcr))<400>218gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctagacaggagtgttctccaaatc56<210>219<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot26,1stpcr))<400>219gtgagccaagatcacaccat20<210>220<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot26,1stpcr))<400>220ctctcagcaagaaggcagatt21<210>221<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot26,2ndpcr))<400>221acactctttccctacacgacgctcttccgatctagatcacaccattgcactcc53<210>222<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot26,2ndpcr))<400>222gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgccagatcagtgtctgctaaa55<210>223<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot27,1stpcr))<400>223ggacacgctgagtcaaagtt20<210>224<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot27,1stpcr))<400>224cctttccttcgtgctgattga21<210>225<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot27,2ndpcr))<400>225acactctttccctacacgacgctcttccgatctgcaaccacgtcgacaataca53<210>226<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot27,2ndpcr))<400>226gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctggtggaagtgacaagcaagtta56<210>227<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot28,1stpcr))<400>227cccaacaattccttctttgagc22<210>228<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot28,1stpcr))<400>228tctgctattagaggaggctagaa23<210>229<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot28,2ndpcr))<400>229acactctttccctacacgacgctcttccgatctcaattccttctttgagctcactat57<210>230<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot28,2ndpcr))<400>230gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgaggctagaacaaccttgga54<210>231<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot29,1stpcr))<400>231gggcaaatccataacccagaata23<210>232<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot29,1stpcr))<400>232aggcgatgcatgagcttaaa20<210>233<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot29,2ndpcr))<400>233acactctttccctacacgacgctcttccgatctgggcaaatccataacccaga53<210>234<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot29,2ndpcr))<400>234gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtagctaatctggctaccatcac57<210>235<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot30,1stpcr))<400>235attggctggcacacagtag19<210>236<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot30,1stpcr))<400>236cccaggatctagcaaacattca22<210>237<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot30,2ndpcr))<400>237acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgaatgaatgaaggaaagaatggg57<210>238<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot30,2ndpcr))<400>238gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgcaaacattcatctttcgagcta57<210>239<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot31,1stpcr))<400>239cacttctcgcctttgacctt20<210>240<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot31,1stpcr))<400>240tggctgtgctcactttactg20<210>241<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot31,2ndpcr))<400>241acactctttccctacacgacgctcttccgatctagaggaggaaactggagctta54<210>242<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot31,2ndpcr))<400>242gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctactttactgccaccagtgc53<210>243<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot32,1stpcr))<400>243atcttccacaggtgcaaatct21<210>244<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot32,1stpcr))<400>244ttgcctatggctgccttg18<210>245<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot32,2ndpcr))<400>245acactctttccctacacgacgctcttccgatctctggtcattctcttccgtcaaa55<210>246<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot32,2ndpcr))<400>246gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaacagtatgggcctgaaaag54<210>247<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot33,1stpcr))<400>247catgtaaccacgactacctcaa22<210>248<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot33,1stpcr))<400>248ccatggcttgcagcaattt19<210>249<211>59<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot33,2ndpcr))<400>249acactctttccctacacgacgctcttccgatctgtaaccacgactacctcaagatataa59<210>250<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot33,2ndpcr))<400>250gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcacacagacgtactgttaagga56<210>251<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot34,1stpcr))<400>251cttagaggaaagagaactgggattat26<210>252<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot34,1stpcr))<400>252agtgtggctgattatggtgatta23<210>253<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot34,2ndpcr))<400>253acactctttccctacacgacgctcttccgatctccaagagtagcctaacctttacaa57<210>254<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot34,2ndpcr))<400>254gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcacgtaaattgcacctgtcac55<210>255<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot35,1stpcr))<400>255tttctctgccattcttcctctg22<210>256<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot35,1stpcr))<400>256gaatgaagacacgaggcatttg22<210>257<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot35,2ndpcr))<400>257acactctttccctacacgacgctcttccgatcttcttagcccatgttgcttcc53<210>258<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot35,2ndpcr))<400>258gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttccagaatgtaccttgcacttt56<210>259<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot36,1stpcr))<400>259tgctgtctttagttccttcatt22<210>260<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot36,1stpcr))<400>260ttaacccagcatcagctctc20<210>261<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot36,2ndpcr))<400>261acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgctgtctttagttccttcatt55<210>262<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot36,2ndpcr))<400>262gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttaacccagcatcagctctc54<210>263<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot37,1stpcr))<400>263tttccagaagagccgacaag20<210>264<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot37,1stpcr))<400>264ccaacaaccaccacgactaa20<210>265<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot37,2ndpcr))<400>265acactctttccctacacgacgctcttccgatctgggcccttctgctttgag51<210>266<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot37,2ndpcr))<400>266gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctagtctcccatgaaggctgta54<210>267<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot38,1stpcr))<400>267aaagtacatagaggacgtgcatag24<210>268<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot38,1stpcr))<400>268agttcaccaccaccacaag19<210>269<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot38,2ndpcr))<400>269acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgtgcaaatactacgccatttc55<210>270<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot38,2ndpcr))<400>270gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctacaagtttgcacttgctttca55<210>271<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot39,1stpcr))<400>271cacctggaccaccagaaa18<210>272<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot39,1stpcr))<400>272gctgtttgcaaatgcctca19<210>273<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot39,2ndpcr))<400>273acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacctggaccaccagaaa51<210>274<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot39,2ndpcr))<400>274gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctacccatctctgcagacctta54<210>275<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot40,1stpcr))<400>275ctgatttcctgagtttctccctaa24<210>276<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot40,1stpcr))<400>276aagtgtgggctgtgcataa19<210>277<211>57<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot40,2ndpcr))<400>277acactctttccctacacgacgctcttccgatctctgtgaagggatttcaaactttcc57<210>278<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot40,2ndpcr))<400>278gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcgatcaaggctaacgtcatca55<210>279<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot41,1stpcr))<400>279catctcctgctgtgtcatctt21<210>280<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot41,1stpcr))<400>280ccagtctcgggtatgtctttatt23<210>281<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的正向引物(ot41,2ndpcr))<400>281acactctttccctacacgacgctcttccgatctgactgacttccatcttcctcac55<210>282<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(由digenome-seq捕获的用于靶向深度测序的反向引物(ot41,2ndpcr))<400>282gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagactaatacatccggtctcatc58<210>283<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的正向引物(小鼠vegfa)<400>283acgtcagagagcaacatcac20<210>284<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的反向引物(小鼠vegfa)<400>284ctgtctttctttggtctgcattc23<210>285<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的正向引物(小鼠gapdh)<400>285gctgagtatgtcgtggagtcta22<210>286<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的反向引物(小鼠gapdh)<400>286gtggttcacacccatcacaa20<210>287<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的正向引物(人vegfa-1)<400>287cgagtacatcttcaagccatcc22<210>288<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的反向引物(人vegfa-1)<400>288ggtgaggtttgatccgcataat22<210>289<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的正向引物(人vegfa-2)<400>289agaaggaggagggcagaat19<210>290<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的反向引物(人vegfa-2)<400>290cacaggatggcttgaagatgta22<210>291<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的正向引物(人gapdh)<400>291caatgaccccttcattgacc20<210>292<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(用于qpcr的反向引物(人gapdh)<400>292ttgattttggagggatctcg20<210>293<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(具有pam的sgrna的靶序列(vegfa-1基因))<400>293ctcctggaagatgtccaccaggg23<210>294<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(具有pam的sgrna的靶序列(vegfa-2基因))<400>294agctcatctctcctatgtgctgg23<210>295<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(具有pam的sgrna的靶序列(vegfa-3基因))<400>295gaccctggtggacatcttccagg23<210>296<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(具有pam的sgrna的靶序列(vegfa-4基因))<400>296actcctggaagatgtccaccagg23<210>297<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot1))<400>297ctcctggaagattttcaccaggg23<210>298<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot2))<400>298ctcctggaagatctccaggaagg23<210>299<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot3))<400>299ctcctggaagaggttctccaggg23<210>300<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot4))<400>300ctcttggcagatgtccacaaggg23<210>301<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot5))<400>301ctcctggaagctgcccatcatgg23<210>302<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot6))<400>302ctcctggaaaatgcccaccctgg23<210>303<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot7))<400>303ctcctggaagatgtgggccatgg23<210>304<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot8))<400>304ctcctgaaagctgaccaccacgg23<210>305<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot9))<400>305cacatggaggatgtccaccatgg23<210>306<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot10))<400>306ctcctggaagctgttgaccaggg23<210>307<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot11))<400>307ctcctggaagaggacaaccaagg23<210>308<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot12))<400>308ctgctggatgttgtccaccaggg23<210>309<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot13))<400>309ctcctggaagttgtcctccttgg23<210>310<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot14))<400>310cccctggaagatttccatcaagg23<210>311<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot15))<400>311ctcttggcagctgtccaccatgg23<210>312<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot16))<400>312ctccaagaagatgtcctccatgg23<210>313<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot17))<400>313ctcctggaagatgtcctggaagg23<210>314<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot18))<400>314ctcctggtagatgttcagcatgg23<210>315<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot19))<400>315gtcctggaagctgtccacaaagg23<210>316<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(小鼠基因组中具有pam的vegfa-1sgrna的潜在脱靶位点(ot20))<400>316ctcagtgaagatgtccaccaagg23<210>317<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot1))<400>317atcctgtaagacatccaccctgg23<210>318<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot2))<400>318ttgctggaagatgtcccccttgg23<210>319<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot3))<400>319tacctggaagaattccaccacgg23<210>320<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot4))<400>320gcctgggaagatgtccaccaggg23<210>321<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot5))<400>321ttccaggaagaaatccaccatgg23<210>322<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot6))<400>322acaatagaagaagtccaccatgg23<210>323<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot7))<400>323ctccaggaagttctccaccaagg23<210>324<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot8))<400>324aattaataagatgtccacctacg23<210>325<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot9))<400>325gtcctggaagatgagcaccaagg23<210>326<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot10))<400>326gtgatggaagatgtccacttagg23<210>327<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot11))<400>327ctccaggaagatttccatcatgg23<210>328<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot12))<400>328gtcctggaggatttccaccaggg23<210>329<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot13))<400>329gtccagaaagatatccacctagg23<210>330<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot14))<400>330cacctggaagatttccaccttgg23<210>331<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot15))<400>331ctactggaagaggtccaccctgg23<210>332<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot16))<400>332ctactgggagaagtccaccttgg23<210>333<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot17))<400>333cttcaggaagatgtccacaatgg23<210>334<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot18))<400>334ctcccggaagctgtccaccctgg23<210>335<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot19))<400>335gactcctgaagatgtacaccctgg24<210>336<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot20))<400>336gaactggatgatgtccaccttgg23<210>337<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot21))<400>337gccttggaagatgtccctcatgg23<210>338<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot22))<400>338ctccttgaaagagtccacccagg23<210>339<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot23))<400>339ctcctgcaagatgtcctccagga23<210>340<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot24))<400>340ggcctggaaaatgtccaccgtgg23<210>341<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot25))<400>341tcatggaagatattccaccaggg23<210>342<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot26))<400>342aagatggaagacatccaccaggg23<210>343<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot27))<400>343cagctggaagatgtccacctttg23<210>344<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot28))<400>344cagctggaagatgtccaccacga23<210>345<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot29))<400>345ctcctggaaggagtccaccatga23<210>346<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot30))<400>346tactcctgggatctccacccatg23<210>347<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot31))<400>347cgtctgaaagatgtccaccacgc23<210>348<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot32))<400>348ggtctggaagatgtcaaccacag23<210>349<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot33))<400>349ctcctggtcaatatccacccaag23<210>350<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot34))<400>350ccctggaagaatgtccaccagga23<210>351<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot35))<400>351tgcctgaaagacatccaccaagg23<210>352<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot36))<400>352tgacaggaagatgtccacccatg23<210>353<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot37))<400>353cctcctgctgatgtccacccagg23<210>354<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot38))<400>354gctcctggaagaatccaccacag23<210>355<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot39))<400>355cagctgggagatgtccaccatga23<210>356<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot40))<400>356ttgggggaagaagtccaccaagg23<210>357<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(使用具有pam的vegfasgrna通过digenome-seq鉴定的人基因组中的体外切割位点(ot41))<400>357ccctaggaagaggtccaccaggg23<210>358<211>4107<212>dna<213>人工序列<220><223>合成物(cas9编码序列)<400>358atggacaagaagtacagcatcggcctggacatcggtaccaacagcgtgggctgggccgtg60atcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaagttcaaggtgctgggcaacaccgaccgc120cacagcatcaagaagaacctgatcggcgccctgctgttcgacagcggcgagaccgccgag180gccacccgcctgaagcgcaccgcccgccgccgctacacccgccgcaagaaccgcatctgc240tacctgcaggagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccaccgc300ctggaggagagcttcctggtggaggaggacaagaagcacgagcgccaccccatcttcggc360aacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgcgcaag420aagctggtggacagcaccgacaaggccgacctgcgcctgatctacctggccctggcccac480atgatcaagttccgcggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgac540gtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaacccc600atcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgagcgcccgcctgagcaagagccgc660cgcctggagaacctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaacggcctgttcggcaac720ctgatcgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgag780gacgccaagctgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcc840cagatcggcgaccagtacgccgacctgttcctggccgccaagaacctgagcgacgccatc900ctgctgagcgacatcctgcgcgtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgccagc960atgatcaagcgctacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaggccctggtgcgc1020cagcagctgcccgagaagtacaaggagatcttcttcgaccagagcaagaacggctacgcc1080ggctacatcgacggcggcgccagccaggaggagttctacaagttcatcaagcccatcctg1140gagaagatggacggcaccgaggagctgctggtgaagctgaaccgcgaggacctgctgcgc1200aagcagcgcaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggcgagctgcac1260gccatcctgcgccgccaggaggacttctaccccttcctgaaggacaaccgcgagaagatc1320gagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccccctggcccgcggcaacagc1380cgcttcgcctggatgacccgcaagagcgaggagaccatcaccccctggaacttcgaggag1440gtggtggacaagggcgccagcgcccagagcttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaag1500aacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtg1560tacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgcgcaagcccgccttcctg1620agcggcgagcagaagaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccgcaaggtgacc1680gtgaagcagctgaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgacagcgtggagatc1740agcggcgtggaggaccgcttcaacgccagcctgggcacctaccacgacctgctgaagatc1800atcaaggacaaggacttcctggacaacgaggagaacgaggacatcctggaggacatcgtg1860ctgaccctgaccctgttcgaggaccgcgagatgatcgaggagcgcctgaagacctacgcc1920cacctgttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagcgccgccgctacaccggctggggc1980cgcctgagccgcaagcttatcaacggcatccgcgacaagcagagcggcaagaccatcctg2040gacttcctgaagagcgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctgatccacgacgac2100ag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